骨髓間充質干細胞的保存試劑及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于細胞保存液技術領域，具體涉及一種骨髓間充質干細胞的保存試劑及 其應用。
【背景技術】
[0002] 干細胞治療是將具有不斷自我繁殖能力和多向化潛能的干細胞在體外培養后，再 將其移植入患者受損或缺損組織，從而實現對損傷組織的補充和修復。而目前能實現人骨 髓間充質干細胞分離并大規模培養的細胞很少，在細胞培養完成之后，同時還需要對細胞 進行表型檢測、細胞形狀分析等等，之后將細胞保存在保存液中，待需要時再進行輸注。在 人骨髓間充質干細胞培養后進行保存的階段中，既要維持細胞的基本生命代謝以防止其死 亡，同時又要避免其代謝量過大而繼續大量增殖產生的大量形狀變異。所以細胞保存中，都 采用0.9WT%氯化鈉注射液、5WT%葡萄糖注射液、復方電解質注射液（Plasmalyte A)、l~ 5WT %人血白蛋白溶液等作為細胞的保存介質來進行。
[0003] 但是細胞保存的過程中，采用上述MSCs的保存液進行保存，在需要保存時間較短 時（4h以內）細胞的性質和變化還能維持在比較正常的水平，細胞活性降低的程度還不會 大幅降低治療的品質。但是如果保存的時間上進一步增加，進行稍長時間的保存時，首先細 胞具有表型異變、活性降低、聚集成團等傾向和性狀變化更加明顯，這些都會降低細胞的品 質影響治療的效果；而上述保存液本身不具有緩解或者降低這些保存過程中問題的能力， 進行保存之后細胞活性大大降低，慢慢轉向于休眠或者凋亡。
【發明內容】
[0004] 本發明實施的目的在于克服現有的缺陷，提供一種能在骨髓間充質干細胞保存中 維持其細胞代謝狀態和活性的保存試劑。
[0005] 為了實現上述發明目的，本發明實施例的技術方案如下：
[0006] -種骨髓間充質干細胞的保存試劑，包括0~100mmol/L的葡萄糖、40~50mmol/ L的甘露醇、24~28mmol/L的磷酸氫二鉀、12~16mmol/L的磷酸二氫鉀、3~4mmol/L的 腺噪呤、1~1. 5mmol/L的肌苷、14~18mmol/L枸橡酸鉀、35~45mmol/L的氯化銨、75~ 80mmol/L的氯化鈉及細胞抗氧化劑。
[0007] 本發明的上述骨髓間充質干細胞的保存試劑，通過葡萄糖、枸櫞酸鉀少數幾種營 養維持細胞基本生命代謝，同時不添加大量豐富的營養避免其大量快速代謝和增殖；并且 進一步輔助腺嘌呤、肌苷、甘露醇維持細胞自身的形態和性狀，保護細胞膜和酶活性的目 的，使保存的過程中細胞活性不發生退化；最后以細胞抗氧化劑抑制細胞的氧化損傷，相比 現有通常的保存液，保存后細胞具有更好的活性和品質。
[0008] 在本發明的上述骨髓間充質干細胞的保存試劑的基礎上，本發明進一步還提出其 在骨髓間充質干細胞保存中的應用。采用上述保存試劑保存骨髓間充質干細胞，在保存中 保護細胞的能量產生機構，使其維持正常結構和功能；并盡量減慢細胞代謝速度，減少能量 消耗并供應能量物質，同時還維持細胞的形態抑制和分化和損傷，相比現有通常的保存液 保存后細胞具有更好的活性和形態。
【具體實施方式】
[0009] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明 進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于 限定本發明。
