技術領域：
本發明屬于貯存技術領域，具體涉及一種長期貯存昆蟲病原線蟲的方法。
背景技術：
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昆蟲病原線蟲是國際上新型的生物殺蟲劑，具有易于大量生產，宿主范圍廣，致死昆蟲速度快的優點，已被廣泛應用于地下害蟲的生物防治(georgis&manweiler,1994；shapiro-ilanetal.,2002；grewaletal.,2005；georgisetal.,2006；yanetal.,2012；shapiro-ilanetal.,2016)。廣東省生物資源應用研究所(原廣東省昆蟲研究所)在華南高爾夫球場分離一種昆蟲病原線蟲——steinernemalongicaudumx-7品系對多種蠐螬，如華北暗黑鰓金龜(holotrichiaparallelamotschulsky)、華北大黑鰓金龜(holotrichiaoblitafaldermann)幼蟲等田間防治效果可達90％以上(guoetal.,2013,2015,2016)，應用前景廣闊。在昆蟲病原線蟲的商品化過程中，延長線蟲有效貨架時間，以便于長距離運輸和最佳時間的田間應用，是線蟲產業化生產的關鍵技術之一。本實驗室針對s.longicaudumx-7線蟲的貨架貯存做了一系列參數研究，最終得到一種s.longicaudumx-7線蟲的長期貯存方法。
技術實現要素：
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本發明的目的在于提供一種貯存期長、存活率高的長期貯存昆蟲病原線蟲的方法。
本發明的長期貯存昆蟲病原線蟲的方法，包括以下步驟：將線蟲泥與腐殖土按照質量比1:0.8～1.2混合均勻得到混合物，然后將混合物裝入容器中，用透氣封口膜封口后進行貯存；所述的線蟲泥由昆蟲病原線蟲感染期線蟲和水組成。
所述的線蟲泥中線蟲密度優選為60萬條/g。
所述的昆蟲病原線蟲優選為steinernemalongicaudumx-7。
所述的用透氣封口膜封口后進行貯存，其貯存溫度優選為5℃～25℃。所述的貯存溫度進一步優選為5℃～15℃。
所述的腐殖土的粒徑優選為24目。
優選，所述的透氣封口膜包括pp膜和設置在pp膜中部的透氣膜。
本發明的方法具有原料易得、容易操作、成本低、占用空間小、貯存時間長、存活率高等的優點。s.longicaudumx-7線蟲與腐殖土按1:0.8～1:1.2混配后于5℃穩定貯存長達180d，存活率仍大于90％。貯存的昆蟲病原線蟲可以直接撒施到田間用于防治田間害蟲，同時也可以作為肥料提高田地肥力。
附圖說明：
圖1是昆蟲病原線蟲steinernemalongicaudumx-7分別與硅藻土、蛭石、腐殖土按照質量比1:1或與碎海綿按照質量比3:1混配在5℃、15℃、25℃條件下的貯存效果；其中，*表明同一取樣時間不同處理線蟲存活率之間顯著差異(p<0.05，tukey’stest)。
具體實施方式：
以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
實施例1：
一、實驗材料與方法
1.s.longicaudumx-7線蟲的培養：s.longicaudumx-7線蟲感染期線蟲(ijs，infectivejuveniles)，按照韓日疇(1996)的固體培養方法進行培養。收獲感染期線蟲將線蟲裝于紗網袋中置于洗衣機中按照常規程序清洗，收集洗衣機排水液于沉降槽(2.0m×1.0m×0.5m)中，加水清洗3次后收集線蟲沉淀于棉布袋中收集線蟲泥。
2.線蟲泥密度統計：取線蟲泥0.1g分別溶于1000ml水中，用玻璃棒攪拌均勻，取1ml于計數板中。每種線蟲泥與每一線蟲懸浮液中均重復取樣3個，于顯微鏡下計數，取平均值計算收獲的線蟲泥中的線蟲密度為60萬條/g。
3.線蟲與不同載體按比例配制劑型：將線蟲泥與硅藻土(150目)分別按照質量比1:0.8、1:1、1:1.2混合均勻，得到線蟲硅藻土劑型。將線蟲泥與蛭石(200目)分別按照質量比1:0.8、1:1、1:1.2混合均勻，得到線蟲蛭石劑型。將線蟲泥與腐殖土(24目)分別按照質量比1:0.8、1:1、1:1.2混合均勻，得到線蟲腐殖土劑型。將線蟲泥與碎海綿(d＝1cm)按照質量比3:1混合均勻，得到線蟲碎海綿劑型。
4.線蟲劑型分裝：將混合均勻后的線蟲劑型按照40g/瓶(硅藻土與蛭石劑型)、23g/瓶(腐殖土劑型)、13g/瓶(碎海綿劑型)裝入塑料杯(pp材質，200ml，上口徑為4.5cm，底部直徑為7cm，高度為7.5cm)中，所有劑型在塑料杯中的高度均為5.5±0.5cm。將塑料杯用透氣封口膜(透氣封口膜包括pp膜和設置在pp膜中間的一透氣膜，透氣膜的直徑為1cm，透氣膜的膜孔徑為5μm)進行熱封。
5.線蟲劑型的貯存溫度設置：將各種載體不同比例的劑型處理分別置于5℃、15℃、25℃貯存室中進行貯存，每一處理為30個重復(30個塑料杯)。
6.線蟲貯存效果測定：每隔一定時間即0、20、40、60、80、100、120、140、160、180天時取樣檢測線蟲的存活率，每次每個處理取樣3個重復，每一重復取3個樣品計數。取樣方法為：將每個處理每一杯子內所有線蟲全部溶于水中，攪拌均勻后取樣10ml于滅菌培養皿中，置于25℃條件下恢復24h后計數，統計線蟲的存活數量及死亡數量，計算線蟲的存活率。
7.數據分析：線蟲死亡率的百分數值均經反正弦arcsin(x1/2)轉換后，以spss軟件(版本為spss16.0forwindows)進行方差分析，多重比較采用tukey檢驗各處理之間的差異顯著性，顯著水平p<0.05(spss16.0，spssinc.，chicago，il，usa)。
二、實驗結果
線蟲與同一載體三種混配比例1:0.8、1:1、1:1.2在同一溫度下的線蟲存活率之間無顯著影響(f≤4.650；df＝2,6；p≥0.06)。線蟲與各載體按照質量比1:1以及線蟲與碎海綿混配在5℃、15℃、25℃下的貯存效果詳見圖1。在同一溫度下，各線蟲硅藻土劑型的存活率顯著低于蛭石劑型和腐殖土劑型(f≥10.368；df＝3，8；p≤0.004)。s.longicaudumx-7在5℃、15℃、25℃與蛭石、腐殖土或碎海綿混配對線蟲的貯存無顯著差異。s.longicaudumx-7線蟲在5℃180天、15℃80天、25℃20天時線蟲的存活率仍大于90％。
因此，s.longicaudumx-7線蟲可與蛭石、腐殖土按質量比1:0.8～1.2混配或與碎海綿按照質量比3:1混配后于5℃穩定貯存長達180d，存活率仍大于90％。
但是由于海綿比較難操作，而腐殖土可以作為肥料使用，因此將線蟲與腐殖土混合，即可以很好的貯存好線蟲，又可以作為肥料使用，一舉兩得，且腐殖土價格便宜，比蛭石價格便宜一半，因此最優劑型還是腐殖土劑型的。