股份有限公司。
[0150] 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸（BCIP):購自生工生物工程（上海）股份有限公 司。
[0151] 三羥甲基氨基甲烷（Tris):購自生工生物工程（上海）股份有限公司。
[0152] NaCl :購自生工生物工程（上海）股份有限公司。
[0153] 7. 2操作步驟
[0154] 7. 2. 1 配制組成如下所示的顯色溶液：PH10. 0、0· lmol/L Tris-HCl、0. lmol/L NaCl、50mMMgCl2、0.33mg/ml NBT 和 0.17mg/ml BCIP，余量為水。
[0155] 7. 2. 2顯色反應：將經步驟（六）中后處理的環烯烴共聚物塑料片表面負載的銀 膜浸沒在上述顯色溶液中，顯色5~lOmin，觀察顯色結果。
[0156] 本實施例的顯色結果如圖1所示。
[0157] 實施例2:
[0158] 同實施例1，不同之處在于將實施例1中的預處理液組成調整為：5份胱胺、3份 C17脂肪醇聚氧乙烯醚和2份Cn異構醇，余量為水；雜交液組成調整為：3XSSC、0. 5 μ g/ ml SA-AP、5mM ZnCl2、5mM MgCl2、0.05% 曲拉通 Χ-100,0·05%多聚賴氨酸和 2%聚乙二醇 8000,余量為水；后處理液調整為：ΡΗ9. 0、0· lmol/L Tris-HCl、0. lmol/L NaCl 和 1 %正辛 基葡萄糖苷，余量為水。其他條件不變。
[0159] 本實施例的顯色結果如圖2所示。
[0160] 實施例3:
[0161] 同實施例1，不同之處在于將實施例1中的固相支持物替換為載玻片，固相支持物 表面負載的金屬膜變為厚度60nm、純度99. 9%的鋁膜；預處理液組成調整為：10份胱胺、12 份C1S脂肪醇聚氧乙烯醚和8份C12異構醇，余量為水；雜交液組成調整為：3 X SSC，1. 2 μ g/ mlSA-AP、50mM ZnC12、50mM MgC12、l%Tween-20、0. 2%多聚賴氨酸和4%聚乙二醇8000,余 量為水；后處理液組成調整為：PH10. 0、0. lmol/L Tris-HCl、0. lmol/L NaCl和4%正癸基 葡萄糖苷，余量為水。其他條件不變。
[0162] 本實施例的顯色結果如圖3所示。
[0163] 實施例4:
[0164] 同實施例1，不同之處在于將實施例1中的預處理液組成調整為：6份胱胺、5份 C19脂肪醇聚氧乙烯醚和4份C13異構醇，余量為水；將雜交液組成調整為：3X SSC，0. 2 μ g/ ml SA-AP，2mM ZnCl2,2mM MgCl2,0.02% 曲拉通 Χ-100,0·02%陽離子聚丙烯酰胺和 3%聚 乙二醇8000,余量為水；將后處理液調整為：ΡΗ9. 5、0. lmol/L Tris-HCl、0. lmol/L NaCl和 0.5%正癸基葡萄糖苷，余量為水。其他條件不變。
[0165] 本實施例的顯色結果如圖4所示。
[0166] 實施例5:
[0167] 同實施例3,不同之處在于將實施例3中的預處理液組成調整為：8份胱胺、10份 C1S脂肪醇聚氧乙烯醚和7份C12異構醇，余量為水；將雜交液組成調整為：3XSSC，1. 5 μ g/ mlSA-AP，80mM ZnCl2,80mM MgCl2，1.5% Tween20,0.4%多聚賴氨酸和 6%聚乙二醇 8000， 余量為水；將后處理液調整為：PH10. 0、0. lmol/L Tris-HCl、0. lmol/L NaCl和5%正十六 烷基葡萄糖苷，余量為水。其他條件不變。
[0168] 本實施例的顯色結果如圖5所示。
[0169] 實施例6:
[0170] 同實施例1，不同之處在于將實施例1中4. 2. 2 -步反應的條件變為：42°C反應 8min。其他條件不變。
[0171] 本實施例的顯色結果如圖6所示。
[0172] 從圖1~6可見，35G > A突變檢測探針呈陽性，35G > T突變檢測探針和35G > C突變檢測探針呈陰性，同時35位點野生型檢測探針也為陽性，所以判定該例結直腸癌患 者的K-ras基因外顯子2中第12密碼子發生了 35G > A突變。由于組織核酸樣本中含有 K-ras基因的35G > A突變型，所以35G > A突變檢測探針為陽性，同時該組織中還含有人 體正常未癌變的組織，因此35位點野生型檢測探針也為陽性。此外，陽性對照探針顯示陽 性，陰性對照探針顯示陰性，表明整個檢測過程正常，實驗結果可信。
[0173] 相比于現有技術中的反向斑點雜交技術，本發明的方法通過在金屬膜表面上實現 核酸雜交過程與堿性磷酸酶聯過程合二為一進行，從而可以在金屬膜表面直接形成堿性磷 酸酶標記核酸雜交體的偶聯物。本發明通過一步反應后的顯色反應，根據著色的深淺以及 雜交信號與金屬膜的強烈色差，可以用肉眼快速判斷核酸雜交的結果，極大提高了反向斑 點雜交的檢測靈敏度與分辨能力。
