重組細菌肌醇六磷酸酶及其應用的制作方法

專利名稱：重組細菌肌醇六磷酸酶及其應用的制作方法
1.發明領域本發明涉及新的鑒定多核苷酸，由這些多核苷酸編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的用途，以及這些多核苷酸和多肽的產生和分離。更特別的是，本發明的多肽已經被鑒定為肌醇六磷酸酶，尤其是具有肌醇六磷酸酶活性的微生物酶。
2.背景2.1.1-簡述礦物質是所有生物體生長的必要成分。食物中的礦物質來源于許多物質，包括植物。例如植物的種子是豐富的礦物質來源，因為它們包含有與肌醇六磷酸分子的磷酸根復合的離子。這些與肌醇六磷酸鹽相關的礦物質滿足了一些圈養類生物的飲食需要，如多胃的反芻動物。因此，反芻動物不需要在飲食中添加無機磷酸鹽和礦物質，因為瘤胃中的微生物產生催化肌醇六磷酸鹽(肌醇-六磷酸鹽)轉變成肌醇和無機磷酸鹽的酶。在這一過程中，與肌醇六磷酸鹽復合的礦物質被釋放出來。然而，大多數圈養類生物不能有效的利用與肌醇六磷酸鹽相關的礦物質。因此，例如，在單胃動物(如，豬，鳥，和魚)的牲畜產生中，通常需要在飼料中添加礦物質和/或抗生素物質，改變消費生物體的消化菌群環境，提高生長率。
正如這樣，在許多應用中存在許多與肌醇六磷酸鹽沒有充分水解有關問題，這些問題涉及營養，體內外處理步驟，健康和醫藥，環境保持和資源管理。以下是這些問題的非限制性實例1)飲食中添加礦物質費用昂貴。
2)在許多體內外應用中未水解的肌醇六磷酸鹽的存在是不希望和有問題的(如導致意外淤泥的出現)。
3)飲食中添加抗生素對人類和動物一樣都存在一種醫療威脅，即增加耐受抗生素的病原體量。
4)大便內未吸收的礦物質排到環境中嚴重干擾和損害了周圍土壤，養魚池和表面水源的生態系統。
5)許多潛在食物的有價值的營養成分明顯未被利用和浪費了。
2.1.2-營養關系許多有潛在營養的植物，包括尤其是它們的種子，含有相當數量的營養成分，如，磷酸鹽，其以一種方式與肌醇六磷酸鹽相關因此這些營養成分不能在消耗時被自由獲取。這些營養成分的不可獲得性可以被一些生物克服，這些生物體包括母牛和其他反芻動物，它們具有充足的消化能力水解肌醇六磷酸鹽，釋放相關的營養成分，這很大程度上來源于它們消化道內共生生命形式的存在。然而，大多數圈養類動物，包括豬，魚，雞，火雞，及其他包括人的非反芻類生物，不能在消化后有效的釋放這些營養成分。
因此，含有肌醇六磷酸鹽的食物需要添加外源營養成分和/或一種有肌醇六磷酸酶活性的來源以彌補大部分種類的生物體在消耗中營養成分的供給不足。
2.1.3-體外體內處理關系在另一個方面，未水解的肌醇六磷酸鹽的存在導致體內外處理中的一些問題，包括，但不局限于-食物的處理。在一個實例中，如EP0321004-B1(Vaara等)所描述的，在處理玉米和高粱谷粒中有一個處理步驟，將堅硬的谷粒浸泡在水中以軟化它們。在這一過程中濾出的水溶性物質通過蒸發濃縮變成玉米浸泡液的一部分。玉米浸泡液中未水解的植酸，大部分以鈣和鎂鹽的形式存在，其與磷結合并且與蛋白和金屬離子一起沉淀為不需要的淤泥。這種淤泥在玉米浸泡液的蒸發，轉運和儲存中是成問題的。因此，在這公開的肌醇六磷酸酶分子-或者單獨存在或者與其它制劑組合(包括但不局限于酶，包括蛋白酶)-不僅在這一應用中(如，防止不需要的淤泥)，而且在其他需要肌醇六磷酸鹽水解作用的應用中都是有用的。
2.1.4-醫學關系飲食內加入抗生素物質在家畜的生產過程中有許多好處。例如，除了它作為預防性抵御疾病的作用，外源性使用抗生素已經被證明可以增加生長率，使其上升3-5％。這一作用的機制可能也包括(或部分包括)圈養動物消化道菌群環境的變化，導致微菌叢平衡，更有利于營養物質的吸收。
然而，與過量應用抗生素相關的明顯副作用是產生病原性抗生素抵抗微生物菌株的儲庫的危險。這一危險是急迫的，已知人耐藥性病原體的上升與牲畜類抗生素的使用有關。例如，阿伏帕星，動物飼料中使用的抗生素，1997年在許多地方已經被禁止使用，現在給予動物另外一種抗生素，維吉霉素，與一種新藥Synercid，非常相似，后者用來代替人類的萬古霉素。然而，許多研究表明圈養動物的一些腸球菌素抵抗synercid。結果，非預期的耐藥后果，如那些已經在阿伏帕星和維吉霉素上看到的，不管什么新抗生素用作圈養動物的預防治療似乎又要發生。因此，研究人員呼吁應嚴格控制工業上藥物使用。
在飼料中添加即將公開的肌醇六磷酸酶分子，飼養動物使其生長率增加與使用抗生素，如阿伏帕星，獲得的生長率增加是相同的-如果不是過量的話。因此，即將公開的肌醇六磷酸酶分子-或單獨或與其他制劑聯合(包括但不局限于酶，包括蛋白酶)-不僅在這一應用(如，增加圈養動物的生長率)中，而且在其他需要肌醇六磷酸鹽水解作用的應用中都是有用的。
2.1.5-環境關系肌醇六磷酸酶缺乏的生物種類-不管食物中是否添加礦物質-消耗含肌醇六磷酸鹽食物的環境后果是未吸收的礦物質排出后導致糞便污染。這一污染不僅對其棲息地而且繼而對其周圍水源都有副作用。這一環境的改變最初在食物鏈的最低層發生，因此具有穿越高層的潛力，且通過生態系統引起長久和災難性的損害-尤其是在持續污染多年后。這一問題能在任何有濃縮肌醇六磷酸鹽的地方顯露出來-包括體內(如通過牲畜的產生地，動物園，野生棲息地的動物，等等)和體外(如在商業谷物濕磨，蜂蠟浸泡過程，等等)處理過程。
2.1.6-財政關系決定使用外源添加肌醇六磷酸酶分子-不管是完全代替或增加外源使用礦物質和/或抗生素-最終需要使用者通過一項財政可行性和成本有效性的測試，使用者的生計依賴于相關的應用，如牲畜生產。
結果，在許多應用中需要獲得有效和成本上有效的肌醇六磷酸鹽水解的方法。尤其是，在商業應用中需要優化水解肌醇六磷酸鹽的方法。在一個特殊方面，需要優化商業治療方法改善人類和圈養動物消耗含肌醇六磷酸鹽食物的營養供給。
以前就有重組肌醇六磷酸酶報道，但通過本發明新發現的肌醇六磷酸酶分子提高了它們較差的活性。因此，即將公開的肌醇六磷酸酶分子較以前鑒定的肌醇六磷酸酶分子，如真菌來源的肌醇六磷酸酶分子提供了本質上更高的工業性能。2.2-肌醇六磷酸鹽和肌醇六磷酸鹽水解的一般概述2.2.1-肌醇六磷酸鹽水解導致營養物質的釋放在實際上所有的植物種子中肌醇六磷酸鹽作為磷的儲存源存在(Graf(Ed.)，1986)。在谷類和莢果中植酸通常形成種子的正常部分。它與飲食中的礦物質結合起作用，這些礦物質在新生植物從種子中發芽時是必需的。當肌醇六磷酸中的磷酸根被種子中的肌醇六磷酸酶去除時，其結合金屬離子的能力消失，礦物質變得可以被植物吸收。在牲畜喂養的谷物中，肌醇六磷酸結合的微量礦物質很大程度上不能被缺乏肌醇六磷酸酶活性的單胃動物吸收。
雖然一些肌醇六磷酸鹽的水解發生在結腸，但是大多數肌醇六磷酸鹽通過單胃動物的胃腸道，在糞尿中排出，導致在密集牲畜生產地區的糞便肌醇六磷酸鹽污染問題。結腸中釋放的無機磷對牲畜來說營養價值略微降低，因為無機磷大部分-如果不是全部-在小腸吸收。因此，肌醇六磷酸鹽中營養學上的重要飲食礦物質的可評價量對單胃動物來說是無法獲得的。
總之，肌醇六磷酸鹽-相關的營養物質不僅包括與肌醇六磷酸鹽共價連接的磷酸鹽，而且包括其他與肌醇六磷酸鹽螯合的礦物質。而且，在攝取中，未水解的肌醇六磷酸鹽可能進一步相遇并與其他礦物質結合。礦物質的螯合可以抑制酶的活性，這些礦物質用于這些酶作為輔因子起作用。
2.2.2-細菌酶可以水解肌醇六磷酸鹽肌醇六磷酸鹽轉變成肌醇和無機磷可以被細菌酶催化，該酶指廣義上的肌醇六磷酸酶。肌醇六磷酸酶如肌醇六磷酸酶#EC3.1.3.8能催化肌醇六磷酸鹽水解成D-肌醇1，2，4，5，6-五磷酸鹽和正磷酸鹽。據報道某些真菌肌醇六磷酸酶將肌醇五磷酸鹽水解成四，三，和低級磷酸鹽。如，據報道A.ficuum肌醇六磷酸鹽產生肌醇二和一-磷酸鹽的混合物(Ullah，1988)。產生肌醇六磷酸酶的微生物由細菌如枯草芽胞桿菌(Powar和Jagannathan，1982)和假單胞菌(Cosgrove，1970)；酵母如啤酒酵母(Nayini和Markakis，1984)；和真菌如土曲霉菌(Yamada等，1968)組成。
酸性磷酸酶是催化多種磷酸酯水解的酶，通常最優的pH值在6.0以下(Igarashi和Hollander，1968)。如，#EC3.1.3.2酶催化正磷酸單酯水解成正磷酸鹽產物。據報道一種酸性磷酸酶已經從A.ficuum中純化。去糖基化形式的酸性磷酸酶的分子量明確為32.6kDa(Ullah等，1987)。
肌醇六磷酸酶和較不特異的酸性磷酸酶是通過真菌曲霉屬ficuum作為胞外酶產生的(Shieh等，1969)。Ullah報道從野生型A.ficuum純化的肌醇六磷酸酶，其分子量為61.7kDA(SDS-PAGE電泳；糖基化作用矯正)；pH最適在pH2.5和pH5.5；Km大約為40μm；特異活性大約為50U/kg(Ullah，1988)。PCT專利申請WO91/05053也報道公開了從曲霉菌ficuum中分離和分子克隆肌醇六磷酸酶，最適pH是pH2.5和pH5.5，Km大約是250μm，特異活性大約是100U/kg蛋白。
簡言之，所引用的以前報道的細菌酶的特異活性大約在50-100U/kg蛋白范圍內。與之相反，已經測定本發明公開的肌醇六磷酸酶活性大約是4400U/kg。這相當于活性改善了大約40倍或更高。2.3-解決肌醇六磷酸鹽水解不充分的問題2.3.1-工業應用中的酶添加劑使用可以產生肌醇六磷酸酶的微生物作為單胃動物飼料添加劑的可能性以前已有報道(USPN3,297,548 Shieh和Ware；Nelson等，1971)。這一方法的成本有效性是這一和其他工業應用的主要局限。因此改善肌醇六磷酸酶分子勢在必行。
也有報道微生物肌醇六磷酸酶可用于在某些工業過程，如小麥和玉米的消費產品，中生產動物飼料。在一個方面，玉米的濕磨過程產生固體谷蛋白作為動物飼料。據報道加入肌醇六磷酸酶可以改善飼料產品的營養價值。例如，使用真菌肌醇六磷酸酶和處理條件(t～50℃和pH～5.5)以前已有報道(如EP 0 321 004)。簡單地說，在使用傳統浸泡方法制造大豆食品過程中，如，不加入外源性肌醇六磷酸酶的方法，據報道未水解的肌醇六磷酸鹽的存在使得食品和廢棄物不適合用來飼養魚，家禽和其他非反芻動物，及喂奶的小牛的飼料。據報道肌醇六磷酸酶可用于改善這一高蛋白大豆物質的營養和商業價值(見Finase酶，Alko，Rajamaki，芬蘭)。真菌肌醇六磷酸酶和一種pH2.5最佳酸性磷酸酶的結合形成A.黑曲霉多糖已經被Alko有限公司作為動物飼料添加劑用在他們的植酸降解產品Finas F和Finas S.中。然而，這一方法的成本有效性對更大范圍的應用來說仍有較大的局限性。因此一種成本有效的肌醇六磷酸酶來源將明顯增加大豆餐食作為動物飼料的價值(Shieh等，1969)。
2.3.2-需要最佳的酶添加劑為了解決暴露的問題，已經建議用外源性肌醇六磷酸酶處理食品，但這一方法沒有完全優化，尤其關于實用性和成本有效性。這種優化需要考慮存在較廣范圍的應用，尤其是用于大批量的生產。例如，食品及其制備方法，和接受的微生物的種類都有很大的范圍。
在一個特定的實例中，要重視的是魚飼料膠囊的制造需要將其成分暴露在高溫和/或高壓之下以便使產生的膠囊在投入水之前不溶解和/或降解(如在消費前)。因此需要這一制造過程獲得高溫和/或高壓條件下穩定的添加酶。因此，不同肌醇六磷酸酶可以分別優選或適于不同的應用。
此外可以認識到優化一個酶過程的方法是通過對重要催化酶進行修飾和改善。例如，要形成的轉基因植物是由一個表達肌醇六磷酸酶分子的表達系統構成的。要重視的是，通過嘗試改善不直接涉及表達的分子的活性的因子，如表達水平，只有有限的-可能是不充分的-優化水平可能在最大程度上實現。因此，也需要獲得改善了特性的分子。
一種特別的實現分子特征改善的方法是通過一種稱為定向進化(directedevolution)的技術方法，包括Diversa Corporation的所有的方法，該方法中的術語DirectEvolution已形成和注冊。這些方法在Diversa的共同擁有的專利(US5,830,696)和一些共同待批的專利申請中有進一步的詳細闡述。簡單地說，DirectEvolution包括a)一種或多種分子模板經受誘變產生新分子和b)從具有更多所需特征的新分子的子代種類中選擇。
然而，定向進化的能力依賴于起始模板的起始選擇，及誘變過程的選擇和使用的篩選過程。例如，對隨機選擇的分子模板和/或對含有過度亞理想特征的初始分子模板的全范圍的誘變排列的產生和評價的方法常常是一項可怕的巨大工程。這些模板的使用提供了，在最好的程度上，間接的亞理想通路并且潛在提供了產生充足的改良子代分子的很少的前景。另外，也意識到我們目前關于嚴格預測有益的修飾能力的知識是非常局限的。
因此，需要一種發現和利用自然界中具有進化前特性-優選進化前酶的優點-的分子的方法。因此在本公開中，要意識的自然界提供了(通過我們有時稱之為“自然進化”的過程)可以立即用于商業應用或其他應用的分子，為了獲得甚至更大的改變可以進行定向進化。
總之，需要新的，高活性的，生理上有效的，來源經濟的肌醇六磷酸酶活性。特別地，需要鑒定新的肌醇六磷酸酶a)在一種或多種特異應用中有較高活性，因此可以用來優化這些特異的應用；b)作為定向進化的模板獲得甚至更進一步改善的新生分子；和c)通過諸如雜交為基礎的方法等方式，作為鑒定其他相關分子的工具。本發明以一種新的方式滿足了這些需要。
3.發明概述本發明提供了一種多核苷酸和一種多核苷酸編碼的多肽，它已被鑒定為具有肌醇六磷酸酶活性的肌醇六磷酸酶。依據本發明的一個方面，提供了一種新穎的重組酶，及其活性片段，類似物和衍生物。
更特別的，本發明涉及細菌來源的重組肌醇六磷酸酶分子的用途，其可用于改善含肌醇六磷酸鹽食物的營養價值。早期出版物已揭示了真菌肌醇六磷酸酶的使用，但用于這一目的細菌肌醇六磷酸酶是新的。
更特別的，本發明涉及新鑒定的大腸桿菌來源的重組肌醇六磷酸酶分子的用途，其可用于改善含肌醇六磷酸鹽食物的營養價值。
這種應用包括使用新鑒定的分子來水解食物中的肌醇六磷酸鹽。水解可以在肌醇六磷酸鹽攝取前或在攝取后或者在攝取前和攝取后都發生。這一應用尤其與非反芻生物相關，但不局限于此，并且包括在轉化宿主公開的新肌醇六磷酸酶分子的表達，公開的新肌醇六磷酸酶分子與食物和其他物質中的肌醇六磷酸鹽的接觸，和在動物的消化系統使用公開的新肌醇六磷酸酶分子。
另外，水解可不依賴于消耗發生，如，在體外應用，如在反應容器中。因此，含肌醇六磷酸鹽的物質的處理包括較大范圍的物質的處理，包括那些并不需要成為食物的物質，如，對排泄物(或糞便)的處理。
本發明優選的分子包括從大腸埃希氏桿菌B中分離的重組肌醇六磷酸酶，與以前鑒定的真菌肌醇六磷酸酶相比，它能改善磷從肌醇六磷酸和肌醇六磷酸的鹽類中釋放的效率。
依據本發明的一個方面，提供了一種可用于摻入食物中的肌醇六磷酸酶。更具體地，提供了一種可用于改善含肌醇六磷酸鹽食物的營養價值的肌醇六磷酸酶。更具體地，還提供了一種肌醇六磷酸酶，當用于含肌醇六磷酸鹽的食物中時，可明顯改善消耗它的生物體生長的情況。從理論上講，肌醇六磷酸酶活性的有益作用機制主要包括(如果不是本質上的)可以察覺的肌醇六磷酸酶的水解。有益的作用可以在含肌醇六磷酸鹽的食物攝取前或可選擇攝取后或可選擇在攝取前和攝取后都發生。在攝取后發生有益作用的情況下，本發明的一個目的是提供一種肌醇六磷酸酶，其具有非反芻生物在消耗過程中仍保留的活性。
依據本發明的另外一個方面，提供了編碼本發明酶的分離核酸分子-包括mRNA，DNA，cDNA，基因組DNA-及活性衍生物，類似物和這些酶的片段。
依據本發明的另一個方面，提供了一個通過重組技術產生這種多肽的方法，該方法包括在促進所述酶表達的條件下培養重組的原核和/或真核宿主細胞并隨后回收所述的酶，該重組的原核和/或真核宿主細胞包含編碼本發明酶的核苷酸序列。
依據本發明的另一個方面，提供了一個在轉基因植物或植物器官表達這種酶或編碼這種酶的多核苷酸的方法和產生這種植物的方法。該是通過引入植物中一個由編碼這種肌醇六磷酸酶的核酸序列組成的表達構建體實現的。
依據本發明的另一個方面，還提供了將這種酶或編碼這種酶的多核苷酸用于工業化生產過程的方法，如從植物材料的肌醇六磷酸鹽釋放礦物質的方法，這一方法或在體外，即，飼料的處理方法，或在體內，如將這種酶施用動物身上。
依據本發明的另一個方面，提供了由公開的飼料處理方法制造的食品。
依據本發明的再一個方面，提供了將這種酶或編碼這種酶的多核苷酸用于涉及研究，發現和發展的體外應用目的的使用方法。在一個非限定性的實例中，這種方法包括鑒定和分離相似序列的探針的產生，這種序列可能編碼其他生物中相似的酶。
在一個特定的非限定的實例中，也提供了生產核酸探針的方法，這種探針包括足夠長度的核酸分子以便與本發明的核酸序列特異雜交。通過優選實施方案，這些探針的雜交基礎方法包括，但不限制于，PCR，北方(Northern)和南方(Southern)雜交類型，RNA保護測定和原位雜交類型。本發明公開的分子的用途進一步包括，以一種非限定性的方式的診斷應用。
根據一個非限定的實例，這些方法包括公開的分子的抗體的產生，這些抗體的使用，包括，例如用于與其他生物體酶相似序列的鑒定和分離。在另外一個非限定性的實例中這些方法包括使用本發明的酶作為模板用于定向進化，該方法包括用篩選基礎方法產生新分子，發現具有改善特征的子代分子。
也提供了一種轉基因的非人類生物體，其基因組包括編碼具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的異源核酸序列，其中所述轉基因導致肌醇六磷酸酶多肽的表達。
本發明的這些和其他方面從本文的講授中對本領域的專業技術人員是顯而易見的。
4.附圖的簡要說明下述附圖是發明實施方案的描述，并不意味限制于本發明被權利要求所包含的范圍。


圖1A和B表明核苷酸和本發明酶的推論的氨基酸序列。序列測定使用378自動DNA測序儀(Applied Biosystems，Inc.)。
圖2顯示本發明肌醇六磷酸酶的pH值和溫度曲線以及穩定性數據。這些分析使用的測定見下述肌醇六磷酸酶活性的測定肌醇六磷酸酶的測定是在37℃孵育150μl酶預備液與添加1mM CaCl2的600μl 2mM植酸鈉的pH7.5，100mM TrisHCl緩沖液30分鐘。孵育后通過加入750μl 5％三氯乙酸終止反應。在加入1500μl顯色試劑(4體積的1.5％鉬酸銨在5.5％硫酸溶液和1體積的2.7％硫酸亞鐵Shimizu，1992)后用700nm磷酸鹽標準分光光度測定法測定釋放的磷酸鹽。圖2中Y軸表示700nm處的OD值。X軸表示溫度或pH。
5.術語的定義為了更好的理解這里提供的實施例，我們將描述某些經常出現的方法和/或術語。另外，這里使用的標題和次標題是為了給讀者提供方便，不以何種方式限定本發明。
這里使用的術語“抗體”指完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的片段，如Fab，Fab’，(Fab’)2，Fv，和SCA片段，它們能結合肌醇六磷酸酶多肽的抗原決定簇。可以用本領域已知的方法制造(見Harlow and Lane，見上)這些抗體片段，這些抗體片段保留一些與與它們來源抗體的抗原(如肌醇六磷酸酶抗原)選擇性結合能力進一步描述如下。
(1)Fab片段由抗體分子的單價抗原結合片段組成，并可以通過用木瓜蛋白酶消化整個抗體分子產生，產生由整個輕鏈和重部分鏈組成的片段。
