1，4-二嗯燒溶液14化L，在室溫靜置5天。濾取固 體物質，用丙酬清洗后，在減壓下使其干燥，得到白色固體的化合物A的鹽酸鹽112mg。
[0311] 1h-NMR(DMS0-D6)S:8.73-8.65(lH，m)，8.17( 1H，s)，8.15-8.10(lH，m) ,7.87-7.84 (4H，m)，7.86-7.83(lH，m)，7.09-6.88(lH，m)，6.75-6.58(lH，m)，4.99(lH，q，J=7.3Hz)， 3.93- 3.86(2H，m)，3.49-3.42(2H，m)，3.28-3.22(2H，m)，3.00(3H，s)，2.75-2.72(6H，m)， 2.48(2H，t J = 6.細 z)，1.73-1.59(4H，m)，1.37-1.28(3H，m)，0.92(3H，tJ = 7.3Hz).
[0312] 實施例6
[0313] 在70°C對化合物Al.OOg的乙醇20mL懸浮液進行加熱攬拌，通過目視確認溶解。向 該溶解液中加入憐酸23祉L，緩緩冷卻至室溫，靜置3小時30分鐘。濾取固體物質，用乙醇清 洗2次后，在減壓下使其干燥，得到淡黃色固體的化合物A的憐酸鹽0.75g。
[0314] iH-NMR(DMS0-D6)S:9.84(lH，s)，8.02-7.95(3H，m)，7.69(2H，d，J = 9.2Hz)，7.22- 7.13(lH，m),6.89-6.77(lH，m),6.71-6.55(2H，m),5.02(lH，q，J=6.細z),3.74-3.62(2H， m)，3.51-3.35(2H，m)，3.49-3.20(2H，m)，2.99(3H，s)，2.61(6H，s)，2.45(2H，t，J=6.3Hz)， 1.75-1.57(4H，m)，1.37-1.27(3H，m)，0.92(3H，t，J = 7.細 z).
[0315] 實施例7
[0316] 在70°C對化合物Al.OOg的乙醇20mL懸浮液進行加熱攬拌，通過目視確認溶解。向 該溶解液中加入硫酸21化L，緩緩冷卻至室溫，靜置3小時。濾取固體物質，用乙醇清洗2次 后，在減壓下使其干燥，得到白色固體的化合物A的硫酸鹽1.10g。
[0；317] iH-NMR(DMS0-D6)S:9.67(lH，s)，8.36-8.27(lH，m)，8.11-8.07(lH，m)，8.04-7.98 (lH，m)，7.88-7.80(4H，m),6.95-6.85(lH，m)，6.66-6.50(lH，m)，4.99(lH，q，J=7.0Hz)， 3.96-3.88(2H，m)，3.47-3.39(2H，m)，3.30-3.22(2H，m)，2.99(3H，s)，2.80(6H，s)，2.48 (2H，t，J = 6.細z)，1.74-1.56(4H，m)，1.37-1.27(3H，m) ,0.91 (3H，t，J = 7.細z).
[0318] 實施例8
[0319] 在室溫下向化合物A200mg的水5mL懸浮液中加入苯橫酸一水合物132mg，在50°C加 熱攬拌，通過目視確認溶解。將反應混合物冷卻至室溫后，在減壓下蒸饋除去溶劑，得到油 狀的化合物A的苯橫酸鹽。
[0320] 實施例9
[0321 ]將化合物A150mg的丙酬4.5mL懸浮液加熱回流，通過目視確認溶解。向該溶解液中 加入氨漠酸64化，緩緩冷卻至室溫。濾取固體物質，用丙酬清洗后，在減壓下使其干燥，得到 淡黃色固體的化合物A的氨漠酸鹽98mg。
[0322] 接著，利用W下的試驗例對本發明化合物的有用性進行說明。
[0323] 試驗例1FLT3酶抑制試驗
[0324] 在化T3酶抑制試驗中，使用了利用桿狀病毒表達系統產生的谷脫甘膚S-轉移酶 (GST)融合人化T3蛋白質（細胞內區域564-993aa) (Carna Biosciences公司）。
[0325] 將包含化T3蛋白質和規定濃度的試驗化合物的化L反應液（1.2yg FLT3、100mM 肥陽5、1011111旨(：12、251111化(：1、0.01%854、1111101'1'、抑7.5)在25°(：下靜置15分鐘。然后，分 別添加基質膚 Biotin-AAA-AE 邸 EYFELVAKKK(Toray 公司）：3μLΧ 終濃度 0.2 扣 M)、ATP(Sigma- A1化ich公司）3化(終濃度50μΜ)，振蕩2分鐘后，進一步在25°C下靜置30分鐘而進行酶反應。
