專利名稱：海帶無性繁殖系程序降溫凍存法的制作方法
技術領域：
本發明屬于海洋生物技術領域，涉及一種大型經濟藻類—海帶種質保存技術。
背景技術：
海帶(Laminariajaponica Aresch)是中國重要的經濟藻類，海帶生活史分兩個明顯的世代階段孢子體世代和配子體世代，配子體世代是海帶的單倍體階段，在該階段將雌配子體(female gametophyte)和雄配子體(male gametophyte)單個分離培養，可形成無性繁殖系(clone)。傳統的種質保存技術就是將無性系繼代培養保存，傳統保存技術具有明顯的不足(1)液體培養是唯一的保存途徑，手段單一，限制了保存的規模和效率；(2)液體培養保存一般需要在半月內更新一次培養液，工作量大，操作繁瑣，頻繁操作也增加了種質污染及混雜的機會；(3)采孢子前無法對種海帶進行無菌處理，整個保存過程都在有菌條件下，不能徹底杜絕微生物尤其雜藻的污染；(4)培養中細胞形態異常、單性生殖等現象時有發生，培養因子有待進一步優化。因此，目前的保種技術是一種傳統的繼代培養保存的方法，無法完全排除混雜、污染、變異的可能性，還不能作到種質永久保存。
藻類種質超低溫保存的研究開始于20世紀60年代，80年代以后發展速度較快，從淡水藻類到海水藻類，從微藻類到大型藻類，從非經濟藻類到經濟藻類都給予了較多的關注。藻類超低溫冷凍保存的方法主要是兩步冰凍法(two-stepfreezing)，該方法首先在保存材料中加入抗凍保護劑，進行預凍，再將預凍過的材料投入液氮中快速冷凍，目前已成為藻類種質冰凍保存的常規方法；超低溫兩步法凍存在大型經濟藻類中使用的種類有紫菜和裙帶菜，目前有關海帶無性系兩步法超低溫保存仍為一個空白。
發明內容
本發明的目的在于改進已有的繼代培養保存無性系技術的不足，而提供一種用于海帶無性系超低溫保存，存活率高，自動化程度高，利于該技術標準化的海帶無性繁殖系程序降溫凍存法。
本發明的目的是這樣實現的，海帶無性繁殖系程序降溫凍存法，其特點是該方法包括以下步驟材料預處理、平衡、降溫、復蘇和去除保護劑。
材料預處理是將無性系用組織破碎儀切割成100-200um的小段，在光強1500±200Lux，光時L∶D 24∶0，水溫10～15℃，營養鹽NO3-N6-10g/m3，PO4-P1-2g/m3的條件下培養兩周以上。
平衡是將絲狀體置于在0-4℃冰箱預冷的10％DMSO溶液中，并在冰箱中平衡30min。
降溫是平衡結束后，用醫用注射器將絲狀體與DMSO混合液注射到0.5ml的麥管中，插入程序降溫儀冷凍腔內，開始降溫，降溫從0℃開始，以-2℃/min的速率降到-40℃，并在-40℃上停留30min，然后投入液氮。
復蘇是超低溫冰凍后，將麥管從液氮中取出，迅速移到26℃恒溫水浴中快速震蕩，至最后一粒冰晶消失移入冰水浴中。
去除保護劑是將混合液經500目篩絹過濾，濾出的無性系移入培養液中培養。
本發明與已有技術相比具有以下顯著特點和積極效果本發明采用超低溫程序降溫凍存海帶無性系，將海帶無性系首先按照程序逐漸降溫進行預冷，然后投入液態氮中冷凍保存，使海帶絲狀體在超低溫(-196℃)狀態下代謝完全停止，生命以靜止的形式可以在這種狀態下長期保存，解凍后又可恢復其原有的生物活性和遺傳特性，有效地解決了海帶無性系種質保存中污染、混雜、變異的問題，實現海帶絲狀體種質的永久保存。本發明方法與無性系逐級冷凍保存法相比一是提高了成活率，二是自動化程度高，利于該技術的標準化，但對降溫設備要求較高，因此適合大型科研院所使用。無性系程序降溫凍存法和逐級冷凍保存法是用途、性質不同的兩種方法，有同時存在的必要性。
