胞被分裝(一共8個試管，每個試管內有20化L的細胞懸浮液），并且將化L的指定化合 物(與合適的稀釋物)分別加入到6個試管中。作為對照，將化L的DMS0(最終濃度為1%)加入 到2個另外的試管中。在37°C培養細胞30分鐘。加載染料后，用eOOOrpm的速度離屯、分離試管 1分鐘，除去上清液，使沉淀細胞重懸浮于含有lOmM皿陽S的20化1皿SS+(含有化和Mgh) 中。用與細胞加載時相同的濃度，重新加入檢驗化合物或DMS0(對照）。細胞懸浮液被分裝到 一個體積是90化(105個細胞/孔）的96孔讀板(康寧）中。化合物板包含激動劑(在皿SS-中的 CX化8)或皿SS-(對照）。利用多功能酶標儀工作站(FlexStation)II讀取巧光基態水平15秒 后，將10化的CX化8或皿SS-自動從化合物板轉移到讀板(CX化8的最終濃度是25nM)。在室溫 下，240秒-500秒內，每5秒檢測巧光變化(Aex = 485皿，Aem=525皿）。
[0151] 利用超過基線的W任意單位表示的巧光的最大變化(Max-Min)確定CX化8反應。標 準化每個化合物對CX化8反應的影響，并表示成DMS0對照百分比，被指定為"100%反應"。通 過利用Prism 4(GraphPad軟件公司，圣地亞哥，CA)生成的劑量反應曲線的非線性回歸分 析，確定曲線擬合并計算:通過50% (IC50)減少CX化8反應水平的化合物抑制濃度，或通過 50%的最大激動劑誘發的變化化C50)增加巧釋放水平的化合物激動劑濃度。
[0152] SX-682(n = 4)的平均（±沈）1〔5〇 是 42±化]?，20±化1和55±611]\1，分別對應0乂〇?1轉 染的邸L細胞（'CXCR1'，正方形），CXCR2轉染的R化細胞（'CXCR2'，倒Ξ角形），和人類中性粒 細胞（'人類PMNs '，圓形）（參考圖1)。
[0153] 藥理學實施例2:SX-682顯示持續的細胞內巧釋放的耐洗性抑制作用
[0154] SX-682包含一個棚酸部分，其可與蛋白祀的結合位點上的含徑基氨基酸側鏈結合 形成一個臨時的共價鍵。理論上不希望被束縛，我們假設運個SX-682的結合位點上的臨時 共價鍵可能導致對CXCR1/2的抑制作用，運種抑制作用可W在洗脫抑制劑后持續。如果在洗 脫SX-682后，運種抑制作用在體外持續，那么運種抑制作用也可能在體內在從血漿中消除 SX-682后持續，運種性質將會使不頻繁的患者給藥方案(例如一天一次、一周兩次和一周一 次給藥)成為可能。不頻繁的給藥方案是優選的實施例。
[0155] 為了測試運種假設，穩定轉染CXCR1或CXCR2的邸L細胞（107個細胞/mL): (1)在37 °C，與不同濃度的SX-682 -起培養30分鐘，（2)在室溫下，洗涂并重懸浮于測定緩沖液 (RPMI/2%血清）中，和(3)洗脫抑制劑后，現憶多個時間點的CXCL8介導的觀反應，直到12小 時。ii試的SX-682濃度是0(正對照），0(負對照），0.4，2，和ΙΟμΜ。在每個時間點的30分鐘前， 除去56.2扣L的小份細胞，并在室溫下，黑暗中與化IPR-3試劑(每管262.扣L) 一起加載30分 鐘。FLIPR-3培養后，緊接著按照藥理學實施例1中的說明，測定細胞的CX化8介導的細胞內 巧釋放。
[0156] 與我們的假設一致，SX-682顯示了對穩定轉染CXCR1 (參考圖2)或CXCR2 (參考圖3) 的R化細胞中的CX化8介導的細胞內巧通量的抑制作用，在洗脫SX-682后，運種抑制作用持 續了至少12小時。
[0157] 藥理學實施例3:在肺部炎癥反應的大鼠模型中，SX-682顯示了顯著的活性
