專利名稱：由二倍體親本生產四倍體雙殼類軟體動物的制作方法
技術領域：
本發明涉及能養活的四倍體雙殼類軟體動物的生產。
背景技術：
多倍體雙殼類軟體動物的生產目前引起人們相當大的興趣，尤其就牡蠣而言。 實際上，三倍體牡蠣，也稱為"四季牡蠣"，具有數種優點。因為它們具有奇數的 染色體，所以它們通常無生殖力，這意味著一方面它們可以更快地生長(它們的能量用于 生長而非用于繁殖)，另一方面它們在夏季期間不會產生精液，這意味著它們一年到頭質 量恒定。
通過二倍體親本雜交、接著通過化學處理(通常用細胞分裂抑素B (CB)，或者任選 地用6-二甲基-氨基嘌呤(6-DMAP)處理)、或者通過物理處理(特別是熱休克或加壓處 理)保持第一或第二極體，可以得到三倍體牡蠣。然而，這兩種技術具有某些缺陷。值得 注意的是，我們會提到在倍數性水平上缺乏均一性；實際上，用于誘導極體保持的處理 會導致混雜的幼蟲種群，具有變化的倍數性水平。在幼蟲發育的末尾，得到的種群通常 含有至多90%的三倍體個體，其余的種群由二倍體組成。另外，在化學處理的情況下，利 用毒性很高的產品的那些極體很少被公眾察覺，這迫使人們經常采取嚴格的預防措施來 避免任何對于處理者的危險。
這就是為什么該方法目前優選用于生產三倍體牡蠣的原因，所述三倍體牡蠣由四倍 體牡蠣與二倍體牡蠣雜交而組成。除不要求重復依賴化學處理的優點之外，該方法還具
有可以得到均質種群的優點，所有的個體都是三倍體。該方法的主要缺陷由得到能養活 的四倍體親本的難度所引起。
人們在用于生產三倍體的實驗過程中已經觀察到可變比例的四倍體幼蟲的產生，該 實驗是通過二倍體親本雜交、并且通過用細胞分裂抑素B (CB)處理排除第一極體的保持 來生產三倍體。然而，四倍體幼蟲的這種產生表現為瞬時的；人們僅描述了在第一次受 精后24小時期間的這種現象(STEPHENS & DOWNING, J. Shellfish Res, 7, 550-51, 1988; GUO etal., Biol. Bull.， 183,381-93， 1992)。檢測到的四倍體幼蟲的比例顯著地下降，結果 在幼蟲繁殖的剩余期間或者在幼蟲定置時、尤其在微型保育器(micronursery)或保育器繁殖期間沒有四倍體幼蟲被檢測到。
人們己經提出兩種假設來解釋所有用于直接從二倍體親本得到能養活的四倍體的方 法的失敗
根據第一種假設，由于特定隱性致死等位基因的表達，等位基因的復制數變得隨著 四倍體化而改變，因此四倍性將涉及不適宜幼蟲存活的遺傳負擔(隱性致死等位基因的假 設)。然而，通過使用同血親系和野生系而進行的單雌生殖實驗趨向于顯示隱性致死等 位基因的表達不能獨立地解釋所有的四倍體在幼蟲期期間的死亡現象(郭，博士論文在
太平洋牡蠣Crassostreagigas.中的四倍體誘導的研究。華盛頓大學，西雅圖。1991)。
根據第二種假設(核質比假設)，由二倍體母本產生的卵母細胞太小，以致不能支撐
遺傳物質隨著四倍體化而加倍的細胞核。第二種假設是優選的，并且成為用于開發迄今
為止預期可得到能養活的四倍體牡蠣的方法的基礎。
第一個方法已經成功應用，包括使三倍體母本與二倍體父本雜交，并且通過誘導第
一極體的保持來阻斷減數分裂(MI)的第一階段(PCT申請WO 95/19703; GUO & ALLEN,
Mol Mar Biol Biotechnol 3， 42-50, 1994)。該方法基于如下事實有生殖力的少數稀有的三
倍體雌性產生的卵母細胞遠遠多于二倍體雌性生產的卵母細胞，以使得它們能夠支撐四
倍體細胞核。
最近，還描述了通過使四倍體雄性與二倍體雌性(此前選擇大尺寸的它們的卵母細 胞)雜交、接著進行第二極體的保持來進行能養活的四倍體牡蠣的生產(MCCOMBIE等， Mar Biotechnol (NY). 7， 318-30， 2005)。然而，目前，在實踐中使用的生產四倍體的僅 有方法是使三倍體雌性與二倍體雄性雜交。然而，該方法具有如下兩個主要缺點
1) 因為由具有可評估的繁殖力的三倍體得到這些四倍體，故這些用于生產新一代三 倍體的相同的四倍體的使用會導致由連續世代得到的三倍體繁殖力的增強。因此，研究 發現平均繁殖力從第一代三倍體的2% (在通過CB處理進行第二極體的保持之后得到的
