反相高 效液相色譜法(RP-HPLC)方案確保使用結合反應混合物成分的C-18固定相。然后洗脫運些 成分并且使用由對于所存在的兩個可水解基團具有最佳穩定性的約4至約6的pH的含水和 有機流動相組成的梯度分離。在一個實施方案中，該梯度包含至少兩相。在另一個實施方案 中，該梯度包含1、2、3、4或5相。在另一個實施方案中，該梯度包含2或3相。在另一個實施方 案中，該梯度包含2相。每個相可W是有機的、水性的或其組合。該梯度經過一定時間從水性 特性移動至增加有機特性。本領域中已知的水相可W用于本發明中。可W用于本發明中的 水相的實例包括，但不限于乙酸鋼(化OAc )、班巧酸鋼、N-甲基嗎嘟、巧樣酸鋼和2- (N-嗎嘟 代）乙橫酸。本領域中已知的有機相可W用于本發明中。可W用于本發明中的有機相的實例 包括，但不限于乙臘、異丙醇、丙酬、二甲氧基乙燒和N-甲基-2-化咯燒酬。正如所述的，所述 相的任意一個可W包含水性和有機特性的混合物，例如化OAc和乙臘的混合物。例如，由pH 5的5 5 % 20mM乙酸鋼和45 %乙臘組成的流動相是可W用于本發明的RP-HPLC純化的水/有機 流動相。作為另一個實例，可用于本發明的梯度的實例是包含第一個流動相，接著第二個流 動相的梯度，所述第一個流動相由抑5的55%20mM乙酸鋼和45%乙臘組成，所述第二個流動 相由乙臘組成。
[0243] 在包含RP-HPLC方案的純化式VI或式X的加利車霉素衍生物的方法的一個實施方 案中，式VI或式X的加利車霉素衍生物包含選自如下的Z:
[0246]在包含RP-HPLC方案的純化式VI或式X的加利車霉素衍生物的方法的另一個實施 方案中，式VI或式X的加利車霉素衍生物包含選自如下的Z:
[0247]
[024引在包含RP-HPLC方案的純化式VI或式X的加利車霉素衍生物的方法的另一個實施 方案中，式VI或式X的加利車霉素衍生物包含Z，其為：
[0249]
[0250] 在反相純化后，可W如本領域中所述，例如通過濃縮和分配分離得到的純化的加 利車霉素衍生物;或可W通過使用固相萃取(SPE)方案分離純化的加利車霉素衍生物。將固 相萃取方案鑒定為用于從RP-冊LC級分中進行產物分離的二氯甲燒分配的有效替代者。在 固相萃取中，產物通過載入弱溶劑而與反相樹脂結合，洗涂W除去緩沖劑鹽(從RP-HPLC純 化中剩余），然后用有機溶劑例如乙臘洗脫，得到不含或基本上不含鹽的濃縮產物溶液。
[0251] 因此，本申請中所述用于合成式VI或式X的加利車霉素衍生物的本發明的任意方 法的另外的實施方案還包括通過進行反相純化方案純化所合成的式VI或式X的加利車霉素 衍生物。在本發明的另外的實施方案中，隨后使得自反相純化方案的式VI或式X的加利車霉 素衍生物經受固相萃取方案。
[0況]發明詳述
[0253] 本發明用于合成式V的連接體中間體的方法描述在如下反應方案I-IV中。在方案 I-IV中的化學式中，護、護、3"、護、0、4'、胖、￥、2哺2如上文所定義。
[0254] 方案 I
[ο 巧5]
[0256]就方案I而言，使(4-烷氧基苯基）甲硫醇！，其中RU如本申請中所述，與千里光酸甲 醋蘭反應，得到簇酸中間體化合物為。然后向中間體為中加入適合的有機溶劑，例如四氨巧喃 和如本申請中所述的式IX的挫系活化劑，例如幾基二咪挫(CDI)。得到中間體在該反應 之后使^與阱結合。阱源可W是如W0 2008/147765中所述的無水阱;然而，優選阱源是含 水阱，例如一水合阱。該反應得到中間體化合物I。化合物對甲氧基芐基硫酸酷阱(其為其中 RU是甲基且RW各自是氨的中間體化合物蘭)描述在W0 2008/147765中，通過引用將該文獻 的全部內容并入本申請。
[0巧7] 方案II 「0巧81