[0158] 測定SX-682在肺部炎癥反應的大鼠模型體內的活性。在運種肺部炎癥反應模型中 的活性提供了證據來支持SX-682用于治療若干肺部炎癥性疾病，包括慢性阻塞性肺疾病 (C0PD)和支氣管肺發育不良（BPD)。在運個實驗中，僅在t = 0時，通過靜脈注射給藥斯普拉 格-杜勒鼠 （n = 4每群）一次誼白對照仁甲基甲酯胺/PEG400/鹽水，40:40:20)，正抑制劑 對照（5乂-576，1111邑/1^)或測試化合物(5乂-682，1111邑/1^)。將所述鼠放置在空氣中（負暴露組； 僅空白對照），或Ippm臭氧中（正暴露組;空白對照、正抑制劑對照SX-576、和測試化合物SX- 682)4小時。在t = 24小時時，犧牲所述鼠，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)。旋轉減慢細胞，進 行瑞特-吉姆薩染色，并進行細胞計數。在所述負暴露組中，染色時沒有發現中性粒細胞。但 是在空白處理的臭氧暴露鼠中，BALF中有大約14000/mL的中性粒細胞涌入(參考圖4)。與此 相反，與僅做空白處理的對照大鼠相比，SX-576和SX-682(分別是Img/kg)顯著地減少了中 性粒細胞涌入肺部（圖4)。對于運兩種被測試的抑制劑，SX-682顯示了明顯更強大的對中性 粒細胞趨化性的抑制作用（圖4)。顯著地，在僅給藥單劑量Img/kg的SX-682后，對中性粒細 胞涌入BALF的抑制作用持續了 24小時。運些結果提供了證據說明SX-682是一種體內肺中性 粒細胞趨化性的有效抑制劑，并且在一個預測性的體內模型中，能有效治療與增強的肺部 炎癥反應有關的疾病，如C0PD。
[0159] 代謝穩定性實施例1:增強的SX-682的微粒體穩定性
[0160] 肝微粒體是一種藥物通過肝(和腸)細胞色素 P450系統在體內進行代謝和消除的 體外模型。在體外，化合物在肝微粒體中的穩定性，可W預測其在體內的代謝和消除。我們 檢查了 SX-682在肝微粒體中的穩定性，連同多個其他的同族化合物，從而量化SX-682的微 粒體穩定性和鑒定潛在的結構-活性關系(SAR)來預測穩定性或不穩定性(參考圖5)。
[0161] 在37 °C，利用人類肝微粒體，培養所述化合物一式兩份。所述反應在1 OOmM憐酸鐘， 2mMNADPH，3mMMgCl2，pH7.4中含有微粒體蛋白質。為每一個化合物運行一個不含有 NADPH的對照，從而檢測不依賴于NADPH的降解。在ο，10，20，30和60分鐘時，從每一個實驗和 對照反應中移除一小份，并與相同體積的冰冷終止液(0.3%醋酸在含有氣贓晚醇、雙氯芬 酸、或其他內標物的乙臘中）混合。在-20°C，培養已終止的反應至少10分鐘，加入附加水量。 離屯、分離樣品，除去沉淀的蛋白質，利用LCMS/MS分析上清液從而定量測定殘留的化合物。 通過除W時間零點濃度值，將數據轉換為殘留百分比。調整數據使其符合一個一階衰減模 型，從而確定半衰期。利用半衰期和蛋白質濃度計算內在清除率:CLint = ln(2)/(tl/2[微粒 體蛋白質])。
[0162] 結果如表1所示。出人意料地，SX-682明顯比SX-671或SX-576(6倍大的半衰期）更 穩定，盡管除了一個單一的環氮原子，后者在結構上完全相同。另一方面，環氮原子的引入 不足W給予SX-682所顯示的穩定性，正如SX-677和SX-678所證明的，SX-677和SX-678的半 衰期分別比SX-682的半衰期小2倍和5倍。更令人吃驚的是，在SX-517中，消除環氮原子產生 的半衰期甚至比SX-682的半衰期大。
[0163] 總的來說，所述結果得到了 SAR預測所無法獲得的SX-682令人吃驚的穩定性。
[0164] 表1.在人類肝微粒體中的穩定性(依賴于NADPH)
[01 化]
[0166] a微粒體內在清除率。
[0167] b半衰期。
[0168] 代謝穩定性實施例2:增強的SX-682的血漿穩定性
[0169] 代謝穩定性實施例1(圖5)中的SX-682及其同族化合物的體外穩定性，進一步在人 類血漿中進行了研究。通過在49扣L的預熱血漿溶液中加入化L的500yMDMS0儲備溶液開始 反應，得到扣Μ的最終濃度。在37°C的加熱器中進行測定，分為一式兩份進行。在0,30,60， 120,240分鐘時取樣(5化L)，加入到150化的乙臘中，除去所述血漿的蛋白質。滿旋混合所述 樣品1分鐘，然后W1400化pm的速度離屯、分離15分鐘。利用LC-MS分析清澈的上清液。
[0170] 利用表達式tl/2 = ln(2)/b計算體外血漿半衰期(tl/2)，其中b是與培養時間相對 的母體化合物饋分殘留的自然對數線性擬合中的斜率。