"化學"三倍體)增強至由四倍體父本與二倍體母本雜交而得到的第二代三倍體的13.4% (GUO & ALLEN, Biol. Bull" 187, 309-18, 1994)。這種在整個世代繁殖期間繁殖力增強的 風險導致會出現在繁殖力將不斷增強的三倍體種群的長期或短期中，使得我們冒累進的 環境不育化的風險，冒土生二倍體牡蠣的保藏污染的風險。這是三倍體牡蠣繁殖的結 果，該三倍體牡蠣的后代顯著地是非整倍體。
2) 需要經過三倍體，這使得在四倍體水平上導入任何通常在二倍體水平上所獲得的 遺傳改進特別困難和繁重。實際上，作為遺傳選擇程序的結果的改良二倍體系必須首先
4通過傳統的化學誘導方法用于生產三倍體。僅僅在后來，能夠達到成熟并產生卵母細胞 的很少的三倍體才可以用作母本以便生產四倍體。
因此，似乎特別期望有一種生產四倍體牡蠣的方法，通過該方法有可能直接由二倍 體階段跨至四倍體階段，而無需經過三倍體階段。
本發明人提出如下假設通過雜交二倍體親本產生的四倍體除幼蟲期外不能存活的 原因可能不是因為二倍體卵母細胞相對于四倍體細胞核太小，并且其原因可能顯著地包 括由四倍性導致的適應值(即，總體存活能力)的普遍下降。這種適應值下降或許歸因于 特定的負性等位基因的表達，該基因通常在二倍體和三倍體中被抑制、但是在四倍體中 不被抑制或僅被局部地抑制。
這將導致四倍體幼蟲的低競爭性，并且因此當將四倍體幼蟲與二倍體和三倍體幼蟲 混合繁殖時，它們會快速消失。這種情況也存在于由二倍體親本雜交、接著保持第一極 體而得到的幼蟲種群中。
基于這種假設，本發明人斷定對幼蟲進行分類以便分離出四倍體，并且使它們能夠 避免由二倍體和三倍體幼蟲產生的極強的競爭，將有可能從僅涉及野生型二倍體親本的 雜交開始而得到能養活的四倍體。
發明內容
發明人因此開發了一種方法，該方法基于如下步驟檢測四倍體幼蟲；分離含有高
比例四倍體幼蟲的幼蟲亞群；以及繁殖該亞群。根據在開發過程中的需要多次重復這些階段。
這樣，發明人發現，四倍體幼蟲顯著地具有如下特征與二倍體和三倍體幼蟲相比， 其在相同的生長階段具有更慢的生長以及更小的尺寸。這一觀測證實了本發明人創立的 關于四倍體幼蟲的適應值會下降的假設。另外，這可以簡化用于得到富集四倍體幼蟲的 種群的幼蟲的分類，因為該分類可基于幼蟲大小來進行。
因此，本發明涉及一種生產四倍體雙殼類軟體動物的方法，其特征在于，其包括
a) 用來自二倍體雄性的精子使來自二倍體雌性的卵母細胞受精，接著誘導受精卵第一
極體的保持；
b) 培養在所述受精之后得到的幼蟲；
c) 從在b)階段培養的幼蟲種群中分離出富集四倍體的亞群，該亞群包含至少20%、 優選至少30%的四倍體幼蟲；d) 培養在c)階段分離的幼蟲亞群。
經典地，通過任何可誘導微小管組裝抑制性的處理，能夠誘導第一極體的保持，該
處理通常在受精后第5分鐘至第25分鐘之間進行，處理時間可在10-20分鐘之間改變。例 如，能夠用化學試劑比如秋水仙堿、咖啡因、諾考達唑(nocodazole)、細胞分裂抑素B、 或6-DMAP處理；或者用物理處理方法比如適度的熱休克或高壓休克處理。
具體實施例方式
根據本發明的優選實施方式，用細胞分裂抑素B處理來誘導第一極體的保持。用細胞 分裂抑素B處理能夠在受精后第5分鐘至第25分鐘之間進行，處理10至20分鐘。優選從受 精后第10分鐘開始進行，處理約15分鐘。尤其有利的是，細胞分裂抑素B以0.3至0.7 mg、 優選0.5 mg左右每升處理介質的終濃度被使用。這些濃度，其強度相當于通常用于誘導在 三倍體牡蠣生產中第一極體的保持的那些濃度的一半，這可以限制細胞分裂抑素B的毒性 作用，但是不會減小誘導的效果。
也可以使用其它的化學試劑比如秋水仙堿、咖啡因、諾考達唑、或6-DMAP (300至 500 ^mi)代替細胞分裂抑素B;或者使用物理處理手段比如適度的熱休克(30至40。C)或 高壓休克。對于每一種處理，所選擇的條件優選相比當使用相同的處理用于在三倍體牡 蠣的生產中誘導第一極體的保持時更適度。
特別有利地，根據本發明的方法包含下述附加的階段
e) 從前階段培養的幼蟲亞群中，分離出富集四倍體的亞群，該亞群包含至少20%、優 選至少30%四倍體幼蟲；
f) 培養在e)階段分離的幼蟲亞群。
通常，在階段b)中的培養進行6至10天、優選約8天；并且在階段d)和f)中的培養進 行2至3天。