[0174] 應當注意的是，以上所述的實施例僅用于解釋本發明，并不構成對本發明的任何 限制。通過參照典型實施例對本發明進行了描述，但應當理解為其中所用的詞語為描述性 和解釋性詞匯，而不是限定性詞匯。可以按規定在本發明權利要求的范圍內對本發明作出 修改，以及在不背離本發明的范圍和精神內對本發明進行修訂。盡管其中描述的本發明涉 及特定的方法、材料和實施例，但是并不意味著本發明限于其中公開的特定例，相反，本發 明可擴展至其他所有具有相同功能的方法和應用。
【主權項】
1. 一種高靈敏度反向斑點雜交方法，其包括如下步驟： A) 將至少一種核酸探針固定在固相支持物負載的金屬膜表面； B) 利用預處理液對所述金屬膜表面進行預處理； C) 將所述核酸探針在包含堿性磷酸酶標記鏈霉親和素的雜交液中與生物素標記的靶 核酸進行一步反應； D) 步驟C)中反應完成后，利用后處理液對所述金屬膜表面進行后處理； E) 將包含底物的顯色溶液與金屬膜表面接觸進行顯色反應。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述金屬膜選自金膜、銀膜、銅膜和鋁膜， 優選銀膜和鋁膜，所述金屬膜的厚度為l〇nm~lOOnm。3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟B)中所述預處理液包括胱胺、月旨 肪醇聚氧乙烯醚和異構醇；其中，所述脂肪醇聚氧乙烯醚選自C 17~C19的脂肪醇聚氧乙烯 醚，所述異構醇選自Q。~C13異構醇。4. 根據權利要求1~3中任意一項所述的方法，其特征在于，在所述預處理液中，胱胺 為3~20重量份，脂肪醇聚氧乙烯醚為2~18重量份以及異構醇為0. 2~9重量份；優 選地，胱胺為5~10重量份，脂肪醇聚氧乙烯醚為3~12重量份以及異構醇為2~8重量 份。5. 根據權利要求1~4中任意一項所述的方法，其特征在于，步驟C)中所述堿性磷酸 酶標記鏈霉親和素在雜交液中的濃度為0.05~2μg/ml，優選0. 1~1.5μg/ml，更優選 0· 5 ~L 2 μ g/ml 〇6. 根據權利要求1~5中任意一項所述的方法，其特征在于，步驟C)中所述雜交液包 括鋅離子、鎂離子、表面活性劑和陽離子型聚合物；其中，所述表面活性劑選自吐溫和曲拉 通，所述陽離子型聚合物選自陽離子聚丙烯酰胺、多聚賴氨酸和聚合氯化鋁。7. 根據權利要求1~6中任意一項所述的方法，其特征在于，在所述雜交液中，鋅離子 為0.001~0· lmol/L，鎂離子為0.001~0· lmol/L，表面活性劑占雜交液的0.01~2% (v/ v)，陽離子型聚合物占雜交液的0. 01~0. 5% (w/v);優選地，鋅離子為0. 005~0. 05mol/ L，鎂離子為0. 005~0. 05mol/L，表面活性劑占雜交液的0. 05~1 % (v/v)，陽離子型聚合 物占雜交液的〇. 05~0. 2% (w/v)。8. 根據權利要求1~7中任意一項所述的方法，其特征在于，步驟D)中所述后處理液 包括Cs~C1S烷基葡萄糖苷，優選C 9~C13烷基葡萄糖苷；所述烷基葡萄糖苷占后處理液的 0· 5 ~5 % (w/v)，優選 1 ~4 % (w/v)。9. 根據權利要求1~8中任意一項所述的方法，其特征在于，步驟D)中所述后處理液 的 PH 為 9. 0 ~10. 0。10. 根據權利要求1~9中任意一項所述的方法，其特征在于，步驟B)中所述預處理是 將所述固相支持物浸泡在25~37 °C溫度的所述預處理液中30~60min。11. 根據權利要求1~10中任意一項所述的方法，其特征在于，所述核酸探針選自長度 為15~40個堿基的寡核苷酸探針，優選選自長度為15~25個堿基的寡核苷酸探針。12. 根據權利要求1~11中任意一項所述的方法，其特征在于，步驟C)中所述反應的 溫度為35~50°C，反應時間為5~30min ;優選地，反應溫度37~42°C，反應時間10~ 15min〇13. 根據權利要求1~12中任意一項所述的方法，其特征在于，在步驟C)之前還包括 使用用于擴增靶核酸的生物素標記的引物進行PCR反應而擴增靶核酸的步驟。14. 根據權利要求1~12中任意一項所述的方法，其特征在于，在步驟C)之前還包括 在生物素標記脫氧核苷酸的存在下進行PCR反應而擴增靶核酸的步驟。15. 根據權利要求1~14中所述的方法，其特征在于，所述固相支持物選自硝酸纖維素 膜、尼龍膜、硅片、載玻片或塑料片，優選塑料片，更優選環烯烴共聚物塑料片。16. 權利要求1~15中任意一項所述的方法在檢測K-ras基因突變中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種高靈敏度反向斑點雜交方法，該方法通過在金屬膜表面上實現核酸雜交過程與堿性磷酸酶聯過程合二為一進行，從而可以在金屬膜表面直接形成堿性磷酸酶標記核酸雜交體的偶聯物。本發明通過一步反應后的顯色反應，根據著色的深淺以及雜交信號與金屬膜的強烈色差，可以用肉眼快速判斷核酸雜交的結果，極大提高了反向斑點雜交的檢測靈敏度與分辨能力。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105648039
【申請號】
【發明人】楊華衛, 曾冀
【申請人】北京百諾奇生物科技有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年8月20日