(布魯克道爾頓GmbH(&r址er Daltonics GmbH),不來梅，德國） 上記錄高分辨率ESI質譜。將樣品（0.5mg左右）溶解在0.5mL的MeCN/出0( 1:1 )+0.1 %的 肥00H中。然后，將該溶液按10:1稀釋，并通過化1 · min-i的連續流體注入分析。在180°C、氮 氣霧化器壓力為0.4己、干燥氣體流速為4.01/min，毛細管電壓為4000V、端板補償 (emlplate offset)為-500V下，W正電噴霧離子化模式操作質譜儀。W20000的分辨率、每 秒掃描一次，在質量范圍m/z為100~2000中W全掃描方式進行MS采集。在m/z為158~1450 的質量范圍內用2mmo VI的甲酸鋼溶液校正，準確度低于化pm。
[0326] 細胞培養:在37°C和5%C02下，在補充有5%胎牛血清巧〔5,6化(；〇)、1001]/1111青霉 素、100μg/ml鏈霉素的DMEM(Gibco)中培養人宮頸癌細胞化ela)。在37°C和5%C02下，將正 常的人胎兒肺成纖維細胞MRC-5細胞系保持在補充有10%。〔5(6化(3〇)、200111111〇1/1的心谷氨 酷胺、lOOU/ml青霉素和100μg/ml的鏈霉素的F-10培養基(Gibco)中。為了確立化合物的抗 癌潛力，采用刃天青(Promocell Gm地），通過巧光細胞存活力測定用一個細胞系（即HeLa) 對運些化合物進行了測試。然后，對正常的MRC-5細胞測試了顯示細胞毒性的化合物。在處 理的前一天，將細胞一式Ξ份W如下密度平鋪在(plated)96-孔板中：對于化La,密度為100 μ1中4 X 103個細胞/孔;對于MRC-5細胞，密度為7 X 103個細胞/孔。用濃度增加的化合物處理 細胞2天。2天后，去除培養基和藥物，添加 100ml含有刃天青的新鮮培養基（最終濃度為 0.2mg/ml)。在37°C解育4小時后，在Spec化aMax M5酶標儀中，使用54化m激發波長在590皿 發射處對高度紅的巧光染料試面靈(Resorufin)的巧光定量。
[03打]秀麗隱桿線蟲（C.elegans)運動抑制測定:根據標準方案(秀麗隱桿線蟲的保持; Stiernagle，T .，Ed . ; WormBook，2006 )，將不同期的N2秀麗隱桿線蟲（布里斯托爾 (Bristol))保持在線蟲(nematode)生長培養基(NGM)瓊脂中，用0P50大腸桿菌上的菌苔接 種作為食物來源。通過用M9緩沖液（42mmol/l的化2冊〇4、22mmol/l的KH2P〇4、86mmol/l的 NaQ和lmmol/1的MgS〇4)清洗從NGM平板收獲蟲，吸出并收集到10血管(Falcon)中。通過將4 X扣L等分試樣轉移到載玻片(Menzel Glaser)上計算化L該懸液中蟲的平均數量，并在復 式顯微鏡(奧林己斯CH30)下枚舉蟲。為了將懸液調節至每化含有1只蟲，在Weooxg對蟲進 行30秒的離屯、(pe 11 et)后，要么添加 M9緩沖液，要么移除M9緩沖液。
[0鄉]稀釋測試化合物、Zolvix(莫奈太爾）和DMS0,用于工作儲備液，和用于液體篩選的 96孔板設置:使用多道移液器，向96-孔板的每個孔中添加體積為70化的M9緩沖液。使用剪 去尖端的吸頭（trimmed pipette tip)(口徑增加 W使對蟲的損害減至最小）的單道移液 器，向每個孔中添加體積為SOiiL的蟲懸液。每加入Ξ個孔后通過輕彈使該蟲懸液重新懸浮 W保持一致性。將所述化合物儲存在4°C下，用二甲基亞諷(DMS0)稀釋，W在添加至測定前1 個小時達到濃度為lOOmmol/1。