富集四倍體的亞群的分離以及分離的亞群的培養的這些階段可重復若干次，直到幼 蟲達到甸足面盤幼蟲階段(大小在220至250(^m之間)。這些階段優選重復至少3次、優選 至少4次、優選重復間隔2至3天。
根據本發明方法的尤其優選的實施方式，將幼蟲分類以分離富集四倍體的亞群是基 于它們的大小而進行的。
實際上，如上所述，四倍體幼蟲小于在相同生長階段的二倍體和三倍體幼蟲。 一般 來講，在相同的生長階段、并且在相同的條件下培養，四倍體幼蟲的平均尺寸比相同種類的二倍體幼蟲的平均尺寸小20至30%，比相同種類的三倍體幼蟲的平均尺寸小25至 35%。
這意味著幼蟲能夠簡單地經過有適當網孔的篩子而被容易地分類，該篩子根據所討論 的種類、幼蟲演變階段、以及培養條件選擇。
優選地，包括分離富集四倍體的亞群和培養分離的亞群的附加階段能夠在匍足面盤 幼蟲階段之后、在定置牡蠣卵上進行。從該階段開始，優選附加階段與此前階段的重復 相比重復間隔更長，例如每次重復為8到15天。
在該情況下，為了進行篩子分類，提供給匐足面盤幼蟲的附著基底包含大小大致等 于幼蟲定置期間的大小的顆粒，從而允許每個顆粒上附著單個幼蟲。使用的基底顯著地 能夠是通過研磨牡蠣殼得到的微裂(microsplinter)顆粒。
在每個亞群分離階段以后，如果需要，選擇的亞群中四倍體的百分比能夠通過慣常 的倍數性水平測定的方法進行檢驗。例如，我們能夠在取自所述亞群的含至少100個個體 的樣本上使用流式細胞術。
根據本發明的方法可以用于我們希望其用于生產四倍體(顯著地著眼于通過使用它們 用于生產三倍體)的所有種類的雙殼類軟體動物(例如尸e"/mWae (扇貝)、貽貝(J\^"/m Mw//^]M>^/^gfl//oprav/"c/a/&)、蛤等)。這對于四倍體牡蠣的生產特別有益，并且，例 如，這不僅能夠用于如下述實施例中所示太平洋牡蠣(Cra^o欣eag/goy)種類的牡蠣，而 且能夠用于巨蠣屬Cra^oW"a (特別是美洲牡蠣(OawoWrea Wrg/m'aO ) 、 SaccoWrea (例 如商品牡蠣(&cco欲eacowwwc/ato)的任何其他種類、或者用于長牡蠣屬中的種類比如 食用牡蠣(ay&eae^/fc)。
根據本發明的方法有可能從任何二倍體親本開始得到能養活的四倍體雙殼類軟體動 物，特別是牡蠣。特別地，其不需要以它們的卵母細胞大小為基準而任意選擇母本。
其有可能直接從二倍體野生型親本產生四倍體親本-無需經過三倍體階段。然后這些 四倍體親本能夠用于三倍體的生產，而沒有如上所述的風險，這與在整個繁殖期間三倍
體的繁殖力增強有關系。
根據本發明的方法還有可能在四倍體中直接導入在二倍體中得到的遺傳改良。為 此，足以使用由所選擇二倍體系的動物得到的卵母細胞和精子作為用于該方法的起始原 料。得到的四倍體然后能夠用于三倍體的生產，該三倍體也結合了相同的改良。
通過補充的下述內容，對本發明進行更好的理解。參考實施例，其顯示了本發明用 于生產能養活的四倍體牡蠣的應用。實施例l:多倍性的誘導和幼蟲的繁殖
用于實驗的二倍體親本來自在法國牡蠣016ron海灣(Marennes 016ron Bay)天然的野 生型二倍體牡蠣卵采集區域。六個母本和四個父本被用于通過生殖腺劃破法進行聚集配 對。由10個親本得到的1500萬個卵母細胞和30億個游動精子被用于在1升的過濾海水中于 25。C下進行雜交。通過使用溶于DMSO的細胞分裂抑素B (CB)來影響第一極體的保持， 直至終濃度為0.5 mg/L。從受精后第10分鐘開始，CB被使用15分鐘。
用于誘導多倍性的該方案類似于巳經在文獻中公開的用于生產三倍體的那些方案 (GUO et al.， Biol. Bull" 183， 381-93, 1992; GERARD et al.， Aquaculture, 174, 229-42 1999)。 然而，CB的終濃度被降低(0.5mg/L，而不是lmg/L)，以便限制該產品的毒性作用，但 沒有降低多倍性的誘導程度。
然后在通過IO lam網孔的尼龍過濾器篩選胚胎并且在含有0.1。/。 DMSO的過濾海水中洗 滌15分鐘之后除去CB。
作為對照，由相同親本得到的1500萬個卵母細胞和50億個游動精子被用于在相同的 條件下進行雜交，只是不用CB處理。
然后將來自兩個組(對照組和CB處理組)中每一組的胚胎返回到在含有150 L過濾海 水的圓柱狀錐頂罐中，在22。C下，通過并入繁殖罐的鼓泡器通氣進行培養。
