聚合物；其中，所述表面活性劑選自吐溫和曲拉通，所述陽離子型聚合物 選自陽離子聚丙烯酰胺、多聚賴氨酸和聚合氯化鋁。
[0033] 根據本發明的一個具體實施例，在所述雜交液中，鋅離子為0. 001~0. lmol/L，鎂 離子為0. 001~0. lmol/L，表面活性劑占雜交液的0. 01~2 % (v/v)，陽離子型聚合物占 雜交液的〇. 01~〇. 5 % (w/v);優選地，鋅離子為0. 005~0. 05mol/L，鎂離子為0. 005~ 0. 05mol/L，表面活性劑占雜交液的0. 05~1 % (v/v)，陽離子型聚合物占雜交液的0. 05~ 0. 2% (w/v) 〇
[0034] 根據本發明的一個具體實施例，所述鋅離子可以選自含鋅離子的可溶性鹽。可用 作本發明的所述含鋅離子的可溶性鹽的實例包括：硫酸鋅、氯化鋅以及其他各種在溶液狀 態可以解離出鋅離子的鹽。
[0035] 根據本發明的一個具體實施例，所述鎂離子可以選自含鎂離子的可溶性鹽。可用 作本發明的所述含鎂離子的可溶性鹽的實例包括：硫酸鎂、乙酸鎂、氯化鎂以及其他各種在 溶液狀態可以解離出鎂離子的鹽。
[0036] 根據本發明的一個具體實施例，所述吐溫選自吐溫20 (TWEEN-20)、吐溫 21(TWEEN-21)、吐溫 40(TWEEN-40)、吐溫 60(TWEEN-60)、吐溫 61(TWEEN-61)、吐溫 80 (TWEEN-80)、吐溫81 (TWEEN-81)和吐溫85 (TWEEN-85)，其中吐溫20是特別優選的。
[0037] 根據本發明的一個具體實施例，所述曲拉通選自曲拉通X-100 (Triton X-100)、曲 拉通X-114(Triton X-114)和曲拉通X-200(Triton X-200)，其中，曲拉通X-100是特別優 選的。
[0038] 在本發明的方法中，酸、堿、鹽離子、溫度條件的變化都會改變甚至使堿性磷酸酶 完全失去活性，因此為了實現本發明的目的之一，雜交液成分的選擇是極為重要的方面。在 本發明的方法中，通過在雜交液中添加鋅離子、鎂離子、表面活性劑以及陽離子型聚合物， 一方面有助于提高核酸雜交效率，另一方面防止雜交液中的堿性磷酸酶標記鏈霉親和素因 吸附而變性，再一方面防止堿性磷酸酶標記鏈霉親和素分子之間因相互作用而導致的聚合 變性。
[0039] 在本發明的方法中，所述陽離子型聚合物能夠與生物素標記的DNA探針產生靜電 吸附作用，使單鏈DNA分子（帶許多負電荷）帶上一個正電荷部分，從而在DNA雜交過程中 同步吸附到固相支持物的表面。由于堿性磷酸酶標記鏈霉親和素也帶有正電荷，這樣就避 免了堿性磷酸酶非特異性吸附到固相支持物的表面。此外，所述陽離子型聚合物可以使得 堿性磷酸酶標記鏈霉親和素在雜交液中形成均勻懸液，使得雜交反應完成以后標記在核酸 偶聯物上的堿性磷酸酶保持活性狀態，從而使得堿性磷酸酶構象的平衡轉換朝著天然狀態 移動。
[0040] 在本發明的方法中，所述雜交液中還可以包括雜交促進劑，所述雜交促進劑在本 質上是本領域技術人員所已知的，可作為本發明所述雜交促進劑的實例包括但不限于：硫 酸葡聚糖、聚乙二醇、酚或硫氰酸胍。
[0041] 在本發明的方法中，所述雜交液中還可以包括其他成分，可以列舉的雜交液中其 他成分的實例包括但不限于：氯化鈉、雜交緩沖溶液、Denhardt' S溶液、十二烷基肌氨酸鈉 或十二烷基磺酸鈉。可以用于本發明所述雜交緩沖溶液的實例包括但不限于：檸檬酸-檸 檬酸鈉緩沖溶液或Tris-鹽酸緩沖溶液。
