] 3、轉基因煙草的制備
[006引 將步驟2的重組菌EHA105-PCAMBIABTW在YEB平板師B平板中，卡郝霉 素和利福平的終濃度均為50mg/L)上劃線并于28°C下避光培養36h，取少許重組菌 EHA105-PCAMBIABTW接種于20ml Y邸液體培養基（該Y邸液體培養基中，卡郝霉素和利福 平的終濃度均為50mg/L)中并于28°C下避光培養過夜，次日取1. 5ml培養液接種于50ml Y邸培養基中（該Y邸液體培養基中，卡郝霉素和利福平的終濃度均為50mg/L，2-嗎晰己 礙酸（ME巧的終濃度為lOmM/L，己醜了香麗（As)的終濃度為20 μ M/L)，劇烈振蕩培養3~ 5h。當培養液的孤e。。值為1. 0時，將菌液于室溫、400化pm下離必10分鐘，收集菌體，用重 懸緩沖液（重懸緩沖液由水和溶質組成，各溶質及其濃度分別為lOmM MgClzUOmM 2-嗎晰 己礙酸（ME巧和100 μ Μ As)重懸菌體，并調整ODe。。值為1. 0,得到重懸菌液，將重懸菌液在 避光條件下于室溫靜置比，得到EHA105-PCAMBIABTW侵染液。
[0064] 按照上述方法，將步驟2的重組菌EHA105-PCAMBIABTW替換為步驟2的重組菌 EHA105-PCAMBIABTM，其他步驟均不變，得到 EHA105-PCAMBIABTM 侵染液。
[0065] 按照上述方法，將步驟2的重組菌EHA105-PCAMBIABTW替換為步驟2的重組菌 EHA105-pCAMBIAmGFP5,其他步驟均不變，得到 EHA105-pCAMBIAmGFP5 侵染液。在 4-6 葉 齡的轉mGFP5基因的本氏煙（Nicotiana benthamiana)株系16c的葉片主葉脈兩側分別 扎一個小孔，用無針頭的醫用注射器吸取5ml EHA105-PCAMBIABTW侵染液，而后將含有 EHA105-PCAMBIABTW侵染液的醫用注射器從葉片背面對準扎孔，用拇指按壓注射器反板將 侵染液從葉片下表皮注射到煙草葉片中，將得到的注射后的煙草（將注射當天記為轉BTW 基因0天）繼續在27°C、光/暗周期為16/8小時的條件下繼續培養21天，得到轉BTW基因 煙草。
[0066] 按照上述方法，將EHA105-PCAMBIABTW侵染液替換為EHA105-PCAMBIABTM侵染液， 其他步驟均不變，得到轉BTM基因煙草（轉BTM基因21天煙草）。
[0067] 按照上述方法：將EHA105-PCAMBIABTW侵染液替換為EHA105-PCAMBIA mGFP5侵染 液，其他步驟均不變，得到陽性對照煙草（即轉mGFP5基因21天煙草）。
[006引在27°C、光/暗周期為16/8小時的條件下培養4-6葉齡的轉mGFP5基因的本氏煙 (Nicotiana benthamiana)株系 16c 21 天，得到本氏煙 16c。
[0069] 在27 °C、光/暗周期為16/8小時的條件下培養4-6葉齡的本氏煙 (N. benthamiana) 21 天，得到本氏煙。
[0070] 4、轉BTM基因煙草中mGFP5的表達穩定性
[0071] 實驗重復Η次，每次重復實驗的具體步驟如下：
[007引將步驟3的轉BTW基因煙草、轉ΒΤΜ基因煙草、陽性對照煙草、本氏煙16c和本氏 煙分別在紫外線下照射（圖3)，當葉片中無 mGFP5蛋白的表達時，葉片上出現葉綠素激發出 的紅色英光，當葉片中含有mGFP5蛋白時，mGFP5蛋白在紫外線照射下發出綠色英光。
[007引結果表明注射EHA105-PCAMBIABTW的煙草培養7-21天得到的轉BTW基因煙草新 生葉片沿葉脈逐漸出現紅綠英光網狀交錯分布，送與陽性對照（即注射EHA105-PCAMBIA mGFP5的煙草）培養7-21天得到的轉mGFP5基因煙草出現一致的表型；而注射 EHA105-PCAMBIABTM的煙草培養7-21天得到的轉BTM基因煙草葉片只發出綠色英光，送與 未進行注射的本氏煙16c的葉片發出綠色英光的表型相同。