如此能夠估計孵化的速度和幼蟲的可能死亡率，后者在受精24小時后通過45 nm直徑 的過濾器被篩出來、收集在含有1L或2 L過濾海水的量筒中，并且由在50 pl樣本中的計數 來估計幼蟲的總數。
另外，通過流式細胞術確定幼蟲的倍數性。在每次篩選后，取幼蟲樣本(至少I00個 幼蟲)并且放進1.5mL試管中。在通過短暫離心除去海水后，將幼蟲加入l mL溶菌緩沖液 (5mMMgCl2， 85mMNaCl， lOmMTris， 0.1% TRITON X-100， pH7)中。然后，用塑 料塞子磨碎幼蟲，并且通過30 )am網孔的尼龍過濾器(Partec Celltrics)過濾釋放出的細胞 核，收集在細胞計數分析試管中。然后，通過加入l mL含有2ng/mlDAPI的溶菌緩沖液和 2(aL倍數性內部對照物(鱒魚紅血球，TRBC， Coulter DNA參照標準No. 629972)，用終 濃度為l 1^g/ml的DAPI (4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽)進行標記。
在冰上避光孵育30 min的最小孵育時間之后，通過使用Partec PAII細胞計數器進行細 胞計數分析。每一個分析(通道FL4， 1024個通道的線性刻度)都是對最少2000個顆粒進 行的。得到的結果顯示在頻率直方圖表格中，在每個峰內都有高斯分布的發生。當它們被FloMaxTM軟件自動識別時，峰被記錄為"峰x";或者當它們被操作者人工識別時，峰 被記錄為"RN/PKx" (x是峰的數量)。
在CB處理組中，幼蟲D在D1 (即，受精后第l天)的比例估計為16.5% (相對于未處理 對照組的42%)，其代表幼蟲D的種群為大約250萬個幼蟲。
從受精后第二天開始，在篩選后每隔一天更新一次水。直至受精后D6(g卩，第6天)， 通過45 Mm的過濾器篩出幼蟲。在每次更新時，對幼蟲進行計數，并且如上所述，通過流 式細胞術確定它們的倍數性水平。
然后使幼蟲返回到它們各自的圓柱狀錐形繁殖罐中，觀察到在受精后D4(即，第4天) 幼蟲的最大密度10，000個幼蟲/L，并且在受精后D6 (即，第6天)為6500個幼蟲/L。
每天用在實驗室中培養并且含有70%大溪地(Tahiti)菌株金藻(/soc^"" ga/6a"a) 和30%纖細角毛藻(Ctoetocemy的食物藻類混合物以25個細胞/pL/天的濃度喂養 幼蟲。
在繁殖第一時期期間的存活率監控顯示，在受精后第1天和第6天之間幼蟲存活率有 明確的降低(圖l)。該降低能夠同時被下述兩種影響解釋用CB處理的有害影響和尤其 是在繁殖罐中幼蟲的高密度的影響。
在受精后第1天和第6天之間，未處理的幼蟲和用CB處理的幼蟲的細胞計數分析顯
示
-對照物雜交具有排他的二倍體細胞核的種群(圖2，"峰l");
-由GPI保持的誘導得到的幼蟲樣本顯示出(圖3和圖4)三個類型細胞核的種群，分別 對應于下述倍數性水平二倍體(平均20%左右，"峰l")、三倍體(平均40%左右，"峰 2")和四倍體(平均40%左右，"峰3")。
在受精第6天后，幼蟲種群穩定化，并且幼蟲的繁殖可連續，未發生值得注意的死亡 率，直至幼蟲定置。
篩選在早上進行，并且每隔兩天或三天進行。直至受精后第6天，通過45 pm的篩子 非選擇性地篩出幼蟲。
緊接著，采用針對幼蟲目標種群的篩分尺寸進行選擇性的篩分，并且基于它們的生 長速度(從不同的篩子尺寸估計)、以及它們的倍數性水平(通過流式細胞術檢驗)組成 不同的幼蟲種群。
用這種方法，組成稱為"批次頭部"的具有較強演變的種群、稱為"批次軀千"的具 有中等演變的種群、以及稱為"批次尾部"的具有緩慢演變的種群作為上述兩個標準的函數，并且被保持在相分離的罐中。這種與大小和倍數性有關的選擇性分類方法的最終目 的是，在繁殖批次不同部分內部通過最大化來最有利于四倍體幼蟲的生長和存活，最有 利于它們相對于二倍體和三倍體幼蟲的比例。
*這樣，在受精后D8 (即，第8天)，進行用于幼蟲大小的第一次篩分選擇，并且兩 個幼蟲種群分離地繁殖種群"批次I頭部"具有正常生長和80 ^m的最小尺寸，而種群 "批次I尾部"具有較慢的生長，并且大小在65 pm和80 nm之間。
下述篩選分別在受精后Dll、 D13、 D15、 D18、 D20、 D23、 D25、 D27、以及D29進行。
