到的儀器為 RocherLi曲t切cler480定量PCR儀。轉BTM基因煙草、轉BTW基因煙草、陽性對照煙草、本 氏煙16c和本氏煙的葉片中mGFP5的相對表達量如圖6所示。
[0086] 結果顯示，轉BTM基因煙草葉片中mGFP5的相對表達量為0. 0225 + 0. 0050,轉BTW 基因煙草葉片中mGFP5的相對表達量為0. 0033 + 0. 0020,陽性對照煙草葉片中mGFP5的相 對表達量為0. 0023 + 0. 0020,本氏煙16c葉片中mGFP5的相對表達量為0. 0255 + 0. 0030， 本氏煙葉片中mGFP5的相對表達量為0。結果表明，轉BTM基因煙草葉片中mGFP5的相對 表達量為本氏煙16c的0.8824倍，轉BTW基因煙草葉片中mGFP5的相對表達量為本氏煙 16c的0. 1299倍，轉BTM基因煙草葉片中mGFP5的相對表達量為轉BTW基因煙草的6. 7934 倍。結果表明，將BTW基因進行煙草密碼子的優化后得到的BTM導入本氏煙株系16c中后， mGFP5的表達量明顯高于轉BTW基因煙草葉片中mGFP5的表達量。
[0087] 7、轉BTM基因煙草中mGFP5蛋白量增加
[0088] 實驗重復Η次，每次重復實驗的具體步驟如下：
[0089] 分別剪取將步驟3的轉BTW基因煙草、轉ΒΤΜ基因煙草、陽性對照煙草、本氏煙16c 和本氏煙葉片各Ig，并提取總蛋白，分別得到轉BTW基因煙草葉片總蛋白、轉BTM基因煙草 葉片總蛋白、陽性對照煙草葉片總蛋白、本氏煙16c葉片總蛋白和本氏煙葉片總蛋白。
[0090] 分別W抗鼠血清GFP標簽單克隆抗體巧artMk公司產品，貨號為E022030-01) 為一抗、W辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠 IgGOl+L)抗體（全式金公司產品，貨號為 HS201-01)為二抗，分別對轉BTW基因煙草葉片總蛋白、轉BTM基因煙草葉片總蛋白、陽性 對照煙草葉片總蛋白、本氏煙16c葉片總蛋白和本氏煙葉片總蛋白進行Western blot并 用BCIP/NBT顯色檢測mGFP5的蛋白量（圖7)，并利用掃描成像系統的Imagequant軟件 對條帶的強弱進行分析。ACTIN蛋白為內參，內參的一抗為抗兔血清植物ACTIN多克隆抗 體巧artMk公司產品，貨號為E021080-01)，二抗為辣根過氧化物酶標記的二抗山羊抗兔 IgGOl+L)抗體（全式金公司產品，貨號為服101-01)。
[0091] 結果顯示，平均每微克轉BTW基因煙草葉片中的mGFP5蛋白量為1.426化g，平均 每微克轉BTM基因煙草葉片中的mGFP5蛋白量為13. 7665ng，平均每微克陽性對照煙草葉 片中的mGFP5蛋白量為0. 2734ng，平均每微克本氏煙株系16c葉片中的mGFP5蛋白量為 13. 10(K)ng，平均每微克本氏煙葉片中的mGFP5蛋白量為化g。轉BTM基因煙草葉片中的 mGFP5蛋白量明顯高于轉BTW基因煙草葉片中的mGFP5蛋白量和陽性對照煙草葉片中的 mGFP5蛋白量：轉BTM基因煙草葉片中的mGFP5蛋白量為轉BTW基因煙草的9. 6519倍；轉 BTM基因煙草葉片中的mGFP5蛋白量為陽性對照煙草的50. 3530倍；轉BTM基因煙草葉片 中的mGFP5蛋白量僅為本氏煙株系16c的1.0509倍；轉BTW基因煙草葉片中的mGFP5蛋白 量為本氏煙株系16c的0. 1089倍。
[0092] 結果表明，將BTW進行煙草密碼子優化后得到的BTM轉入本氏煙株系16c中后，轉 BTM基因煙草中mGFP5在RNA水平上和蛋白質水平上的表達量均高于將沒有進行煙草密碼 子優化的BTW轉入本氏煙株系16c后的轉BTW基因煙草中mGFP5的表達量。本發明的鑒別 或輔助鑒別外源基因密碼子優化的方法可用來鑒別外源基因密碼子是否優化。
【主權項】