[0010] 本發明實例提出一種骨髓間充質干細胞的保存試劑，該保存試劑成分包括有 80~100mmol/L的葡萄糖、40~50mmol/L的甘露醇、24~28mmol/L的憐酸氛二鐘、12~ 16mmol/L的憐酸二氛鐘、3~4mmo1 /],的腺噪吟、1~1. 5mmol/L的肌昔、14~18mmo1 /],枸 橡酸鉀、35~45mmol/L的氯化銨、75~80mmol/L的氯化鈉及細胞抗氧化劑。
[0011] 本發明的上述骨髓間充質干細胞的保存試劑，是基于維持細胞基本代謝活性的同 時，一方面是保護細胞的能量產生機構，使其維持正常結構和功能；二是盡量減慢細胞代謝 速度，減少能量消耗并供應能量物質；并且輔助修復成分，降低保存過程中的細胞損傷。
[0012] 其中，細胞抗氧化劑比較中重要的補充性的細胞損傷修復和抑制工程成分，是能 清除自由基和抑制自由基活動的物質，能夠預防自由基的形成，或是在自由基形成之后防 止它們與其他的細胞分子結合，從而阻止自由基造成細胞的衰老和氧化損傷。在實施中，上 述細胞氧化劑可以采用超氧化物歧化酶（S0D)、谷胱甘肽過氧化物酶、維生素 C、維生素 E及 還原型谷胱甘肽中的一種或多種。
[0013] 當然，最優選的是超氧化物歧化酶（S0D)，相對是人體不可缺少、重要的氧自由清 除劑，其以不穩定的自由基作為催化底物。這種酶對于需氧細胞的存活是比較重要的，它可 以催化清除超氧自由基，也是目前為止發現的唯一的以自由基為底物的酶，所以在維護生 物機體內自由基產生與清除的動態平衡中起極其重要的作用。相比其他的基中細胞抗氧化 劑，其直接清除氧自由基，效果上更加明確，對抑制氧化性細胞損傷的針對性更強一些。
[0014] 另外，谷胱甘肽過氧化物酶是機體內廣泛存在的過氧化物分解酶，是以硒半胱氨 酸結構為活性中心，能催化GSH變為GSSG，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，從 而保護細胞膜的結構及功能不受過氧化物的干擾及損害，主要針對于細胞膜結構的損傷修 復。其他的幾種，維生素 C、維生素 E及還原型谷胱甘肽都是具有還原性的生物成分，能減緩 造成細胞氧化性損傷的氧化物質的氧化損傷。
[0015] 進一步在實施的過程中，由于上述細胞抗氧化劑的類型和成分并不相同，超氧化 物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶是屬于蛋白質酶類，維生素 C、維生素 E是屬于還原性維 生素，還原型谷胱甘肽是寡肽，添加的過程中分別按照各自適合的量進行添加，相互之間并 不存在統一的標準用量（酶類是以活力單位U計量、化學成分以mol、質量等方式計量）。 比如，實施中超氧化物歧化酶在保存試劑中控制添加量35000~45000U/L比較適中；谷 胱甘肽過氧化物酶其是過氧化物底物催化酶，相比產生的過氧化物量，控制添加20000~ 25000U/L的濃度范圍即可；維生素 C和維生素 E這兩者添加3~10mm〇l/L即可，在有上 述的酶共同協作使用時，在上述范圍中采用低量添加；同時，由于還原型谷胱甘肽自身也是 多肽，添加量多有可能會作為C、N源進行能源代謝，可能也會誘導細胞產生分化，控制低量 1~1. 5mmol/L即可，在于上述多種抗氧化劑共同使用時，在上述范圍下可以采用低量添 加。