(2)抗體分子的Fab’片段可以通過用胃蛋白酶處理整個抗體分子獲得，接著還原，產生由整個輕鏈和重部分鏈組成的分子。每個抗體分子經這一方法處理后獲得兩個Fab’片段。
(3)抗體的(Fab’)2片段可以通過用胃蛋白酶處理整個抗體分子獲得，而不要后續的還原。一個(Fab’)2片段是兩個Fab’片段的二聚體，通過兩個二硫鍵結合在一起。
(4)Fv片段定義為包含表達為兩個鏈的輕鏈可變區和重鏈可變區的基因工程片段。
(5)單鏈抗體(“SCA”)是一個基因工程單鏈分子包含輕鏈可變區和重鏈可變區，通過合適的，彈性的多肽連接子連接。
術語“降解有效的”數量指與未與酶接觸的肌醇六磷酸鹽相比，需要降解至少50％肌醇六磷酸鹽的酶的數量。優選的是，至少80％的肌醇六磷酸鹽被降解。
DNA的“消化”指用限制酶催化的DNA的斷裂，限制酶僅在DNA的某些序列中起作用。這里用的不同的限制酶是商業上可以獲得的，它們的作用條件，輔助因子和其它需要的條件對于本領域的普通技術人員是已知的。為了分析的目的，典型的1μg質粒或DNA片段在大約20μl的緩沖液中與大約2單位的酶作用。為了質粒構建中分離DNA片段的目的，典型的5至50μg的DNA用20至250單位的酶在一個大容積內消化。特定限制酶合適的緩沖液和底物數量由制造商說明。通常使用的孵育時間大約是37℃約1小時，但是可以根據提供者的說明書改變。消化后反應物直接在凝膠上電泳以分離需要的片段。
本發明所使用的術語“抗原決定簇”指一個抗原上的抗原決因素，如肌醇六磷酸酶多肽，可與抗體的抗體結合位點，如肌醇六磷酸酶特異的抗體結合。抗原決定簇通常由分子的化學活性表面基團，如氨基酸或糖側鏈組成，并可以有特異的三維結構特征，和特異的電荷特征。
術語“片段”，“衍生物”和“類似物”當指
圖1中的酶時，包括保留至少一個生理功能或活性與參考酶至少本質上相同的酶。而且，術語“片段”，“衍生物”和“類似物”可以用一個“原體形式”，如可以通過分裂來修飾的，以產生具有明顯高活性的成熟酶的低活性的原蛋白的實例說明。
術語“基因”表示參與了產生多肽鏈的DNA片段；它包括編碼區的前區或后區(頭和尾)，以及單一編碼片段(外顯子)之間的中介序列(內含子)。
術語“分離的”表示從其最初環境(如，如果它是自然發生的話即自然環境)移走的物質。例如，在一個活體動物存在的自然形成的多核苷酸或酶沒有被分離，但是從自然系統一些或所有共同存在的物質中分離的相同的多核苷酸或酶是被分離的。這些多核苷酸可以是載體的一部分和/或這些多核苷酸或酶可以是組成成分的一部分，但如果這些載體或組成成分不是自然環境的一部分的話，仍然被分離。
通過“分離的核酸”表示一種核酸，如一個DNA或RNA分子，這種核酸不緊鄰5’或3’末端側向序列，而它正常在它來源的生物的自然存在的基因組中是緊鄰的。因此這個術語描述了，例如，摻入到載體如質粒或病毒載體中的核酸；摻入到異種細胞(或同種細胞的基因組，但所在位點與自然發生的位點不同)基因組中的核酸；和作為分離分子，如PCR擴增或限制酶消化產生的DNA片段，或體外轉錄產生的RNA分子存在的核酸。術語也描述了形成雜交基因部分的重組核酸，后者編碼可用來例如，在產生融合蛋白的其它多肽序列。
“連接”指在兩個雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的方法(Sambrook等，1989)。除非其他所指，連接可以使用已知的緩沖液和條件完成，用每0.5μg大約等摩爾量的待連接DNA片段使用10單位T4DNA連接酶(“連接酶”)。
在此使用的一個“核酸分子”包括至少一個核苷酸堿基或一個核苷酸堿基對，分別依賴它是否是單鏈或是雙鏈。而且，一個核酸分子可以排它地或嵌合地屬于任何含核苷酸分子的基團，舉例如，但不局限于，以下核酸分子基團RNA，DNA，基因組核酸，非基因組核酸，自然產生或非自然產生的核酸，和合成的核酸。這包括，以非限定性舉例，與任何細胞器，如線粒體相關的核酸，核糖體RNA，和由一種或多種自然存在或非自然存在的成分嵌合組成的核酸分子。
另外，“核酸分子”可以包含部分一個或多個以非核苷酸為基礎一，舉例，但不限于氨基酸和糖。因此，通過實例，但不限于一個部分是以核苷酸為基礎的，部分是以蛋白為基礎的核糖體，被認為是“一個核酸分子”。
另外，通過實例，但不局限于，用可探測部分標記，如放射活性或可選擇的非放射活性標記的核酸分子，也同樣作為一個“核酸分子”。
術語“編碼特定酶的核酸序列”或一個特定酶“的DNA編碼序列”或一個“編碼特定酶的核苷酸序列”-及其他同名術語-指在合適的調控序列的控制下轉錄和翻譯成酶的DNA序列。“啟動子序列”是能在細胞內結合RNA聚合酶并啟動下游(3’方向)編碼序列轉錄的DNA調控區域。啟動子是DNA序列的一部分。這一序列區在3’端有一個起始密碼子。啟動子序列包括堿基的最小數目，以背景結合以上的可檢測水平啟動轉錄的必需元件結合于此。然而，RNA聚合酶與序列結合，并且在起始密碼子(啟動子的3’末端)開始轉錄以后，轉錄在3’方向下游發生。在啟動子序列內會發現轉錄起始位點(通過核酶S1基因序列方便地確定)及負責結合RNA聚合酶的蛋白結合區(連續序列)。
術語“編碼一種酶(蛋白)的核酸”或“編碼一種酶(或蛋白)的DNA”或“編碼一種酶(蛋白)的多核苷酸”和其他同名術語包括一種僅包括酶的編碼序列的多核苷酸及包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
在一個優選的實施方案中，一種“特異核酸分子種類”通過其化學結構定義，舉例如通過，但不局限于，其基本序列。在另外一個優選的實施方案中，一種特異的“核酸分子種類”通過核酸種類的功能定義或通過來源于核酸種類產品的功能定義。因此，通過非限定性實例的方式，一個“特異核酸分子種類”可以通過一種或多種歸因于它的活性或特性定義，包括歸因于它表達產物的活性或特性。
“工作核酸樣品收集入核酸庫”的直接定義包括將核酸樣品并入載體-為基礎的集合物中的方法，如通過連接進入載體，和轉化入一個宿主。相關載體，宿主，和其他試劑的描述及它的特異非限定實例在以后提供。“將工作核酸樣品收集入核酸庫”的直接定義也包括將核苷酸樣品并入非載體-為基礎的集合物中的方法，如通過連接到接頭上。優選的接頭可以使PCR引物退火以加速PCR擴增。
因此，在一個非限定實施方案中，一個“核酸庫”是包括一種或多種核酸分子的載體-為基礎的集合物。在另外一個優選的實施方案中，一個“核酸庫”是包括核酸分子的非載體-為基礎的集合物。仍然在另外一個優選的實施方案中，一個“核酸庫”是包括核酸分子的聯合集合物，部分是載體-為基礎的，部分是非載體-為基礎的。優選的是，根據個體核酸分子種類，包括庫的分子的集合物是可搜索和分離的。
本發明提供了一個“核酸構建物”或可選擇的一個“核苷酸構建物”或可選擇的一個“DNA構建物”。這里使用的術語“構建物”描述了一個分子，如多核苷酸(如一個肌醇六磷酸酶多核苷酸)可以選擇性的以化學鍵與一種或多種其它的分子部分如一個載體，或載體的一部分結合。在一個特異-但非限制-的方面，一個核苷酸構建物以適于宿主細胞轉化的DNA表達為例。
“寡核苷酸”指或者一個單鏈多脫氧核苷酸或者兩個互補的多脫氧核苷酸鏈，它們可以通過化學合成。這種合成的寡核苷酸可以具有或不具有5’磷酸鹽。在激酶存在的情況下，那些沒有5’磷酸者不用ATP添加磷酸鹽將不與另外的寡核苷酸連接。合成的寡核苷酸將與沒有被去磷酸化的片段連接。
當RNA聚合酶將兩個編碼序列轉錄成單獨的mRNA時，一個編碼序列與另外一個編碼序列“可操作地連接”，mRNA然后翻譯成單獨的具有來源于兩種編碼序列氨基酸的多肽。編碼序列不需要一個與另一個相鄰，只要表達的序列最后被加工產生需要的蛋白。
在發明方法中的術語“肌醇六磷酸酶特異探針”，指與編碼肌醇六磷酸酶多肽的核酸結合，或其互補序列結合的探針，其可檢測程度比編碼其他酶，或其互補序列的核酸要大。
嚴格意義上，術語“肌醇六磷酸鹽”，“植酸”和“肌醇六磷酸鈣鎂”可以區別如下“肌醇六磷酸鹽”指植酸的陰離子形式；“植酸”指肌醇六磷酸，植物包括尤其是植物的葉子中自然存在的一種化合物，可以作為肌醇六磷酸酶的底物；和“肌醇六磷酸鈣鎂”指植酸的一種鹽，如植酸的鈣鎂鹽。因此，可以理解“肌醇六磷酸鹽”，“植酸”和“肌醇六磷酸鈣鎂”是化學相關和可以內在轉化的形式，具有一個共同的化學結構。因此，正如在此使用的，“肌醇六磷酸鹽”，“植酸”和“肌醇六磷酸鈣鎂”是可互換的術語，由于它們高度相關，相似，化學上可以內在轉化，都(或者具有或者沒有所述的化學內在轉化)可以被在此公開的新的肌醇六磷酸酶降解。因此，術語“肌醇六磷酸鹽”，“植酸”和“肌醇六磷酸鈣鎂”的其中一種在這里公開方法的描述中，可以理解它作為一個代表性術語起作用，其進一步是指肌醇六磷酸酶的任何底物，包括“肌醇六磷酸鹽”，“植酸”和“肌醇六磷酸鈣鎂”。
一個“多核苷酸”是由2個或更多核苷酸堿基或核苷酸堿基對組成的分子。
具有“前體”或“原體”的分子是在途中經過一種或多種共價或非共價化學修飾的任何組合(如糖基化，水解分裂，二聚體化或低聚體化，溫度-誘導或pH-誘導的構象變化，伴隨輔因子，等等)，獲得一種更成熟的分子形式，這種分子形式與參考的原體分子相比有不同的特性(如活性增加)。當一個“前體”或“原體”的前體分子能經歷兩種或更多化學修飾時(如兩個水解裂開，或一個水解裂開和一個糖基化變化)，途中產生了成熟分子，術語“前體”或“原體”也可以用于參考的前體分子。因此，前體—原體酶是“前態—原體—形式”的酶。同樣的，前體—原體激素是“前體—原體—形式”的激素。
這里使用的術語“試劑”包括本發明的肌醇六磷酸酶分子。優選的是，這種肌醇六磷酸酶分子催化肌醇六磷酸鹽水解成肌醇和游離磷酸鹽，從植酸復合物中釋放礦物質。一種肌醇六磷酸酶的實例是來源于大腸埃希氏桿菌B.的肌醇六磷酸酶。這種實例的酶見
圖1，SEQ ID NO2。另外，如此所述，術語“試劑”包括本發明的底物試劑分子，如肌醇六磷酸鹽分子。優選的是，在食物，潛在食物，副食品(既有體外副食品也有體內副食品，如體內外反應產物和動物排泄產物)，食物前體，和其他來源的肌醇六磷酸鹽中可以發現這種肌醇六磷酸鹽分子。
“重組”酶指重組DNA技術產生的酶，即，編碼需要酶的外源DNA構建轉化細胞產生。“合成”酶是那些化學合成的酶。
本領域中已知的兩種酶之間的“相似性”是通過比較氨基酸序列和一種酶的氨基酸與第二種酶的序列的保守氨基酸替代物決定的。相似性可以由本領域內熟知的步驟測定，例如，BLAST程序(國家生物信息中心的局部基本排列搜索工具)。
一對分子的成員(如，抗體-抗原對或核酸對)說成相互“特異結合”，如果它們相互結合后親和力比其他非特異分子的結合力大。例如，抗體與它結合的抗原的結合比非特異蛋白更有效可以描述成與抗原的特異結合。(類似地，核酸探針可以描述成與靶核酸特異結合，如果它通過堿基連接相互作用與靶核酸形成特異雙體(見上)。)
“嚴格的雜交條件”表示僅僅在序列間至少90％相同，優選的是至少95％相同，最好是97％相同，雜交才會發生。見Sambrook等，1989，在此整體引入作為參考。
本發明還包括具有與肌醇六磷酸酶多肽序列“實質上相同的”的序列的多肽，如SEQ ID NO1的一種。一種“實質上相同的”氨基酸序列是不同于參考文獻序列的序列和僅僅通過保守氨基酸替代的序列，例如，一種氨基酸序列替代另外一種同類的氨基酸序列(如替代一種疏水氨基酸，如異亮氨酸，纈氨酸，亮氨酸，或蛋氨酸，為另外一種，或替代一種極性的氨基酸為另外一種，如替代精氨酸為賴氨酸，谷氨酸為天冬氨酸，或谷氨酰胺為天冬酰胺)。
另外一種“實質上相同的”氨基酸序列是不同于一個參考序列的序列和通過一種或多種非-保守替代，缺失，或插入的序列，尤其是當這樣一個替代發生在分子的非活性位點的位點時，提示多肽必須保留它的行為特性。例如，一種或多種氨基酸可以從肌醇六磷酸酶多肽缺失，導致多肽的結構修飾，但并不明顯改變其生理活性。例如，不需要肌醇六磷酸酶生物活性的氨基-或羧基-末端氨基酸可以被去掉。這種修飾導致形成更小的活性肌醇六磷酸酶多肽。
本發明提供了一種“實質上的純酶”。這里使用的術語“實質上的純酶”描述了一種分子，如一種實質上不含有其他蛋白，脂類，碳水化合物，核酸和其他生物物質的多肽(如肌醇六磷酸酶多肽，或其片段)，但它與它們是自然相關的。例如，一種實質上的純分子，如一種多肽，至少占目標分子干重的60％。多肽的純度可以使用標準方法測定，包括如，多丙烯酰胺凝膠電泳(如SDS-PAGE)，柱層析法(如高效液相色譜(HLPC))，和氨基末端氨基酸序列分析。6.發明的詳細描述6.1-新的肌醇六磷酸酶6.1.1-新肌醇六磷酸酶-一般概述本發明提供了純化的重組肌醇六磷酸酶，見
圖1。另外，本發明提供了編碼成熟酶的分離核酸分子(多核苷酸)，此成熟酶具有
圖1推斷的氨基酸序列。
本發明的肌醇六磷酸酶分子(尤其是重組酶和編碼它的多核苷酸)，它們的結構和它們的起源在專利上是新的。另外，關于本活性肌醇六磷酸酶分子在專利上也是新的。例如，使用一種測定方法(在食品化學藥典，第四版中有描述)，證明本發明的肌醇六磷酸酶的活性與真菌(曲霉屬)肌醇六磷酸酶相比有明顯高的活性。具體地，許多實驗表明大腸桿菌肌醇六磷酸酶的活性大約是4400U/mg，而曲霉屬肌醇六磷酸酶的活性大約是105U/mg。這相當于在活性上有超過40倍以上的差異。
6.1.2-肌醇六磷酸酶多肽本發明提供了一種純化的重組酶，其催化肌醇六磷酸鹽水解為肌醇和游離磷酸鹽，從植酸復合物中釋放出礦物質。典型的純化酶是來源于大腸埃希氏桿菌B的肌醇六磷酸酶。這一典型的肌醇六磷酸酶見
圖1 SEQID NO2所不。
除了
圖1的酶(尤其是成熟酶)以外，本發明的酶還包括具有與肌醇六磷酸酶多肽序列“實質上相同的”序列的多肽，如SEQ ID 1中的一種。
在一個實施方案中，本發明SEQ ID NO2的肌醇六磷酸酶的分子量大約是47,056千道爾頓，其測定使用SDS-PAGE并從基因的核苷酸序列推斷。PI是6.70。這種酶的pH和溫度的關系以及穩定性數據見圖2。這種純化的酶可以用來催化肌醇六磷酸鹽水解成肌醇和需要的游離磷酸鹽。本發明的肌醇六磷酸酶具有較高的熱穩定性；因此它尤其適用于高溫和/或高壓應用包括，但不局限于，不過早溶于水的魚食膠囊的制備。
本發明的肌醇六磷酸酶多肽具有
圖1所示的肌醇六磷酸酶氨基酸序列(SEQID NO2)。肌醇六磷酸酶多肽，如從中大腸桿菌B分離的那些，其特征是催化肌醇六磷酸鹽水解成肌醇和游離的磷酸鹽，從植酸復合物中釋放出礦物質。
本發明的其他肌醇六磷酸酶多肽是與肌醇六磷酸酶多肽氨基酸序列至少有約50％相同的氨基酸序列的多肽，如SEQ ID NO2中任何肌醇六磷酸酶。決定氨基酸序列同源性的比較的長度可以是，例如，至少15個氨基酸和例如至少20，25或35個氨基酸。
同源或相同性常常使用序列分析軟件(如基因計算機集團的序列分析軟件包，Wisconsin大學生物工程中心，1710大學大道，Madison，WI53705)測定。這個軟件通過選定多個缺失，替代或其他修飾的同源程度選出相同的序列。上下文中兩個或多個核酸或多肽序列的術語“同源”和“相同”指當在對比窗口或指定區域比較和排列最大一致性時，兩個或多個相同序列或或相同的子序列，或具有特異比例的氨基酸殘基或相同的核苷酸，其測定使用任何數目的序列比較算法或通過手工排列和可視化檢查。
為了序列比較，典型地，是將一種序列作為參考序列，與測試序列比較，但可以使用參考序列的數據庫。當使用一種序列比較算法，測試和參考序列輸進計算機，繼之同等序列被指定，如果需要，序列算法程序參數被指定。使用默認程序參數，或可以指定其他可選擇的參數。然后序列比較算法基于程序參數上計算檢測序列相對參考序列的序列等同百分比。
這里使用的一個“對比窗口”，包括任何鄰位數目的一個片段的參考，該鄰位選自由20至600組成的基團，通常大約50至大約200，更通常大約100至大約150，在兩種序列都最佳排列后，其中一種序列可以與鄰位相同數目的參考序列相比較。作為比較的序列排列方法在本領域中是已知的。比較序列的最佳排列可以通過，如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482，1981的局部同源算法，Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol 48443，1970的同源排列算法，Person和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444，1988的相似性方法搜索，這些算法的計算機化工具(Wisconsin基因軟件包，基因計算機組，575科學Madison博士，WI的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA)，或手工排列和可視化檢查來進行。其他測定同源或相同性的算法包括，例如，除了BLAST程序(國家生物資料中心的局部基本排列搜索工具)以外，ALIGN，AMAS(多排列序列的分析)，AMPS(蛋白多序列排列)，ASSET(排列片斷統計估算工具)，BANDS，BESTSCOR，BIOSCAN(生物序列比較分析節點)，BLIMPS(Blocks IMProved Searcher)，FASTA，區間和切點，BMB，CLUSTAL V，CLUSTAL W，CONSENSUS，LCONSENSUS，WCONSENSUS，Smith-Waterman算法，DARWIN，Las Vegas算法，FNAT(強化核苷酸排列工具)，框架排列，框架尋找，DYNAMIC，FILTER，FSAP(Fristensky序列分析包)，GAP(全球排列程序)，GENAL，GIBBS，GenQuest，ISSC(敏感序列比較)，LALIGN(局部序列排列)，LCP(局部容量程序)，MACAW(多排列構建和分析工作臺)，MAP(多排列程序)，MBLKP，MBLKN，PIMA(模式誘導的多序列排列)，SAGA(基因算法序列排列)和WHAT-IF。這些算法程序也可以用來掃描基因數據庫，以鑒定有實質上相同序列的多核苷酸序列。許多基因數據庫都是可獲得的，例如，人類基因組的實質部分可作為人類基因組序列計劃的一部分而獲得(J.Roach，http//weber.u.Washington.edu/～roach/human_genome_progess 2.html)(Gibbs，1995)。至少21個其他基因組已經被測序，包括，例如，M.genitalium(Fraser等，1995)M.jannaschii(Bult等，1996)，H.influenzae(Fleischmann等，1995)，大腸桿菌(Blattner等，1997)，和酵母(S.cerevisiae)(Mewes等，1997)和D.melanogaster(Adams等，2000)。在模型生物如小鼠，C.elegans，和Arabadopsis sp基因組測序中已經取得了明顯的進步。含有一些功能信息注釋的基因組信息的許多數據庫由不同的組織進行維護，通過國際互聯網可以得到，例如，http//wwwtigr.org/tdb；http//www.genetics.wisc.edu；http//genome-www.stanford.edu/～ball；http//hiv-web.lanl.gov；http//www.ncvi.nlm.nih.gov；http//www.ebi.ac.uk；http//pasteur.fr/other/biology；和http///www.genome.wi.mit.edu.
