需要使 用的附圖做簡單地介紹，顯而易見，下面簡述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本 領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的 附圖。
[0066] 圖1表示本發明實施例1的顯色結果圖。
[0067] 圖2表示本發明實施例2的顯色結果圖。
[0068] 圖3表示本發明實施例3的顯色結果圖。
[0069] 圖4表示本發明實施例4的顯色結果圖。
[0070] 圖5表示本發明實施例5的顯色結果圖。
[0071] 圖6表示本發明實施例6的顯色結果圖。
【具體實施方式】
[0072] 下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體 條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為 可以通過市購獲得的常規產品。
[0073] 實施例1 :
[0074] (一）固相支持物表面金屬膜的負載
[0075] 首先將市購環烯烴共聚物塑料片裁剪成尺寸為25mmX30mm的基底；然后將其浸 入95%乙醇溶液中超聲清洗10分鐘，取出后再次用新的95%乙醇溶液反復沖洗10次，并 用氮氣吹干；最后利用ZZSX-800AZ型真空鍍膜機，以鎢舟作為蒸發源，通過真空蒸發法在 環烯烴共聚物塑料片表面負載一層厚度為30nm、純度為99. 99 %的銀膜。
[0076] 真空蒸鍍銀膜所經歷的過程為：銀原子蒸發、蒸汽凝集、成核、核生長以及形成連 續膜。由于烯烴共聚物塑料片的溫度遠低于蒸發源的溫度，因此，銀原子很容易在塑料片的 表面直接發生由氣相到固相的轉變，形成厚度為30nm的固體薄膜。
[0077] 表面負載有銀膜的環烯烴共聚物塑料片制備好后，真空環境下密封保存備用。 [0078](二）靶核酸的擴增
[0079] 靶核酸：從一例結直腸癌患者的石蠟包埋組織樣本分離純化的濃度為0. 05ng/ μ 1的人體基因組核酸（經過PCR測序確認為K-ras基因外顯子2中第12密碼子35G > A 突變）
[0080] 擴增κ-ras基因的引物對，其中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示，下游 引物的核苷酸序列如SEQ ID N0 :8所示，上游引物的5'端用生物素標記，上游引物和下游 引物的濃度均為〇. 2 μ M。
[0081] 擴增人Actin基因的引物對，其中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示，下 游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:10所示，上游引物的5'端用生物素標記，上游引物和下 游引物的濃度均為〇. 2 μ M。
[0082] Go Taq 酶：5U/ μ 1，購自 promega 公司。
[0083] 10 X Taq酶反應緩沖溶液：購自promega公司。
[0084] MgCl2 :25mM，購自 promega 公司。
[0085] dNTPs Mix : 10mM，購自 promega 公司
[0086] 2· 2操作步驟：
[0087] 2. 2. 1配制PCR反應體系（使用下列50 μ 1的PCR擴增體系）：
[0088] 6〇了&9酶：11];
[0089] 酶反應緩沖溶液：1 X ;
[0090] 擴增 K-ras 基因的上游引物（SEQ ID NO :7) :0· 2 μ Μ ;
[0091] 擴增 K-ras 基因的下游引物（SEQ ID NO :8) :0· 2 μ Μ ;
[0092] 擴增人Actin基因的上游引物（SEQ ID Ν0:9) :0·2μΜ;
[0093] 擴增人Actin基因的下游引物（SEQ ID NO :10) :0. 2μ Μ;
[0094] MgCl2 ：2. OmM ；
[0095] dNTPs Mix ：0. 2mM
[0096] 模板：1 μ 1
[0097] 余量為水。
[0098] 2· 2. 2PCR 擴增反應：首先 95°C 預變性 5min ;然后 95°C 1. Omin ;50°C 1. 5min ; 72°C，lmin，40 個循環；最后 72°C延伸 5min。
[0099] 2· 2. 3PCR產物的變性：首先在95°C孵育lOmin，然后冰浴5min。
[0100] (三）核酸探針在金屬膜表面的固定
[0101] 3.1實驗材料：
[0102] 核酸探針：
[0103] (1).核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示的35G > A突變檢測探針，5'端巰基修飾， 用于檢測結直腸癌患者癌組織樣本中的K-ras基因外顯子2中第12密碼子35G > A突變；