[0016] 在細胞氧化損傷良好緩解的情形下，剩下的成分即是在上述保護細胞的能量 產生機構使其維持正常結構和功能、以及減慢細胞代謝速度并供應能量物質進行的采 用。比如，其中葡萄糖作為基本的生命能源；枸櫞酸鉀和氯化鈉維持紅細胞膜上鈉鉀栗 (Na+-K+-ATPase)的正常運轉；腺嘌呤用于維持和恢復ATP、DPG水平，還能穩定干細胞形 態；肌苷與磷酸鹽一方面是形成緩沖系，維持環境pH，同時還可以起到保護細胞膜和酶活 性的目的；甘露醇和氯化鈉能維持適合細胞生存的晶體和膠體物質，保持合適的細胞外滲 透壓，穩定細胞的膜結構。從上述選擇可以看出，并不存在大量的多種營養，在保存中控制 細胞代謝速度處于較低的水平。
[0017] 在上述基礎功能的立意下，本身骨髓間充質干細胞是屬于比較容易分化的干細 胞，所以保存試劑如果自身具有了誘導細胞表型發生變化的成分，就很有可能會造成細胞 在保存的過程中產生分化；結合本案中不添加細胞因子等具有誘導效果的成分，并用肌苷、 甘露醇以及氯化鈉在外環境中穩定細胞膜結構和形態，可以比較良好地抑制細胞的表型變 化或發生分化。
[0018] 同時，保存試劑在使用過程中，很大多數情形下均是將細胞置于常規空間內，而不 是無菌環境，所以有必要進一步添加抑制雜菌污染的抗生素試劑；基于本案中對骨髓間充 質干細胞保存的情況，在保存試劑中采用添加5~10mm〇l/L的氯霉素，氯霉素相比其他類 型的抗生素，其屬于抑菌性廣譜抗生素。本發明中一方面是基于其廣譜性采用，以避免窄譜 性的抗生素的抑菌類型過少而達不到良好的抑菌效果；另一方面，其主要是抑菌性的類型， 而不是殺菌性的類型；這樣可以最大化地避免對骨髓間充質干細胞自身的代謝產生殺傷。
[0019] 同時，本發明的上述保存試劑在制備的過程中，雖然基本上絕大多數成分都是水 溶性的（維生素 E屬于脂溶性），同時氯霉素在冷水中溶解比較慢且溶解度非常低；所以本 案的保存液在配置的過程中可以將除細胞抗氧化劑的酶類之外的成分全部添加完成之后， 整體可能并不能直接完全溶解，而是呈膠狀的懸液，可以采用適當加熱至懸液呈現比較均 一之后進行分裝和高溫滅菌處理；并且在滅菌處理完成之后，最后再添加超氧化物歧化酶 (S0D)和谷胱甘肽過氧化物酶，以避免提前添加導致在后續的滅菌處理中變性失活。同時， 由于配置之后，可能并不一定會立即將上述試劑進行細胞保存，而長期存放的過程中超氧 化物歧化酶（S0D)和谷胱甘肽過氧化物酶可能自身可能還是容易降解或者失活，所以長期 保存可以按照上述方式配置好之后冰凍保存；或者是配置完成之后，暫時不添加超氧化物 歧化酶（S0D)和谷胱甘肽過氧化物酶這兩種，而在使用之間添加即可。
[0020] 采用本發明的上述骨髓間充質干細胞的保存試劑，通過葡萄糖、枸櫞酸鉀少數幾 種營養維持細胞基本生命代謝，同時不添加大量豐富的營養避免其大量快速代謝和增殖； 并且進一步輔助腺嘌呤、肌苷、甘露醇維持細胞自身的形態和性狀，保護細胞膜和酶活性的 目的，使保存的過程中細胞活性不發生退化；最后以細胞抗氧化劑抑制細胞的氧化損傷，盡 可能地維持細胞的活性和品質。
[0021] 在本發明的上述骨髓間充質干細胞的保存試劑的基礎上，本發明進一步還提出其 在骨髓間充質干細胞保存中的應用，采用上述保存試劑保存骨髓間充質干細胞，在保存中 保護細胞的能量產生機構，使其維持正常結構和功能；并盡量減慢細胞代謝速度，減少能量 消耗并供應能量物質，同時還維持細胞的形態抑制和分化和損傷，相比現有通常的保存液 保存后細胞具有更好的活性和形態。
[0022] 為使本發明的上述保存試劑的制備在骨髓間充質干細胞保存中實施能更易于本 領域技術人員的理解和實施參考，同時凸顯出本發明