一個有用的算法實例是BLAST和BLAST2.0算法，分別在Altschul等，Nuc.AcidRes.253389-3402，1977，和Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410，1990中分別描述。運行BLAST分析的軟件可以公開通過生物技術信息國家中心獲得(http//www.ncvi.nlm.nih.gov)。這一算法首先包括通過在所查詢的序列中鑒別長度W的短代碼識別高分數序列對(HSPs)，當在序列數據庫中排列相同長度的代碼時，它可以匹配或滿足一些正值一值分數T。T指作為相鄰代碼的域值分數(Altschul等，見上)。這些最初的相鄰代碼命中作為啟動尋找含它們的較長HSPs的搜索依據。只要累加排列分數增加，命中的代碼沿著每一序列向兩個方向延伸。核苷酸序列的累加分數使用參數M計算(一對匹配殘基的回饋分數；總是＞0)。氨基酸序列的評分矩陣使用累加分數計算。命中的代碼在每一方向延伸，在以下情況下停止，當累加排列分數從它的最大獲得值通過定量X下降時；累加分數由于一種或多種負分殘基排列累加降至0或以下時；或任何一個序列到達末端時。BLAST算法參數W，T和X決定了排列的敏感性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用默認一個長度為11的代碼，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4和兩鏈的比較。用于氨基酸序列的BLASTP程序采用默認的一個長度為3的代碼，期望值(E)為10，BLOSUM62評分矩陣(見Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915，1989)排列(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4，和兩鏈的比較。
BLAST算法在統計分析兩個序列的相似性時也起作用(見如，Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873，1993)。BLAST算法提供的一種相似性的測量是最小數目的可能性(P(N))，它提供一種可能性的提示，即兩個核苷酸或氨基酸序列可能偶然相配。例如，如果檢測的核酸與參考核酸相比其最小數目可能性低于0.2的話，可以認為這一核酸與參考核酸序列相似，更優選低于大約0.01，最好優選低于大約0.001。
在一個實施方案中，蛋白和核酸序列同源使用基礎局部排列搜索工具(BasicLocal Alignment Search Tool)(“BLAST”)評價。尤其是，5種特異的BLAST程序用來進行以下工作(1)BLASTP和BLAST3比較一個氨基酸查詢序列與一個蛋白序列數據庫；(2)BLASTN比較一個核苷酸查詢序列與一個核苷酸序列數據庫；(3)BLASTX比較一個查詢核苷酸序列(雙鏈)的六框架結構概念翻譯產物與一個蛋白序列數據庫；(4)TBLSTN比較一個查詢蛋白序列與所有六種可讀框架(雙鏈)中翻譯的一個核苷酸序列數據庫；和(5)TBLASTX比較一個核苷酸查詢序列的六框架結構翻譯物與一個數據庫核苷酸序列六種框架結構。
BLAST程序通過在一個查詢氨基或核酸序列與一個優選通過蛋白或核酸序列數據庫獲得的檢測序列之間鑒別相似片段鑒別同源序列，這里的片段是指“高分數的片段堿基對”。高分數片段堿基對優選通過評分矩陣的方法鑒別(即，排列)，其中許多在本領域中是已知的。優選的使用的評分矩陣是BLOSUM62矩陣(Gonnet等，Science 2561443-1445，1992；Henikoff和Henikoff，Proteins1749-61，1993)。次優選的是，可以使用PAM或PAM250矩陣(見，如Schwartz和Dayhoff，eds，1978，檢測距離關系的矩陣蛋白序列和結構圖集，Washington國家生物醫學研究委員會)。BLAST程序可以通過美國國家醫學圖書館獲得，如在www.ncbi.nlm.nih.gov.
上述算法中的參數可以根據研究的序列長度和同源的程度來修改。在一些實施方案中，在使用者沒有說明書的時候，參數可以是算法的默認參數。
本發明進一步涉及一種具有
圖1推斷的氨基酸序列的酶，及類似物，衍生物，和這種酶的片段。
圖1酶的一個類似物，衍生物或酶的片段可以是(a)用不是由基因代碼編碼的一個氨基酸殘基替代的一種或多種氨基酸殘基其中的一個，或(b)包括一個替代基團的一種或多種氨基酸殘基中的一個，或(c)成熟酶與另一種化合物融合的一個，如增加酶的半衰期的化合物(例如，聚乙二醇)，或(d)提供了一種標記或標識，如6倍His標記或綠色熒光蛋白標記，(e)附加的氨基酸融合至成熟酶內中的一個，如一種引導或分泌序列或用于純化成熟酶或原蛋白原序列的一個序列。這些類似物，衍生物和片段被認為是在此講授的本領域中的專業技術人員的范圍之內。
一種變體，如，一種“片段”，“類似物”或“衍生物”酶，和參考酶可能在氨基酸序列的一種或多種替代物，附加物，缺失物，融合物和截斷物上不同，它可以以任何組合形式存在。
優選變體中，那些是從保守氨基酸替代的參考物中發生變化的。這種替代是在一個多肽中給定的氨基酸被另外一種類似特征的氨基酸替代。已知典型的保守替代是用替換，一種替換另一種，在脂肪族氨基酸Ala，Val，Leu和Ile中；Ser和Thr羧基互換，酸基殘基Asp和Glu的交換，Asn和Gln氨基殘基之間替代，Lys和Arg堿性殘基交換和芳香族殘基Phe和Tyr中的替換。
因此，在一個特異的非限定的實例中，一種替代可以包括一個氨基酸被另外一個類似特性的氨基酸替代。在另外一個特異的非限定性實例中，一種替代可以包括一個氨基酸被不相似的氨基酸替代，其中變化是非抑制或靜止的或至少一種酶的特性被加強。
另外，在一個非限定性的實例中，一種附加物包括在蛋白的羧基末端或者氨基或可選擇的在末端區之間的一種附加物，其中變化是非抑制或靜止的或至少一種酶的特性被加強。
在另外一個特異的非限定的實例中，一種變化可以由許多修飾組成，包括替代，附加，缺失，融合和/或切斷，在由參考多核苷酸(SEQ ID NO1)編碼的酶中，因此，不管個別修飾的的效果，當共同發生時，修飾效果是非抑制或靜止的或至少一種酶的特性被加強。
最優選的是保留與來自其改變的參考多肽具有實質上相同生物學功能和活性的變體。
本發明的術語“變體”指多核苷酸或多肽，其一個或多個堿基對，密碼子，內含子，外顯子或氨基酸殘基(分別)被修飾，仍然保留本發明肌醇六磷酸酶的生物學活性。變體可以通過任何數目的方式產生，包括方法如，錯誤傾向PCR、移動、寡核苷酸定向突變、組合PCR、有性PCR突變、體內突變、盒式突變、循環集合突變、指數集合突變、位點特異的突變、連接重裝、GSSM和它們任何的組合，以下會有更完整的討論。
6.1.3-肌醇六磷酸酶多核苷酸依據本發明的一個方面，提供了編碼成熟酶的分離核酸分子(多核苷酸)，該酶具有
圖1推斷的氨基酸序列。
編碼SEQ ID NO2的多核苷酸最初從大腸埃希桿菌B基因組中回收的基因組DNA，以下會有描述。它包含一種開放的可讀框架，該框架編碼一個432個氨基酸殘基的蛋白。
依據本發明的另外一個方面，提供了一種分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼包括
圖1的DNA的本發明的一個典型的酶(SEQ ID NO1)。
本發明還涉及與參考多核苷酸不同的多核苷酸，其變化是靜止的變化，例如，這種變化不改變多核苷酸編碼的氨基酸序列。本發明還涉及核苷酸變化，該變化引起由參考多核苷酸(SEQ ID NO1)編碼的酶的氨基酸替代，附加，缺失，融合，和切斷。在發明的一個優選方面，這些酶保留了與參考多核苷酸編碼的酶大致相同的生物功能。
本發明還提供了編碼上述肌醇六磷酸酶多肽的分離的核酸分子。例如，包括在本發明內的編碼SEQ ID NO2的核酸。這些核酸包含自然產生的核苷酸序列，或不同于那些自然產生的編碼肌醇六磷酸酶的核酸，但編碼相同的氨基酸的序列，這是由于基因代碼的簡并性。本發明的核酸包含DNA或RNA核苷酸，或它的組合體或修飾體。發明的典型核酸見SEQ ID NO1。
本發明的多核苷酸可以是DNA的形式，DNA包括cDNA，基因組DNA和合成DNA。DNA可以是雙鏈或單鏈，如果單鏈可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。編碼成熟酶的的編碼序列可以與
圖1所示的編碼序列和/或淀質克隆(SEQ ID NO1)相同，或可以是一個不同的編碼序列，而這一編碼序列，是基因代碼的超員或簡并的結果，編碼了與
圖1DNA(如，SEQ ID NO1)相同的成熟酶。
編碼
圖1(如，SEQ ID NO2)成熟酶的多核苷酸可以包括，但不局限于僅對成熟酶的編碼序列；成熟酶的編碼序列和附加編碼序列如一個引導序列或一個原蛋白序列；成熟酶的編碼序列(選擇性附加編碼序列)和非編碼序列，如內含子或成熟酶的非編碼序列5’和/或3’編碼序列。
本發明進一步涉及這里和上面描述的多核苷酸的變體，它編碼具有
圖1(如，SEQ ID NO2)推斷的氨基酸序列酶的片段，類似物和衍生物。多核苷酸的變體可以是一個自然產生的多核苷酸的等位基因變體或一個多核苷酸的非自然產生的變體。
因此，本發明包括編碼與
圖1所示相同成熟酶的多核苷酸，以及這些多核苷酸的變體，該變體編碼
圖1酶的一個片段，衍生物或類似物。這種核苷酸變體包括缺失變體，替代變體和附加或插入變體。
正如這里和上面所示，多核苷酸可以具有一個自然產生
圖1所示編碼序列的等位基因變體的一個編碼序列。如在本領域中已知的，一個等位基因變體是一個多核苷酸序列的另外一種形式，它可以有一個或多個核苷酸的替代，缺失或附加，實質上并不改變所編碼酶的功能。
如這里討論的，變體可以通過任何種方式產生，包括的方法如錯誤傾向PCR、移動、寡核苷酸定向突變、組合PCR、有性PCR突變、體內突變、盒式突變、循環集合突變、指數集合突變、位點特異的突變、連接重裝、GSSM和它們任何的組合。
在一個方面，一個非隨機方法命名為合成的連接重裝(SLR)，有一些與隨機移動相關，只是核酸構筑塊不是移動或鏈狀結合或隨機嵌合，而是非隨機結合，可以用于產生變體。
SLR方法不依賴于要移動的多核苷酸之間高水平同源物的存在。本發明可以用于非隨機產生子代分子庫(或區)，包括超過10100不同的嵌合體。可以想象，SLR甚至可以用來產生包括超過101000不同子代嵌合體的庫。
因此，在一個方面，發明提供了一個非隨機方法產生一類具有總裝配順序的最終嵌合核酸分子，該其順序是通過設計選擇，設計方法包括通過設計產生一些具有有用的相容的可連接末端的多數特異核酸構筑塊的步驟，將這些核酸構筑塊裝配，因此獲得了總裝配順序的設計。
要裝配的核酸構筑塊的相容的可連接末端對這類順序的裝配來說認為是“有用的”，如果它們能使構筑塊在測定前順序中被偶聯。因此，在一個方面，核酸構筑塊可以偶聯的總裝配順序通過專門對可連接末端進行設計，并且如果使用了超過一種裝配步驟，那么可被偶聯的核酸構筑塊的總裝配順序可通過裝配步驟系列順序來特殊化。在發明的一個實施方案中，退火構筑部件用酶處理，如連接酶(如T4 DNA連接酶)以實現構筑部件的共價結合。
在另外一個實施方案中，核酸構筑塊的設計依賴一些前體核酸模板的序列分析獲得，模板作為產生子代最終嵌合核酸分子的基礎。因此這些前體核酸模板作為序列資料來源幫助設計要突變，如嵌合或移動的核酸構筑塊。
在一個實例中，本發明提供了相關基因家族的嵌合及其編碼相關產物的家族。在一個特定的實例中，編碼的產品是酶。本發明的酶和多肽可以依據這里描述的方法突變。
因此根據發明的一個方面，一些前體核酸模板序列為了選擇一種或多種分界點而排列，分界點可以定位于同源區域。分界點可以用于描述要產生的的核酸構筑塊的界限。因此，在前體分子中鑒別和選擇的分界點作為子代分子裝配的潛在嵌合點。
一個有用的典型分界點是同源區域(包括至少一個同源核苷酸堿基)被至少兩個前體模板分享，但是典型分界點是被至少一半前體，至少三分之二的前體模板，至少四分之三的前體模板，優選的是幾乎所有的前體模板，分享的同源區域。甚至最優選的是有用的典型分界點是同源區域被所有的前體模板分享。
在一個實施方案中，為了產生詳盡的庫進行完整的連接重裝方法。換一句話說，核酸構筑塊的所有可能的順序組合是以一類最終嵌合的核酸分子為代表。同時，每一組合的裝配順序(如在每一最終嵌合核苷酸的5’至3’序列的每一構筑塊的順序)經過設計(或非隨機)。由于方法的非隨機屬性，出現不需要的副產品的可能被大大降低了。
在另外一個實施方案中，方法提供了系統性執行的連接重裝過程，例如為了產生系統性的區室文庫，可以系統性的篩選區室，如一個挨一個。換一句話說發明提供，通過選擇性和審慎使用特異核苷酸構筑塊，與選擇性和審慎使用的順序的分步驟的裝配反應，可以實現實驗性的設計，其中子代產品特異種類可以在每一反應管獲得。這允許進行一個系統性的檢查和篩選步驟。因此，這允許潛在非常大數量的子代分子可以在較小基團中進行檢查。
由于它執行嵌合的能力在一定意義上是高度彈性的，雖然也很詳盡和系統性，尤其當在子代分子中有低水平的同源性時，但本發明提供一個包括大量子代分子的庫(組)的產生。由于本發明的連接重裝的非隨機屬性，優選產生的子代分子包括最終嵌合核酸分子的庫，該分子具有一個總體的通過設計選擇的裝配順序。在一個特定的實施方案中，這樣一個產生的庫包括超過103至101000不同的子代分子種類。
在一個方面，一類最終嵌合的核酸分子，其產生如上描述，包括編碼多肽的多核苷酸。根據一個實施方案，這一多核苷酸是一個基因，可以是人造基因。根據另外一個實施方案，這種多核苷酸是一個基因通路，可以是一個人造基因通路。本發明提供一種或多種由本發明產生的人造基因可以被摻入一個人造基因通路，如一個真核生物中的(包括一種植物)可操作通路。
在另外一個實例中，產生構筑塊的步驟的合成屬性允許設計和引入核苷酸(如，一種或多種核苷酸，例如可能是密碼子或內含子或調控序列)，以后可選擇性在體外過程(如通過基因突變)或體內過程(如通過利用宿主生物的基因剪接能力)中移除。適宜的是，除了產生可用分界點的潛在益處外，許多例子中引入這些核苷酸還需要許多其它理由。
因此，根據另外一個實施方案，發明提供了一個核酸構筑塊可以用于引入一個內含子。因此，發明提供功能性內含子可以引入本發明的人造基因中。本發明還提供了功能性內含子引入本發明人造基因的通路。因此，本發明提供了嵌合多核苷酸的產生，該多核苷酸是含一個(或多個)人工引入內含子的人造基因。
因此，發明還提供了一個嵌合多核苷酸的產生，多核苷酸是包含一個(或多個)人工引入內含子的人造基因通路。優選是，人工引入的內含子在一種或多種宿主細胞的基因剪接上有用的，剪接的方式是自然發生的內含子在基因剪接中起作用。發明提供了產生含內含子的人造多核苷酸引入宿主生物用作重組和/或剪接方法。
本發明產生的人造基因也可以用作與另外的核酸重組的底物。類似的，本發明產生的人造基因通路也可以用作與另外的核酸重組的底物。在一個優選的實例中，重組的促進是通過，或發生在，在人造含內含子基因和一個核酸之間作為一個重組對的同源區域。在一個尤其優選的實例中，重組對也可以是本發明產生的一個核酸，包括一個人造基因或一個人造基因通路。重組的促進可以通過，或發生在，存在在一個或(多個)人工引入的人工基因的內含子上的同源區域。
本發明的合成連接重新裝配方法利用許多核酸構筑塊，每一個優選具有兩個可連接端。每一個核酸構筑塊的兩個可連接端可以是兩個平端(如每一個含0個核苷酸的懸垂)，或優選一個平端一個懸垂端，或最優選的是有兩個懸垂端。
這一目的的可用的懸垂可以是3’懸垂或5’懸垂。因此，核酸構筑塊可以有一個3’懸垂或一個5’懸垂或兩個3’懸垂或兩個5’懸垂。核酸構筑塊聚合形成一個最后嵌合核酸分子的總順序通過目的性的實驗設計而不是隨機決定。
根據一個優選的實施方案，核酸構筑塊通過兩個單鏈核酸(也指單鏈寡核苷酸)的化學合成產生，使它們接觸以便讓它們退火形成雙鏈核酸構筑段塊。
雙鏈核酸構筑塊尺寸可以變化。這些構筑塊的尺寸可以很小也可以很大。優選的構筑段塊尺寸區域從一個堿基對(不包括任何懸垂)至100,000堿基對(不包括任何懸垂)。也提供了其他優選的尺寸范圍，較低的限度從1個堿基對至10,000個堿基對(包括兩者之間的每一整數值)，和高限度從2個堿基對至100,000個堿基對(包括兩者之間的每一整數值)。
許多通過產生雙鏈核酸構筑塊的方法可用于本發明；它們在本領域中是已知的，可以逐漸被熟練的專業技術人員所使用。
根據一個實施方案，雙鏈核酸構筑塊的產生，首先通過產生兩個單鏈核酸允許它們退火形成一個雙鏈核酸構筑塊。雙鏈核酸構筑塊的兩條鏈可以在每一個遠離任何形式懸垂的核苷酸上互補；因此不包含錯配，也遠離任何懸垂。根據另外一個實施方案，雙鏈核酸構筑段塊的兩條鏈互補較每一遠離任何形式懸垂的核苷酸少。因此，根據這一實施方案，雙鏈核酸構筑塊可以用于引入密碼子簡并。優選的密碼子簡并是使用這里描述的區域飽和基因突變引入，使用一種或多種N，N，G/T基因盒或選擇使用另外一種或多種N，N，N基因盒。
本發明的體內重組方法可以在一個未知的特異多核苷酸或序列的雜交或等位基因上設盲進行。然而，不必要知道特異多核苷酸的實際的DNA或RNA序列。
在混合數量基因內使用重組方法對產生任何有用蛋白是有用的，例如，白介素I，抗體tPA和生長激素。這種方法可以用于產生具有變化特性或活性的蛋白。這一方法對產生雜交核酸序列也是有用的，例如，啟動子區，內含子，外顯子增強子序列，基因的31未翻譯區或51未翻譯區。因此這一方法可以用來產生增加表達率的基因。這一方法在研究重復DNA序列中也是有用的。最后，這一方法可能用于突變核糖體或aptamers。
