0%時，按照每孔細胞數目計算Μ0Ι = 10時所需要的病毒液體積。與 此同時，用DMEM完全培養液配制不同藥物濃度的HIV藥物，將配置好的藥物與病毒混合液， 加入到96孔293A細胞中。感染60小時后，檢測每孔細胞熒光素酶活性。結果顯示，除了2種藥 物(利匹韋林和依曲韋林)大部分藥物都顯示較高的重復性。結果如表1所示，其中，IC50,能 夠使ZsGreen陽性細胞減少50 %的藥物濃度;SD，標準差;CV，變異系數。
[0040] 表1十種藥物用于表型耐藥檢測的可重復性
(3.3.4)病人HIV-1毒株耐藥相關的突變基因分析 HIV-1感染病人的特征(表2)，病人都是聯合應用抗病毒藥物，但所有的8名病人CD4細 胞數低于400細胞/mm3,其中5人低于400細胞病毒載量在155~104000copies/ml之 間。為了分析8名患者HIV-1毒株藥物相關的突變，擴增了HIV-1的pol區基因，并進行了測 序。基于此次研究涉及到的10種HI V抑制劑的基因型耐藥數據，測到8名患者的HI V-1毒株突 變(表3)，這表明所有的HIV-1毒株都存在基因型耐藥，但不能預測它們對抗病毒藥物的耐 受水平。
[00411表2臨床樣本的特性
表3 8名患者體內HIV-1毒株藥物耐受相關的突變分析
注：該項研究中涉及到的5種核苷酸類抑制劑地達諾新、司他夫定、齊多夫定、恩曲他 濱、硫酸阿巴卡韋和三種非核苷酸類抑制劑奈韋拉平、依曲韋林和利匹韋林及2種蛋白酶抑 制劑奈非那韋和洛匹那韋的基因型藥物耐藥性在數據庫可以查到。
[0042] (3.3.6)病人體內HIV-1毒株的表型耐藥分析 8名患者的HIV-1樣本用本發明中帶有雙報告基因的重組慢病毒系統進行表型耐藥分 析。野生型的慢病毒作為對照。病毒抑制率（％ ) = ( 1-藥物處理組的熒光素酶RLU/對照組的 熒光素酶RLU)X100%。用非線性回歸分析每個HIV-1毒株的ICSOAIV-l毒株對每種抑制劑 的表型耐藥程度用倍數變化(FC)來表示，即測試株的IC50/野生株的IC50。校正的用于表型 耐藥的分類標準:FC〈3為敏感，FC = 3-6為低度耐藥，FC = 6.01-10為中度耐藥，FC>10為高度 耐藥[6,22,23]。表4呈現了6種6冊1'18(0丨(1&11〇8；[116,3七&￥11(1;[116,2丨(10￥11(1;[116,2&1(3；^&13；[116， Emtricitabine，Abacavir Sulfate)，4NNRTIs(Nevirapine，Etravirine，Dapivirine， Rilpivirine)及2種PIs(Nelfinavir and Lopinavir)的表型耐藥情況。Zalcitabine(DDC) 和Dapivirine(DPV)兩種藥物在現有數據庫中無基因型耐藥情況分析。對10種藥物的表型 耐藥與基因耐藥結果進行分析，表明，大部分一致(表4)。例如，HIV-1毒株0022表型耐藥分 析對DDI和D4T兩種藥物敏感，但是基因型耐藥分析顯示為中度或高度耐藥，毒株0312對ETR 表型耐藥分析為高度耐藥，但基因型分析為低度耐藥。
[0043] 表4HIV-1毒株的基因型和表型耐藥分析比較
注:DDI，地達諾新;D4T，司他夫定;AZT，齊多夫定;DDC，扎西他濱;FTC，恩曲他濱;ABC， 硫酸阿巴卡韋；NVP，奈韋拉平;ETR，依曲韋林;DPV，達匹韋林;RPV，利匹韋林;NFV，奈非那 韋;LPV，洛匹那韋。
[0044] (3.4)本發明重組慢病毒在TZM-B細胞中的應用 使用該重組慢病毒體系共轉染TZM-B細胞，以評價HIV-1抑制藥物是否影響病毒感染和 蛋白生產，齊多夫定(D4T)作為抗病毒藥物代表，以優化檢測條件。
[0045] (3.4.1 )HIV藥物司他夫定敏感性與細胞數目相關實驗 鋪板96孔板TZM-B細胞，分5組，每組分別為10000、15000、20000、25000、與30000個/孔， 當細胞匯合度達到80 %時，按照每孔細胞數目計算Μ0Ι = 10時所需要的病毒液體積。配制不 同藥物濃度的司他夫定，將上述所需病毒液加至不同濃度的藥物中，加入到96孔TZM-B細胞 中。感染60小時后，檢測每孔細胞熒光素酶基因表達情況。結果顯示，細胞數目為1.5 X 104 細胞/孔時，藥物濃度和焚光素酶的活性相關性最佳。結果如圖7中的A圖所示。