[0326] 之后，添加包含Str邱tavidin-Xlent(Cisbio公司）和Mab PT66-K(Cisbio公司）的 酶反應停止液（5yg/mL Strep化vidin、0.19yg/mL PT66-K、30mM 肥陽S(pH7.0)、150mM KF、 75mM EDTA、0.15%BSA、0.075%Tween20)30μL，停止酶反應，同時在室溫下靜置l小時，由此 進行抗原抗體反應。之后，使用化vision(Perkin Elmer公司）測定615皿、665皿的時間分解 巧光（time decomposition fluorescence),測定基質膚的憐酸化。
[0327] 將結果示于表7中。
[0328] 試驗例2白血病細胞增殖抑制試驗
[03巧]使用白血病細胞株MV4-11(ATCC Number:C化-9591)及M0LM-13(DSMZ Number: A(X554)，進行白血病細胞增殖抑制試驗。
[0330] 白血病細胞增殖抑制試驗按照W下記載的方法來進行。
[0331] 為了測定化合物所產生的增殖抑制，使用利用巧光素-巧光素酶反應而能夠定量 ATP濃度的CellTitet-Glo(Promega公司）試劑，基于總細胞ATP濃度而對總細胞數進行定量 化。將M0LM-13或MV4-11細胞加入到加有青霉素（lOOunits/mL)/鏈霉素（100yg/mL)、10% FBS的RPMI培養基中，調整至達到2 X 105個/mL，在96孔板(Corning公司）中對每個孔各播種 50μLΧ?0,000個)細胞。
[0332] 在上述細胞中加入化合物的階段稀釋液或0.1 % DMS0 (溶劑對照）5化L后，將上述 細胞在標準的細胞增殖條件(37°C，5%C02)下培養增殖72小時。為了測定總細胞增殖，按照 CellTitet-Glo的使用說明書，在各孔中加入等體積的CellTitet-Glo反應液，然后對發光 計數(1皿inescence count)(相對光單位，RLU)進行定量。
[03削將培養72小時后的DMS0溶劑對照所顯示的RLU信號定義為0%抑制，與增殖抑制相 關的GIso值相當于造成該DMS0溶劑對照中的總細胞增殖的50 %抑制的化合物液濃度。各數 據點通過二個重復樣品而獲得。GI50值使用XLf it軟件，通過基于Sigmoid用量反應式 (sigmoid dose-reaction equation)的非線性回歸擬合(Fit Model(205))來計算。
[0334] 將結果示于表7中。
[0335] [表 7]
[0336]
[0337] 本發明的化合物A的鹽顯示出了優異的化Τ3酶抑制活性及白血病細胞增殖抑制活 性。
[0338] 試驗例3溶解性試驗
[0339] 作為試驗化合物，選擇實施例1及3的化合物。
[0340] 作為比較化合物，選擇化合物Α。
[0%1]向水中添加試驗化合物或比較化合物后，在室溫攬拌24小時。使用膜濾器(0.2皿） 濾除不溶物。將濾液用HPLC進行分析，求得溶解度。
[0342]將結果示于表8中。
[0；343][表 8]
[0344]
[0345] 本發明的化合物A的鹽顯示出優異的溶解性。
[0346] 試驗例4保存穩定性試驗（1)
[0347] 作為試驗物質，選擇實施例1及3的結晶。
[0%引將試驗物質200mg加入到開放狀態的玻璃瓶中，在保存條件1(25°C、相對濕度 75%)或保存條件2(40°C、相對濕度75%)的條件下保存2周。在試驗開始前及試驗結束后測 定試驗物質的純度及水分含量。
[0349]將試驗開始前及試驗結束后的試驗物質的純度及水分含量示于表9中。
[0；350][表 9]
[0351]
[0352] 本發明的化合物A的鹽顯示出了優異的保存穩定性。
[0353] 實施例1及3中得到的結晶在2周的保存后純度及水分含量的變化也小，保存穩定 性優異。
[0354] 試驗例4保存穩定性試驗(2)
[0355] 作為試驗物質，選擇實施例1的結晶。