在一個方面，這里描述的多核苷酸和多肽的變體通過使用還原基因重新分配，重組和選擇的重復循環獲得，它們允許高度復合線性序列如DNA，RNA的定向分子進化或蛋白的完全重組。
分子的體內移動對提供變體有用，可以利用細胞的自然屬性重組多聚體。而體內重組為分子的多樣性提供了較大的自然條件，基因重組保持相對較復雜的過程包括1)識別同源序列；2)鏈解開，鏈進入和導致重組交叉產物的代謝步驟；最后3)檢查交叉進入分泌重組分子。交叉的形成需要識別同源序列。
在另外一個實施方案中，本發明包括從至少第一個多核苷酸和第二個多核苷酸產生雜交多核苷酸的方法。本發明可以用來產生一個雜交多核苷酸，其方法是通過引入至少第一個多核苷酸和第二個多核苷酸進入合適的宿主細胞，它們至少有一個相同的部分同源序列區。部分同源序列區促進導致序列重新識別產生一個雜交多核苷酸的過程。這里使用的術語“雜交多核苷酸”，是從本發明的方法中得到的任何核苷酸序列，包含至少兩種來源多核苷酸序列。這種雜交多核苷酸可以從分子內重組事件中得到，它促進了DNA分子中的序列整合。另外，這種雜交多核苷酸可以從還原基因重配的分子外過程得到，這一過程利用了重復序列在DNA分子內改變核苷酸序列。
本發明提供了一種產生雜交多核苷酸的方法，該雜交多核苷酸可以編碼生物活性雜交多肽(如雜交肌醇六磷酸酶)。在一個方面，原始多核苷酸編碼生物活性多肽。本發明的方法通過利用細胞過程產生新的雜交多肽，這一過程整合原始多肽序列，因此得到的雜交多核苷酸編碼表現來源于原始生物活性多肽的多肽。例如，原始多肽可以從不同的微生物中編碼一個特殊的酶。從一種生物或變體的第一個多核苷酸編碼的酶可以，例如，有效的在特殊的環境條件下起作用，如高鹽。從一種不同的生物或變體來源的第二個多核苷酸編碼的酶可以，例如，有效的在不同的環境條件下起作用，如極高溫度。包含來自第一個和第二個原始多核苷酸順序的雜交多核苷酸可以編碼一種展示原始多核苷酸編碼的兩種酶的特性的酶。因此，雜交多核苷酸編碼的酶可以有效的在第一個和第二個多核苷酸編碼的每一個酶共有的環境條件下有效作用，如，高鹽和極高的溫度。
原始多核苷酸編碼的酶包括，但不局限于，肌醇六磷酸酶。來自本發明方法的一個雜交多核苷酸可以展示特殊的酶活性，而不表現原始酶的特殊酶活性。例如，編碼水解酶活性多核苷酸重組和/或還原基因重新分配后，得到的雜交多核苷酸編碼的雜交多肽可以篩選從每一個原始酶獲得的特殊水解酶活性，如，水解酶起作用的鍵的類型和水解酶作用的溫度。因此，例如，水解酶可以被篩選以確定那些化學功能，從原始酶中鑒別雜交水解酶，如(a)酰胺(肽鍵)，如蛋白酶；(b)脂鍵，如酯酶和脂肪酶；(c)乙縮醛，如糖苷酶和例如，雜交多肽作用的溫度，pH或鹽濃度。
原始多核苷酸的來源可以是從個體生物體分離(“分離物”)，在限定介質內生長的生物收集(“強化培養”)，或，非培養生物(“環境樣品”)。優選使用不依賴培養的方法從環境樣品中獲得多核苷酸編碼的新活性，因為它允許獲得生物多樣性的未使用資源。
“環境庫”是從環境樣品中產生，代表自然發生生物的基因組集合，在克隆載體中實現，可以在合適的原核宿主內繁殖。因為克隆的DNA最初是從環境樣品中直接提取，庫不局限于可以在純培養下生長的小部分原核細胞。另外，在這些樣品中存在的環境DNA的正常化可允許原始樣品中存在的所有種類有更多同等DNA顯示。這可以明顯增加從樣品中的最小成分中發現興趣基因的效率，這可以通過相對顯性種類的幾個數量順序來顯示。
例如，從一個或多個非培養微生物產生的基因庫中篩選感興趣的活性。編碼感興趣的生物活性分子的潛在通路首先被基因表達文庫形式的原核細胞捕獲。編碼感興趣的活性的多核苷酸從這些庫中分離，引入一個宿主細胞。宿主細胞在促進重組和/或還原基因重排的條件下生長，產生潛在的具有新的或增加活性的活性生物分子。
多核苷酸制備的微生物包括原核微生物，如黃色無芽孢桿菌屬，真細菌，和原始真細菌，和較低級真核微生物如真菌，一些藻和原蟲。多核苷酸可以從環境樣品中分離，其中核酸可以不從培養生物獲得或從一種或多種培養的生物中獲得。在一個方面，這些微生物可以是有特殊嗜好，如嗜高溫，嗜寒冷，psychrotrophs，適鹽性，嗜酸性。特別優選有特殊嗜好的微生物中分離的編碼酶的多核苷酸。這種酶可以在陸棲熱噴泉和深海高溫孔內超過100℃的溫度下工作，可以在北極水低于0℃下，在死海飽和鹽環境，在煤沉淀和地熱豐富含硫物的pH在0左右，或在污泥pH超過11環境下工作。例如，一些從特別嗜好的生物中克隆和表達的酯酶和脂肪酶在較廣范圍溫度和pH值下表現很高活性。
這里和上面描述的選擇和分離的多核苷酸被引入合適的宿主細胞。合適的宿主細胞是任何能促進重組和/或還原基因重新分配的細胞。選擇的多核苷酸優選是已經在一個包含合適控制序列的載體內。宿主細胞可以是高級真核細胞，如哺乳動物細胞，或低級真核細胞，如酵母細胞，或優選的，宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞。構建體引入宿主細胞可以用鈣磷轉染，DEAE-葡聚糖介導的轉染，或電穿孔(Dasiv等，1986)。
作為合適宿主的代表性的實例，將提到細菌細胞，如大腸桿菌，鏈霉菌屬，沙門菌屬typhimurium；細菌細胞，如酵母；昆蟲細胞如果蠅S2和Spodoptera SF9；動物細胞如CHO，COS或小牛黑色素瘤；腺病毒；和植物細胞。在此所講授的合適宿主的選擇在本領域的那些技術人員的理解范圍內。
對不同哺乳動物細胞培養系統的特殊參考可以用于表達重組蛋白，哺乳動物表達系統實例包括COS-7系猴子腎臟成纖維細胞，見“SV40轉化猴細胞支持早期SV40突變體的復制”(Gluzman)描述，和其他能表達相容性載體的細胞系，如，C127，3T3，CHO，HeLa和BHK細胞系。哺乳動物表達載體包括復制起始，合適的啟動子和增強子，和其他必須的核糖體結合區，多腺苷酸區，剪接供區和受區，轉錄末端序列，和5’側向非轉錄區。來源于SV40剪接的DNA序列，和多腺苷酸區可以用于提供需要的非轉錄基因成分。
包含需要的多核苷酸的宿主細胞可以在常規營養培養基中培養，該培養基為激活啟動子，選擇轉化體或擴增基因進行適當的修飾。培養條件，如溫度pH值以及類似物，以前用于選擇表達的宿主細胞，對本領域的普通技術人員來說是明顯的。然后鑒定為具有特異酶活性的克隆進行測序以鑒別編碼具有編碼增強活性的酶的多核苷酸序列。
在另外一個方面，方法可以用于從一個或多個操縱子或基因束或它們的部分產生新地編碼生物化學通路的多核苷酸。例如，細菌或許多真核細胞具有一個調節基因的協調機制，該基因的產物參與相關過程。基因集中在在單一染色體或和與另外一個緊緊相鄰，結構上指“基因束”，在單個調控序列的控制之下共同轉錄，包括單個啟動子發動了整個束的轉錄。因此，一個基因束是一組相鄰基因，它們通常與它們的功能或者相同或者相關。一個由基因束編碼的生物化學通路的一個實例是聚酮化合物。聚酮化合物是具有極端豐富生物活性資源的分子，包括抗生素(如四環素族和紅霉素)，抗癌制劑(柔紅霉素)，免疫抑制劑(FK506和雷怕霉素)，和獸藥產品(莫能星)。許多聚酮化合物(由聚酮化合物合成酶產生)是有價值的治療制劑。聚酮化合物合成酶是多功能酶，催化大量的長度不同，功能和成環作用的方式不同的碳鏈的生物合成。聚酮化合物合成酶基因進入基因束，至少一種類型(命為I類)的聚酮化合物合成酶有擁有大量的基因和酶，復雜的基因調控和這些基因/蛋白的體外研究。
基因束DNA可以從不同生物分離，連接進入載體，尤其是那些含有表達調控序列的載體，可以控制和調節連接基因束的可探測蛋白的產生或來自連接的基因束的蛋白相關排列活性。使用含允許大量外源DNA引入的載體尤其適于這些基因束的使用，通過這里的實例描述，包括大腸桿菌的f-因子(或生育力因子)。大腸桿菌的f-因子是在結合過程中的一個影響其本身高頻率轉移的質粒，對獲得和穩定繁殖大量DNA片段是理想的，如混合微生物樣品的基因束。一旦連接進入合適的載體，兩個或多個行不同肌醇六磷酸酶基因束的載體被引入合適的宿主細胞。基因束共有的部分同源序列區域將促進導致序列重組的過程，獲得雜交基因束。新的雜交基因束然后在起始基因束進行篩選未發現活性的增加。
因此，在一個實施方案中，本發明涉及產生一種生物活性雜交多核苷酸和篩選這樣的增加活性的多肽的方法，通過1)引導至少第一個多核苷酸以可操作的連接和第二個多核苷酸以可操作的連接進入合適的宿主細胞，所述的至少第一個多核苷酸和第二個多核苷酸分享至少一個部分序列同源的區域；2)使宿主細胞在促進序列重組的條件下生長，在可操作連接處獲得一個雜交多核苷酸；3)表達一個雜交多核苷酸編碼的雜交多肽；
4)在促進鑒定增加的生物活性的條件下篩選雜交多肽；和5)分離編碼雜交多肽的一個多核苷酸。
篩選不同的酶活性的方法對本領域內的那些技術人員是已知的，且通過本特例討論。當分離發明的多肽和多核苷酸時這種方法可以使用。
可在此使用的表達載體的代表性實例，將提到病毒微粒，桿狀病毒群，噬菌體，質粒，噬菌粒，粘粒，磷粒，人造細菌染色體，病毒DNA(如牛痘，腺病毒，禽痘病毒，假性狂犬病和SV40衍生物)，P1-依賴的人造染色體，酵母質粒，酵母人造染色體，和其他任何人造宿主的特異載體(如芽胞桿菌屬，曲霉屬和酵母)。因此，例如，DNA可以包括在任何表達多肽的表達載體中。這種載體包括染色體，非染色體和合成DNA序列。大量的合適載體對本領域中的那些技術人員是已知的，可以通過商業獲得。以下載體可以通過實例獲得細菌pQE載體(Qiagen)，pBluescript質粒，pNH載體，λZAP載體(Stratagene)；ptrc99a，pKK223-3，pDR540，pRIT2T(Pharmacia)；真核細胞pXT1，pSG5(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVLSV40(Pharmacia)。然而，只要它們在宿主細胞內是可以復制和有活性的，任何其他質粒或載體都可以使用。本發明使用了低拷貝數目或高拷貝數目的載體。
本發明優選使用的載體類型包含f-因子來源的復制。大腸桿菌的F-因子(或生育力因子)是一個在結合過程中影響高頻轉移和細菌染色體本身的低頻轉移的質粒。優選的實例是使用克隆載體，指作為“磷粒”或人工細菌染色體(BAC)載體。這些來源于大腸桿菌的f-因子能穩定整合基因組DNA的大片段。當從混合非培養環境樣品中整合DNA時，可能實現大基因組片段成為穩定的“環境DNA庫”形式。
發明使用的另外一類載體是粘粒載體。粘粒載體最初為了克隆和傳代大量基因組DNA片段設計。克隆進入粘粒載體詳細描述在“分子克隆實驗手冊”(Sambrook等，1989)。
表達載體的DNA序列可操作性的與指導RNA合成的合適表達控制序列(啟動子)連接。特殊命名的細菌啟動子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，拉拇達PR，PL和trp。真核啟動子包括立即早期CMV，HSV胸腺嘧啶激酶，早期和晚期SV40，反轉錄病毒的LTR，和小鼠金屬硫因-I。選擇合適的載體和啟動子在本領域的普通技術人員的水平之內。表達載體還包括翻譯起始和轉錄終點的核糖體結合區。載體還包括擴增表達的合適序列。啟動子區可以用CAT(氯霉素轉移酶)載體或其他有選擇標記的載體從任何可用的基因中選擇。另外，優選的表達載體包含一個或多個可選擇的標志基因提供轉化宿主細胞的表型特性，如二氫葉酸還原酶或新霉素抗性的真核細胞培養，或大腸桿菌四環素或氨芐青霉素抗性。
體內基因重新分配集中于“分子間”過程，總體是指“重組”，在細菌中常常指“RecA依賴”現象。發明依賴于一個宿主細胞的重組和基因的重新分配的重組過程，或細胞介導還原過程的能力，該過程通過缺失來減少細胞內準重復序列的復雜性。這一“還原性基因重新分配”的過程發生在“分子中”，RecA-不依賴的過程中。
因此，在本發明的另一個方面，變體多核苷酸可以通過還原性基因重新分配方法產生。該方法包括含連續序列(起始編碼序列)構建體的產生，它們插入合適的載體，繼之引入合適的宿主細胞。個體分子同一性的基因重新分配通過擁有同源區的構建體中連續序列之間的組合過程發生，或準-重復單位之間。基因重新分配過程重組和/或減少重復序列的復雜性和程度，導致新分子種類的產生。可以應用許多處理作用增加基因重組比率。這些包括用紫外光處理，或DNA化學性損傷，和/或使用宿主細胞系顯示的“基因不穩定性”的增強水平。因此，基因重新分配過程包括同源重組或準重復序列的自然特性以指導它們的進化。
重復或“準重復”序列在基因的不穩定性上具有重要作用。在本發明中，“準重復”是不限于它們起始單位結構的重復。準-重復單位可以表現為構建體的序列排列；相似序列的連續單位。一旦連接后，連續序列之間的連接基本上看不見，所得構建體的準-重復屬性在分子水平繼續。細胞降低所得構建體復雜性的缺失過程在準-重復序列之間起作用。準重復單位提供實際上無限的模板，在模板上可發生滑脫作用。含準-重復的構建體因此有效的提供了幾乎在準重復單位內的任何地方缺失(和潛在的插入)發生的充足的分子彈性。
當準重復序列在相同的方向都連接時，例如頭至尾或相反的方向，細胞不能區別個體單位。結果，還原過程可以通過序列發生。與之相反，例如，當顯示頭至頭的單位時，而不是頭至尾，反轉表明了鄰近單位的終點，所以缺失的形成將對分離單位的失去有利。因此，本方法優選是序列在相同的方向。準重復序列的隨機方向會導致基因重新分配效率的喪失，而一致的序列方向會提供最高的效率。然而，雖然相同方向具有較少的鄰近序列會降低效率，但是它仍然會提供充足的彈性有效的獲得新分子。在準-重復序列內的相同方向制造構建體會有較高的效率。
序列可以使用任何方法在頭至尾方向裝配，包括以下a)可以使用包括制造單鏈時提供方向的多-A頭和多-T尾的引物。這可以通過具有從RNA制造引物的最初少量堿基來實現，因此易于移走RNAseH。
b)可以使用包含唯一限制剪切位點的引物。需要多個位點，唯一序列的集合，和重復合成和連接步驟。
c)引物的內在少量堿基可以硫基化，使用核酸外切酶產生合適的尾分子。
回收基因重新分配序列依賴于具有降低的RI的克隆載體的識別。重新分配的基因編碼序列然后通過擴增回收。產物被重新克隆和表達。降低的RI克隆載體的回收可以被以下影響1)當構建體的復雜性降低時載體的使用僅僅可穩定的保留，2)通過物理程序物理性回收變短的載體。在這一實例中，使用標準質粒分離方法和尺寸分離獲得克隆載體，分離使用瓊脂糖凝膠或用標準程序將低分子量去除的柱。3)當插入尺寸降低時，可以選擇回收含切斷基因的載體。4)使用直接選擇技術和一個表達載體和合適的選擇。
來自相關生物的編碼序列(如基因)可以闡明高度同源和編碼多種蛋白產品。這些類型的序列作為準-重復在本發明中尤其有用。然而，雖然下面的實例闡明幾乎相同起源編碼序列(準-重復)的基因重新分配，但是這一過程不局限于這些幾乎相同的重復。
以下實例闡明了發明的一種方法。描述了來源于3種獨特種類的編碼核酸序列(準-重復)。每一序列編碼一個獨特特性的蛋白。每一序列的不同在于在序列的獨特位置一個或多個堿基對，稱為“A”，“B”和“C”。準-重復序列被分別或共同擴增和連接進入隨機的集合體，因此在眾多的連接分子中所有可能的排列和組合都是可行的。準-重復單位數目可以被集合條件控制。構建體中準-重復單位平均數目用重復索引(RI)定義。
一旦形成，構建體可以，或不可以根據公開發表的方案在瓊脂糖凝膠上按大小分開，插入克隆載體，轉染進入合適的宿主細胞。然后細胞傳代和“還原性基因重排”發生。還原性基因重排過程的比率可以引入DNA的損傷來刺激，如果需要的話。RI的減少是否通過一種“分子間機制”在重復序列之間的缺失來介導的，或是通過“分子內機制”的類似重組事件的介導不重要。最終結果是分子的基因重新分配進入所有可能的組合中。
選擇性的，本方法包括篩選移動庫的文庫成員的附加步驟以識別具有結合或相互作用，或催化特殊反應(如催化鏈烷鹽水解)能力的單一移動文庫成員。
從這些庫里識別的多肽可以用于治療，診斷，研究和相關目的(如催化劑，增加水溶液的容積滲透克分子濃度的溶質，等等)，和/或可以用于一種或多種移動和/或選擇的加性循環。
在另外一個方面，在基因重組或重新分配之前或之中，本發明的多核苷酸或這里描述的方法產生的多核苷酸可以用作制劑或促進突變體引入起始多核苷酸的方法。這些突變的引入增加了獲得的雜交多核苷酸和它們編碼的多肽的多樣性。促進突變形成的制劑或過程包括，但不局限于(+)-CC-1065，或合成的類似物如(+)-CC-1065-(N3-腺苷酸，見Sun和Huley，1992)；N-乙酰或去乙酰4’-氟-4-氨二苯加合物，能抑制DNA合成(見，例如，van de Poll等，1992)；或N-乙酰或去乙酰4-氨二苯加合物，能抑制DNA合成(同樣見，van de Poll等，1992，pp.751-758)；三價鉻，一種三價鉻鹽，多環的芳香族碳水化合物(“PHA”)DNA加合物，能抑制DNA復制，如7-溴甲基-苯[a]蒽(“BMA”)，tris(2，3，二溴丙基)磷酸鹽(“Tris-BP”)，1，2-二溴-3-氯丙烷(“DBCP”)，二溴丙烯醛(2BA)，苯[a]芘-7，8-二氫化二醇-9-10-環氧化物(“BPDE”)，一種鉑(II)鹵素鹽，N-羥基-2-氨基-3甲基咪唑[4，5-f]喹啉(“N-羥基-IQ”)，和N-羥基-2-氨基-1-甲基-6-苯咪唑[4，5-f]吡啶(“N-羥基-PhIP”)。減慢和停止PCR擴增的優選方法包括紫外光(+)-CC-1065和(+)-CC-1065-(N3-腺苷酸)。特殊的包括方法是DNA加合物或多核苷酸包括多核苷酸或多核苷酸池的DNA加合物，它可以通過一個過程釋放或去除，這一過程包括在進一步的過程之前將包括多核苷酸的溶液加熱。