四、具體實施方案下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明。
實施例，海帶無性繁殖系程序降溫凍存法，包括材料預處理、平衡、降溫、復蘇和去除保護劑五步驟，材料預處理是將無性系用組織破碎儀切割成100-200um的小段，在光強1500±200Lux，光時L∶D24∶0，水溫10～15℃，營養鹽NO3-N 6-10g/m3，PO4-P 1-2g/m3的條件下培養兩周；平衡是將無性系置于在0-4℃冰箱預冷的10％DMSO溶液中，并在冰箱中平衡30min；降溫是平衡結束后，用醫用注射器將絲狀體與抗凍劑混合液注射到0.5ml的麥管(straws)中，插入程序降溫儀冷凍腔內，開始降溫，降溫從0℃開始，以-2℃/min的速率降到-40℃，并在-40℃上停留30min，然后投入液氮；復蘇是超低溫冰凍后，將麥管從液氮中取出，迅速移到26℃恒溫水浴中快速震蕩，至最后一粒冰晶消失移入冰水浴中，超低溫凍存的時間可以根據需要確定，在需要對凍存無性系復蘇時結束凍存即可；去除保護劑是將混合液經500目篩絹過濾，濾出的無性系移入常規培養液中培養。
采用本發明方法保存的海帶無性系，再培養法測定存活率，存活率達73％。
權利要求
1.海帶無性繁殖系程序降溫凍存法，其特征是該方法包括以下步驟材料預處理、平衡、降溫、復蘇和去除保護劑。
2.根據權利要求1所述的海帶絲狀體程序降溫凍存法，其特征材料預處理是將無性系用組織破碎儀切割成100-200um的小段，在光強1500±200Lux，光時LD240，水溫10～15℃，營養鹽NO3-N 6-10g/m3，PO4-P 1-2g/m3的條件下培養兩周以上。
3.根據權利要求1所述的海帶絲狀體程序降溫凍存法，其特征平衡是將絲狀體置于在0-4℃冰箱預冷的10％DMSO溶液中，并在冰箱中平衡30min。
4.根據權利要求1所述的海帶無性繁殖系程序降溫凍存法，其特征降溫是平衡結束后，用醫用注射器將絲狀體與DMSO混合液注射到0.5ml的麥管中，插入程序降溫儀冷凍腔內，開始降溫，降溫從0℃開始，以-2℃/min的速率降到-40℃，并在-40℃上停留30min，然后投入液氮。
5.根據權利要求1所述的海帶無性繁殖系程序降溫凍存法，其特征復蘇是超低溫冰凍后，將麥管從液氮中取出，迅速移到26℃恒溫水浴中快速震蕩，至最后一粒冰晶消失移入冰水浴中。
6.根據權利要求1所述的海帶無性繁殖系程序降溫凍存法，其特征去除保護劑是將混合液經500目篩絹過濾，濾出的無性系移入培養液中培養。
全文摘要
本發明公開了一種海帶無性繁殖系程序降溫凍存法，其特征是該方法包括以下步驟材料預處理、平衡、降溫、復蘇和去除保護劑，本發明改進已有的繼代培養保存無性系技術的不足，提供了一種用于海帶無性系超低溫保存，存活率高，自動化程度高，利于該技術標準化的海帶無性繁殖系程序降溫凍存法。
文檔編號A01G33/00GK1732746SQ20051004420
公開日2006年2月15日 申請日期2005年8月4日 優先權日2005年8月4日
發明者張全勝, 羅世菊, 解建祖, 張壯志, 叢義周 申請人:山東東方海洋科技股份有限公司, 煙臺大學