定量。與SDS-樣品緩沖液混合，在95Γ反應5分鐘使蛋白變性，制為樣品溶 液。在4-20%的梯度丙締酷胺凝膠（3 乂子八^才社、No.414879)的各孔中按每孔扣L上樣 樣品溶液，進行電泳。然后，使用iBlot凝膠轉移系統（ク斗フテ夕7口ク一乂社)將凝膠中 的蛋白轉印至化VD刊莫。
[0246] (BTK或憐酸化BTK的檢測）
[0247] 將轉印的PVDF膜用2 % E化prime阻斷試劑(GE~瓜乂少7社)進行封閉處理后，使 用作為一抗的抗BTK小鼠抗體(BDtransduction laboratoiy社、No.611116)或抗憐酸化811( 兔抗體(pY223、EPIT0MICS社、齡.2207-1)，在4°(：反應1夜。將未反應的一抗用了851'緩沖液 (lOmM Tris-HCl(抑7.5)、150mM NaCl、0.1 %Tween20)洗涂后，使用作為二抗的HRP標記的 抗小鼠 IgG山羊抗體（弓斗7テ夕7 口公一乂社、No. 62-6520)或抗兔IgG山羊抗體（弓斗7 テ夕7 口公一乂社、No.65-6120)，在添加有2%ECL prime阻斷試劑的TBST緩沖液中，在室 溫反應1小時。將未反應的二抗用TBST緩沖液洗涂后，使用ECL Prime蛋白質印跡檢測系統 (GE~瓜乂少7社）依照所附方案進行反應后，使用CCD照相機(ATT0、Li曲t-化ptureII)，通 過化學發光檢測各條帶。將檢出的條帶通過光密度法(Densitome1:ry)(ATT0 CS Analyzer ver3.0)而數值化，將未添加化合物且IgM刺激組的憐酸化BTK的條帶的發光作為100%，將 未添加化合物且無 IgM刺激組的憐酸化BTK的條帶的發光作為0%，根據各組中的條帶的強 度算出抑制率。應予說明，各憐酸化BTK的條帶通過總BTK進行校正。
[0248] 本試驗中使用的一抗和二抗的組合W及稀釋濃度如下所述。
[0249] 敵]
[0巧0]
[0251 ]將被測化合物濃度為0.3μΜ的濃度時的結果示于表6。細胞內BTK的自身憐酸化抑 制活性為70% W上的那些用***符號表示，50% W上且小于70%的那些用**符號表示，30% W上且小于50%的那些用*符號表示。
[0252]本試驗中，如表6所示，本發明化合物Κ〇.3μΜ的濃度強烈抑制細胞內BTK的自身憐 酸化活性。
[0 巧 3][表 6]
[0 巧 4]_
[0255]試驗例2的結果表明本發明的化合物對于"細胞內ΒΤΚ的自身憐酸化活性作用"也 具有強烈的抑制作用。
[0巧6] 試驗例3
[0257] Ramos細胞內巧離子變動抑制試驗
[0258] 通過測定本發明的化合物對"抗IgM抗體的BCR刺激所引起的細胞內巧流入"發揮 的作用來驗證本發明的化合物所引起的細胞內BTK抑制。
[0259] (細胞懸浮液、和巧指示劑的添加）
[0260] ii定的1天前，將Ramos細胞W細胞密度為1.ΟΧΙΟ6細胞/mL的方式重懸于新鮮的 生長培養基(與試驗例2相同的生長培養基）中進行培養，次日通過離屯、操作回收細胞，用添 加有5%青霉素-鏈霉素（十力弓^社）的RPMI-1640培養基(培養基1)進行洗涂。將該細胞W 細胞密度為2.0X106細胞/mL的方式重懸于添加有l%叫traLowIgGFBS(GIBC0、#16250) 與5%青霉素-鏈霉素（十力弓^社）的RPMI-1640培養基(培養基2)中，然后將細胞懸浮液按 每孔lOOyL添加至聚賴氨酸包被的微板（BD BioCoat?、#356692)的各孔中，離屯、操作 (700巧m、3分鐘）后，在37 °C的5 % C〇2培養箱內進行1小時解育。將巧指示劑F1UO-8NW載染料 (dye-loading)溶液(AAT Bioquest、#36315)按每孔lOOyL添加至各孔中，在37°C的5%C02 培養箱內進一步解育30分鐘。
[0261] (被測化合物的添加）
[0%2]由被測化合物的lOmM DMS0膽存液，用DMS0進一步稀釋為6個濃度（1、0.3、0.1、 0.03、0.01、0.003mM)，另外將不含被測化合物的DMS0溶液作為對照，將各自用培養基2進行 47.6倍稀釋，按每孔10化添加至上述板的各孔后，在37°C解育10分鐘(被測化合物的最終濃 度：1、0.3、0.1、0.03、0.01、0.003、0μΜ)。
[0263] (巧離子濃度的測定）