在另外一個方面，本發明涉及產生具有生物活性重組蛋白的方法，該方法在本發明的為產生雜交或重新分配的多核苷酸提供的條件下，處理包括編碼野生型蛋白的雙鏈模板多核苷酸的樣品。
發明還提供了使用專用密碼子引物(包含簡并的N，N，N序列)將點突變進入多核苷酸，以便產生一類子代多肽，其中完全范圍的單個氨基酸替代在每一氨基酸位置展示(基因區飽和的突變基因(GSSM))。使用的寡探針包括相鄰的第一個同源序列，簡并的N，N，N序列，優選但不必需的第二個同源序列。使用這種寡探針的下游子代翻譯產物包括所有可能的沿著多肽的氨基酸區的氨基酸變化，因為簡并的N，N，N序列包括所有20種氨基酸的密碼子。
在一個方面，這種簡并的寡體(包括一個簡并的N，N，G/T基因盒)用于進行每一母代多核苷酸模板起始密碼子全范圍的密碼子替代。在另一方面，至少兩個簡并N，N，G/T基因盒被使用-或用相同的寡探針或不用，在母代多核苷酸模板上至少兩個起始密碼子進行全范圍的密碼子替代。因此，一種以上的N，N，G/T序列包含在一個寡探針之中，在超過一個區域引入氨基酸突變。這些N，N，G/T序列可以直接相鄰，或被一種或多種附加的核苷酸序列分離。在另一方面，對引入附加和缺失可用的寡探針可以單獨或與含N，N，G/T序列的密碼子一起使用，以引入任何氨基酸附加，缺失，和/或替代的結合或突變。
在一個特定實例中，用含相鄰N，N，G/T三聯體寡體，如簡并(N，N，G/T)n序列的寡探針同時使兩個或多個相鄰氨基酸位置突變是可能的。
在另外一個方面，本發明提供使用含較N，N，G/T序列簡并少的簡并基因盒。例如，在一些例子中需要使用(如寡體)簡并三聯體序列，簡并三聯體包括只有一個N，其中所述N可以在三聯體的第一第二或第三的位置。任何其他堿基包括它的任何組合和突變可以用于保留三聯體中的兩個位置。另外，在一些例子中需要使用(如寡體)簡并N，N，N三聯體序列或一個N，N，G/C三聯體序列。
然而，可以發現因為一些理由使用本發明公開的簡并三聯體(如N，N，G/T或N，N，G/C三聯體序列)是有幫助的。在一個方面，本發明提供了系統性和相對簡單的方法產生全范圍的可能氨基酸(總數為20個氨基酸)替代為多肽中的每一氨基酸位置。因此，為了100個氨基酸多肽，本發明提供了系統性和相對簡單的方法產生2000個不同種類(如，每一位置20個可能的氨基酸乘100個氨基酸位置)。可以發現提供了，通過使用含簡并N，N，G/T或N，N，G/C三聯體序列的寡探針，編碼20個可能氨基酸的32個個體序列。因此，在一個母代多核苷酸序列的反應管中使用一個這類寡探針用于飽和基因突變，產生32個不同子代多核苷酸編碼的20個不同多肽。作為對照，在區域介導的基因突變中使用非簡并寡探針導致每一反應管中只有一種子代多肽產品。
本發明還提供了使用非簡并寡體，它可以選擇性的與公開的簡并寡體一起使用。可以發現在一些情況下，使用非簡并寡體在工作多肽中產生特異突變點是有幫助的。這提供了一種方法產生特異的無義點突變，導致了相應的氨基酸改變的點突變，引起終止密碼子產生的點突變和多肽片段的相應表達。
因此，在一個實施方案中，每一飽和突變基因反應管包含編碼至少20個子代多肽分子的多核苷酸，以至于所有20個氨基酸顯示在一個與母代多核苷酸突變密碼子位置相對應的特異氨基酸位置上。從每一飽和突變基因反應管產生的32倍簡并子代多肽可以用于克隆擴增(如，用一個表達載體克隆進入合適的大腸桿菌宿主中)和進行表達篩選。當個體子代多肽通過篩選識別表現可取的特性變化時(與母代多肽比較)，可以測序識別包含它們的相關可取的氨基酸替代。
可以發現基因突變中在使用這里公開的飽和基因突變在母代多肽的每一氨基酸位置上，發現可取的氨基酸變化可以在超過一個氨基酸位置。一個或多個新子代分子可以在包含所有或部分這些可取的氨基酸替代的組合中產生。例如，如果2個特異可取的氨基酸變化鑒定在多肽三個氨基酸位置的任一時，每一位置突變包括三個可能(起始氨基酸沒有變化，兩個可能的改變中的每一個)和三個位置。因此，有3×3×3或27種總的可能，包括7種以前檢查出來的-6個單獨的點突變(如三個位置，每個有2個)和任何位置沒有變化。
在另一方面，位點飽和突變基因可以與篩選一起共同用于移動，嵌合，重組和其他突變方法。本發明提供以重復方式使用任何基因突變過程，包括突變基因飽和。在一個實例中，重復使用任何基因突變方法與篩選一起使用。
因此，在一個非限定性實例中，本發明的多核苷酸和多肽來源于加性基因突變過程結合的飽和基因突變，如兩個或多個相關多核苷酸引入合適的宿主細胞的過程，通過重組和還原性基因重新分配產生一個雜交多核苷酸的方法。
除了沿著整個基因序列進行的基因突變過程，基因突變可以用于替換多核苷酸序列中任何數目堿基的每一個，其中突變的堿基數目優選從15至100000的每一整數。因此，除了沿著分子的每一位置的基因突變，可以將每一或分散數目的堿基(優選總數從15至100000)進行基因突變。優選的，分離核苷酸用于沿著多核苷酸序列的每一位置或位置組進行基因突變。三個位置一組進行基因突變是一個密碼子。突變優選使用突變基因引物引入，引物包含外源基因盒，也指作為一個突變基因盒。優選的基因盒可以具有從1至500個堿基。在這樣的基因盒中每一核苷酸位置是N，A，C，G，T，A/C，A/G，A/T，C/G，C/T，G/T，C/G/T，A/G/T，A/C/T，A/C/G，或E，其中E是非A，C，G，或T的任何堿基(E可以指設計寡體)。
一般意義上來說，飽和基因突變包括突變基因盒(其中每一基因盒優選大約1-500堿基長度)的完全突變，基因盒在限定的多核苷酸序列進行突變(其中突變的序列優選大約從15至100000堿基長度)。因此，一組突變(從1至100突變范圍)引入每一基因盒進行突變。在一個周期的飽和基因突變過程中，一組引入一個基因盒的突變可以與引入第二個基因盒的的第二組突變不同或相同。這類組別通過缺失，附加，特殊密碼子組，和特殊核苷酸基因盒組進行實例。
突變的限定序列包括完整的基因，通路，cDNA，完整的開放可讀框架(ORF)，和完整的啟動子，增強子，抑制子/轉化激活子，復制起始，內含子，操縱子，或任何多核苷酸功能基團。一般的，這一目的的“限定序列”可以是任何多核苷酸，即15個堿基-多核苷酸序列，15個堿基和15000個堿基之間長度的多核苷酸序列(本發明特異命名了之間的每一整數)。選擇密碼子組的考慮包括簡并突變基因盒編碼的氨基酸類型。
在一個優選的實例中，一組突變可以引入突變基因盒，這一發明特異提供了簡并密碼子替代(使用簡并寡探針)在每一位置編碼2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，和20個氨基酸，和因此編碼的多肽庫。
本發明還包括多核苷酸，其中成熟酶的編碼序列可以在相同的可讀框架中融合至多核苷酸序列，可以幫助酶從宿主細胞表達和分泌，例如，控制酶從細胞中轉運的引導序列。具有引導序列的酶是一個蛋白前體的實例，可以通過宿主細胞切斷引導序列形成一個成熟形式的酶。多核苷酸還編碼蛋白原，其實例是成熟蛋白加附加5’氨基酸殘基。另外一種具有原序列的成熟蛋白實例是無活性形式蛋白的蛋白原。一旦原體序列被切斷，活性成熟蛋白就形成了。
因此，例如，本發明的多核苷酸可以編碼成熟的酶，或具有原體序列的酶或具有原體序列和前體序列的酶(如引導序列)。
6.1.4-分離方法本發明肌醇六磷酸酶編碼序列通過制備大腸桿菌B基因組DNA，和例如從基因組DNA(通過，例如，PCR擴增)，編碼肌醇六磷酸酶活性的DNA回收來鑒定。這些回收方法在本領域中是已知的。一種方法，例如，包括設計擴增引物回收編碼序列，從基因組DNA擴增基因，亞克隆DNA進入載體，所得構建體轉化進入宿主系，表達肌醇六磷酸酶用于評價。這些過程在本領域中是已知的，并且Sambrook等，1989已提供了方法(本文整體引入作為參考)。
在一個優選的實施方案中，本發明的酶，通過以下技術從大腸桿菌B基因組DNA中分離大腸桿菌B基因組DNA是商購獲得(SigmaCatalog#D-2001，St.louis，New Jersey)。以下引物用于直接從基因組DNA擴增基因5’引物gtttctgaattcaaggaggaatttaaATGAAAGCGATCTTAATCCCATT(SEQ IDNO3)；和3’引物gtttctggatccTTACAAACTGCACGCCGGTAT(SEQ ID NO4)Pfu聚合酶使用根據制造商說明(Stratagene Cloning Systems，Inc，La Jolla，CA)。
PCR產物和pQE60載體(Qiagen)根據制造商說明用EcoRI和BglII限制內切酶消化(New England Biolabs)。在M15 pREP4宿主細胞(Qiagen)的連接和轉化進入和表達產生c-term 6X-His標記蛋白。
6.1.5-活性測定然后可以測定分離的核酸序列和其他酶，以保留本發明酶的生物活性特性，例如，在一個檢測肌醇六磷酸酶活性的測定(食品化學規程第4版)。這些酶包括肌醇六磷酸酶的切斷形式，和變體如缺失和插入變體。
這種體外測定的實例是檢測肌醇六磷酸酶活性的以下測定肌醇六磷酸酶的測定是150μl酶預備液與600μl 2mM植酸鈉在添加1mM CaCl2的100mM TrisHCl緩沖液pH7.5中37℃孵育30分鐘。孵育后通過加入750μl5％三氯乙酸終止反應。磷酸鹽釋放測定在加入1500μl顯色制劑(4體積1.5％鉬酸銨在5.5％硫酸和1體積2.7％硫酸亞鐵Shimizu，1992)后用700nm磷酸鹽標準分光光度測定法。一單位的酶活性定義為每分鐘釋放1μmol測定條件需要的酶的數量。特異活性可以用每毫克蛋白表達的酶活性單位來表示。
本發明的酶具有植酸鹽水解為肌醇和游離磷酸鹽相關的酶活性。6.2-新肌醇六磷酸酶的產生6.2.1-產生的方法-一般概述本發明的酶和多核苷酸優選以分離形式提供，優選是純化的同源基因。發明的肌醇六磷酸酶多肽可以使用任何標準方法獲得。例如，肌醇六磷酸酶多肽可以在標準重組表達系統(見下)中產生，化學合成(這一方法限于少量肌醇六磷酸酶肽片段)，或從它們自然表達的生物中純化產生。可用的重組表達方法包括使用哺乳動物宿主，微生物宿主，和植物宿主。
本肌醇六磷酸酶分子的重組表達可以與一個或多個附加分子結合獲得如，例如，其他酶。這一方法可用于產生組合產物，如包含本肌醇六磷酸酶分子和一個或多個附加分子的植物或植物部分-優選所述的肌醇六磷酸酶分子和所述的附加分子用于聯合的應用中。獲得的重組表達分子可以用于同源基因和/或純化形式或選擇性的相對未純化形式(如可食用的植物部分，當與其他食物混合催化植酸鹽降解時是可用的)。
總之，在一個非限定性實施方案中，本發明提供了一個宿主內表達的重組酶。在另外一個非限定性實施方案中，本發明提供了實質上純的肌醇六磷酸酶。因此，本發明的酶可以是一個重組酶，一個自然酶，或一個合成酶，優選是一個重組酶。
6.2.2-重組表達本發明還涉及包括本發明多核苷酸的載體，本發明載體的基因工程宿主細胞，通過重組技術產生本發明的酶。
宿主細胞用含本發明的多核苷酸載體進行基因工程(如轉導或轉化或轉染)。這些載體可以是，例如，一個克隆載體或一個表達載體。載體可以是，例如，質粒的形式，病毒微粒，噬菌體，朊病毒等等。工程宿主細胞可以在為適于激活啟動子而改良的常規營養介質內培養，和/或選擇轉化或擴增本發明的基因。培養條件，如溫度，pH和類似物，以前用于選擇表達的宿主細胞所使用的，對普通的技術人員是明顯的。
本發明的多核苷酸可以通過重組技術產生酶。因此，例如，多肽可以包括在許多表達酶的表達載體的任何一個。這種載體包括染色體，非染色體和合成DNA序列，如，SV40衍生物；細菌質粒，噬菌體DNA；桿狀病毒群；酵母質粒；來源于重組質粒和噬菌體DNA的載體，病毒DNA如牛痘，腺病毒，禽痘病毒和偽狂犬病。然而，任何其他的載體都可以使用只要它在宿主內可復制的和具有活力的。
合適的DNA序列可以通過一些步驟插入載體中。一般地，DNA序列通過領域中已知的過程插入合適的限制內切酶區域。這一方法除外的是使用平端分子，它可以通過使用限制消化和不依賴限制消化方法產生。另外，插入可以通過叫“不依賴連接酶”方法摻入一個載體。在一個特殊方面，“不依賴連接酶”方法通過在室溫下使用拓撲異構酶-介導的連接反應來實例，例如根據商業獲得的試劑盒叫TOPO-TA Cloning(Introgen Corporation，Carlsbad，CA)。另外的酶，包括拓撲異構酶的異構體或更遠涉及的重組酶(如重組酶)，也可以用于介導這類“不依賴連接酶”的摻入。在另外一個特殊方面，“不依賴連接酶”方法通過使用宿主修復機制來實例。這些步驟和其他一些被認為是在本領域的專業技術人員的范圍內。
表達載體的DNA序列可操作性的與合適的表達控制序列(啟動子)連接介導mRNA合成。作為這些啟動子的代表實例，可以提到LTR或SV40啟動子，大腸桿菌lac或trp，噬菌體拉拇達PL啟動子和其他已知控制原核或真核細胞或它們的病毒表達的啟動子。表達載體還包括用于翻譯起始的核糖體結合區和轉錄終止子。載體還包括擴增表達的合適序列。
另外，優選的表達載體包含一種或多種可選擇的標志基因提供選擇轉化宿主細胞的表型特性，如真核細胞培養物的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或如大腸桿菌中的四環素抗性或氨芐青霉素。
如這里和上面描述的含合適DNA序列的載體和合適的啟動子或控制序列，可以用于轉化合適的宿主，允許宿主表達蛋白。
作為合適宿主的代表實例，可以提到細菌細胞，如大腸桿菌，鏈霉素，枯草桿菌；細菌細胞，如酵母；昆蟲細胞如果蠅S2和Spodoptera Sf9；動物細胞如CHO，COS或小牛黑色素瘤，腺病毒；植物細胞，等等。從在此的講授，選擇合適的宿主被認為在本領域專業技術人員的范圍為之內。
更特殊的是，本發明還包括重組構建體，后者包括一種或多種序列，上面已有廣泛描述。構建體包括載體，如質粒或病毒載體，發明的序列已經被插入其中，在一個正向或相反方向。在本實施方案的優選方面，構建體進一步包括調節序列，包括，例如，啟動子，可操作的與序列連接。一個或多個附加插入物也可以被摻入導致一種或多種附加分子的表達，如另外一種肌醇六磷酸酶或蛋白酶，優選的上述一種或多種附加分子可用于在聯合應用中與本肌醇六磷酸酶結合。
大量的合適載體和啟動子對本領域中的專業技術人員是已知的，商業中可以獲得。“質粒”命名是通過小寫的p在前和/或其后是大寫字母和/或數字。這里的初始質粒既可以商業獲得，非限制的公開購買，也可以根據出版公開的步驟從獲得的質粒中構建。另外，與那些所描述的同等的質粒在本領域中是已知的，對于普通的專業技術人員是很明顯的。
以下的載體是以實例的方式提供的；細菌的pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pBluescript II(Stratagene)；pTRC99a，pKK223-3，pDR540，pRIT2T(Pharmacia)；真核生物的pXT1，pSG5(Stratagene)pSVK3，pBPV pMSG，pSVLSV40(Pharmacia)。但是，任何其他質粒或其他載體只要可以在宿主中復制和具有活力均可以使用。
啟動子區可以采用CAT(氯霉素轉移酶)載體或其他具有可選擇標記物的載體選自任何需要的基因。兩個合適的載體為pKK232-8和pCM7。特殊命名的細菌啟動子包括lacI，lacZ，T3，gpt，λPR，PL和trp。真核細胞啟動子包括前早期CMV，HSV胸苷激酶，早期和晚期SV40，來自逆轉錄病毒的LTRs和鼠金屬硫蛋白-I。合適載體和啟動子的選擇很好地在本領域普通技術水平范圍內。
在進一步的實施方案中，本發明涉及含有上述構建物的宿主細胞。宿主細胞可以是一個較高級的真核細胞，如一個哺乳動物細胞，或一個較低級的真核細胞，如一個酵母細胞，或宿主細胞可以是一個原核細胞，如一個細菌細胞。通過磷酸鈣轉染，DEAE-右旋糖苷介導的轉染，或電穿孔(Davis，1986)將構建物導入宿主細胞可以是有效的。
宿主細胞中的構建物可以采用常規的方式來產生由重組序列編碼的基因產物。可以選擇的是，本發明的酶可以通過常規的肽合成儀來合成地產生。
成熟的蛋白可以在合適啟動子的控制下在哺乳動物細胞，酵母，細菌或其他細胞中表達。無細胞的翻譯系統也可以采用來源于本發明DNA構建物的RNA來生產這樣的蛋白。原核細胞和真核宿主細胞中使用的合適的克隆和表達載體得到了描述(如，Sambrook等，1989，其中公開的在此引用作為參考)。
真核細胞轉錄編碼本發明酶的DNA可以通過在載體中插入一個增強子序列而增加。增強子是DNA的順式反應元件，通常大約為10至300bp，作用于啟動子而增強其轉錄。實例包括位于復制起點bp100至270后側的SV40增強子，一個細胞巨病毒早期啟動子增強子，在復制區起點后側的多瘤病毒增強子，和腺病毒增強子。
一般來說，重組表達載體將包括復制區起點和選擇性標記物以保證宿主細胞的轉化，如，大腸桿菌的氨比西林抗性基因和S.cerevisiae TRP1基因，和來源于高度表達基因的啟動子，用來引導下游結構序列的轉錄。這樣的啟動子可以來源于編碼如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)，-因子，酸性磷酸酶或熱休克蛋白，以及其他的糖分解酶的操縱子。異源結構序列與翻譯的起始點和終止序列，以及優選地一個能夠引導翻譯酶分泌的引導序列在適當的時期進行裝配。可以選擇的是，異源序列可以編碼一個融合蛋白，該蛋白包括一個具有所需特性的N-末端鑒定肽，如表達的重組產物的穩定或簡單純化。