*在受精后Dll，在對照組上、以及在用CB處理的兩個幼蟲種群上進行的細胞計數
分析顯示
-對照物雜交仍然具有排他的二倍體細胞核的種群(圖5，"峰l"，而峰"峰2"對應 于內部對照TRBC);
-由具有最小尺寸80 (am (1^80 pm)的種群"批次I頭部"得到的處理后的幼蟲樣本 表明，該種群單獨地由二倍體幼蟲(占57%， "PK1")和三倍體幼蟲(占43%， "PK2") 組成。在那里沒有檢測出四倍體幼蟲的比例(圖6，峰"PK3"，對應于內部對照TRBC)。
-由具有小于80nm(65 nnKT〈80nm)大小的種群"批次I尾部"得到的處理過的幼 蟲樣本表明，該種群具有完全不同的組成，不論就倍數性分類而言，還是就倍數性分類 比例而言。細胞計數分析表明，該種群由15%的二倍體幼蟲(峰1)、 40%的三倍體幼蟲(峰 2)和尤其是45%的四倍體幼蟲(峰3)組成(圖7中峰"峰4"對應于內部對照TRBC)。
該結果顯示，繁殖的全部幼蟲種群中的四倍體組分限制在幼蟲繁殖的"批次尾 部"，因此證實了我們的假設，根據該假設，當具有不同倍數性水平的幼蟲被混合在一 起繁殖時，它們存在著有差別的演變。因此，倍數性的四倍體水平顯示，當其與二倍體 和三倍體水平競爭時，其給出了最低的生長速率。
下述繁殖，要特別注意種群"批次I尾部"，其是唯一"^個含有四倍體的種群，并且 對所述"批次I尾部"種群進行兩次選擇性的篩選，即，在通過60 nm和80 nm篩選之后'
從而能夠分離出四倍體幼蟲逐漸富集的兩個亞群。
這樣，第一個亞群(稱為"批次l尾部")的幼蟲組成是其尺寸大于65]am，并且小
于80nm;而第二個亞群(稱為"批次I軀干")的幼蟲組成是其尺寸大于或等于80 nm， 并且通常直至IOO nm。
*在受精后D13，對未處理的幼蟲或用CB處理的幼蟲進行的細胞計數分析顯示
10-未處理的對照物仍然僅顯示排他的二倍體細胞核(圖8中峰"RN1"，峰"RN2"對 應于內部對照TRBC)。
-處理過的幼蟲種群"批次I頭部"繼續唯一地由二倍體幼蟲(45%，峰l)和三倍體 幼蟲(55%，峰2)組成(圖9中"峰3"對應于內部對照TRBC)。該種群由展示出正常生 長的并且已經達到最小尺寸100 pm的幼蟲組成。
-處理過的幼蟲種群"批次I軀干"和"批次I尾部"是僅有的兩個仍然顯示較高四倍 體幼蟲比例(40至50%,在
圖10中表示為峰"峰3"，并且在圖ll中為"RN3")的種群。 峰"峰l-2-4"和"RN1-2-4"分別對應于
圖10和
圖11中的二倍體、三倍體細胞核和內部對 照TRBC。
*在受精后D15，我們的努力集中在處理過的幼蟲(含有四倍體)種群"批次I軀干" 和"批次I尾部"的繁殖的條件。通過使用網孔65、 100和125(am的篩子，對這些種群進行 選擇性的篩選，以便組成新的亞群
-具有較強的生長，稱為"批次II頭部"，其大小在125和150pm之間；
-具有中等生長，稱為"批次II軀干"，其大小在100和125)am之間；
-^S^很弱^fe長，稱為"批^3I尾部"，其大/J彌5和l(X^m;tJ司。
對未處理的幼蟲和用CB處理的幼蟲進行的細胞計數分析顯示
-未處理的對照物仍然僅顯示排他的二倍體細胞核(
圖12中"峰l";"峰2"對應于 內部對照TRBC)。
-處理過的幼蟲種群"批次I頭部"仍然唯一地由二倍體幼蟲(以45%的水平)和三倍 體幼蟲(以55%的水平)組成。
-用CB處理的幼蟲種群"批次II頭部"(150nm>T^125|am)、"批次II軀干"(125 )iim > K 100 |um)和"批次II尾部"(100 jam > K 65 |im)繼續顯示出值得注意的四倍體 幼蟲比例(
圖13、
圖14、
圖15中峰"RN 1-2-3-4"分別對應于二倍體、三倍體、四倍體細 胞核、以及內部對照TRBC)。然而，該四倍體種群的尺寸使繁殖批次的一個部分明顯不 同于另一個部分。四倍體幼蟲的比例在"批次II頭部"中是最低的(15%)(
圖13，峰 "RN3")，并且在"批次II尾部"中是最高的(50%)(
圖15，峰"RN3")。在"批次 II軀干"部分，四倍體幼蟲的比例具有中間值(28%，