[0264] Ramos細胞內巧離子濃度是使用酶標儀（Synerg炸1)對巧指示劑F1UO-8NW的巧光 強度進行測定巧x/Em = 490/525皿）。測定基線15秒鐘后，在上述各孔中添加用培養基2稀釋 至 10.4yg/mL 的抗 IgM 抗體（Invitrogen、細 15100)50yL(最終濃度 2.0yg/mL)，進行 BCR 刺激， 進一步進行150秒鐘測定。
[0265] 圖1示出作為代表例的實施例1的化合物的結果。如圖1所示，本發明的化合物從低 濃度起濃度依賴性地抑制"抗IgM抗體的BCR刺激所引起的細胞內巧離子變動"，可W理解有 效地抑制了 BCR信號。
[0%6] 試驗例4
[0267] 小鼠被動皮膚過敏反應試驗
[0268] BTK在肥大細胞中對于FceRI的信號傳導發揮著重要的作用，因此對于肥大細胞參 與的作為即刻型過敏反應的被動皮膚過敏反應（passive cutaneous anaphylaxis react ion: PCA反應)是否被化合物給藥所抑制進行了研究。
[0269] (被測化合物溶液的制備）
[0270] 向被測化合物依次加入DMS0、聚乙二醇400(陽G#400、ナ力ク^テス夕社、#28215- 95)、30%(*八)徑丙基-護環糊精水溶液化?-護〔0、51旨1113社、#332607-500)并充分混合，審。 備被測化合物溶液(溶劑組成：5 %被測化合物DMS0溶液、30 %陽GM00、65 % ΗΡ-β-CD [ 30 % (w/v)水溶液])。另外，溶劑給藥組使用了DMS0溶液來替代被測化合物DMS0溶液。
[0打。（PCA反應）
[0272] 全身麻醉下，在兩側耳郭對ICR小鼠（6周齡、雄)皮內給予（1化L/處)抗DNP-I姐單 克隆抗體（50yg/mL、Santa Cruz社、#sc-69695)。46小時后，口服給予（lOmL/小鼠體重化g)) 溶劑或W達到試驗給藥用量的方式溶解于溶劑的被測化合物溶液(3.0mg/mLK2小時后，靜 脈給予（0.25mL/小鼠）包含0.5%伊文斯蘭染料(和光純藥株式會社、#054-04062)的DNP- BSA(lmg/mL、L化社、#LG-3017)，引發過敏反應。30分鐘后，全身麻醉下通過頸椎脫白將動物 安樂死，采集兩耳郭。對采集的一對耳郭加入1M K0田容液(0.7mL)，在37°C放置一夜，使耳郭 溶解。在該懸浮液中添加9.3mL的丙酬-0.2M憐酸（13:5)混合液后，將產生的不溶物通過離 屯、分離（30(K)rpm、10分鐘）和0.2皿過濾器除去。測定所得濾液的620nm處的吸光度，作為染 料漏出量的指標。上述實驗是各組使用5只小鼠進行，染料漏出量的評價采用了對運些小鼠 所得的值的平均值。
[0273] 圖2示出結果。如圖2所示，與溶劑組相比，實施例1的化合物顯著性地抑制了染料 向耳郭的漏出。即確認到對被動皮膚過敏反應(PCA反應)的抑制作用。
[0274] 試驗例5
[0275] 在小鼠膠原誘導性關節炎模型中的作用
[0276] 將在不完全弗氏佐劑(化omlrex社、#7002)中W達到2.5mg/mL的方式添加干燥的 結核分枝桿菌冊7Ra(M.Tuberculosis冊73曰）（八夕bシテ'^ッ年シッシ社、#231141)而成 的試劑、與牛II型膠原的2mg/mL溶液(化on化ex社、#20022) W1比1進行混合并乳化，從而制 作乳液。
[0277] 對于3組（10只/組)DBA/ 1J小鼠（6周齡、雄），在第0天和第21天，將相對于1只小鼠 為O.lmL的乳液分為小份注入尾根部皮內進行免疫。將溶劑或被測化合物溶液從第18天至 第36天為止1天2次每天口服給予（各組中的被測化合物給藥量：Omg/kg，30mg/kg，60mg/ kg)。給藥液的制備是使用與試驗例4相同的溶劑相同地進行。
[0278] 第21天的追加免疫W后，2~3天1次，依照表7所示的基準通過目視對四肢各處的 關節炎發病狀態進行評分。對于每一只小鼠總計四肢全部的評分，將各組10只的平均值作 為關節炎評分(正常0至最高16)。
[0279] [表 7]
[0280]_
[0281] 作為本發明的化合物的實施例1的化合物如圖3所示用量依賴性地抑制了關節炎 的發病。而且此時沒有顯示出體重減少等毒性。由該結果確認到本發明的化合物在具有優 異的抗炎作用的同時安全性也優異的可能性高。
[0282] 試驗例6
[0283] 在大鼠膠原誘導性關節炎模型中的作用