細菌中有用的表達載體通過在具有功能性啟動子的讀碼運行期內插入編碼所需蛋白的結構性DNA序列，以及合適的翻譯起始點和終止信號。載體將包括一個或多個顯性選擇標記物和一個復制起始點以保證載體的維持，以及如果需要提供在宿主內的擴增。雖然其他也可以作為選擇，適合轉化的原核細胞宿主包括大腸桿菌，枯草芽胞桿菌，鼠傷寒沙門氏菌和假單胞菌屬，鏈霉菌屬和葡萄球菌屬中的多種菌屬。
作為一個代表性但非限制性的實例，細菌用的有用表達載體由一個選擇性標記物和來源于市售質粒的細菌復制起始點組成，市售質粒包括已知克隆載體pBR322(ATCC 37017)的基因元件。這樣的市售載體包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美國)。這些pBR322“主干”區與適當的啟動子和將表達的結構序列結合。
在一個合適宿主菌株的轉化和宿主的生長達到適當的細菌密度后，選擇的啟動子通過適當的方式進行誘導(如，溫度轉變或化學誘導)，且細胞繼續培養一段時間。
細胞常規的收集采用離心，用物理或化學方式破裂，為進一步純化保留得到的原始提取物。
在表達蛋白中使用的微生物細胞可以通過方便的方法進行破裂，包括冷凍-復溫的重復，超聲作用，機械性破壞，或采用細胞溶解劑，這樣的方法對本領域專業技術人員是已知的。
也可以使用不同的哺乳動物細胞培養系統表達重組蛋白。哺乳動物表達系統的實例包括猴腎成纖維細胞的COS-7細胞系，如Gluzman(1981)所描述的，和其他能夠表達相容性載體的細胞系，如，C127，3T3，CHO，HeLa和BHK細胞系。哺乳動物表達載體將包括一個復制起始點，一個合適的啟動子和增強子，以及任何需要的核糖體結合位點，多腺苷酸化位點，剪接供體和受體位點，轉錄終止序列，和5’-側向非轉錄序列。來源于SV40剪接和多腺苷酸化位點的DNA序列可能用于提供所需的非轉錄基因元件。
酶可以重組細胞培養物中回收和純化，其方法包括硫酸銨或乙醇沉淀法，酸提取，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水作用層析，親和層析，羥磷灰石層析和植物凝集素層析。如果需要可以使用蛋白折疊步驟，以完成成熟蛋白的構型。最后，也可以使用高效液相(HPLC)來進行最后的純化步驟。
本發明的酶可能是一個天然純化的產物，或一個化學合成的產物，或通過重組技術從原核細胞或真核細胞宿主(如培養的細菌，酵母，高等植物，昆蟲和哺乳動物細胞)產生的。在重組生產方法依靠使用的宿主，本發明的酶可能被糖基化或非糖基化。發明的酶可能不包括一個起始的蛋氨酸殘基。
在一個優選的實施方案中，本發明的酶是一個肌醇六磷酸酶，它是熱穩定的，具有熱抵抗性，可以催化肌醇六磷酸鹽的酶性水解，即該酶能夠復性，并在一個簡短(即5到30秒)或較長的時期，如幾分鐘或幾小時，暴露于直至大約50℃或稍微超過50℃的溫度后恢復活性。
本發明進一步由在此包含的文獻進行描述；但是，可以理解的是，本發明不限于這樣的實例。所有的部分或數量，如果沒有特殊說明，均由重量來表示。
在發明的一個方面，提供了一個產生一個肌醇六磷酸酶的方法，如在
圖1中所顯示。該方法包括在允許核酸表達，和選擇性分離編碼核酸的酶的條件下使一個宿主細胞生長，該細胞包含一個編碼酶(如SEQ ID1)的多核苷酸酸。培養宿主細胞的方法在實例中描述，并被本領域專業技術人員所熟知。
6.2.3-轉基因植物和植物器官的使用在一個特定的實施方案中，本發明提供了在轉基因植物或植物器官中肌醇六磷酸酶的表達和產生它的方法。提供DNA構建物用來在調控序列的控制下用編碼肌醇六磷酸酶的基因來轉化植物，該調控序列能夠引導肌醇六磷酸酶的表達。這些調控序列包括能夠引導植物中的轉錄，以構成性或階段性和/或組織特異的方式。
表達的方式部分依靠使用植物或其一部分。本發明提供的轉基因植物和植物器官可用于許多工業的方法中，該方法可以直接，如用于動物的飼養，或可以選擇的，表達的肌醇六磷酸酶可能被提取，如果需要，在應用前進行純化。可以選擇的是，重組的宿主植物或植物的一部分可以直接使用。在一個特定的方面，本發明提供了采用含有大量肌醇六磷酸酶的種子催化肌醇六磷酸鹽水解反應的方法。方法涉及將轉基因，非野生型種子的優選以一種基本形式或破碎的形式與含有肌醇六磷酸鹽的底物接觸，并允許酶包含在種子中以增加反應率。通過直接將種子加入到含有肌醇六磷酸鹽的底物中，發明提供了一個提取和純化酶的昂貴和有問題的方法的解決方法。在一個特殊—但不限于的實例中，本發明也提供了處理的方法，其中將酶以含有大量酶的種子的形式提供給缺乏足夠酶供應的生物體。在一個優選的實施方案中，將酶給予生物體的時間選擇與含有肌醇六磷酸鹽糧食的的消耗相適應。
肌醇六磷酸酶在植物中的表達可以通過許多的方法實現。具體地，如可以獲得轉化大量植物種屬，包括雙子葉屬(如煙草，馬鈴薯，番茄，矮牽牛花，蕓苔)的技術。可以選擇的是，如在植物中表達外源基因的戰略是可以獲得的。仍然可以選擇的是，已經鑒定的來自植物基因的調控序列對于嵌合基因的構建是有用的，該嵌合基因可以在植物和植物細胞中功能性的表達(如Klee等，1987；Clark等，1990；Smith等，1990)。
基因構建物導入植物可以采用幾種技術來實現，這些技術包括用膨脹土壤桿菌或土壤桿菌生根基因來轉化。因此可以轉化的非限制性的植物組織的實例包括原生物，小孢子或花粉，和如葉，莖，根，下胚軸和胚軸的外植體。DNA可以直接通過微注射，電穿孔，微粒轟擊和直接DNA攝取的方法導入原生物和植物細胞或組織中。
蛋白可以在植物中通過多種表達系統產生。例如，如花椰菜嵌合病毒的35S啟動子(Guilley等，1982)的構成性啟動子事實上在轉基因植物的所有器官中濃集表達的蛋白中是有用的。可以選擇的是，高度組織特異性和/或時期特異性啟動子的使用對于本發明是有用的(Higgins，1984；Shotwell，1989)，其目的是使表達朝向所希望的組織和/或朝向所希望的進展期。進一步關于本發明的在植物中表達肌醇六磷酸酶分子的詳細描述也進行了公開，例如，在USPN5,770,413(Van Ooijen等)和USPN5,593,963(Van Ooijen等)，雖然公開發表的可獲取文獻中的資料不能講授本申請的發明的分子，但卻能講授真菌肌醇六磷酸酶的使用。
總之，與本發明有關的是，許多方法可以用于實現在一個轉基因植物或一部分植物中重組表達肌醇六磷酸酶。這樣一個轉基因植物和植物的一部分可以用作重組表達的肌醇六磷酸酶的來源，它可以直接加入到含有肌醇六磷酸鹽的來源物中。可以選擇的是，重組的植物表達的肌醇六磷酸酶可以從植物來源中提取出來，如果需要，在于肌醇六磷酸酶底物接觸前進行純化。
6.2.4-可用植物的實例在本發明的內容中，可選擇的植物包括，但不限于產生，可食用花朵如菜花(蕓苔oleracea)，朝鮮薊(朝鮮薊scolymus)的作物，如蘋果(蘋果屬，如domesticus)，香蕉(Musa，如acuminata)，草莓(如黑醋栗，虎耳草科酷栗屬，如rubrum)，櫻桃(如甜櫻桃，李屬，如avium)，黃瓜(香瓜屬，如sativus)，葡萄(vitis，如vinifera)，檸檬(柑橘檸檬)，甜瓜(melo甜瓜)，堅果(如核桃，胡桃屬，如regia；花生，地花生)，橙(柑橘屬，如maxima)，桃(李屬如persica)，梨(pyra，如communis)，李子(李屬如domestica)，草莓(fragaria，如moschata)，番茄(番茄屬，如esculentum)，葉，如苜蓿(苜蓿屬，如sativa)，卷心菜(如蕓苔屬oleracea)，菊苣(cichoreum，如endivia)，韭蔥(蔥屬，如porrum)，萵苣(萵苣屬，如sativa)，菠菜(菠菜，如oleraceae)，煙草(煙草屬，如煙草)，根，如竹竽(竹竽，如arundinacea)，甜菜(Beta，如vulgaris)，胡蘿卜(daucus，如carota)，木薯(木薯屬，如esculenta)，蕪箐(蕓苔屬，如rapa)，蘿卜(raphanus，如sativus)，薯蕷屬(薯蕷屬，如esculenta)，番薯(番薯屬batatas)和種子，如豆類(菜豆屬，如vulgaris)，豌豆(pisum，如sativum)，大豆(glycin，如max)，小麥(小麥屬，如aestivum)，大麥(大麥屬，如vulgare)，玉米(玉蜀黍屬，如mays)，稻米(oryza，如sativa)，油菜籽(蕓苔napus)，栗(黍L.)，向日葵(helianthus annus)，燕麥(avena sativa)，塊莖，如大頭菜(蕓苔，如oleraceae)，馬鈴薯(茄屬，如tuberosum)和類似物。
可以理解的是，其他植物和非植物表達系統可以在本發明的內容中使用。植物種屬的選擇是根據植物或其部分的使用目的來基本的確定，并以要轉化的植物種屬為根據。
6.2.5-植物轉化的方法幾種技術可以用來將含有肌醇六磷酸酶編碼的DNA序列的表達構建物導入目標植物中。這樣的技術包括但不限于采用鈣/聚乙二醇法，電穿孔和微注射或(包被的)微粒轟擊(Potrykus，1990)進行的原生質轉化。除了這些所謂的直接DNA轉化方法，涉及載體的轉化系統可以廣泛的獲得，如病毒載體(如，來自花椰菜嵌合病毒(CaMV))和細菌載體(如，來自土壤細菌屬)(Potrykus，1990)。在選擇和/或篩選后，被轉化的原生質，細胞或植物的一部分可以在整個植物中再生，采用的方法在本領域是為人熟知的(Horsch等，1985)。轉化和/或再生技術的選擇對于本發明是不重要的。
6.2.6-雙子葉植物的方法對于雙子葉植物，本發明的一個優選實施方案采用了雙重載體系統的原理(Hoekema等，1983；EP 0120516 Schilperoort等)，其中使用了土壤桿菌菌株，該菌株含有一個具有毒性基因的病毒質粒和一個含有要轉移基因構建物的相容質粒。這個載體可以在大腸桿菌和土壤桿菌中復制，來源于雙重載體Bin19(Bevan，1984)，其細節可以改變，這與本發明無關。在本實例中使用的雙重載體包含在T-DNA的左和右邊界序列之間，一個編碼卡那霉素抗性(Bevan，1984)的相同的NPTII基因和一個在所需基因構建物中克隆的多克隆位點。
6.2.7-單子葉植物的方法單子葉植物作物的轉化和再生不是一個標準的步驟。但是，最近的科學進展顯示從原理上，單子葉植物是可以接受轉化的，從轉化的細胞可以再生出多產的轉基因植物。對這些作物的再生產組織培養系統的建立和將基因物質導入植物細胞中的強有力的方法，將有助于轉化。最近選擇單子葉植物轉化的方法是外植體或懸浮細胞的微型發射轟擊作用，和直接DNA的攝取或原生質的電穿孔。例如，轉基因大米植物已經可以采用細菌的hph基因獲得，該基因編碼一個作為選擇性標記物的潮霉素抗性。基因通過電穿孔的方法導入(Shimamoto等，1993)。轉基因玉米植物已經可以通過導入鏈霉素hygroscopicus棒狀基因到通過微型發射轟擊作用產生的玉米懸浮培養液的胚細胞(GordonKamm等，1990)中來獲得，該基因編碼phosphinothricin乙酰基轉移酶(一個可以滅活除草劑Phosphinothricin的酶)。已經有報道將基因物質導入如小麥和大麥的其他單子葉作物的糊粉原生質中(Lee等，1989)。小麥植物已經從胚懸液培養物中再生，該培養物是僅從為形成胚懸液培養物所使用的老塊和結節胼胝組織中選擇的(Vasil等，1972；Vasil等，1974)。這些作物轉化系統的結合使本發明可以應用于單子葉植物。這些方法也可以應用于雙子葉植物的轉化和再生。
6.2.8-在植物中表達的方法肌醇六磷酸酶構建物的表達涉及一些細節，如通過植物聚合酶的基因轉錄，mRNA的翻譯等，這些對于重組DNA技術領域中專業技術人員是熟知的。下面僅討論本發明正確含義的相關細節。已知或發現導致肌醇六磷酸酶表達的調控序列可能在本發明中使用。使用的調控序列的選擇依依賴于感興趣的目的作物和/或目的器官。這些調控序列可能從植物或植物病毒中獲得，或可能是化學合成的。這些調控序列是在引導植物轉錄中有活性的啟動子，是構成性或時期性和/或組織特異性，這取決于使用植物或植物的一部分。這些啟動子包括，但不限于顯示構成性表達的啟動子，如花椰菜嵌合病毒(CaMV)(Guilley等，1982)的35S啟動子，葉特異性表達的啟動子，如核酮糖二磷酸羥化酶小亞單位基因的啟動子(Coruzzi等，1984)，種子特異表達的啟動子，如來自蕓苔napus(Ryan等，1989)的cruciferinA啟動子，結節特異表達的啟動子，如來自馬鈴薯的I型patatin啟動子(Koster-Topfer等，1989；Wenzler等，1989)或果實特異表達啟動子，如來自番茄的多聚半乳糖醛酸酶(PG)的啟動子(Bird等，1988)。
其他調控序列如終止序列和多聚腺苷酸化信號，包括任何在植物中發揮作用的此類序列，在其中的選擇可以為專業人員所掌握。這樣序列的一個實例是tumefaciens土壤桿菌的胭脂堿合酶(nos)基因3’-側向區域(Bevan，見前)。調控序列可能也包括增強子序列，如在CaMV 35S啟動子中發現的，和mRNA穩定序列，如苜蓿(AIMV)RNA4(Brederode等，1980)的引導序列或已相似的方式發揮功能的任何其他序列。
肌醇六磷酸酶應該在允許穩定表達蛋白的環境中進行表達。可以在本發明中使用細胞內區室如胞液，內質網，空胞，蛋白體或胞質周圍空間來建立這樣一個穩定的環境，依靠肌醇六磷酸酶的生物物理參數。這樣的參數包括，但不限于最佳pH，對蛋白水解酶的敏感性或對優選區室的克分子濃度的敏感性。
為在細胞胞漿中獲得表達，已表達的酶不應含有一個分泌肽或其他任何目的序列。為在葉綠體和線粒體中表達，表達的酶應該含有特異的進入這些細胞器的所謂轉運肽。可以與為實現這樣目的的感興趣的酶結合的目的序列是已知的(Smeekens等，1990；Vanden Broeck等，1985；Wolter等，1988)。如果在空胞中需要該酶的活性，要存在一個分泌信號肽以及一個特異的目的序列，該序列可以引導該酶導入這些空胞中(Tague等，1990)。對在種子中的蛋白體也是一樣。編碼感興趣酶的DNA序列應該以下面的方式進行修飾，即該酶可以在細胞中需要的部位發揮作用。
為在細胞外表達肌醇六磷酸酶，本發明的表達構建物使用一個分泌信號序列。雖然優選使用與植物宿主種屬同源(天然)的信號序列，異源性的信號序列，即那些來源于其他植物種屬或微生物來源的序列也可以使用。這樣的信號序列對本領域專業技術人員是熟知的。在本發明的內容中可能使用的合適的信號序列在Blobel等，1979；Von Heijne，1986；Garcia等，1987；Sijmons等，1990；Ng等，1994；和Powers等，1996中公開。
本發明的相關DNA構建物的所有部分可能被修飾，如果需要，可以采用本領域專業技術人員熟知的方法影響其控制特性。可以指出，含有經本發明獲得的肌醇六磷酸酶的植物可以用于獲得具有更高肌醇六磷酸酶水平的植物或植物器官。例如，可能通過使用somoclonal變異技術或雜交技術來獲取這樣的植物或植物器官。這樣的技術對于本領域專業技術人員是熟知的。
6.2.9-新的肌醇六磷酸酶和其他分子的雙重表達在一個實施方案中，本發明提供了一種實現肌醇六磷酸酶和其他分子高效過量表達的方法(及其產物)。在一個優選的實施方案中，本發明提供了一種在木霉屬中實現肌醇六磷酸酶和pH2.5酸性磷酸酶的高效過量表達系統(及其產物)的方法。這個系統可以產生酶組合物，它在動物飼養工業中具有特殊的用途。關于這種方法的其他細節可在公開發表的文獻中獲得和/或是專業技術人員所了解的。在一個特殊的非限制性的實例中，這些公開發表的可獲取文獻包括EP 0659215(WO 9403612 A1)(Nevalainen等)，雖然公開發表的可獲取文獻中的資料不能講授本申請中發明的分子。
6.2.10-新的肌醇六磷酸酶及其穩定的液體配方的可溶性制劑在一個實施方案中，本發明提供了一種產生具有肌醇六磷酸酶活性的穩定的水溶液制劑的方法，該制劑可增加酶活性對熱滅活的抵抗力，并在延長儲存期間保留其肌醇六磷酸酶活性。液體制劑的穩定是通過添加尿素和/或如山梨醇和甘油的多元醇作為穩定劑。也提供了單胃動物的飼料制劑和使用上述穩定的水溶液制劑來進行生產的方法。關于這種方法的其他細節可在公開發表的文獻中獲得和/或是專業技術人員所了解的。在一個非限制性的實例中，這些公開發表的可獲取文獻包括EP 0626010(WO9316175 A1)(Barendse等)，雖然公開發表的可獲取文獻中的資料不能講授本申請中發明的分子。
6.3-新的肌醇六磷酸酶的使用6.3.1-肌醇六磷酸鹽的一般應用，水解和肌醇的產生在一個實施方案中，本發明提供了一種水解肌醇六磷酸鹽的方法，該法包括將肌醇六磷酸鹽與一個或多個在此公開的新的肌醇六磷酸酶分子接觸。相應地，本發明提供了一種催化肌醇六磷酸鹽水解為肌醇和磷酸鹽，從植酸復合體中釋放無機離子的方法。該方法包括將一個肌醇六磷酸鹽底物和有效降解量的本發明的酶接觸，該酶如在SEQ ID NO2中顯示的酶。術語“有效降解”的量是指與未與酶接觸的肌醇六磷酸鹽相比，降解至少50％肌醇六磷酸鹽，優選至少降解80％的肌醇六磷酸鹽所需酶的量。
在另一個實施方案中，本發明提供了在肌醇六磷酸鹽中水解磷酸單酯鍵的方法。該方法包括施用有效量的本發明的肌醇六磷酸酶分子(例如SEQ ID NO2)以產生肌醇和游離磷酸鹽。“有效”量是指與未與酶接觸的肌醇六磷酸鹽相比，水解至少50％的磷酸單酯鍵，優選水解至少80％的鍵所需酶的量。
