I雙酶切pMD2.G質粒，回收酶切產物，收取119bp CMV片段； (1.2) 將pHAGE-EFla-IRES-ZsGreen質粒用BamH I和Κρη I進行雙酶切，回收4736bp pHAGE-IRES-ZsGreen 片段； (1.3) 將回收的CMV片段和pHAGE-IRES-ZsGreen用T4DNA連接酶進行連接，連接成功后， 提取的質粒命名為pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen質粒； (1.4) 使用Ncol和Xbal雙酶切PGL3_Promoter Vector，回收 1906bp Luciferase片段， pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen質粒用Ncol和Xbal雙酶切，回收4855bp的片段，將該片段和 Luciferase片段用T4DNA連接酶進行連接;連接成功后，提取的質粒即為pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen〇
[0021] (2)包裝質粒的構建 所述包裝質粒為psPAX2m-pol質粒，其序列如序列如SEQIDNo.6所示，結構如圖3所 不。
[0022]所述包裝質粒的構建方法如下： (2 · 1)基于psPAX2的載體重建 定點突變改造載體psPAX2，以定向封閉多余的酶切位點AgeI與Apal。
[0023] 為使人源HIV-1耐藥基因片段(Pol-HIV(partial)片段，簡寫為pol)克隆到包裝質 粒psPAX2限制性酶切位點Age I和Apa I之間，需要通過PCR和基因定點突變修飾質粒另外 兩位點的Age 1(7697位)和Apa 1(863位）。
[0024]在本發明中，該HIV-1耐藥基因片段的提取方式如下： PCR擴增獲得pol片段，其序列如SEQ ID No.5所示。
[0025] OUT-R：CCTTGCCCCT GCTTCTGTAT TTCTGC IN-F:TGCAGG GCCCCTAGGA AAAAGGGCTG(Apal) IN-R:CACTCCATGT ACCGGTTCTT TTAGAATCTC(Agel) 模板為人體樣本提取的RNA，第一輪反應條件：45°C逆轉錄30min，PCR 94°C預變性 2min，98°C變性10s，51°C退火15s，68°C延伸2min，循環30次；第二輪反應條件：98°C變性 10s，51°C 退火 15s，68°C 延伸 2min，循環 30 次。
[0026] (2.1.1)利用長引物法PCR突變包裝質粒psPAX2酶切位點Agel (2.1.1.1) PCR擴增突變包裝質粒psPAX2酶切位點Agel獲得Agel-l片段，其序列如SEQ ID No. 1 所示。
[0027] 引物:Age I-F: CGAAGAGCTC ATCAGAACAG TCAGACTCAT CAAGCTTCTC TATC(SacI) AgeI~R:CTGCTAGCTA TAGTTCTAGA GGTATCGGTT GTTTCGAGCT TATAG(Nhel) 加粗斜體T代表突變后的堿基，其原始堿基為C。模板為psPAX2(psPAX2為HIV-1野生株 假病毒骨架質粒，GenBank編號:D86068.1 )PCR條件:94 °C預變性4min，94 °C變性20s、55 °C退 火20s、72°C延伸lmin，循環35次，最后72°C延伸5min。
[0028] (2 · 1 · 1 · 2)回收突變后Agel-l片段，插入PZeroBack/Blunt Vector(北京天根公 司），形成T-AgeV質粒;將T-AgeF質粒進行鑒定測序，正確即點突變成功；用SacI與Nhel雙 酶切T-AgeV質粒，即酶切突變成功的片段；將該酶切突變成功的片段連接至表達載體 psPAX2，連接成功后，提取的質粒命名為psPAX2-l，其序列如SEQIDNo.2所示。
[0029] (2.1.2)利用定點突變試劑盒突變載體psPAX2-l酶切位點Apal (2.1.2.1) 使用Agi 1 ent公司定點突變試劑盒對載體psPAX2-1進行定點突變，命名為 psPAX2-2，其序列如SEQIDNo·3所示。
[0030] 引物：M-Apal-F GCC TTG AGG GGC CTC CGG GGA CGG CCC TTT GTG CGG GG M-Apal-R CCC CGC ACA AAG GGG CCG TCC CGG AGC CCC CTC AAG GC 模板為 psPAX2-l，PCR 條件:95°C 預變性 2min，95°C 變性 30sec，55°C 退火 lmin，68°C 延伸 10min，循環18次。
