一種特異識別大鼠成骨細胞的寡核苷酸配基的序列和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物醫學技術領域，具體涉及特異識別大鼠成骨細胞的寡核巧酸 配基L54的序列和修飾，W及修飾后的L54在識別大鼠成骨細胞方面的應用。本發明涉及 L54在生物醫藥方面的應用。L54作為試劑盒的組成部分或者檢測指標，用于骨質疏松、骨 關節炎等骨代謝相關疾病的輔助診斷，治療骨質疏松、骨關節炎等骨代謝相關疾病，W及用 于關于骨代謝疾病發生、發展、進程相關的基礎研究等。L54作為載體遞送藥物祀向骨代謝 相關疾病祀向治療方面的應用。
【背景技術】
[0002] 指數富集的配基系統進化技術，簡稱沈LEX(SystematicEvolutionofLigands byExponentialEnrichment)技術，是一種新型的高通量生物文庫篩選技術。送種技術運 用大容量的隨機寡核巧酸文庫（ssDNA文庫和RNA文庫），同時結合體外PCR擴增技術，W 指數形式富集與祀分子特異性結合的寡核巧酸，經過反復的體外篩選、擴增，最終獲得基于 空間結構與祀分子呈高特異性和高親和力的結合寡核巧酸配基-適配體（aptamer)。由于 aptamer具有精確識別、無免疫原性、易體外合成與修飾等優點，又稱為"人工替代抗體"，在 基礎醫學、臨床診斷與新藥研發等方面具有廣闊的應用前景。隨機文庫中的寡核巧酸序列 能形成多樣的空間結構，因此SELEX技術可選擇的祀分子范圍十分廣泛，包括金屬離子、蛋 白多膚、有機染料等，其中蛋白多膚類祀分子最多，包括酶、生長因子、抗體、轉錄因子、細胞 粘附分子和選擇素等。完整的病毒顆粒、細菌病原體，甚至完整的哺乳動物細胞也可W通過 完整細胞消減SELEX技術篩選出其高親和力的寡核巧酸配基。SELEX技術作為一種極其有 用的分子生物學工具而越來越受到重視，并在基礎醫學、臨床診斷和疾病治療中都顯示了 廣闊的應用前景。
[0003] 本發明是通過完整細胞消減SELEX技術獲得了一個寡核巧酸配基L54。經鑒定L54 能夠特異識別大鼠成骨細胞，而不結合其它細胞，對照核酸序列與上述細胞均無結合，目前 尚未見能特異結合大鼠成骨細胞的核酸適配體的相關研究報道。
【發明內容】
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[0004] 本發明目的在于提出特異識別鼠成骨細胞的寡核巧酸配基L54的序列及其應用 領域，包括L54作為試劑盒的組成部分或者檢測指標，用于骨質疏松、骨關節炎等骨代謝相 關疾病的輔助診斷，治療骨質疏松、骨關節炎等骨代謝相關疾病，W及用于關于骨代謝疾病 發生、發展、進程相關的基礎研究等。L54作為載體遞送藥物祀向骨代謝相關疾病祀向治療 方面的應用。
[0005] 本發明通過W下技術方案實現：
[0006] 首先由Invitrogen公司合成L54序歹(J，并在5'端或3'端修飾、標記（如FAM、生 物素或者同位素），然后進行應用研究：組織化學或英光方法檢測L54識別大鼠成骨細胞。
[0007] 本發明優點：
[000引 I)與蛋白類的抗體相比，單鏈的寡核巧酸更加穩定；aptamer可直接體外合成、標 記，因此不需要標記的二抗，使得操作更為簡單、迅速；aptamer的合成成本較抗體制備成 本低，周期短。
[0009] 2)本發明證實L54能夠特異識別大鼠成骨細胞。因此，L54序列在臨床醫學與基 礎醫學的腫瘤研究相關領域中均具有廣泛的應用價值和廣闊的市場前景。
【附圖說明】：
[0010] 圖1流式細胞儀測定L54與大鼠成骨細胞的結合情況。
[0011] 圖2流式細胞儀測定L54與大鼠骨肉瘤細胞的結合情況。
[0012] 圖3流式細胞儀測定L54與大鼠腸上皮細胞的結合情況。
[0013] 圖化54與大鼠成骨細胞結合的平衡解離常數（KD值）的測定。
【具體實施方式】：
[0014] 下面通過FAM標記的L54對大鼠成骨細胞的識別來進一步描述本發明。
[0015] 1、合成L54序列（序列表中沈Q ID No. 1)和GP30序列（序列表中沈Q ID No. 2)， 均在5'端標記FAMdnvitrogen公司完成）。