[0074] 當被注射葉片局部細胞中mGFP5基因發生沉默時，葉片上出現葉綠素激發出紅色 英光形成的斑點，稱此失活現象為局部沉默。當沉默信號傳遞到新生葉片時，新生葉片上出 現沿葉脈逐漸擴散開的紅色，稱此失活現象為系統沉默。通過農桿菌注射法進行mGFP5基 因沉默誘導實驗中，W出現系統沉默現象為判斷mGFP5基因被誘導失活的標準進行統計。
[0075] 單次實驗mGFP5沉默速率=(單次誘導實驗mGFP5系統沉默株數/單次誘導實 驗注射mGFP5基因的煙草總株數）X 100% ;多次實驗mGFP5沉默總速率=(多次誘導實驗 mGFP5系統沉默總株數/多次誘導實驗注射mGFP5基因的煙草總株數）X 100 %。轉BTW基 因煙草、轉BTM基因煙草、陽性對照煙草、本氏煙16c中mGFP5的沉默速率如圖4和表1所 /J、- 〇
[0076]
[0077] 結果顯示，轉BTM基因煙草和本氏煙16c中，mGFP5均有很高的表達量，mGFP5的表 達均未被抑制；轉BTW基因煙草和陽性對照煙草中，mGFP5的表達量均很低，mGFP5的表達 均受到抑制；本氏煙中無 mGFP5的表達。表明BTM基因的核巧酸序列是煙草優化序列。
[007引 5、轉BTM基因煙草中mGFP5的表達增加（半定量RT-PCR檢測）
[0079] 實驗重復Η次，每次重復實驗的具體步驟如下：
[0080] 分別剪取轉ΒΤΜ基因煙草、轉BTW基因煙草、陽性對照煙草、本氏煙16c和本氏煙 的葉片，并提取RNA，分別得到轉BTM基因煙草葉片總RNA、轉BTW基因煙草葉片總RNA、陽性 對照煙草葉片總RNA、本氏煙16c葉片總RNA和本氏煙葉片總RNA。
[008。 分別W轉BTM基因煙草葉片總RNA、轉BTW基因煙草葉片總RNA、陽性對照煙草葉 片總RNA、本氏煙16c葉片總RNA和本氏煙葉片總RNA為模板進行半定量RT-PCR，檢測mGFP5 的表達。mGFP5 引物為 RT-mGFP5-F:5' -ATGAAGACTAATCTTTTTCTCTTTCTC-3'，RT-mGFP5- R:5' -TTAAAGCTCATCATGTTTGTATAGT-3'。內參為 ACTIN基因，內參基因的引物為 RT-ACTIN -F:5' -TAACCCAAAGGCTAATCGTGA-3' ，RT-ACTIN-R:5' -AAAGGACCTCAGGACAACGGA-3'。轉 BTM基因煙草、轉BTW基因煙草、陽性對照煙草、本氏煙16c和本氏煙的葉片中mGFP5的表達 如圖5所示。
[0082] 結果表明，將BTW基因進行煙草密碼子的優化后得到的BTM導入本氏煙株系16c 中后，mGFP5的表達量增加。
[008引 6、轉BTM基因煙草中mGFP5的表達增加（實時定量RT-PCR檢測）
[0084] 實驗重復Η次，每次重復實驗的具體步驟如下：
[00財分別W步驟5的轉ΒΤΜ基因煙草葉片總RNA、轉BTW基因煙草葉片總RNA、陽性對 照煙草葉片總RNA、本氏煙16c葉片總RNA和本氏煙葉片總RNA模板進行實時定量RT-PCR 檢測mGFP5的表達量，操作步驟按照試劑盒中的說明書進行，mGFP5引物為qRT-mGFP5-F:5 '-GACGACGGGAACTACAAGAC-3'，qRT-mGFP5-R:5' -CTTGTGGCCGAGGATGTTTC-3'。實時定 量RT-PCR的內參為18S基因，內參基因的引物為qRT-ACTIN-F:5' -CGGAAACATAGTGCTCAGT GG-3'，qRT-ACTIN-R:5' -TGGAAGGTGCTGAGGGAAG3'。實時定量 RT-PCR 中用