圖14，峰"RN3")。因此，顯而易 見，具有最大四倍體幼蟲含量的繁殖批次是雜交最慢的幼蟲，這再一次強調了三個倍數 性水平的適應性一般數值的差異，并且需要進行選擇性分類以維持四倍體幼蟲。*在受精后D18,在種群"批次I頭部"(T^250|imi)中一些處理過的幼蟲是甸足面盤 幼蟲，并且在未處理的對照物幼蟲之前兩天開始定置。在D18進行的細胞計數分析繼續在 對照物中顯示排他的二倍體水平(
圖16中"峰l";"峰2"對應于內部對照TRBC)、以 及在種群"批次I頭部"中二倍體(30%，"峰l")和三倍體(70%，"峰2")的混合物 (
圖17中"峰3"對應于內部對照TRBC)。
*在受精后D20和D23，而未處理的對照物繼續顯示排他的二倍體水平(
圖18和圖22， "峰l")，含有四倍體幼蟲的繁殖批次((批次II頭部(T^180pm);批次II軀干(180 iam 〉K 150 pm)和批次II尾部(150 jam >K 100 jam))大致顯示出與受精后D15相同的四倍 體幼蟲比例(四倍體分別為20%、 35%和45%，由
圖19-21和圖23-25中峰"RN/峰3"表示， 其中其他的峰"峰/RN 1-2-4"分別對應于二倍體、三倍體、以及內部對照TRBC)。另 外，即使它們的生長與未處理的對照物相比似乎明顯較慢，但這些幼蟲始終顯示出它們 最小尺寸的增加(在受精后D23各自的最小尺寸為180nm、 150 iam和lOO nm，而在受精后 D15為125nm、 100nm和65—。
*在受精后D25，含有30%四倍體幼蟲(圖26中峰"RN3"，其他的峰"RN 1-2-4"分 別對應于二倍體、三倍體、以及內部對照TRBC)的第一群匐足面盤幼蟲(K250 iam)定 置在牡蠣殼的微小碎片上。在D27和D29四倍體幼蟲的第一次附著之后，含有20至40%范 圍的可變比例的四倍體幼蟲(圖27、 28和29中峰"峰3";其他的峰"峰l-2-4"分別對應 于二倍體和三倍體細胞核、以及內部對照TRBC)的匐足面盤幼蟲緊接著進行三次定置。
實施例2:四倍體牡蠣卵的定置和生長
定置后l個月
在定置后l個月，通過流式細胞術在成功變性和定置的幼蟲種群內部進行四倍體牡蠣 卵的存在的檢查。由于在該階段牡蠣卵的較小尺寸，在某時在含有一些牡蠣卵的樣本上 破壞性地進行該操作。將牡蠣卵放進1.5 mL試管。然后它們在l mL的溶菌緩沖液中孵 育，并且通過使用塑料塞子將它們磨碎。最后，通過30 pm網孔的尼龍過濾器(Partec Celltrics)過濾釋放出的細胞核，并且收集在細胞計數分析試管中，按照在上述實施例l中 描述的方法用DAPI標記并進行分析。
細胞計數結果使我們能夠證實，除三倍體和二倍體種群之外，四倍體牡蠣卵(29%) 種群也顯著存在(圖30中"峰3";峰"峰l-2-4"分別對應于二倍體和三倍體細胞核以及
12內部對照TRBC)。該四倍體牡蠣卵種群因此在微型培育器中成功地定置并且繼續其生 長。
該結果表明，可直接由二倍體親本產生四倍體牡蠣卵，其可存活至幼蟲繁殖階段并 且存活至允許定置的變形。另外，得到的四倍體牡蠣卵甚至在定置以后可繼續生長。
在定置后2個月，再一次通過流式細胞術在3個月大牡蠣卵種群內部檢查四倍體牡蠣 卵的存在，以破壞性模式但是在各個互不相同的牡蠣卵上進行。
我們的研究結果使我們能夠證明3個月大四倍體牡蠣卵的存在(圖31)。如同在幼蟲 繁殖期間顯示的那樣，個體的倍數性水平與其在微型培育器繁殖期間的大小相關也顯示 了有差別的演變。實際上，生長緩慢的四倍體牡蠣卵種群表現出相當受限于繁殖的"批 次尾部"和"批次軀干"部分，而"批次頭部"部分表現為由生長更快的二倍體和三倍 體牡蠣卵組成。
此后，為了促進四倍體的生長，我們因此采用與幼蟲繁殖期間采用的相同的方法 即，用于根據牡蠣卵的大小和倍數性水平對它們進行分類的系統，從而組成具有最大可 能含量的四倍體牡蠣卵的繁殖批次，并且使四倍體牡蠣卵與三倍體和二倍體牡蠣卵進行 最小可能的競爭。
在實踐中，通過網孔范圍為150 pm至2 mm、穿過中間尺寸為350 pm、 500 nm和1000 !^n的矩形篩子(45X35X12厘米)，使各個互不相同的牡蠣卵經受連續的選擇性篩分。
這些選擇性篩分每隔15天的定期間隔進行。根據與下述幼蟲繁殖階段期間類似的方 法，分別組成并繁殖"批次頭部"、"批次軀千"和"批次尾部"種群。