[0020] 注；N代表A、T、G、C任意一種。
[0021] 2、流式細胞儀分別測定FAM-L54與大鼠成骨細胞、大鼠骨肉瘤細胞、大鼠腸上皮 細胞的結合
[0022] 2. 1將一定濃度的FAM-L54或FAM-GP30溶于50U1賠育緩沖液 (1 XPBS-1. 25mmol/LCaCl廠0. 25mmol/LMgCl廠0. 1 U g/ U 1 5rtRNA-0. 1 U g/ U 1娃魚精DNA) 中，95°C加熱5min后迅速置于冰上冷卻IOmin ;
[0023]2. 2分別收集大鼠成骨細胞、大鼠骨肉瘤細胞和大鼠腸上皮細胞，無菌IXPBS 洗一次，調整細胞濃度為5X l(f/管單細胞懸液，加入封閉液（1 XPBS-1. 25mmol/ LCaClz-O. 25mmol/LMgCl2-〇. 1Ug/U1 }^tRNA-〇. 1Ug/U1娃魚精DM)于室溫封閉30min ;
[0024] 2. 3離必去除封閉液，將等量變性處理好的FAM-L54或FAM-GP30與大鼠成骨細胞、 大鼠骨肉瘤細胞和大鼠腸上皮細胞37°C賠育Ih;
[00巧]2.4離必去除上清，每管加入500U11XPBS-ImmolMgCl廠1. 25mmol/LCaCl2溶液重 懸細胞后用流式細胞儀計數測定FAM英光強度。
[002引 3、L54與大鼠成骨細胞結合的平衡解離常數腳值）的測定
[0027] 將不同濃度的FAM-ssDNA與篩選祀細胞在封閉液中混勻，于37C避光共賠育 30min，洗涂、離必，棄去上清 350yl(lXPBS，1.25mmol/LCaC12,0.25mmol/LMgC12)緩沖 液重懸細胞，流式細胞儀檢測英光強度值的大小，采用GraphpadPrism4軟件繪制結合曲 線，選用函數Y=BmaxxAKcWO計算適配體與祀細胞的平衡解離常數KD值
[0028] 實驗結果：
[0029] 通過英光顯微鏡和流式細胞儀的檢測均可表明L54能特異結合大鼠成骨細胞。
[0030] 由圖1、2、3可W得到結論；流式細胞儀測定結果表明FAM-L54能夠特異結合大鼠 成骨細胞，而與大鼠骨肉瘤細胞和大鼠腸上皮細胞均不發生結合，對照序列FAM-GP30與上 述幾種細胞均無結合。
[0031] 由圖4可W得到結論；L54與大鼠成骨細胞結合的平衡解離常數KD值，約為 494. 4+133. 3nmol/L
[0032] 總之，L54能夠特異識別大鼠成骨細胞，具有廣泛臨床應用價值。
【主權項】
1. 一種特異識別大鼠成骨細胞的寡核苷酸配基L54的序列，其特征在于，所述的核苷 酸序列如序列表中SEQIDNo. 1所示。2. 據權利要求1中所述方法，寡核苷酸適配體L54可以是體外化學合成的，也可以是通 過PCR或其他分子生物學方法制備的。3. 據權利要求1中所述方法，寡核苷酸適配體L54的5'端或3'端可以經FITC、生物 素、地高辛等標記。4. 據權利要求1中所述方法，寡核苷酸適配體L54在腫瘤研究領域、臨床腫瘤組織切片 標本的鑒別、腫瘤生物導向治療領域中的應用。
【專利摘要】本發明公開了屬于分子生物醫學技術領域的一種特異識別大鼠成骨細胞的寡核苷酸配基L54的序列和應用。本發明設計L54特異性的序列，采用5’端或3’端修飾、標記(如FITC、生物素或者地高辛)的方法檢測L54能夠特異識別大鼠成骨細胞。L54作為試劑盒的組成部分或者檢測指標，用于骨質疏松、骨關節炎等骨代謝相關疾病的輔助診斷，骨質疏松、骨關節炎等骨代謝相關疾病的治療，以及用于骨代謝疾病發生、發展、進程相關的基礎研究等。L54作為載體遞送藥物靶向骨代謝相關疾病靶向治療方面的應用。本發明的方法簡單，迅速，靈敏，適用于臨床輔助診斷、骨代謝相關疾病靶向治療，具有廣泛臨床應用和基礎應用前景。
【IPC分類】C12Q1/04, C12N15/115
【公開號】CN105296490
【申請號】CN201410347341
【發明人】邵寧生, 李慧, 李少華, 丁紅梅, 李潔, 黃皚雪, 蘇雪婷, 趙強
【申請人】中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2014年7月22日