[0259] 在方案II中，使中間體I與化合物^其中Zi如本申請中所述），例如4-(4-酷基-苯 氧基)下酸，在惰性(換句話說，非反應性)溶劑中、任選地使用酸性催化劑反應，得到中間體 盡。可W用于該反應中的惰性溶劑的實例包括，但不限于醇類(例如甲醇）、酸類和醋類，例如 乙酸乙醋。本領域普通技術人員可W確定用于該反應的適合惰性溶劑。酸性催化劑也可W 由本領域普通技術人員確定;酸性催化劑的實例包括，但不限于乙酸。
[0260] 方案 III
[0261]
[0262]在方案III中，使中間體化合物卽兌保護，形成化合物互。在該反應中，向化合物盡中 加入甲氧基苯和任選在加熱條件下的強酸，例如在加熱條件下的Ξ氣乙酸，得到中間體化 合物心可W使用其它強酸，例如硫酸替代Ξ氣乙酸。
[026；3]方案 IV
[0264]
[0265] 在方案IV中，將中間體巧t化成化合物呈，其為本申請中所述的式V的連接體中間體 的實施方案。可W如本領域中所述，例如美國專利8,273,862(通過引用將該文獻的全部內 容并入本申請）中所述，將中間體互轉化成連接體中間體，例如呈。然而，優選地，如方案IV中 所述，使中間體互與叔胺堿例如Ξ乙胺(TEA)和Ξ甲基乙酷氯(P i vCl)在惰性溶劑例如四氨 巧喃的存在下反應。隨后，引入式ZH的化合物，例如N-徑基班巧酷亞胺，得到連接體中間體 8。
[0266] 在合成式V的連接體中間體(例如化合物苗后，然后使用來自反應方案IV的連接體 中間體和本領域已知的方法，例如美國專利No.8,273,862中所述的方法，合成式VI的加利 車霉素衍生物。例如，可W首先使式V的連接體中間體與堿金屬碳酸鹽(包括，但不限于碳酸 鋼)反應，通過在溫和回流下加熱，形成在乙臘中的連接體中間體的鋼鹽。再使所述連接體 中間體的鋼鹽與甲基Ξ硫化物C曲-S-S-S-J在約-15°C下在惰性有機溶劑(優選乙臘）中反 應，得到式VI的加利車霉素衍生物。優選該反應在乙臘中在約〇°C下進行。任選地，有機堿可 W替代所述堿金屬碳酸鹽，其優選包括在乙臘中在約〇°C下的Ξ乙胺。
[0267] 或者，可W通過使用本申請中所述包含碳二亞胺的方法，通過與式C曲-S-S-S-J的 分子反應，由式V的連接體中間體合成式VI的加利車霉素衍生物。
[0%引還可W使用本領域中所述的技術，例如美國專利No. 5，053，394和美國專利No. 5， 770，701中所述的方法，使式VI的加利車霉素衍生物與生物大分子例如單克隆抗體綴合，形 成抗體-藥物綴合物，通過引用將上述兩篇文獻的全部內容并入本申請。
[0269]提供下列實施例W舉例說明本發明的一些實施方案，但不應將其解釋為限制本發 明的范圍。本領域技術人員容易理解，可W使用下列實施例的特定條件的已知變化形式。 腳0] 實施例1 腳1] 3-(4-甲氧基節硫基)-3-甲基下酸
[0272]
[0273] 在20-25°C，將85g的1和255mL的2-甲基四氨巧喃加到反應器中。向反應器中加入 125.05g的2，通過使氮氣氣流經過攬拌的溶液起泡15-20分鐘給反應器脫氣。向反應器中加 入氣化四下基錠(1M的THF溶液，0.05當量，36. ImL)，將該反應在20-30°C維持2小時。
[0274] 加入二水合氯化巧(0.35當量，28.060g)在255mL水中的溶液。攬拌20分鐘后，除去 下面的水相。向上面的有機相中加入252mL甲醇和3當量的化0H在252mL水中的溶液。將該反 應混合物攬拌直到觀察到中間體醋(3)完全耗盡為止。
[0275] 將該反應冷卻至15°C，加入2-甲基四氨巧喃（252mL)，然后加入252mL水。緩慢地加 入濃HCK3.1當量，184mL)，維持該反應在15-30°C的范圍內。除去下面的水相。用1MHC1 (252mL)洗涂有機層，加入庚燒（1940mL)。蒸饋該溶液W便除去2-甲基四氨巧喃。將得到的 渺漿攬拌1小時，然后過濾，干燥。濃縮母液，得到第二批固體。