[0046] (3.4.2汨1￥藥物司他夫定敏感性與病毒101相關實驗 鋪板96孔板TZM-B細胞，每孔20000個細胞，共設置10個實驗組，當細胞匯合度達到80 % 時，計數每個實驗組孔中的細胞數目，按照每孔細胞數目計算當Μ0Ι分別為2、4、6、8、10、12、 14、16、18、20時所需要的病毒液體積。配制不同藥物濃度的司他夫定，并將上述所需病毒液 加至不同濃度的藥物中。將配制好的藥物與病毒混合液，加入到96孔TZM-B細胞中。感染60 小時后，檢測每孔細胞熒光素酶基因表達活性。結果顯示，Μ0Ι為10時，藥物濃度和熒光素酶 的活性相關性最佳。結果如圖7中的B圖所示。
[0047] (3.4.3)HIV藥物司他夫定敏感性與病毒感染時間相關實驗 鋪板96孔板TZM-B細胞，分4組，每組20000個/孔，當細胞匯合度達到80 %時，按照每孔 細胞數目計算M0I = 10時所需要的病毒液體積。配制不同藥物濃度的司他夫定，并將上述所 需病毒液加至不同濃度的藥物中。將配制好的藥物與病毒混合液，加入到96孔TZM-B細胞 中。分別于病毒感染36、48、60、72小時后，檢測每孔細胞熒光素酶活性。結果顯示，感染時間 為60小時時，藥物濃度和熒光素酶的活性相關性最佳。結果如圖7中的C圖所示。
[0048] (3.4.4)十二種抗病毒藥物用于表型耐藥檢測的可重復性 通過測定12種抗病毒藥物IC50的藥物濃度來判斷表型耐藥檢測的穩定性和可重復性。 根據上述3個實驗，確定了用于表型耐藥檢測時的細胞數目、Μ0Ι以及病毒感染時間。鋪96孔 板，當細胞匯合度達到80%時，按照每孔細胞數目計算Μ0Ι = 10時所需要的病毒液體積。與 此同時，用DMEM完全培養液配制不同藥物濃度的HIV藥物，將配置好的藥物與病毒混合液， 加入到96孔TZM-B細胞中。感染60小時后，檢測每孔細胞熒光素酶活性。結果顯示，除了2種 藥物(利匹韋林和依曲韋林)大部分藥物都顯示較高的重復性。結果如表5所示，其中，IC50， 能夠使ZsGreen陽性細胞減少50 %的藥物濃度;SD，標準差;CV，變異系數。
[0049] 表5十種藥物用于表型耐藥檢測的可重復性
(3.4.5)病人體內HIV-1毒株的表型耐藥分析 8名患者的HIV-1樣本用本發明中帶有雙報告基因的重組慢病毒系統進行表型耐藥分 析。野生型的慢病毒作為對照。病毒抑制率（％ ) = ( 1-藥物處理組的熒光素酶RLU/對照組的 熒光素酶RLU)X100%。用非線性回歸分析每個HIV-1毒株的ICSOAIV-l毒株對每種抑制劑 的表型耐藥程度用倍數變化(FC)來表示，即測試株的IC50/野生株的IC50。校正的用于表型 耐藥的分類標準:FC〈3為敏感，FC = 3-6為低度耐藥，FC = 6.01-10為中度耐藥，FC>10為高度 耐藥[6,22,23]。表4呈現了6種6冊1'18(0丨(1&11〇8；[116,3七&￥11(1;[116,2丨(10￥11(1;[116,2&1(3；^&13；[116， Emtricitabine，Abacavir Sulfate)，4NNRTIs(Nevirapine，Etravirine，Dapivirine， Rilpivirine)及2種PIs(Nelfinavir and Lopinavir)的表型耐藥情況。Zalcitabine(DDC) 和Dapivirine(DPV)兩種藥物在現有數據庫中無基因型耐藥情況分析。對10種藥物的表型 耐藥與基因耐藥結果進行分析，表明，大部分一致(表6)。例如，HIV-1毒株0022表型耐藥分 析對DDI和D4T兩種藥物敏感，但是基因型耐藥分析顯示為中度或高度耐藥，毒株0312對ETR 表型耐藥分析為高度耐藥，但基因型分析為低度耐藥。
[0050] 表6HIV-1毒株的基因型和表型耐藥分析比較
[0051 ] (3.5)本發明重組慢病毒在huh7.5細胞中的應用 使用該重組慢病毒體系共轉染huh7.5細胞，以評價HIV-1抑制藥物是否影響病毒感染 和蛋白生產，齊多夫定(D4T)作為抗病毒藥物代表，以優化檢測條件。
[0052] (3.5.1 )HIV藥物司他夫定敏感性與細胞數目相關實驗 鋪板96孔板huh7 · 5細胞，分5組，每組分別為10000、15000、20000、25000、與30000個/ 孔，當細胞匯合度達到80 %時，按照每孔細胞數目計算Μ0Ι = 10時所需要的病毒液體積。配 制不同藥物濃度的司他夫定，將上述所需病毒液加至不同濃度的藥物中，加入到96孔 huh7.5細胞中。感染60小時后，檢測每孔細胞熒光素酶基因表達情況。結果顯示，細胞數目 為1.5X104細胞/孔時，藥物濃度和熒光素酶的活性相關性最佳。結果如圖8中的A圖所示。 [0053] (3.5.2汨1￥藥物司他夫定敏感性與病毒101相關實驗 鋪板96孔板huh7.5細胞，每孔20000個細胞，共設置10個實驗組，當細胞匯合度達到 80%時，計數每個實驗組孔中的細胞數目，按照每孔細胞數目計算當Μ0Ι分別為2、4、6、8、 10、