1. 鑒別或輔助鑒別外源蛋白基因是否為受體生物材料密碼子優化基因的方法，包括如 下Sl)-S3)的步驟： 51) 將沒有進行受體生物材料密碼子優化的目的外源蛋白基因作為對照外源基因轉入 所述受體生物材料中得到對照轉基因生物材料；所述受體生物材料表達報告基因，所述報 告基因相對于所述受體生物材料是外源基因； 52) 將編碼所述目的外源蛋白的待測外源基因轉入所述受體生物材料得到待測外源基 因轉基因生物材料； 53) 比較所述對照轉基因生物材料和所述待測外源基因轉基因生物材料中所述報告基 因的表達量，確定所述待測外源基因是否為所述受體生物材料密碼子優化基因：如果所述 待測外源基因轉基因生物材料中所述報告基因的表達量高于所述對照轉基因生物材料中 所述報告基因的表達量，所述待測外源基因為所述受體生物材料密碼子優化基因或候選為 所述受體生物材料密碼子優化基因；如果所述待測外源基因轉基因生物材料中所述報告基 因的表達量等于或低于所述對照轉基因生物材料中所述報告基因的表達量，所述待測外源 基因不為所述受體生物材料密碼子優化基因或候選不為所述受體生物材料密碼子優化基 因； 所述生物材料為植物、動物或微生物。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述受體生物材料為煙草。3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述煙草為本氏煙。4. 根據權利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述報告基因為mGFP5基因；所 述mGFP5基因編碼下述A1)或A2)的蛋白質： A1)氨基酸序列為序列表中SEQ ID No. 1的蛋白質； A2)在A1)的蛋白質的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基 酸殘基得到的具有mGFP5蛋白功能的由A1)衍生的蛋白質。5. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述mGFP5基因的核苷酸序列為SEQ ID No. 5〇6. 根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述目的外源蛋白為如下B1) 或B2)的蛋白質： B1)氨基酸序列為序列表中SEQ ID No. 2的蛋白質； B2)在B1)的蛋白質的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基 酸殘基得到的具有相同功能的由B1)衍生的蛋白質。7. 根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述對照外源基因的核苷酸序 列為序列表中SEQ ID No. 4。8. 根據權利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述受體生物材料為轉mGFP5 基因本氏煙株系16c。9. 根據權利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：所述對照外源基因轉入所述受 體生物材料和所述待測外源基因轉入所述受體生物材料均包括采用農桿菌注射葉片的方 法進行轉化。10. 根據權利要求9所述的方法，其特征在于：所述方法中，在所述轉化后7天-21天 比較所述對照轉基因生物材料和所述待測外源基因轉基因生物材料中所述報告基因的表 達量。
【專利摘要】本發明公開了鑒別或輔助鑒別外源基因密碼子優化的方法。本發明所提供的鑒別或輔助鑒別外源蛋白基因是否為受體生物材料密碼子優化基因的方法，包括：S1)將沒有進行受體生物材料密碼子優化的外源基因和待測外源基因分別轉入受體生物材料中，分別得到對照轉基因生物材料和待測外源基因轉基因生物材料；S2)如果待測外源基因轉基因生物材料中報告基因的表達量高于對照轉基因生物材料中報告基因的表達量，待測外源基因為或候選為所述受體生物材料密碼子優化基因；如果待測外源基因轉基因生物材料中報告基因的表達量等于或低于對照轉基因生物材料中報告基因的表達量，待測外源基因不為或候選不為受體生物材料密碼子優化基因。
【IPC分類】G01N33/68, C12Q1/68
【公開號】CN105671140
【申請號】
【發明人】朱禎, 周云, 戴艷
【申請人】中國科學院遺傳與發育生物學研究所
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2014年11月17日