[0276] 標題化合物酸4的總收率為 162.59g(88.5%)</H NMR(CDCl3):S(ppm)1.5(s，6H), 2.3(s，2H)，3.6(m，5H)，6.7(d，2H)，7.6(d，2H)。 腳7] 實施例2
[0別]3-(4-甲氧基節硫基)-3-甲基下酷阱
[0279]
[0280] 將酸4(81.67g，321mmol)加到375mL THF(四氨巧喃）中。分3部分裝入CDI (1.05eq.，54.7g)，將該反應在2(TC攬拌2.5小時。在單獨的反應器中，制備一合阱（2.巧 量，40.19g)在200mL THF中的溶液。將中間體5的溶液加到水合阱溶液中，保持內部溫度在 20°C。添加完成后，將該反應攬拌18小時，然后濃縮至lOOmL。加入850mL化OAc(乙酸乙醋）， 將該溶液用500mL水洗涂3次、然后用200mL鹽水洗涂。用NasSCk干燥有機層，通過娃藻±過 濾，用旋轉蒸發器濃縮，得到白色渺漿。加入300mL庚燒，用旋轉蒸發器除去200mL。再加入 200mL庚燒，汽提得到濃稠白色渺漿。過濾該混合物，用庚燒洗涂，干燥。由4得到83.15g (96.5%)標題化合物6。]?5 269(]\1+1)，121，120。
[0巧1] 實施例3
[0巧。4-(4-(1-(2-(3-(4-甲氧基節硫基)-3-甲基下酷基)亞阱基)-乙基)苯氧基)下酸
[0283]
[0284] 將68g的6和57.43g的巧頓j680mL甲醇(MeOH)中。加入68mL乙酸(冊Ac),將該混合 物在45°C加熱3小時，冷卻至20°C，并保持16小時。過濾該渺漿，用甲醇洗涂，干燥。得到 112.60g標題化合物8，為E和Z異構體的混合物。1h NMR(DMS0-d6): δ (ppm) 1.5 (m，6H)，2.0 (m， 2H),2.2(m,3H),2.4(m,2H),2.7(s,l.lH),3.0(s,0.9H),3.7(m,3H),3.8(m,2H),4.0(m, 2H),6.8(m 2H),6.9(m,2H),7.3(m,2H),7.7(m,2H),10.2&10.3(s,lH),12.1(s,lH)〇LC-MS m/z473[M+扣+。
[02化]實施例4 卿]4-(4-(1-(2-(3-琉基-3-甲基下酷基)亞阱基）乙基)-苯氧基)下酸
[0287]
[0288] 在20-25°C，向反應器中裝入290.5g(614.7mmol)的8和1162mL茵香酸。加入Ξ氣乙 酸（1162mL)，歷時2分鐘，將該反應加熱至65-70°C，持續2.5小時。將該反應冷卻至40°C。真 空蒸饋TFA(S氣乙酸），并代之W2-甲基四氨巧喃（2905mL)。持續蒸饋直到觀察到濃稠渺漿 (該渺漿的最終體積約為化）。將該渺漿冷卻至15°C，過濾。將粗產物在甲醇（1836.6mL)中再 制成渺漿，加熱至55°C，然后冷卻至20°C過夜。過濾該渺漿，用甲醇洗涂，干燥。由8得到 171.80g(93.54% )標題化合物9，為E和Z異構體的混合物。1h NMR(DMS0-d6): S(ppm) 1.5(m, 6H),2.0(m,2H),2.2(m,3H),2.4(m,2H),2.7(s,l.lH),3.0(s,0.9H),3.3(s lH),4.0(m, 2H),6.9(m,2H),7.7(m,2H),10.2&10.3(s,IH),12.1(s,IH)〇
[0289] 實施例5
[0290] 4-(4-(1-(2-(3-琉基-3-甲基下酷基)-亞阱基）乙基)苯氧基)-下酸2,5-二氧代化 咯燒-1-基醋
[0291]
[0292 ] 反應器設置:2-L夾套反應器，Tr探頭，氮氣入口。
[0巧3] 將60g(17〇.3mmol)加到2400mL THF中，冷卻至1(TC。加入Ξ乙胺（2當量，34.46邑）， 然后緩慢地加入Ξ甲基乙酷氯（1.1當量，22.81g)，歷時10分鐘，維持溫度在10-20°C的范圍 內。將該混合物在10-20°C攬拌30分鐘。向反應器中加入N-徑基班巧酷亞胺（1.1當量， 21.99邑），在20-25°(：攬拌30分鐘。