在一個特定的方面，當需要時，為了在肌醇六磷酸鹽分子和/或其他底物來源的分子中產生化學性改變(如水解)，肌醇六磷酸酶分子可以用來與其他試劑結合，如其它催化劑。根據這一方面，優選肌醇六磷酸酶分子和添加的試劑不能互相抑制，更優選肌醇六磷酸酶分子和添加的試劑具有整體的加性效應，更優選肌醇六磷酸酶和添加的試劑具有整體的協同效應。
底物肌醇六磷酸鹽分子的相關來源包括食品，潛在的食品，食品的副產品(在體外和體內的副產品，如體內體外反應產物和動物排泄產物)，食品的前體和任何其他肌醇六磷酸鹽的物質來源。
6.3.2-給予生物體在一個非限制性的方面，重組的肌醇六磷酸酶可以通過生物體來消耗，并在消耗的過程保持活性。在另一個實例中，轉基因的方法可以用來實現重組肌醇六磷酸酶的表達—優選以一個可控的方式進行(以時間特異性和組織特異性的方式控制轉基因分子的表達的方法是可以獲得的)。
在一個特定的實例中，在來源物質(一個轉基因植物來源或重組原核生物宿主)中的肌醇六磷酸酶活性可能在消耗的過程中增加；這種活性的增加，例如可能發生在以蛋白原形式的前體肌醇六磷酸酶分子轉變為更成熟形式的活性更加明顯的蛋白的過程中，其中所述的轉變可能，例如來自肌醇六磷酸酶來源的攝取和消化。肌醇六磷酸鹽底物的水解可在肌醇六磷酸酶和肌醇六磷酸鹽接觸過程中的任何時候發生；例如，這可能發生在攝取(injestion)前，或攝取后，或底物或酶，或兩者的攝取之前和之后都攝取。另外要重視的是肌醇六磷酸鹽底物可與—除了肌醇六磷酸酶以外—一個或多個添加的試劑，如另一個酶接觸，這也可以直接或從其來源物質純化后應用。
令人欣賞的是，一種肌醇六磷酸酶來源物質(多種)可以直接與一種肌醇六磷酸鹽來源物質(多種)接觸；如，一種肌醇六磷酸酶來源(多種)和一種肌醇六磷酸鹽來源(多種)的其中一種或兩者一起在體外或體內研磨或咀嚼時。可以選擇的是肌醇六磷酸酶可以從一種來源物質(多種)中純化，或肌醇六磷酸鹽底物可以在肌醇六磷酸酶與肌醇六磷酸鹽底物接觸前從一種來源物質(多種)中純化。要重視的是純化和未純化的試劑的結合—包括一種酶(多種)或一種底物(多種)或兩者—都可以使用。
適合的是，超過一種來源物質可以用作肌醇六磷酸酶活性的來源。這在作為實現從一種來源物質(多種)中定時釋放一種試劑(多種)的一種方法中是有用的，其中的釋放是從各自的來源物質分別釋放不同的試劑，例如，如同攝取(injested)來源物質在體內被消化或來源物質在體外應用時被處理一樣。可以遇到這樣的問題，超過一種肌醇六磷酸酶活性的來源物質的使用也可用來在一定條件和波動的范圍內獲得肌醇六磷酸酶活性，如pH值，溫度，鹽度和時間間隔范圍—例如，在一種應用的不同處理步驟中。不同來源物質的使用也可用于獲得不同的試劑，如通過肌醇六磷酸酶/或肌醇六磷酸鹽和/或其他物質的一種或多種形式所實例的。
適合的是，一個單一的來源物質，如一個轉基因植物種屬(或植物的一部分)，可以是肌醇六磷酸酶和肌醇六磷酸鹽的來源物質；該酶和底物可分別隔離在所述的單一來源之內的區室中—如，分泌相對非分泌的，分別表達和/或分別富含在不同植物部分或器官或組織，或同一植物部分或器官或組織中的亞細胞區室中。在此含有的肌醇六磷酸酶分子的純化可能包括將一個或多個所需的植物部分或器官或組織或亞細胞區室分離和/或進一步處理。
在一個特定的方面，本發明提供了一種采用含有大量酶的種子催化體內和/或體外反應的方法。這種方法包括將轉基因，非野生型種子，優選以研磨的方式加入到一個反應混合物中，使酶在種子中增加反應率。通過直接將種子加入到反應混合物中，該法提供了一種對提取和純化酶的更昂貴和煩瑣方法的解決辦法。也提供了處理的方法，其中缺乏足量酶供應的生物體中使用種子形式的酶，該種子來自一種或多種植物種屬，優選含有大量酶的轉基因植物種屬。關于這種方法的其他細節可在公開發表的文獻中獲得和/或是專業技術人員所了解的。在一個特殊的非限制性的實例中，這些公開發表的可獲取文獻包括USPN5,543,576(Van Ooijen等)和USPN5,714,474(Van Ooijen等)，雖然公開發表的可獲取文獻中的資料不能講授本申請中發明的分子并講授真菌肌醇六磷酸酶的使用。
在一個非限制性的方面，本肌醇六磷酸酶分子可用于產生重組消化系統的生命形式(或微生物或植物)和將所述的重組消化系統的生命形式給予動物。施用可以任選單獨進行或與其他酶和/或與其他可以在一個消化系統中提供酶活性的生命形式聯合給予，其中所述的其他酶和所述的生命形式可能是重組的或其他方式。例如，施用可能是與xylanolytic細菌聯合使用。
6.3.3-谷類的浸泡在一個非限制性的方面，本發明提供了一個在含有二氧化硫的溫水中浸泡谷物或高粱谷粒的方法，溫水中存在含有一個或多個植酸鈣鎂降解酶的酶制劑，其量優選的量為將存在于谷物或高粱中的植酸鈣鎂基本被降解。酶制品可包括肌醇六磷酸酶和/或酸性磷酸酶和任選其他植物材料降解酶。浸泡的時間可以是12至18小時。浸泡通過中間的研磨步驟，減少浸泡時間來中止。在一個優選的實施方案中，谷物或高粱谷粒浸泡在含有二氧化硫的溫水中來消除或大幅度減少植酸和肌醇六磷酸鹽，溫水中存在包括一個或多個如肌醇六磷酸酶和酸性磷酸酶的植酸鈣鎂降解酶的酶制劑。關于這種方法的其他細節可在公開發表的文獻中獲得和/或是專業技術人員所了解的。在一個特殊的非限制性的實例中，這些公開發表的可獲取文獻包括USPN4,914,029(Caransa等)和EP 0321004(Vaara等)，但公開發表的可獲取文獻中的資料沒有講授本申請中發明的分子。
6.3.4-發酵面團的制備在一個非限制性的方面，本發明提供了一種獲得具有所需物理特性如非粘性和有彈性的面包團和高質量如比容的面包產品的方法，該方法包括將肌醇六磷酸酶分子加入到面包團中。在一個優選的實施方案中，本發明的肌醇六磷酸酶分子加入到正在制作中的面包團制品中，隨后成型和烘烤。關于這種方法的其他細節可在公開發表的文獻中獲得和/或是專業技術人員所了解的。在一個特殊的非限制性的實例中，這些公開發表的可獲取文獻包括JP03076529(Hara等)，但公開發表的可獲取文獻中的資料沒有講授本申請中發明的分子并且是講授的真菌肌醇六磷酸酶的使用。
6.3.5-含大豆食品的生產在一個非限制性的方面，本發明提供了產生改良的大豆食品的方法。大豆與本發明的肌醇六磷酸酶分子混合以去除大豆中的植酸，因此產生的大豆食品在提供消化生物體的重要微量營養物和蛋白的消化性方面有所改善。在一個優選的實施方案中，在豆奶的產生中，將本發明的肌醇六磷酸酶分子加入或開始與大豆接觸以減少植酸含量。在一個非限制性的實例中，應用的方法可以通過將豆奶與酶在加熱的條件下振動或通過在一個振動容器中采用固定酶進行混合型反應。關于這種方法的其他細節可在公開發表的文獻中獲得和/或是專業技術人員所了解的。在一個特殊的非限制性的實例中，這些公開發表的可獲取文獻包括JP 59155049(Kamikubo等)，但公開發表的可獲取文獻中的資料沒有講授本申請中發明的分子。
6.3.6-液體食品包括米酒的生產在一個方面，本發明提供了一種生產飲用水或液體形式動物飼養的混合產物的方法，該方法包括采用礦物質混合物和維生素混合物，也包括本發明的新的肌醇六磷酸酶分子。在一個優選的實施方案中，為消耗生物體形成必須營養物的正確的給予和組成的混合物，而沒有任何重要礦物質/維生素的沉淀和破壞的危險，而同時最佳的應用是由在飼料中植酸結合的磷酸鹽組成的。關于這種方法的其他細節可在公開發表的文獻中獲得和/或是專業技術人員所了解的。在一個特定的非限制性的實例中，這些公開發表的可獲取文獻包括EP 0772978(Bendixen等)，但公開發表的可獲取文獻中的資料沒有講授本申請中發明的分子。
適合的是，本發明的肌醇六磷酸酶分子也可以用于產生其他酒精和非酒精的基于使用土壤和/或谷物和/或其他植物的可飲用的食品(或飲料)。這些可飲用的食品包括酒，葡萄酒，混合的酒精飲料(如冷酒器，其他酒精咖啡如愛爾蘭咖啡等等)，啤酒，仿制啤酒，果汁，榨汁，勻漿和濃湯。在一個優選的實例中，這里公開的肌醇六磷酸酶分子可用于產生可用于產生這樣可飲用食品的真菌和/或谷物和/或其他植物的轉基因副本。在另一個優選的實例中。這里公開的肌醇六磷酸酶分子用作制造過程中和/或在這樣可飲用的食品的最終容量中的其他成分。關于這種方法的其他細節可在公開發表的文獻中獲得和/或是專業技術人員所了解的。但是，由于本發明的新穎性—這些公開發表的文獻沒有講授這里公開的發明的分子。
在另一個非限制性的實例中，本發明提供了一種獲得植酸鈣鎂量較少和肌醇較多的精制米酒的方法。這樣的米酒可—通過直接和/或心理效應—具有預防肝臟疾病，動脈硬化和其他疾病的作用。在一個優選的實施方案中，米酒是從日本大米青酒曲通過作為原料的增加具有高度肌醇六磷酸酶活性的大米日本青酒曲產生的。要重視的是本發明的肌醇六磷酸酶分子可能用于產生具有增強活性的有用的真菌(優選一個轉基因真菌)和/或被外源性的加入以增加青酒曲真菌的效應。菌株加入到一種煮沸的大米中，青酒曲通過常規的步驟產生。在一個優選的實例中，使用制備的青酒曲，全部大米在兩個時期進行制備，米酒在15℃的固定米酒溫度下產生以得到目的精制米酒，其中植酸鈣鎂較少，肌醇量較多。關于這種方法的其他細節可在公開發表的文獻中獲得和/或是專業技術人員所了解的。在一個特殊的非限制性的實例中，這些公開發表的可獲取文獻包括JP 06153896(Soga等)和JP06070749(Soga等)，但公開發表的可獲取文獻中的資料沒有講授本申請中發明的分子。
6.3.7-礦物質吸收劑的生產在一個非限制性的方面，本發明提供了獲得能夠促進礦物質吸收的吸收劑的方法，該方法包括以較低的代價攝取鈣，而不被胃液或腸液消化。在一個優選的實施方案中，所述的礦物質吸收劑含有植酸的部分水解產物作為活性成分。優選地，植酸的部分水解產物是通過用本發明的新的肌醇六磷酸酶分子水解植酸或其鹽產生的。用所述肌醇六磷酸酶進行的處理可單獨發生和/或聯合處理(抑制或增加最后的效應)，隨后在一定范圍內抑制水解作用而不釋放所有的磷酸根。關于這種方法的其他細節可在公開發表的文獻中獲得和/或是專業技術人員所了解的。在一個特殊的非限制性的實例中，這些公開發表的可獲取文獻包括JP 04270296(Hoshino)，但公開發表的可獲取文獻中的資料沒有講授本申請中發明的分子。
6.3.8-與其他肌醇六磷酸酶和/或酸性磷酸酶聯合使用在一個非限制性的方面，本發明提供了一種產生具有添加劑或優選的協同肌醇六磷酸鹽水解活性成分的酶組合物的方法；所述的組合物包括新的本發明的肌醇六磷酸酶分子和一種或多種添加的試劑，形成一種可聯合使用的組合物。在一個優選的實施方案中，本發明的聯合處理可以使用至少兩種不同位置特異性的肌醇六磷酸酶來實現，即1-，2-，3-，4-，5-和6-肌醇六磷酸酶的任何組合。通過聯合不同位置特異性的肌醇六磷酸酶，可以獲得加性的或協同的效應。如食物和飼料的組合物或包括聯合使用的肌醇六磷酸酶的食物和飼料添加劑也包括在本發明中作為制備的方法。關于這種方法的其他細節可在公開發表的文獻中獲得和/或是專業技術人員所了解的。在一個特定的非限制性的實例中，這些公開發表的可獲取文獻包括WO9830681(Ohmann等)，但公開發表的可獲取文獻中的資料沒有講授本申請中發明的分子。
在另一個優選的實施方案中，本發明的聯合處理是用酸性磷酸酶來實現，該酶在pH2.5具有肌醇六磷酸鹽水解活性，以較低的比例對應于pH2.5∶5.0的活性資料，從大約0.1∶1.0至10∶1，優選從大約0.5∶1.0至5∶1，更優選從大約0.8∶1.0至3∶1，更優選從大約0.8∶1至2∶1。所述的酶組合物優選在熱處理后顯示更高的協同性肌醇六磷酸鹽水解活性。所述的酶組合物可用于處理食品(可飲用的和固體食品，飼料和飼料產品)以提高肌醇六磷酸鹽的水解。關于這種方法的其他細節可在公開發表的文獻中獲得和/或是專業技術人員所了解的。在一個特殊的非限制性的實例中，這些公開發表的可獲取文獻包括USPN5,554,99(Vanderbeke等)和，USPN5,443,979(Vanderbeke等)，但公開發表的可獲取文獻中的資料沒有講授本申請中發明的分子，只講授真菌(特殊的曲霉菌)肌醇六磷酸酶的應用。
6.3.9-與作用于多糖(如木糖膠酶)的酶聯合使用在一個非限制性的方面，本發明提供了一種產生作用于多糖的組合物的方法(及其產物)，該組合物由本發明的新的肌醇六磷酸鹽作用酶和一種或多種添加的酶組成。這些多糖選自阿聚糖，果聚糖，巖藻聚糖，半乳聚糖，聚半乳糖醛酸，葡萄糖，甘露聚糖，木聚糖，左聚糖，墨角藻聚糖，愛蘭苔膠，半乳卡洛糖，果膠，果膠酸，支鏈淀粉，出芽短梗霉聚糖，動物淀粉，支鏈淀粉，纖維素，羧甲基纖維素羥丙基甲基纖維素，葡聚糖，石耳素，殼多糖，瓊脂糖，角質素，軟骨素，皮膚素(dermatan)，透明質酸，褐藻酸和多糖，含有至少一個赤蘚糖，蘇糖，核糖，阿拉伯糖，木糖，來蘇糖，阿洛糖，阿卓糖，葡萄糖，甘露糖，古洛糖，艾杜糖，半乳糖，塔羅糖，赤蘚酮糖，核酮糖，木酮糖，阿洛酮糖，果糖，山梨糖，塔格糖，葡萄糖醛酸，葡萄糖酸，葡萄糖二酸，半乳糖醛酸，甘露糖醛酸，葡萄糖胺，半乳糖胺和神經氨糖酸。
在一個特定的方面，本發明提供了一種產生具有協同肌醇六磷酸鹽水解活性的組合物，該組合物包括一種或多種本發明的新的肌醇六磷酸酶分子，一種纖維素酶(包括優選但不排除木聚糖酶)，選擇性的使用一種蛋白酶和選擇性的使用一種或多種添加的試劑。在優選的實施方案中，這樣的組合物可用于處理食品，木材產品，如紙產品和清潔液和固體。
在一個非限制性的實例中，本發明的肌醇六磷酸酶分子可與多纖維素酶體成分聯合使用。已知許多可分解纖維素的細菌酶分子可組成不連續的多酶復合體，稱為多纖維素酶體。多纖維素酶體的多個亞單位由大量的功能區組成，它們可以互相作用，可與纖維質底物作用。這些亞單位之一包括特色的新的一類非催化性支架多肽，可以選擇性的整合多種纖維素酶和木聚糖酶亞單位成為粘著復合體。多纖維素酶體雜合體和多纖維素酶體區的嵌合構建物的精心應用應該能夠更好的使用纖維素的生物量，并可能提供在研究，醫藥和工業中廣闊范圍的新應用。
在另一個非限制性的實例中，本發明的肌醇六磷酸酶分子可用于—單獨或聯合使用—生物制漿和生物漂白領域，其中需要還原傳統在制漿和造紙工業中使用的環境有害化學物質。廢水的處理代表了另一個廣闊的應用領域，其中生物酶顯示不僅可有效去除顏色，而且可有效地將潛在有害物質生物轉化為有用的生物產品。
在另一個非限制性的實例中，本發明的肌醇六磷酸酶分子可用于產生生命形式，該形式可以在生物體的消化系統處理中提供至少一種酶活性—單獨或聯合應用。特定的相關的待處理的生物體包括非反芻生物體。具體地，要重視的是這種方法可以單獨進行或與其他生物分子(例如木聚糖酶)聯合應用以產生一個表達多數生物分子的重組宿主。也要重視的是，本發明的肌醇六磷酸酶分子和/或表達本發明肌醇六磷酸酶分子的重組宿主的施用可單獨或與其他生物分子，和/或可以在消化系統中提供酶活性的生命形式聯合施用，其中所述的其它的酶和所述的生命形式可以是重組或其他方式的。例如，可以與分解木聚糖的細菌聯合施用。
例如，除了肌醇六磷酸鹽以外，許多生物體也不能完全消化半纖維素。半纖維素或木聚糖是植物中的主要成分(35％)。對于反芻動物，大約50％的飲食中的木聚糖被降解，但在非反芻動物和人的下消化道中僅有小量的木聚糖被降解。在瘤胃中，主要的木聚糖分解菌屬是溶纖維丁酸弧菌和棲瘤胃擬桿菌。在人的直腸中，卵圓形的擬桿菌和脆弱擬桿菌亞種“a”是主要的木聚糖分解細菌。木聚糖是化學復合體，它們的降解需要多種酶。溶纖維丁酸弧菌可制造細胞外木聚糖酶，而擬桿菌屬具有細胞結合的木聚糖酶活性。來自消化道細菌的木聚糖分解酶的生物化學特性還沒有完全完成。木糖苷酶基因已經從溶纖維丁酸弧菌113中克隆。采用從溶纖維丁酸弧菌49克隆的木聚糖酶基因進行DNA雜交得到的數據表明這個基因存在其他溶纖維丁酸弧菌菌株中。一個從棲瘤胃擬桿菌中克隆的木聚糖酶轉移到并高度表達于脆弱擬桿菌和uniformis擬桿菌中。來自卵圓形的擬桿菌的阿拉伯糖苷酶和木糖苷酶基因已經被克隆，兩種活性似乎都是通過單一的雙重功能的新的酶來催化的。
相應地，適合的是，本發明的肌醇六磷酸酶分子可用于1)轉移進合適的宿主中(如脆弱擬桿菌或uniformis擬桿菌)；2)在得到的重組宿主中獲得適當的表達；和3)將所述的重組宿主施用于生物體中以提高所處理的生物體降解肌醇六磷酸鹽的能力。在基因和生物化學領域的進一步研究將為在腸道水平控制消化提供知識和深入洞察，并提高對結腸纖維素消化的認識。
關于這種方法的其他細節可在公開發表的文獻中獲得和/或是專業技術人員已知的。在一個特定的非限制性的實例中，這些公開發表的文獻包括USPN5,624,678(Bedford等)，USPN5,683,911(Bodie等)，USPN5,720,971(Beauchemin等)，USPN 5,759,840(Dunh等)，USPN5,770,012(Cooper)，USPN5,786,316(Baeck等)，USPN5,817,500(Hansen等)和期刊文章(Jeffries，1996；Prade，1996；Bayer等，1994；Duarte等，1994；Hespell和Whitehead，1990；Wong等，1998)，但這些文獻沒有講授本申請中發明的分子，也沒有講授所有在生產食品，木材產品如紙產品和清潔液和固體中肌醇六磷酸酶分子的添加。相反，本發明講授了肌醇六磷酸酶分子—優選本發明的肌醇六磷酸酶分子可以被加入到公開的一種試劑(多種)中，以獲得具有加性肌醇六磷酸酶活性的制品。優選地，所述的一種試劑(多種)和加入的肌醇六磷酸酶分子不會互相抑制，更優選地，所述的一種試劑(多種)和加入的肌醇六磷酸酶分子將具有整體上的加性效應，更優選地，所述的一種試劑(多種)和加入的肌醇六磷酸酶分子將具有整體上的協同效應。