運些儲備液進一步用DMS0稀釋，W產生20mmo VI、2mmol/l、 0. 02mmo VI和0.002mmo VI的系列，隨后用M9緩沖液按1:20稀釋，產生lmmol/1、0.1 mmo VI、 1皿ο 1Λ和0.1皿ο 1/1(所有都是5% (體積/體積)DMSO)。每個濃度10化W -式兩份加入孔 中，W實現100μLΧΟ. 5%DMS0)中的最終濃度為100μL?οΙ/Ι、10皿〇1/1、lOOnmol/l和lOnmol/ 1。 按照相同的稀釋方案，同時產生Zolvix(莫奈太爾）稀釋系列，用作陽性對照；添加10化 10 %的DMS0，W實現1 %的DMS0溶媒對照。向陰性對照孔中添加10化M9 (參見圖1)。在室溫 下(22-24Γ)解育平板，在20°C下過夜。
[0329] 定量的蟲運動性評分:使用奧林己斯SZ30解剖顯微鏡，將每個孔中的不動蟲計數 為占總蟲的百分比。從總數中減去不動的部分，用余數除W總數得到每個孔中活蟲的百分 比。將描述統計和推論統計推遲到直到進行進一步的重復實驗。
[0330] 體外試驗可W通過在幼蟲發育測定中測試化合物來進行。為此，采用血矛線蟲屬 (化emonchus)、毛圓線蟲屬（Trichstrongylus)、背帶線蟲屬（Teladorsagia)、古柏線蟲屬 (Cooperia)、結節線蟲屬(Oesophagostomum)或夏氏線蟲屬(Chabertia)的物種的感染性第 Ξ期幼蟲化3)感染綿羊。收集綿羊的排泄物，并用于試驗;將約lOOg的排泄物粉碎，攬勻，懸 浮于約1000ml的糖溶液中（比重為1.2)，使穿過"茶濾網"篩，丟棄篩中未被消化的大的食物 物質。然后將糖溶液置于扁平盤中，并在表面放置塑料高架透明薄膜帶。使塑料保持至少45 分鐘，W使得卵粘住，然后小屯、地除去該塑料。通過用水清洗，將卵從塑料膜收集到50ml的 離屯、管中。使含有卵懸液的水穿過40mm篩子，W除去另外的植物物質，然后WlOOOXg離屯、 10分鐘。檢查上清液中的卵，然后丟棄上清液，因為大部分卵都在管的底部。將運些卵收集 在1ml水中，并稀釋為大約200個卵/20ml。
[0331] 1、每種化合物測試5種濃度：100、50、25、12.5和6.25111111〇1/1(即從100111111〇1/1開始 的一系列2倍稀釋液）。每種化合物的稀釋(總共10ml)在1.5ml微量離屯、管中進行，添加1ml 烙化的瓊脂，滿旋該管，將瓊脂等分(150ml)到96-孔微量滴定板的孔中。
[0332] 2、在許多孔中使用DMS0作為唯一的溶劑對照（陰性對照），而莫昔克下(cydectin) 用作陽性對照。用于化合物再測試的陽性對照的莫昔克Tkydectin)的濃度為6.25、12.5、 25、50和10〇1111]1〇1/1。
[0333] 3、然后向每個孔中添加約100個卵（20ml)。
[0334] 4、然后，在27°C下解育板過夜。
[0335] 5、在第二天上午和下午檢查板，W確保大部分卵都已解化。記錄似乎具有殺卵作 用的任何化合物。
[0336] 6、在解化大部分卵后，添加15ml營養培養基來飼喂幼蟲。營養培養基的制備如下： 向90ml生理鹽水(0.85%)中添加1邑酵母提取物，并在121°(：下熱壓處理2〇111111。向271111的酵 母提取物溶液中添加3mL的lOXEarle's平衡鹽溶液，通過添加碳酸氨鹽將該溶液的抑調節 至5.4~5.6。
[0337] 7、接下來的7天，另外解育，確定每個孔中已經發育的L3幼蟲的數量。