[0294] 過濾渺漿W除去TEA-HC1鹽，真空濃縮至約800血體積。緩慢地加入己燒(780mL)W 使產物結晶。將該渺漿攬拌1.5小時，然后過濾，用庚燒洗涂，干燥。由9得到70.4g(92%收 率)標題化合物連接體中間體10。
[02巧]將144g的10添加至2100mL THF中，使粗產物重結晶，并加熱至60°C。通過娃藻±過 濾該混合物，緩慢地加入2100mL己燒，冷卻至20°C，歷時1.5小時。過濾該渺漿，用冷THF/己 燒（1:1)洗涂，然后用己燒洗涂，干燥。由9得到126g(87.5%回收率)標題化合物連接體中間 體 10。4 NMR(DMS0-d6):S(ppm)1.5(m，6H)，2.1(m，2H)，2.2(m，3H)，2.7(s，l.lH)，2.9(M，5H) 3.0(s，1.9H)，3.3(s lH)，4.3(m，2H)，7.0(m，2H)，7.5(m，2H)，10.2&10.3(s，lH)。
[0巧引實施例6
[0 巧 7]下酸，3-[[(沈)-2-[ (1R，4Z，8S)-8-[ [2-0-[4-(乙酷基乙基氨基)-2,4-雙脫氧-3- 0-甲基-aA-蘇型-化喃戊糖基]-4,6-雙脫氧-4-[[[2,6-雙脫氧-4-S-[4-[(6-脫氧-3-0-甲 基-a-k化喃甘露糖基)氧基]-3-艦-5，6-二甲氧基-2-甲基苯甲酯基]-4-硫代-g-D-化喃核 己糖基]氧基]氨基]-g-D-化喃葡萄糖基]氧基]-1-徑基-10-[(甲氧基幾基)氨基]-11-氧代 雙環[7.3.1]十Ξ-4,9-二締-2,6-二烘-13-亞基]乙基]二硫代]-3-甲基-，2-[(化)-1-[4- [4-[(2,5-二氧代-1-化咯烷基)氧基]-4-氧代下氧基]-苯基]亞乙基]酷阱的制備 [0巧引在室溫，向N-乙酷基-加利車霉素(50mg，0.035mmo 1)在乙臘（1.0血）中的溶液中一 次加入連接體中間體下酸，3-琉基-3-甲基-，2-[化)-1-[4-[4-[(2,5-二氧代-1-化咯燒 基)-氧基]-4-氧代下氧基]苯基]亞乙基]酷阱(31.9111旨，0.07111111〇1)，然后加入1，（3-二甲氨 基丙基）-3-乙基碳二亞胺（6.7111邑，0.035111111〇1)，然后加入；乙胺（5.3111邑，7.3化， 0.053mmol)。在室溫，將該反應混合物(渺漿)攬拌1小時，此時，它變成黃色溶液。根據相對 于衍生物標準品的面積百分比確定了收率(60%收率）。
[0299] 質譜；
[0300] (M+Na) = 1801.4578
[0301] 1h NMR:
[0302] 1h NMR(CDClsW %CD30D，400MHz): 8.69(s，IH，18C-NH-N-)，7.75(d J = 8.7Hz， 2H,22),6.95(d J = 8.7Hz,2H,23),6.38(br t J = 7Hz , IH, 14), 6.23(d J= 1.5Hz , 1H,8), 5.90(d J = 9.5Hz, IH, 4),5.80(ddJ = 9.5,1.5Hz，lH, 5),5.72(dJ=l.甜z，lH, ID) ,5.63 (br d，J = 2.2Hz，lH，lE)，5.03(dd，J=11.5，1.6Hz，lH，lB)，4.70(m，lH，W)，4.61(d，J = 7.8Hz，lH，lA)，4.6(m，lH，3E)，4.49(m，lH，2D)，4.31(m，lH，3B)，4.20(m，lH，5D)，4.10(m， 2H，25)，4.07(m，lH，5B)，4.03(m，lH，3A)，3.91(m，lH，15)，3