[0042] 在本發明的方法中，所述雜交液不包括乙二胺四乙酸鹽、無機磷酸鹽和乙醇胺。
[0043] 根據本發明的一個具體實施例，步驟D)中所述后處理液包括Cs~C1S烷基葡萄糖 苷，優選C 9~C13烷基葡萄糖苷；所述烷基葡萄糖苷占后處理液的0. 5~5 % (w/v)，優選 1 ~4 % (w/v) 〇
[0044] 根據本發明的一個具體實施例，步驟D)中所述后處理液的PH為9. 0~10. 0。
[0045] 本發明的方法利用后處理液對雜交反應完成后的固相支持物表面進行洗滌是非 常重要的步驟，一方面該步驟可以將步驟C)中未與靶DNA雜交的以及非特異性雜交的生物 素標記DNA探針分子從固相支持物表面洗去，并將特異性雜交體保留在固相支持物表面； 另一方面該步驟能夠保持堿性磷酸酶的活性，可以保證后續步驟E)中的顯色的效率，背景 反差對比更好。
[0046] 根據本發明的一個具體實施例，步驟D)中所述后處理是指利用后處理液對所述 金屬膜表面洗滌3~5次。
[0047] 根據本發明的一個具體實施例，步驟C)中所述反應的溫度為35~50°C，反應時間 為5~30min ;優選地，反應溫度37~42°C，反應時間10~15min。
[0048] 在本發明的方法中，由于在核酸探針與靶核酸雜交反應的過程中同步實現了酶聯 反應過程，因此需要嚴格控制雜交反應的時間和溫度。本發明的發明人經過大量實驗和創 造性勞動發現，如果雜交反應時間較短或雜交反應溫度較低，核酸雜交效率將會降低，難以 在固相支持物表面形成穩定的雙鏈，影響靶核酸檢測的靈敏度；反之，如果雜交反應時間較 長或雜交反應溫度較高，堿性磷酸酶標記鏈霉親和素在雜交液中容易失活，影響靶核酸檢 測的特異性。反應溫度為35~50°C、反應時間為5~30min時比較合適，優選反應溫度為 37~42°C，反應時間為10~15min，此時靶核酸檢測的靈敏度和特異性較高。
[0049] 根據本發明的一個具體實施例，所述核酸探針選自長度為15~40個堿基的寡核 苷酸探針，優選選自長度為15~25個堿基的寡核苷酸探針。特別優選的核酸探針的長度 包括 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24和25個堿基。
[0050] 本發明的方法通過調整核酸探針的長度和組成，降低了核酸探針與生物素標記靶 核酸雜交的溫度，從而使得雜交反應與酶聯反應能夠統一成一個反應過程進行。本發明的 發明人經過大量實驗發現，所述核酸探針選自長度為15~40個堿基的寡核苷酸探針時 比較合適，優選選自長度為15~25個堿基的寡核苷酸探針，此時一步反應的溫度可以為 37 ~42。。。
[0051] 在本發明的方法中，核酸探針長度的選擇的依據是：如果核酸探針長度過低，雖然 可以提高探針雜交的特異性，但是會顯著降低探針雜交的靈敏度；如果核酸探針長度過長， 可以進一步提高探針雜交的靈敏度，但探針雜交特異性會顯著降低。對于過長的核酸探針， 也不能夠通過提高雜交溫度來提高探針雜交的特異性，因為過高的溫度會使得雜交體系中 的堿性磷酸酶標記鏈霉親和素失活。綜合上面各種因素，同時考慮到探針的GC含量對雜交 Tm值得影響，并經實驗驗證，15~25個核苷酸的寡核苷酸探針是特別優選的。