[0356] 將試驗物質200mg加入2層的塑料袋中，將開口部捆扎，在保存條件1(25°C、相對濕 度75%)或保存條件2(40°C、相對濕度75%)的條件下保存4周。在試驗開始前及試驗結束后 測定試驗物質的純度及水分含量。
[0357] 將試驗開始前及試驗結束后的試驗物質的純度及水分含量示于表10中。
[0；35 引[表 10]
[0359]
[0360] 本發明的化合物A的鹽顯示了優異的保存穩定性。
[0361] 產業上的可利用性
[0362] 本發明的化合物A的鹽或其結晶具有優異的化T3抑制活性、且保存穩定性或溶解 性等作為藥品的物性優異，因此對與化T3關聯的疾病或狀態的處置是有用的。
【主權項】
1 .(S，E)-N-( 1-( (5-(2-( (4-氰基苯基）氨基)-4-(丙基氨基）嘧啶-5-基)戊-4-炔-1-基)氨基)-1_氧代丙烷-2-基)-4-(二甲氨基)-N-甲基丁-2-烯酰胺的羧酸鹽、無機酸鹽或磺 酸鹽。2. 根據權利要求1所述的鹽，其為羧酸鹽。3. 根據權利要求1所述的鹽，其為無機酸鹽。4. 根據權利要求2所述的鹽，其中，羧酸鹽為甲酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、苯甲酸鹽、檸檬酸 鹽、草酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、琥珀酸鹽、蘋果酸鹽、酒石酸鹽、天冬氨酸鹽、三氯乙酸鹽、 三氟乙酸鹽或帕莫酸鹽。5. 根據權利要求2所述的鹽，其中，羧酸鹽為富馬酸鹽、琥珀酸鹽或帕莫酸鹽。6. 根據權利要求3所述的鹽，其中，無機酸鹽為鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、磷 酸鹽或硫酸鹽。7. 根據權利要求3所述的鹽，其中，無機酸鹽為鹽酸鹽或氫溴酸鹽。8. (S，E)-N-( 1-((5-(2-( (4-氰基苯基）氨基)-4-(丙基氨基）嘧啶-5-基)戊-4-炔-1-基)氨基)-1_氧代丙烷-2-基)-4-(二甲氨基)-N-甲基丁-2-烯酰胺的琥珀酸鹽的結晶，在粉 末X射線衍射中，所述結晶在衍射角度(2Θ) 10.5、17.1、19.1及22.4°處具有衍射峰。 9 .(S，E)-N-( 1-((5-(2-( (4-氰基苯基）氨基)-4-(丙基氨基）嘧啶-5-基)戊-4-炔-1-基)氨基)-1_氧代丙烷-2-基)-4-(二甲氨基)-N-甲基丁-2-烯酰胺的琥珀酸鹽的結晶，在粉 末X射線衍射中，所述結晶在衍射角度(2Θ) 12.8、16.1、21.4及28.0°處具有衍射峰。10. (54)4-(1-((5-(2-((4-氰基苯基)氨基)-4-(丙基氨基)嘧啶-5-基)戊-4-炔-1-基)氨基)-1_氧代丙烷-2-基)-4-(二甲氨基)-N-甲基丁-2-烯酰胺的富馬酸鹽的結晶，在粉 末X射線衍射中，所述結晶在衍射角度(2Θ) 8.6、13.7、17.8及23.0°處具有衍射峰。11. 一種藥品組合物，其含有權利要求1~7中任一項所述的鹽或權利要求8~10中任一 項所述的結晶。12. -種FLT3抑制劑，其含有權利要求1~7中任一項所述的鹽或權利要求8~10中任一 項所述的結晶。
【專利摘要】本發明的課題在于，提供穩定性和/或溶解性等優異且具有更優異的FLT3抑制活性的化合物及藥品組合物。本發明提供(S，E)-N-(1-((5-(2-((4-氰基苯基)氨基)-4-(丙基氨基)嘧啶-5-基)戊-4-炔-1-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)-4-(二甲氨基)-N-甲基丁-2-烯酰胺(化合物A)的鹽或其結晶。這些鹽或其結晶具有優異的FLT3抑制活性、且保存穩定性或溶解性等作為藥品的物性優異，因此，對與FLT3關聯的疾病或狀態的處置是有用的。本發明還提供含有這些鹽或其結晶的藥品組合物及FLT3抑制劑。
【IPC分類】A61P43/00, C07D239/48, A61K31/505, A61P35/02
【公開號】CN105683167
【申請號】
【發明人】水本真介, 松本拓也
【申請人】富士膠片株式會社
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2014年10月15日