[0031] (2· 1.2.2)DpnI酶切擴增產物psPAX2-2;將酶切產物轉化XL 10-G0LD感受態細胞， 質粒提取，命名為PSPAX2-2'; Apal酶切質粒PSPAX2-2'，挑取酶切鑒定正確的質粒，送英駿公司測序，并將測序結果 正確的質粒命名為psPAX2m，其序列如SEQIDNo.4所示。
[0032] (2.2)psPAX2m-pol 質粒構建 用Apal和Agel酶切pol片段回收并插入psPAX2m載體(psPAX2m用Apal和Agel切割），構 建為psPAX2m-pol質粒，用于重組慢病毒的生產。psPAX2m-pol質粒如圖3所示，其序列如SEQ ID No .6所示。
[0033] (3)重組慢病毒的生產及其在不同細胞的應用 (3.1)將步驟（1)構建好的pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen轉移質粒、步驟(2)構建好的 psPAX2m-pol包裝質粒與pMD2.G包膜質粒共轉染293FT細胞或293T細胞后得到的包裝體。本 發明采用293FT細胞。轉染前36h，鋪細胞，75cm 2細胞培養瓶，細胞總數為3 X 106個。當細胞匯 合度達75%時，將總量為15yg的三質粒(2.8yg包膜質粒pMD2.G，5.2yg包裝質粒psPAX2-Pol 和7yg轉移質粒pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen)和45μ1 X-tremeGENE HP DNA轉染試劑 (尺〇吐6，1^4)一起置于1.5!111的0?^-1^1培養基中，室溫靜置151^11，共轉染293?1'細胞。4811 后倒置熒光顯微鏡下質粒共轉染情況，結果如圖4所示，證明重組慢病毒載體改造前后，轉 染特性未變。收集慢病毒上清，4°C 3000rpm離心20min，用0.45μπι濾器濾過，得到重組慢病 毒。
[0034] (3.2)重組慢病毒活性與滴度測定 病毒滴度測定按照Ngai，S. C.等標準，得到的樣本假病毒原液10倍稀釋后，用50ul稀釋 后的病毒液感染十二孔板培養的293A細胞，60小時后，流式細胞儀檢測每孔熒光百分比，計 算慢病毒活性滴度。結果如圖6所示，證明重組慢載體改造前后，病毒感染性未變。
[0035] (3.3)本發明的重組慢病毒在293A細胞中的應用 因 psPAX2m中的pol基因來源于野生型的HIV-1，以psPAX2m，pMD2.G和pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen共轉染293A細胞制備的重組慢病毒在表型耐藥檢測中作為野生型的HIV-1對 照病毒。為了評價HIV-1抑制藥物是否影響病毒感染和蛋白生產，齊多夫定(D4T)作為抗病 毒藥物代表，以優化檢測條件。
[0036] (3.3.1 )HIV藥物司他夫定敏感性與細胞數目相關實驗 鋪板96孔板293A細胞，分5組，每組分別為10000、15000、20000、25000、與30000個/孔， 當細胞匯合度達到80 %時，按照每孔細胞數目計算Μ0Ι = 10時所需要的病毒液體積。配制不 同藥物濃度的司他夫定，將上述所需病毒液加至不同濃度的藥物中，加入到96孔293A細胞 中。感染60小時后，檢測每孔細胞熒光素酶基因表達情況。結果顯示，細胞數目為1.5 X 104 細胞/孔時，藥物濃度和焚光素酶的活性相關性最佳。結果如圖5中的A圖所示。
[0037] (3.3.2汨1￥藥物司他夫定敏感性與病毒101相關實驗 鋪板96孔板293A細胞，每孔20000個細胞，共設置10個實驗組，當細胞匯合度達到80 % 時，計數每個實驗組孔中的細胞數目，按照每孔細胞數目計算當Μ0Ι分別為2、4、6、8、10、12、 14、16、18、20時所需要的病毒液體積。配制不同藥物濃度的司他夫定，并將上述所需病毒液 加至不同濃度的藥物中。將配制好的藥物與病毒混合液，加入到96孔293A細胞中。感染60小 時后，檢測每孔細胞熒光素酶基因表達活性。結果顯示，Μ0Ι為10時，藥物濃度和熒光素酶的 活性相關性最佳。結果如圖5中的B圖所示。
[0038] (3.3.3)HIV藥物司他夫定敏感性與病毒感染時間相關實驗 鋪板96孔板293A細胞，分4組，每組20000個/孔，當細胞匯合度達到80 %時，按照每孔細 胞數目計算M0I = 10時所需要的病毒液體積。配制不同藥物濃度的司他夫定，并將上述所需 病毒液加至不同濃度的藥物中。將配制好的藥物與病毒混合液，加入到96孔293A細胞中。分 別于病毒感染36、48、60、72小時后，檢測每孔細胞熒光素酶活性。結果顯示，感染時間為60 小時時，藥物濃度和熒光素酶的活性相關性最佳。結果如圖5中的C圖所示。
[0039] (3.3.4)十二種抗病毒藥物用于表型耐藥檢測的可重復性 通過測定12種抗病毒藥物IC50的藥物濃度來判斷表型耐藥檢測的穩定性和可重復性。 根據上述3個實驗，確定了用于表型耐藥檢測時的細胞數目、Μ0Ι以及病毒感染時間。鋪96孔 板，當細胞匯合度達到8