[0284] 將不完全弗氏佐劑（Sigma-Aldrich社、#巧506)與牛II型膠原的4mg/mL溶液 (Sichuan University、Lot.08冊497) 比1進行混合并乳化，從而制作乳液。對于3組（10 只/組化ewis大鼠（5-6周齡、雌），在第0天和第7天，將相對于1只大鼠為0.5mL的乳液分開注 入尾根部(O.lmL)和尾根部附近的背部皮內2處(各0.2mL)的共計3處，進行免疫。將溶劑或 被測化合物溶液從第0天至第20天為止1天2次每天口服給予(各組中的被測化合物給藥量： Omg/kg，30mg/kg，60mg/kg)。給藥液的制備是使用與試驗例4相同的溶劑相同地進行。
[0285] 第7天的追加免疫W后，1周2次，依照表8所示的基準通過目視對四肢各處的關節 炎發病狀態進行評分。對于每一只大鼠總計四肢全部的評分，將各組10只的平均值作為關 節炎評分(正常0至最高16)
[0286] [表 8]
[0287] __
[0288] 作為本發明的化合物的實施例1的化合物如圖4所示用量依賴性地抑制了關節炎 的發病。而且此時沒有顯示出體重減少等毒性。由該結果確認到本發明的化合物在具有優 異的抗炎作用的同時安全性也優異的可能性高。
[0289] 試驗例7
[0290] 小鼠的口服給藥的血中濃度測定(前藥的代謝確認試驗）
[0291 ]通常，前藥理想的是在口服給藥后由消化道吸收，然后在體內被迅速代謝從而產 生活性型的藥物。因此，研究了本發明的相當于前藥的化合物(I)在體內是否被迅速代謝為 活性型的藥物。
[0292] 對于ICR小鼠（3只/組）（6周齡、雄），將懸浮于溶劑(0.5%甲基纖維素水溶液）中的 被測化合物溶液W30mg/kg的試驗給藥用量的方式進行口服給藥。1小時后，將使用涂覆了 肝素的注射器從全身麻醉下的小鼠的屯、臟采集的血液樣品進行離屯、分離(4°C、10000rpm、 10分鐘），回收血漿樣品。在帶有過濾器的板的各孔中，添加化L的血漿樣品與49扣L的包含 內標化合物的甲醇溶液并進行混合。通過離屯、分離(4°C、300化pm、3分鐘）除去變性蛋白，回 收濾液(提取液）。作為校準曲線用，制備含有內標化合物的代謝物的甲醇溶液，與采集自未 處置的小鼠的血漿混合，使用帶有過濾器的板同樣地進行處理。另外關于前藥(未改變體） 的校準曲線，使用了將前藥的甲醇溶液與內標化合物的甲醇溶液混合制備的校準曲線用標 準液。
[0293]提取液中的前藥和作為其代謝物的實施例1的化合物的濃度是使用LC/MS(液相色 譜質譜），基于使用了與內標物質的峰面積比的校準曲線來對化合物濃度進行定量。
[0 巧 4][表 9]
[0295]
[0巧6] ND:未檢測到
[0297]如表9所示，本發明的前藥化合物口服給藥后在血中未觀測到，而觀測到作為代謝 物的實施例1的化合物。由此確認本發明的前藥體在體內被迅速代謝而轉換為活性型。
[0巧引產業實用性
[0299]由本發明提供的化合物可用作針對已知與BTK介導的異常細胞應答相關的疾病， 例如，自身免疫疾病、炎性疾病、骨病、淋己瘤之類的癌癥等的預防或治療用藥物(藥物組合 物)或其前藥。另外，作為BTK抑制劑，對于實驗用、研究用的試劑也有用。
【主權項】
1. 下式(I)所示的三嗪衍生物、或其藥學上可接受的鹽，式中，R1表示可具有取代基的低級烷基，R2表示氫原子、可具有取代基的低級烷基，A表 示氮原子或C-R3，R3表示氫原子、氰基、可具有取代基的酰基、可具有取代基的磺酰基、可具 有取代基的氨甲酰基，R 4表示可具有取代基的低級烷基、可具有取代基的環烷基。2. 權利要求1所述的三嗪衍生物、或其藥學上可接受的鹽，其中R1表示式-CH2OR5,式中R 5 為可具有取代基的酰基。
【專利摘要】本發明的目的在于提供下述式(I)所示的三嗪衍生物或其藥學上可接受的鹽。式中，R1表示可具有取代基的低級烷基，R2表示氫原子、可具有取代基的低級烷基，A表示氮原子或C-R3，R3表示氫原子、氰基、可具有取代基的酰基、可具有取代基的磺酰基、可具有取代基的氨甲酰基，R4表示可具有取代基的低級烷基、可具有取代基的環烷基。
【IPC分類】A61P37/02, A61P35/02, C07D401/14, A61P37/08, A61K31/53, A61P35/00
【公開號】CN105683178
【申請號】
【發明人】川畑亙, 淺見齊子, 澤匡明, 朝光優子, 入江隆行, 三宅隆弘, 清位孝夫
【申請人】卡爾那生物科學株式會社
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2014年7月15日