[0338] 體內試驗可W在單特異性感染運些寄生物（即血矛線蟲屬(化emonchus)、毛圓線 蟲屬（1'1'1油3付011肖71113)、背帶線蟲屬（了日1日(1〇'3日肖1日）、古柏線蟲屬（(：0〇9日1'1日）、結節線蟲 屬(Oesophagostomum)或夏氏線蟲屬(化abertia)的物種）的綿羊中進行。
[0；339] 內寄生物
[0340] 對犬惡絲蟲(Dirofilaria immitis)(Pi)(絲蟲的線蟲)的體夕慌性。
[034。 從來自供體動物(對于Di為狗）的血液新鮮收獲并清潔微絲蝴。然后，將微絲蝴分 布在含有待評價抗寄生物活性的測試物質的格式化微量培養板中。通過系列稀釋來測試每 種化合物，W便確定其最小有效劑量(MED)。將上述板在26°C、60%的相對濕度(畑)下解育 48小時。然后記錄微絲蝴的運動性，W確定可能的殺線蟲活性。功效用與對照和標準品相比 減少的運動性百分比表示。
[0342] 對搶轉血矛線蟲和蛇形毛圓線蟲(Trichostrongylus colubriformis)(胃腸道線 蟲類)的體外活性。
[0343] 使用新鮮收獲并清潔的線蟲卵接種在含有待評價抗寄生物活性的測試物質的適 當格式化的微量培養板上。通過系列稀釋測試每種化合物，W確定其MED。測試化合物用營 養培養基稀釋，使得卵完全發育為3齡幼蟲(3rd instar larvae)。將上述板在28°C、60%的 相對濕度(RH)下解育6天。記錄卵解化和隨后的幼蟲發育W確定可能的殺線蟲活性。
[0344] 功效用卵解化減少的百分比、L3的發育減少的百分比或所有階段幼蟲的無力和死 亡百分比表示。
[0345] 合成途徑的實施例
[0346] 實施例1:
[0347] 化合物l(N-[l-(二茂鐵基氧基)-2-氯基丙-2-基]二茂鐵甲酯胺)的合成
[0348] 所提出的合成途徑描繪在方案7中。
[0349]
[0巧0] 方案7:試劑與條件：（a)叔下醇金屬，叔下基裡，0)2，THF，-78°C 一室溫，35%;(b) C此CI2,草酷氯，回流一室溫，過夜；（c)THF，NEt3,室溫，過夜，29%;((1化2〇)3和18-冠-6， C 出 C!2,29%。
[0351]使化合物15與叔下醇金屬、叔下基裡和CO2反應，得到化合物3a。二茂鐵甲酸3a(步 驟a)的合成方法改編自來自Witte等（Organometal lies, 1999,18,4147)的方法。使化合物 3a在回流下與草酷氯反應，得到化合物3b。二茂鐵甲酯氯3b(步驟b)的合成方法改編自 〔〇1'111〇(16等（0日11:〇]1化日]13.2010,39,6532)的方法。任選地，可^使用]^〇'1?)￥31^等（￥111.單 體的和聚合的亞二茂鐵基嗯二挫的制備（VIII.Preparation of monomeric and polymeric ferrocenylene oxadiazoles)，J.Prakt.Chem. 1967，35，149-58)的改編方法。 將二茂鐵甲酯氯3b和2-氨基-2-?甲基丙臘6溶解于無水THF中，并添加 Ξ乙胺（步驟c)。在 蒸發掉溶劑和通過柱色譜法純化后，根據Gasser等（J. Organomet.化em. 2010，695，249- 255)的改編方法，分離N-(2-氯基-1-?丙-2基）二茂鐵甲酯胺7a，收率為29%。根據Gasser 等（J.Organomet.化em.2007,692,3835-3840)和Gasser等（J.Med.化em.2012,55,8790- 8798)的改編方法，使化合物7a與1當量的5a在K2CO3和18-冠-6的無水C出CN溶液的存在下反 應，得到化合物1，收率為43 %。