[0104] (2).核苷酸序列如SEQ ID N0 :2所示的35G > T突變檢測探針，5'端巰基修飾， 用于檢測結直腸癌患者癌組織樣本中的K-ras基因外顯子2中第12密碼子35G > T突變；
[0105] (3).核苷酸序列如SEQ ID N0 :3所示的35G > C突變檢測探針，5'端巰基修飾， 用于檢測結直腸癌患者癌組織樣本中的K-ras基因外顯子2中第12密碼子35G > C突變；
[0106] (4).核苷酸序列如SEQ ID N0 :4所示的35位點野生型檢測探針，5'端巰基修飾， 用于檢測結直腸癌患者癌組織樣本中的K-ras基因的35位點野生型；
[0107] (5).核苷酸序列如SEQ ID N0 :5所示的人Acticn基因檢測探針，5'端巰基修飾， 作為陽性對照；
[0108] (6).核苷酸序列如SEQ ID N0 :6所示的隨機序列探針，5'端巰基修飾，作為陰性 對照；
[0109] 將上述（1)~（6)所述的核酸探針分別加水配制成6種核酸探針的濃度均為 100 μ Μ (艮p lOOpmol/μ 1)的溶液備用。
[0110] 磷酸二氫鉀（ΚΗ2Ρ04):購自 Sigma-Aldrich 公司；
[0111] PEG8000 :購自 Sigma-Aldrich 公司；
[0112] 3. 2操作步驟：
[0113] 3. 2. 1配制組分如下所示的6種核酸探針的溶液（以下簡稱點樣液）：1Μ ΚΗ2Ρ04、 4%PEG8000 和10μM核酸探針，余量為水。
[0114] 3. 2. 2核酸探針的固定，步驟如下所示：
[0115] 使用優級乙醇搖洗步驟（一）中得到的表面負載有30nm厚銀膜的環烯烴共聚物 塑料片3次，每次5min，然后用高純氮氣吹干；
[0116] 每次用移液器取1 μ 1的點樣溶液，將步驟3. 2. 1中配制的6種點樣液分別點于清 洗后的銀膜的表面，然后將塑料片置于濕盒內，室溫孵育lh ;
[0117] 再使用純化滅菌水搖洗孵育后的塑料片3次，每次5min，最后用高純氮氣吹干塑 料片，真空保存備用。
[0118] 核酸探針在銀膜表面的排列方式如下表1所示：
[0119] 表 1
[0120]
[0121] (四）預處理
[0122] 4.1實驗材料：
[0123] 胱胺、脂肪醇聚氧乙烯醚和異構醇均購自Sigma-Aldrich公司。
[0124] 4. 2操作步驟
[0125] 3. 2. 1配制組成如下所示的預處理液：7. 5份胱胺、7. 5份C17脂肪醇聚氧乙烯醚和 5份(；。異構醇，余量為水。
[0126] 4. 2. 2預處理：將步驟（三）中表面固定有核酸探針的環烯烴共聚物塑料片浸泡 在溫度為37°C的預處理液中30min，期間翻動一次。
[0127] (五）一步反應
[0128] 5.1實驗材料：
[0129] 20XSSC 溶液：3. Omol/L NaCl，0. 3mol/L 檸檬酸鈉，ρΗ7· 0 ;
[0130] 堿性磷酸酶標記鏈霉親和素：購自Gibcol公司；
[0131] 氯化鋅：購自生工生物工程（上海）股份有限公司；
[0132] 六水氯化鎂：購自生工生物工程（上海）股份有限公司；
[0133] Tween-20 :購自生工生物工程（上海）股份有限公司；
[0134] 多聚賴氨酸：購自生工生物工程（上海）股份有限公司；
[0135] 聚乙二醇8000 :購自生工生物工程（上海）股份有限公司；
[0136] 5. 2操作步驟：
[0137] 5. 2. 1 配制組成如下所示的雜交液：3XSSC，ly g/ml SA-AP、20mM ZnCl2、20mM MgCl2、0. 5% Tween-20、0. 1%多聚賴氨酸和2%聚乙二醇8000,余量為水。
[0138] 5. 2. 2 -步反應：將步驟（四）經預處理后得到的表面固定有核酸探針的環烯烴 共聚物塑料片放入lml雜交液中，同時加入1〇μ 1的步驟（二）中變性后的PCR產物，混勻 后于37°C反應15min。
[0139] (六）后處理
[0140] 6. 1實驗材料：
[0141] 正十二烷基葡萄糖苷：購自生工生物工程（上海）股份有限公司。
[0142] 三羥甲基氨基甲烷（Tris):購自生工生物工程（上海）股份有限公司。
[0143] NaCl :購自生工生物工程（上海）股份有限公司。
[0144] 6. 2操作步驟
[0145] 6. 2. 1 配制組成如下所示的后處理液：ΡΗ9· 5、0· lmol/L Tris-HCl、0. lmol/L NaCl 和2. 5%正十二烷基葡萄糖苷，余量為水。
[0146] 6. 2. 2后處理：利用后處理液洗滌經上述步驟（五）中一步反應后的環烯烴共聚 物塑料片表面負載的銀膜3次，每次洗滌5min。
[0147] (七）顯色反應
[0148] 7. 1實驗材料：
[0149] 硝基藍四氮唑（NBT):購自生工生物工程（上海）