[0052] 根據本發明的一個具體實施例，步驟A)中所述核酸探針還包括陽性質控探針和 陰性質控探針。其中，所述陽性質控探針可以是人Actin基因探針；所述陰性探針可以是引 物設計軟件隨機生成的一段序列，其特點是不與任何生物的核酸序列相似。
[0053] 根據本發明的一個具體實施例，在步驟A)之前還包括使用用于擴增靶核酸的生 物素標記的引物進行PCR反應而擴增樣品中靶核酸的步驟。
[0054] 在本發明的方法中，所述生物素標記靶核酸可以通過如下方法制備得到：首先對 樣品中的靶核酸進行分離純化，然后使用用于擴增靶核酸的生物素標記的引物對分離純化 的靶核酸進行PCR擴增得到擴增樣品的靶核酸，以提高檢測的靈敏度。
[0055] 根據本發明的一個具體實施例，在步驟A)之前還包括在生物素標記脫氧核苷酸 的存在下進行PCR反應而擴增樣品中靶核酸的步驟。
[0056] 在本發明的方法中，所述生物素標記靶核酸可以通過如下方法制備得到：首先對 樣品中的靶核酸進行分離純化，然后在生物素標記脫氧核苷酸的存在下對分離純化的靶核 酸進行PCR擴增得到擴增樣品的靶核酸，以提高檢測的靈敏度。
[0057] 根據本發明的一個具體實施例，所述包含底物的顯色溶液包括但不限于：硝基藍 四氮唑（NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸（BCIP)的混合溶液或堅牢紅與萘酚ASMX 的混合溶液。在堿性磷酸酶的催化下，BCIP會被水解產生強反應性的產物，該產物會和NBT 發生反應，形成不溶性的深藍色至藍紫色的NBT-formazan。
[0058] 根據本發明的一個具體實施例，所述生物素標記的靶核酸在進行雜交反應前需要 進行變性，變性的方法可以是本領域技術人員所熟知的。
[0059] 根據本發明的又一方面，本發明還提供了所述方法在檢測K-ras基因突變中的應 用。
[0060] 將本發明的方法用于檢測κ-ras基因突變，在核酸探針與靶核酸雜交的過程中同 步實現了堿性磷酸酶標記鏈霉親和素與生物素的結合過程，從而可以在金屬膜表面直接形 成堿性磷酸酶標記核酸雜交體的偶聯物，不僅省去了傳統縮短了傳統K-ras基因突變檢測 操作的耗時，而且促進了核酸雜交，提高了堿性磷酸酶標記效率，使得金屬膜表面單位面積 上覆蓋的堿性磷酸酶標記核酸雜交體的偶聯物的數量大大增加，再通過顯色反應，根據著 色的深淺以及雜交信號與金屬膜的強烈色差，可以用肉眼快速判斷核酸雜交的結果，在同 等條件下明顯提高了傳統K-ras基因突變的檢測靈敏度與分辨能力。
[0061] 在本發明的方法中，所述的"核酸"術語是總括表示核糖核酸（即RNA)、脫氧核糖 核酸（即DNA)、肽核酸（即PNA)、甲基磷酸酯核酸、S-低聚、cDNA和cRNA，以及任何低聚核 苷酸和多核苷酸等、核酸及核酸類似體的術語，這樣的核酸可以是天然存在的，也可以是人 工合成的。
[0062] 在本發明的方法中，所述的"核酸探針"是指在含有與靶序列互補的堿基序列核酸 中，固定于固相支持物表面的核酸片段，核酸探針具有與所述靶序列至少一部分互補的序 列，由此，可在適宜的條件下與靶序列進行雜交。
[0063] 在本發明的方法中，所述的"靶核酸"是指通過本發明的方法檢測的具有靶序列的 核酸。
[0064] 在本發明的方法中，所述的"靶序列"是指在靶核酸中包含的序列，靶序列用于檢 測靶核酸。
【附圖說明】
[0065] 為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所