[0171] 結果如表2所示。就血漿穩定性而言，與其在肝微粒體中明顯增強的穩定性相對 比，SX-682大致與SX-576-樣穩定，。顯然地，除去環氮原子對血漿穩定性的影響很小。另一 方面，在SX-671中，用氧原子替換硫原子導致了血漿半衰期顯著的減少35倍。然而，如SX- 517 所示 ，保留硫原子不足 W 維持血漿穩定性，在 SX-517 中，保留了硫原子但是除去了環 F3C0基團，從而導致了血漿半衰期減少5倍。
[0172] 表2.人類血漿中的穩定性(在37 °C培養，利用LC-MS/MS測定）
[0173]
【主權項】
1. 一種具有式SX-682的化合物2. -種藥物制劑，包含權利要求1所述的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。3. 根據權利要求2所述的藥物制劑，其中權利要求1所述的化合物被包含在用于吸入或 口服給藥的粉末、溶液、懸浮液、乳液、或沉積在合適的藥物賦形劑上的表面中。4. 根據權利要求2所述的藥物制劑，其中權利要求1所述的化合物被包含在用于口服、 經皮、注射、或鼻腔給藥的制劑中。5. 根據權利要求2所述的藥物制劑，其中權利要求1所述的化合物在人類血漿中的半衰 期大于200分鐘。6. 根據權利要求2所述的藥物制劑，其中權利要求1所述的化合物在人類肝微粒體中的 半衰期大于100分鐘。7. -種治療患者疾病或紊亂的方法，包括給藥有效量的具有式SX-682的化合物8. 根據權利要求7所述的方法，其中所述的具有式SX-682的化合物通過口服、經皮、注 射、滴鼻、或吸入給藥。9. 根據權利要求7所述的方法，其中所述的具有式SX-682的化合物與化學治療劑一起 給藥。10. 根據權利要求7所述的方法，其中所述的具有式SX-682的化合物的給藥劑量是 0.01mg-1000mg〇11. 根據權利要求7所述的方法，其中所述的具有式SX-682的化合物的給藥劑量是 0.01mg-7500mg〇12. 根據權利要求7所述的方法，其中所述的具有式SX-682的化合物的給藥劑量是 0.01mg-500mg〇13. 根據權利要求7所述的方法，其中所述的具有式SX-682的化合物通過口服或吸入給 藥，以0.04mg-4000mg的劑量每天、一周兩次或一周一次給藥，分兩次至四次劑量或單-- 次劑量給藥。14. 根據權利要求13所述的方法，其中所述具有式SX-682的化合物的劑量是10mg- 2000mg〇15. 根據權利要求13所述的方法，其中所述具有式SX-682的化合物的劑量是10mg-1000mg〇16. 根據權利要求13所述的方法，其中所述具有式SX-682的化合物的劑量是50mg- 600mg〇17. 根據權利要求7所述的方法，其中所述的疾病是炎癥性疾病。18. 根據權利要求17所述的方法，其中所述的炎癥性疾病是慢性阻塞性肺疾病或支氣 管肺發育不良。19. 一種制備具有式SX-682的化合物的方法，所述方法包括使2-氯代嘧啶-5-羧酸與4-氟苯胺反應以產生N-(4-氟苯基)-2-氯代嘧 啶酰胺。20. 根據權利要求19所述的方法，還包括使N-(4-氟苯基)-2-氯代嘧啶酰胺與氫硫化鈉 反應以產生2-巰基-嘧啶-5-羧酸(4-氟苯基)-酰胺。21. 根據權利要求20所述的方法，還包括使2-巰基-嘧啶-5-羧酸(4-氟苯基)-酰胺與2-溴甲基-4-三氟甲氧基-苯基硼酸，頻哪醇酯反應以產生具有式I的頻哪醇酯衍生物22. 根據權利要求20所述的方法，還包括通過與氟化氫鉀反應，對所述式I的硼酸頻哪 醇酯脫保護。
【專利摘要】本發明公開了一種可用作藥物制劑的嘧啶甲酰胺化合物，其合成工藝，以及含有所述嘧啶甲酰胺化合物的藥物組合物。更具體地，本發明公開了一種CXCR1/2抑制劑，可用于治療各種炎癥性和腫瘤性疾病。
【IPC分類】A61K31/69, C07F5/02, A61K31/505, A61P29/00
【公開號】CN105683202
【申請號】
【發明人】約翰·A.·則巴拉, 迪恩·Y.·梅達, 亞倫·D.·舒勒
【申請人】Syntrix生物系統公司
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2013年8月2日