[0352] 實施例2:化合物2(二茂鐵甲酸(2-二茂鐵甲酯胺基-2-2氯基)丙醋)的合成
[0353] 所提出的合成途徑描繪在方案8中。
[0354]
[03W]方案8:將2當量的二茂鐵甲酯氯3b與1當量的2-氨基-2-?甲基丙臘6溶解于無水 THF，并添加 Ξ乙胺。在蒸發掉溶劑和通過柱色譜法純化后，分離出二茂鐵甲酸(二茂鐵甲酯 胺基-2-2氯基)丙醋2，收率為29%。
[0356] 合成與表征 [0；357]二茂鐵甲酸(3a):
[035引
惦59] 二茂鐵甲酸3a的合成方法改編自來自Witte等（Organometallics，1999,18,4147) 的方法。
[0360] 將二茂鐵15(6 . Og，32mmol)和叔下醇鐘（0.46g，4. OSmmol)完全溶解于無水THF (300mL)中。在溫度保持在低于-70°C的狀態下，在15分鐘內滴加叔下基裡（34.0mL， 64.5mmo 1，在戊燒中為1.9M)時，將澄色溶液冷卻至-78°C。在-78 °C下攬拌該反應混合物1小 時，然后傾倒在干冰(過量)和乙酸的漿料上。將該混合物溫熱至室溫過夜，用氨氧化鋼的水 溶液(0.75N，4X250ml)萃取。用鹽酸(pH〉4)中和合并的水層，用化20(4X250ml)萃取得到 的澄色固體，直到有機層保持無色。將合并的有機層過濾，W除去微量的二茂鐵二簇酸，用 MgS化干燥，過濾，在減壓下蒸發溶劑，得到澄色固體二茂鐵甲酸，收率為35%。產物的光譜 數據與由巧;[?6等(0巧日]1〇1]161日11;[。3，1999，18,4147)之前報道的數據一致。
[036。二茂鐵甲酯氯3b:
[0362]
[0363] 二茂鐵甲酯氯 3b 的合成改編自 Cormode 等（Dalton Trans.，2010,39,6532)的方 法。在將二茂鐵甲酸36(462111旨，2.01111111〇1)懸浮于無水(：出(：12(231^)中后，向反應混合物中滴 加草酷氯（110化L，13.64mmol)的無水C出Cl2( lOmL)溶液，由此使澄色懸液變成暗紅色。回流 反應混合物2小時，然后在室溫下攬拌過夜。然后在真空下除去溶劑。產物未經純化直接用 于下一個合成步驟。
[0364] 2-氨基-2-徑甲基丙臘6:
[03 化]
[0366] 2-氨基-2-徑甲基丙臘4按照由Gauv巧等(W02005/044784A1)公開的方法制備。IR 化化，cm-1) :3329s、3286s、3205s、2985s、2935s、2858s、2756w、2229m、1625s、1476m、1457m、 1383m、1368w、1348w、1269m、1178s、1093s、1065s、1044s、963m、934s、888m、785m、626w、 465m〇iH NMR(400MHz、Me0D):δ/卵m = 3.51 (dd、2j= 11.2Hz、2j= 10.8Hz、2H、CH2)、1.40(s， 3H，CH3)〇Uc 匪R(100MHz，CDCl3):S/ppm=124.4、69.8、53.1、23.9〇ESI-MS:m/z(%) = 101.07([M+H] +，100)、83.06([M-此0]%64)。皿ESI-MS:對于C4H9化0([M+H] + )，計算值:m/z (% ) = 101.07088，實際值:m/z( % ) = 101.07094。
[0化7] N-(2-氯基-1-徑基丙-2-基)二茂鐵甲酯胺7a:
[036引