在定置后6個月時，7個月大的牡蠣卵開始可進行單個的標記，并且從它們的鰓活檢 樣本進行非破壞性倍數性水平檢驗。這樣，每個個體通過用環氧樹脂粘合劑膠粘至其殼 的塑料標簽而被識別。然后使待分析的個體在含有150 g的MgCl2的3升海水池中麻醉，從 而有可能得到鰓活檢樣本，用于進行動物的倍數性測量。在該階段，對總共600個個體進 行的細胞計數分析己經使我們能夠分類出超過90個建立的幼小四倍體牡蠣，平均15%比例 的四倍體牡蠣直接從野生型二倍體親本誘導而來(圖32)。
定置后8-9個月
在定置后8個月，我們的細胞計數分析使我們能夠進行超過200個尤其是在"批次尾 部"和"批次軀干"種群中發現的四倍體個體的分類。出于對可用空間的考慮，個體的分類在該階段被終止。
在定置后9個月，將平均大小為6厘米的約20個個體調節成允許開始成熟并產生配 子。這些未來的親本習慣于20 。C、含有2"09個細胞的浮游植物/每天/每個體的海水。在 該適合于成熟的時期后，對四倍體親本進行數次休克(熱休克和外顯性(ofexondation), 以便引起產卵。在30個被調節成熟的親本中，18個親本以明顯有利于雄性性別比率U7個 雄性和l個雌性)的方式產卵，這完美地符合太平洋牡蠣(C. g/g^)的雄性先熟本性。為 了測試這些四倍體親本產生的配子，我們進行了兩種類型的雜交
第一類型是，通過與17個四倍體雄性產生的四倍體精子混合，使僅由四倍體雌性得 到的四倍體卵母細胞受精。
第二種類型是，使來自6個野生型二倍體雌性的卵母細胞用由17個四倍體雄性得到的 精子受精。
我們的結果清楚地顯示，受測親本產生的配子完全能養活并受精。因此，通過它們 之間雜交，新的四倍體僅產生四倍體幼蟲(圖33， 100%的四倍體，由峰"RN1"表示；峰 "RN2"代表內部對照TRBC)，并且通過與二倍體雌性雜交，四倍體雄性僅產生三倍體 后代(圖34， 100%的三倍體，由峰"峰l"表示；峰"峰2"代表內部對照TRBC)。目前， 這些新的四倍體世代和三倍體世代巳經變性并且定置，并且在微型培育器(大小在500)am 和1000 pm之間)中被繁殖。
總之，我們成功地由二倍體親本生產出四倍體牡蠣。這些相同的四倍體，在用于配 子成熟的調節性處理之后成功地經歷配子形成，并且能夠產生完全能養活并受精的四倍 體雌性、雄性配子。當這些四倍體彼此雜交時，它們能夠生產新一代的完全能養活的四 倍體。最后，當它們被用作父本用于使二倍體雌性受精時，這些相同的四倍體生產出新 一代的也完全能養活的三倍體，這樣就開發出了一種能使用這些四倍體親本作為提供三 倍體系的親本的途徑。
定置后超過9個月(2Q07年2月至2008年3月)
通過細胞計數分析并且使用經典的染色體組型技術進行鰓組織的染色體計數后，確 定了由二倍體雄性和雌性雜交而得到的第一代四倍體牡蠣(直系的四倍體牡蠣，在下文中 稱為"TM1")的倍數性水平。與同歲并在相同環境中繁殖的普通的四倍體牡蠣(即，由 三倍體雌性而得到的那些)相比，第一代直系四倍體牡蠣"TM1"己經顯示出甚至更大的 耐久性，并且重量增加(圖35)。因此，在繁殖20個月后，第一代四倍體(TM1)比普通的四倍體(2006-01)重1.86倍。另外，TM1保藏證明是特別耐久，因為那里沒有發生死 亡；相比之下普通四倍體的保藏(2006-01)已經遭受數個死亡，尤其在夏季。
在2007年初，第一代直系四倍體牡蠣"TM1"被用作雄性和雌性親本以便緊接著自 然產卵后生產第二代直系四倍體牡蠣(在下文中稱為"G2TM1" ) 。 G2TM1幼蟲和牡蠣卵 的四倍體性也通過細胞計數分析和使用經典染色體組型技術的染色體計數確定。G2TM1 牡蠣卵全部是四倍體，并且不論是在幼蟲階段、微型培育器階段還是培育器階段，它們的 繁殖都不會以任何方式不同于普通的繁殖。在繁殖期間，G2TM1牡蠣卵顯示出非常好的 性狀，尤其就耐久力、生長和四倍性水平穩定性而言。因此、與同歲并且在相同環境中 繁殖的普通的(即、由三倍體雌性得到的)四倍體牡蠣卵(2007-01)相比，即使G2TM1 牡蠣卵的水平恢復至較低倍數性水平，也不會表現出與普通四倍體牡蠣卵不同，它們顯 示出優良得多的生長性和耐久力。實際上，在繁殖9個月后，G2TM1保藏物由四倍體個體 組成，其平均總重量是75克左右，而普通四倍體僅是27克左右，這意味著G2TM1個體平 均比同歲的普通四倍體重2.7倍(圖36)。另夕卜，相比2007-01保藏物，G2TM1保藏物已經 證明特別強壯，因為那里沒有發生死亡。