[0369] 將二茂鐵甲酯氯36(0.162邑，0.652111111〇1)和2-氨基-2-徑甲基丙臘6(0.065邑， 0.652mmo 1)溶解于無水THF(15血）中。向該溶液中添加 Ξ乙胺(453化，3.26mmo 1)，將反應混 合物在室溫下攬拌過夜。在減壓下蒸發溶劑，使用己燒：乙酸乙醋（7:1^0:1)作為洗脫液 (Rf = 0.07)通過二氧化娃柱色譜法純化粗產物。用二氯甲燒清洗被污染的產物，得到純的 澄色固體N-(2-氯基-1-徑基丙-2-基)二茂鐵甲酯胺7曰。收率為29%dIR化Br，cm-i):3467s， 3412s，3103w，2941W，2862w，1635s，1534m，1454w，1377w，1312m，1267w，120Iw，1160w， 1099w，1056m，1037w，1023w，998w，911w，826w，772w，710w，620m，528w，499w，483w，464wDiH NMR(400MHz，丙酬）：S/ppm=7.12(s，1H，NH) ,5.01 (t，3j = 6.4Hz，1H，0H) ,4.85-4.84(m，2H， C已曲），4.39-4.38(m，2H，Cs曲），4.24(s，5H，C5曲），4.0-3.93(m，lH，CH2) ,3.90-3.86(m，lH， C出），1.71 (s，3H，CH3)。1化醒R( 125MHz，丙酬）：S/ppm= 170.9,121.1,76.1,71.5,70.5， 69.4,67.0，66.9,53.3，22.6〇ESI-MS:m/z(% )=351.02([M+K]%8) ,335.04([M+Na] +，100)， 312.06([]?]%52)。皿651-]\15:對于(：1出16化化〇2(]\〇，計算值:111八（％)=312.05508，實際值： m/z(%)=312.05557ο
[0巧0](二茂鐵基甲基)Ξ甲基艦化錠5a
[0371] 根據Lindsay等(J. 0巧.Chem. 1957，22，355-358)制備（二茂鐵基甲基）Ξ甲基艦化 錠5曰。
[0巧。N-[l-(二茂鐵基氧基)-2-氯基丙-2-基]二茂鐵甲酯胺1:
[0373]
[0374] 將N-(2-氯基-1-徑丙-2-基）二茂鐵甲酯胺7a(0.02g，0.064mmol)、（二茂鐵基甲 基）Ξ 甲基艦化錠 5日（0.04邑，0.128111111〇1)、1(2(：03(26.5111邑，0.192111111〇1)和18-冠-6(5.0111邑， 0.0192mmol)溶解于無水C曲CN( lOmU中，回流72個小時。然后，使反應混合物冷卻至室溫。 在減壓下蒸發溶劑。然后，將殘余物再次溶解于C出Cb(lOmL)中，用出0(5mL)和鹽水（2X 5mL)清洗。將有機相用MgSCk干燥，過濾，并在減壓下蒸發溶劑。使用己燒：乙酸乙醋（10:1 一 8:1^3:1^1:1)作為洗脫液(Rf = 0.16,（3:1))通過二氧化娃柱色譜法純化粗產物，得到黃 色固體N-[ 1-(二茂鐵基氧基)-2-氯基丙-2-基]二茂鐵甲酯胺1。收率:43 %。IR化Br，cm-i): ；3469s，2929w，2852w，1637s，1518s，1378w，1339w，1305w，1280w，1101m，1008m，825m，523m， 502m，485m。1h 醒R(500MHz，CD3CN): S/ppm = 6.50(s，IH，NH)，4.73-4.70(m，2H，C5H4)，4.45 (s，2H，RCH20R) ,4.39-4.38(m，2H，C5H4)，4.30(d，3j = 7.7Hz，2H，C5H4)，4.19(s，7H，C5H 已， C 出4)，4.16(s，5H，C5也），3.80(d，3J = 9.3Hz，lH，0CH2CR)，3.70(d，3J = 9