從2007年11月開始，定置后9個月大的G2TM1四倍體被調節成熟，并且2.5個月后，它 們被用作親本以通過誘導產卵來生產配子，這些配子在2008年2月被用于生產在下文中稱 為"G3TM1"的第三代直系四倍體。G2TM1四倍體親本的性別比率和它們的繁殖力不會 不同于二倍體親本。產生的G3TM1幼蟲當然是四倍體。并行地，為了生產三倍體， G2TM1雄性也被有效地用于使二倍體雌性產生的卵母細胞受精。
上述結果表明，根據本發明得到的四倍體可非常有效地用于生產三倍體。如同二倍 體一樣，四倍體牡蠣在它們的第一歲期間達到成熟。這些成熟四倍體牡蠣(商氏太平洋牡 蠣(Oawo^r^Thunberg)具有正常的性別比率和可與二倍體相比的繁殖力。在四倍 體和二倍體之間雜交能夠容易并通常地進行。根據流式細胞術的倍數性檢查，所有四倍 體與二倍體雜交(反之亦然)皆可唯一地產生三倍體牡蠣卵。
實施例3:在貽貝中四倍體的生產
通過使用在實施例1和2中詳述的方法，在貽貝(M e^/^和似W/iwga〃o; raw'wcZafc) 中有效地得到了四倍體。
在貽貝中，細胞計數結果證實，除了三倍體和二倍體種群之外，還存在占優勢的四 倍體牡蠣卵種群。因此，
15-對照物雜交可提供排他的二倍體細胞核的種群(圖37，峰"RN1");
-由GPI保持的誘導得到的樣本顯示出三個類型的細胞核種群(圖38)，分別對應于下 述倍數性水平二倍體(平均10%左右，峰"RN1")、三倍體(平均20%左右，峰 "RN2")和四倍體(平均70%左右，峰"RN3")。得到的四倍體個體正處于繁殖過程 中。
總而言之，通過使用上述實施例詳述的方法，采用與用于太平洋牡蠣和貽貝的方式 相同的方式，在所有的雙殼類軟體動物中都能夠制備出能養活的四倍體。
權利要求
1.一種生產四倍體雙殼類軟體動物的方法，其特征在于，其包括a)用來自二倍體雄性的精子使來自二倍體雌性的卵母細胞受精，接著誘導受精卵第一極體的保持；b)培養在所述受精之后得到的幼蟲；c)從b)階段培養的幼蟲種群中分離出富集四倍體的亞群，所述亞群包含至少20％的四倍體幼蟲；d)培養在c)階段分離的幼蟲亞群。
2. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，通過用細胞分裂抑素B處理，來誘導所述第一極體的保持，所述處理在受精后第5分鐘至第25分鐘進行，處理時間為10至20分鐘。
3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述細胞分裂抑素B以0.3至0.7 mg每升處理介質的終濃度被使用。
4. 如權利要求1至3中任一項所述的方法，其特征在于，在b)階段的所述培養進行6至8天。
5. 如權利要求1至4中任一項所述的方法，其特征在于，在d)階段的所述培養進行2至3天。
6. 如權利要求1至5中任一項所述的方法，其特征在于，還包含下述附加的階段e) 從前階段培養的幼蟲亞群中，分離出富集四倍體的亞群，所述亞群包含至少20%的四倍體幼蟲；f) 培養在e)階段分離的幼蟲亞群。
7. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，在f)階段的所述培養進行2至3天。
8. 如權利要求1至7中任一項所述的方法，其特征在于，所述富集四倍體的亞群的分離是基于所述幼蟲的大小通過對幼蟲分類而進行的。
9. 如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述富集四倍體的亞群的分離是通過穿過適當網孔的篩子而進行的，并且所選擇的幼蟲不被所述篩子保留。
10. 如權利要求1至9中任一項所述的方法，其特征在于，所述雙殼類軟體動物是牡蠣。
11. 如權利要求1至9中任一項所述的方法，其特征在于，所述雙殼類軟體動物是貽貝。
全文摘要
本發明涉及一種用于生產能養活的四倍體雙殼類軟體動物的方法，其包括用二倍體雄性精子使二倍體雌性卵母細胞受精；接著誘導受精卵第一極體的保持；從得到的幼蟲中分離富集四倍體的幼蟲亞群；以及選擇改良的亞群。
文檔編號A01K67/00GK101677524SQ200880012642
公開日2010年3月24日 申請日期2008年3月19日 優先權日2007年3月23日
發明者克里斯托夫·勒迪, 阿卜杜拉·貝納德爾姆納 申請人:法國海洋開發研究院