6.3.10-與維生素D聯合使用在一個非限制性的方面，本發明提供了一種增強植酸磷的使用和治療和防止動物，特別是家禽脛骨軟骨發育不良的方法(及其產品)，其實現方法是通過給予動物一種含有羥化維生素D3衍生物的飼料組合物。維生素D3衍生物優選在飼料中給予動物，為了增強植酸磷的使用，該飼料含有較低的鈣和磷水平。相應地，維生素D3衍生物優選與本發明的新的肌醇六磷酸酶分子聯合使用以進一步增強植酸磷的使用。關于這種方法的其他細節可在公開發表的文獻中獲得和/或是專業技術人員所了解的。在一個特定的非限制性的實例中，這些公開發表的文獻包括USPN5,516,525(Edwards等)，和USPN5,366,736(Edwards等)，USPN5,316,770(Edwards等)，但公開發表的可獲取文獻中的資料沒有講授本申請中發明的分子。
6.3.11-與產乳酸細菌聯合使用在一個非限制性的方面，本發明提供了一種獲得食品的方法(及其產品)1)包括可以在生物體內以肌醇形式很容易吸收和應用的植酸鈣鎂；2)能夠以排泄的方式減少磷；和3)相應地可用于改善環境的污染。所述的食品由含有植酸鈣鎂的谷物，產乳酸微生物和本發明的新的肌醇六磷酸酶分子的混合物組成。在一個優選的實施方案中，所述的食品通過將一種含有植酸鈣鎂的谷物(優選，如米糠)和一種有效微生物群，該微生物具有嗜酸性的特性，可產生乳酸，而不產生丁酸，沒有致病性，以及一種肌醇六磷酸酶混合產生。有效的微生物組的實例包括，如屬于放線菌群的鏈霉菌屬(ATCC3004)和屬于乳酸菌群的乳酸桿菌屬(IFO3073)。進一步，添加有效微生物群的優選的添加量基于谷物原料就細菌重量而言為0.2wt.％。關于這種方法的其他細節可在公開發表的文獻中獲得和/或是專業技術人員所了解的。在一個特定的非限制性的實例中，這些公開發表的文獻包括JP 08205785(Akahori等)，但公開發表的可獲取文獻中的資料沒有講授本申請中發明的分子。
6.3.12-與蛋白酶一起溶解蛋白在一個非限制性的方面，本發明提供了一種改善蔬菜蛋白溶解度的方法。更具體地，發明涉及在蔬菜蛋白來源中溶解蛋白的方法，該法包括用有效量的一種或多種肌醇六磷酸酶—包括本發明的肌醇六磷酸酶分子—來處理蔬菜蛋白來源，和用有效量的一種或多種蛋白水解酶來處理蔬菜蛋白來源。在另一個方面，發明提供了動物飼料添加劑，它包括一種肌醇六磷酸酶和一種或多種蛋白水解酶。關于這種方法的其他細節可在公開發表的文獻中獲得和/或是專業技術人員所了解的。在一個特定的非限制性的實例中，這些公開發表的可獲取文獻包括EP 0756457(WO9528850 A1)(Nielsen和Knap)，但公開發表的可獲取文獻中的資料沒有講授本申請中發明的分子。
在一個非限制性的方面，本發明提供了一種產生一種植物蛋白制品的方法，該法包括將蔬菜蛋白來源物質分散在pH范圍在2至6的水中，并混合本發明的肌醇六磷酸酶分子。含有可溶性蛋白的酸性提取物被分離，并進行干燥產生所需特性的固體蛋白。一種或多種蛋白酶也可以用來改善蛋白的特性。關于這種方法的其他細節可在公開發表的文獻中獲得和/或是專業技術人員所了解的。在一個特殊的非限制性實例中，這些公開發表的可獲取文獻包括USPN3,966,971(Morehouse等)，但公開發表的可獲取文獻中的資料沒有講授本申請中發明的分子。
6.3.13-采用新的肌醇六磷酸酶，皂甙和殼聚糖三重處理混合肥料在一個非限制性的方面，本發明提供了一種方法(及其產品)，以激活土壤和/或混合肥料中惰性磷，提高氮化合物的利用率，并通過在混合肥料中加入三種試劑，肌醇六磷酸酶，皂甙和殼聚糖來抑制致病霉菌的繁殖。在一個非限制性的實施方案中，該法包括的處理混合肥料的方法有1)在媒質中加入含肌醇六磷酸酶的微生物—優選過度表達本發明的新的肌醇六磷酸酶分子的重組宿主—如以100ml媒質/100kg濕重混合肥料；2)也可以選擇性的加入一個含有肌醇六磷酸酶的植物來源—如麥麩—如以0.2至1kg/100kg濕重混合肥料；3)加入一種皂甙來源—如泥煤，艾蒿和絲蘭植物—如以0.5至3.0kg；4)加入含有殼聚糖的物質—如蝦，螃蟹等的殼粉—如以100至300g/kg濕重混合肥料。在另一個非限制性的實施方案中，使用重組來源和三個試劑，肌醇六磷酸酶，皂甙和殼聚糖。關于這種方法的其他細節可在公開發表的文獻中獲得和/或是專業技術人員所了解的。在一個特殊的非限制性的實例中，這些公開發表的可獲取文獻包括JP07277865(Toya Taisuke)，但公開發表的可獲取文獻中的參考資料沒有講授本申請中發明的分子。
6.3.14-用作雜交探針和擴增模板本發明全長基因的片斷可被用作一個cDNA或一個基因組文庫的雜交探針用來分離全長DNA，和分離其他與基因序列高度相似的或相似生物學活性的DNAs。這種類型的探針具有至少10，優選至少15，更優選至少30個堿基，可以含有，例如至少50個或更多的堿基。該探針也可被用來鑒定對應于全長轉錄物的一個DNA克隆，和含有完全基因的一個基因組克隆或多個克隆，完全基因包括調控和啟動子區，外顯子和內含子。
本發明提供了鑒定核酸分子的方法，該分子編碼除SEQ ID NO1外的肌醇六磷酸酶多肽家族成員。在這些方法中，一個樣品，如一個核酸文庫，如cDNA文庫，含有一個編碼肌醇六磷酸酶多肽的核酸，用一個肌醇六磷酸酶特異探針來篩選，如一個肌醇六磷酸酶特異的核酸探針。肌醇六磷酸酶特異的核酸探針是可特異與編碼肌醇六磷酸酶多肽或其互補序列雜交的核酸分子(如含有DNA或RNA核苷酸的分子，或組合物或其修飾物)。發明的本方法內容中的術語“肌醇六磷酸酶特異探針”，是指與編碼肌醇六磷酸酶多肽的核酸或其互補序列結合，其可檢測程度超過與編碼其他酶的核酸或其互補序列的結合。
本發明加速了肌醇六磷酸酶特異的核酸探針產生。獲得這樣探針的方法可以基于
圖1中顯示的氨基酸序列來設計。含有至少12，如至少15，25，35，50，100或150個核苷酸的探針，可以采用幾種標準方法中的任何一種(見，如Ausubel等，見上)來生產。例如，優選地，探針可以采用PCR擴增的方法來產生。在這些方法中，引物的設計對應于肌醇六磷酸酶的保守序列(見
圖1)，可以包括肌醇六磷酸酶特異氨基酸，且得到的PCR產物被用作探針來篩選一個核酸文庫，如一個cDNA文庫。
本發明可用于分離基本類似于編碼如
圖1(SEQ ID NO1)所示的肌醇六磷酸酶的分離核酸分子的核酸序列。分離的核酸序列基本上是相似的，如果(i)它們能夠在嚴格的條件下與SEQ ID NO1雜交，此后進行描述；或(ii)由于基因編碼的退化(如退化為SEQ ID NO1)，它們編碼一個如SEQ ID NO2中所顯示的肌醇六磷酸酶多肽。
退化的DNA序列編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列，但在核苷酸編碼序列中有一些變異。如此所使用的，“基本相似”是指與本發明的序列具有相似特性的序列。基本相似的核苷酸序列可以通過雜交或序列對比來鑒定。基本相似的酶序列可以通過下列方法的一種或多種來鑒定蛋白水解消化，凝膠電泳分析和/或微序列分析。
一種分離編碼肌醇六磷酸酶核酸分子的方法是以天然和人工設計的探針采用本領域認可的程序(見，如Ausubel等，見上)探測一個基因組基因文庫。對于本領域的技術人員要重視的是，SEQ ID NO1或其片斷(包括至少15個連續的核苷酸)是一個特別有用的探針。其他用于此目的的特別有用的探針是SEQ ID NO1序列的雜交片斷(即包括至少15個連續的核苷酸酸)。
這些探針可以被、并優選地用一種分析檢測試劑進行標記，以促進探針的識別。有用的試劑包括但不限于放射活性，熒光染料或能夠催化形成可檢測產物的酶。這個探針因此可被用以從其他動物來源中分離DNA互補拷貝，或篩選這種來源的相關序列。
關于可與在此公開的特異核酸序列雜交的核酸序列，雜交可以在簡化的嚴格條件，中等嚴格條件或十分嚴格條件下進行。作為寡核苷酸雜交的實例，一種含有固定變性核苷酸的聚合膜首先在一種溶液中預雜交30分鐘，該溶液包括0.9MNaCl，50mM NaH2PO4，pH7.0，5.0mM Na2EDTA，0.5％SDS，10X Denhardt’s和0.5mg/mL聚核糖腺苷酸。然后將大約2×107cpm(特異活性4-9×108cpm/ug)的32p末端標記的寡核苷酸探針加入到溶液。在孵育12-16小時后，室溫下在含有0.5％SDS的1XSET(150mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH7.8，1mM Na2EDTA)中洗膜30分鐘，然后在新鮮的1XSET中在Tm-10℃下清洗寡核苷酸探針30分鐘。然后膜暴露于放射自顯影膠片上以檢測雜交信號。
發明的核酸分子可在產生肌醇六磷酸酶基因產物(如肌醇六磷酸酶RNAs和肌醇六磷酸酶多肽)的標準方法中被用作模板。另外，編碼肌醇六磷酸酶多肽(及其片斷)的核酸分子和相關的核酸—如(1)含有與編碼肌醇六磷酸酶多肽或其片斷(如含有至少12，15，20或25個核苷酸的片斷)互補，或雜交的序列的核酸；和(2)含有與編碼肌醇六磷酸酶多肽的核酸，或其片斷(如含有至少12，15，20或25個核苷酸的片斷)互補序列雜交的核酸—可用于方法。例如，如在此所進一步詳細描述的，這樣的核酸分子可用在下列的方法中合成肌醇六磷酸酶核酸的PCR方法，在一個樣品中檢測一個肌醇六磷酸酶核酸存在的方法，鑒定編碼新的肌醇六磷酸酶家族成員的核酸的篩選方法。雜交作用為基礎的應用包括南方(Southern)型，北方(Northern)型，RNA保護和任何將核酸作為雜交合作者的雜交步驟。
本發明的多核苷酸的片斷或部分可被用于合成本發明的全長多核苷酸。相應地，本發明酶的片斷或部分可被用于通過肽合成來產生全長的酶；因此，片斷可以用作產生全長酶的中間體。斷裂片斷的大小分離一般采用8％聚丙烯酰胺凝膠進行，如文獻(如Goeddel等，1980)中所描述的。
6.3.15-在定向進化中的使用本發明提供了酶及其片斷，其他衍生物和類似物，和用于定向進化的相應核苷酸。如在此公開的多數模板的使用和發現與單一模板蛋白的定向進化相比，可能明顯增加了定向進化的潛在產量。因此，發現的需求是基于這樣的前提，大自然提供了一筆財富，即在截然不同但相關的分子分組的成員中具有潛在的難以獲得的或不可預測的特性，這些特性的開發可能極大的促進定向進化。因此，在一個方面，相關但截然不同的分子可能作為一個所需特性的定向進化的唯一起始模板。在另一個方面，它們可能作為結構—功能資料的儲存庫，這些信息包括但不限于，多種一致的基序。兩種作用都有助于排除邏輯上不切實際的任務，這些任務致力于立即開發任何給定分子過寬范圍的突變變換。例如，在100個氨基酸蛋白上的全范圍突變變換，包括超過10130個可能性(假設每個位點有20個氨基酸可能性)，從實用性上考慮這個數字太大了。
相應地，特別是因為邏輯上和技術上的限制，在進行“定向進化”時需要一種方法以發現和利用多數具有進化前差異的相關起始模板。這些模板然后進行多種誘變處理，包括，通過非限制性實例的方法，DNA突變發生和組合酶形成，一種在共同待批的USPN5,830,696(Short等)中進一步詳述的方法。
產生的新分子的酶活性然后用多種方法篩選，包括通過非限制性實例的方法a)分子生物包被；b)重組克隆篩選；和c)提取篩選。
6.3.16-在抗體生產中使用本發明提供了酶，及其片斷、其他衍生物和類似物，和表達它們的細胞，它們可以作為免疫原以產生其抗體。這些抗體可以是，例如，多克隆或單克隆抗體。本發明也包括了嵌合的，單鏈和人源化抗體，以及Fab片斷，或一個Fab表達文庫的產物。在本領域已知的各種步驟可被用于這樣的抗體和片斷的產生。
對應于本發明序列的酶產生的抗體可以通過將酶直接注射給一種動物或將酶給予一種動物來獲得，優選非人動物。然后這樣獲得的抗體將與酶本身結合。以這種方式，即使僅編碼酶的一個片斷的序列也可被用于產生與整個天然酶結合的抗體。這種的抗體然后可用于從表達該酶的細胞中分離酶。
為了制備單克隆抗體，可以使用任何通過連續細胞系培養提供抗體產物的技術。實例包括可以產生人單克隆抗體的雜交瘤技術(Kohler和Milstein，1975)，三瘤(trioma)技術，人B細胞雜交瘤技術(Kozbor等，1983)和EBV雜交瘤技術(Cole等，1985，77-96頁)。
描述的產生單鏈抗體的技術(USPN4,946,778 Ladner等)可以用來產生本發明的免疫原性酶產物的單鏈抗體。而且，轉基因鼠也可被用來表達本發明的免疫原性酶產物的人源化抗體。
產生的抗本發明酶的抗體可被用于從其他生物體和樣品中篩選相似的酶。這種篩選技術是本領域所熟知的。抗體也可被用作探針來篩選從這個或其他生物體中產生的基因文庫，以便鑒別這個或交叉的反應活性。
在上述系統中產生的多肽的分離和純化可以采用適合特殊系統的常規方法進行。例如，可以使用用于抗體，如單克隆或多克隆抗體，的制備性層析和免疫學分離。
如上所述，可以用于產生肌醇六磷酸酶特異抗體的抗原包括肌醇六磷酸酶多肽，如任何在
圖1多肽片斷中顯示的肌醇六磷酸酶。用于免疫動物的多肽或肽可用標準的重組，化學合成，或純化方法來獲得。如在本領域中所熟知的，為了增加免疫原性，抗原可以與一種載體蛋白結合。通常使用的載體包括鑰孔血蘭素(KLH)，甲狀球蛋白，牛血清白蛋白(BSA)，和破傷風類毒素。然后偶聯的肽用來免疫動物(如，小鼠，大鼠或兔)。除了這樣的載體，已知的佐劑可以與抗原一起使用來加速強免疫反應的誘導。
肌醇六磷酸酶特異的多克隆和單克隆抗體可以被純化，例如通過與含有肌醇六磷酸酶多肽，如產生抗體的肌醇六磷酸酶多肽(或其片斷)，的基質結合，并從中洗脫。其他抗體純化和濃縮的方法是本領域所熟知的，可以用本發明的肌醇六磷酸酶特異抗體進行(見，如Coligan等，1996)。
對應于肌醇六磷酸酶特異性抗原的抗遺傳型抗體也包括在本發明中，并可以采用標準的方法來產生。這些抗體是肌醇六磷酸酶特異性抗體，因此可以模仿肌醇六磷酸酶特異的抗原決定簇。本發明也包括肌醇六磷酸酶多肽片斷的其他應用，該多肽保留了至少一個肌醇六磷酸酶特異活性或抗原決定簇。肌醇六磷酸酶活性可以通過檢測肌醇六磷酸酶對肌醇和游離磷酸的催化來進行檢測。這樣的片斷可容易地通過比較
圖1中發現的肌醇六磷酸酶序列來鑒定。
在一個非限制性實例中，一個包含如至少8-10個氨基酸的肌醇六磷酸酶多肽片斷可以用作免疫原來產生肌醇六磷酸酶特異的抗體。片斷可以包含，例如，一個肌醇六磷酸酶保守的氨基酸序列，這個氨基酸序列可以包含肌醇六磷酸酶保守的氨基酸。在另一個非限制性的實例中，上述的肌醇六磷酸酶片斷可被用于免疫測定，如ELISAs，來檢測樣品中肌醇六磷酸酶特異抗體的存在。
6.3.17-在轉基因中使用可以使用多種制備本發明的轉基因動物的方法。一般來說，可以采用三種這樣的方法。在一種這樣的方法中，一個處于單倍體核期(一個“單細胞胚胎”)的胚胎從雌性中獲得，轉基因被微注射到胚胎中，此時轉基因將在染色體上整合到所得到的成熟動物的胚細胞和體細胞中。在另一種這樣的方法中，分離胚胎干細胞，在其中通過電穿孔，質粒轉染或微注射合并轉基因，然后將干細胞再導入胚胎中，在其中定植，形成種系。哺乳動物種屬微注射的方法在美國專利第4,873,191中描述。在另一種這樣的方法中，胚胎細胞可以用含有轉基因的逆轉錄病毒來感染，其中胚胎的胚細胞具有在染色體上整合的轉基因。當制備轉基因的動物是鳥禽類時，因為鳥禽類受精卵一般在輸卵管的第一個24小時進行細胞分裂，由于單倍體核不能進入，微注射入受精卵的單倍體核中是有問題的。因此，在總體上述的制備轉基因動物的方法中，逆轉錄病毒感染優選對于鳥禽類種屬，例如在美國專利第5,162,215中所述的。但是，如果微注射用于鳥禽類種屬，可以使用Love等(Biotechnology，1994年1月12日)公開發表的步驟，其中胚胎在前一次產卵2.5小時后從處死的雌性鳥禽類中獲得，轉基因微注射入胚盤的細胞質中，胚胎培養在宿主的殼中直至成熟。當制備轉基因的動物是牛或豬時，微注射可以用卵的不透明來中止，這樣使核很難通過常規的相差顯微鏡來鑒定。為了克服這樣的問題，可以首先離心卵來分隔單倍體核以便更好的觀察。
發明中“非人動物”指牛，豬，羊和鳥禽類動物(如母牛，豬，綿羊，雞)。本發明的“轉基因非人動物”是通過將“轉基因”導入非人動物種系中產生的。在不同發育期的胚胎靶細胞可以用于產生靶基因。依靠胚胎靶細胞的發育期來使用不同的方法。受精卵是微注射的最好靶目標。將受精卵用作基因轉移靶目標的主要優點是在大多數情況下，注射的DNA將在首次分裂前整合到宿主基因中(Brinster等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 824438-4442，1985)。其結果，轉基因非人動物的所有細胞將帶有合并的轉基因。一般來說，這也將在轉基因有效傳遞到首建者后代中反映，因為50％的受精卵將藏有轉基因。
術語“轉基因”用來描述一種在其所有細胞內包括外源基因物質的動物。一種“轉基因”可以通過交叉配種兩種嵌合體動物來產生，該動物在復制中使用的細胞中包括外源基因物質。得到的后代的25％將是轉基因的，即在其所有細胞的兩個等位基因中均包括外源性基因物質，得到動物的50％將在其一個等位基因中包括外源性基因物質，25％將不包括外源基因物質。
在本發明的實踐中有用的微注射方法中，轉基因不要任何載體DNA而被消化和純化，如通過凝膠電泳。優選的是，轉基因包括一個運轉相關啟動子，后者與參與轉錄的細胞蛋白相互作用，最后導致結構性表達。在這一方面中使用的啟動子包括來自細胞巨化病毒(CMV)，莫洛尼白血病病毒(MLV)和皰疹病毒，以及那些來自編碼金屬硫蛋白，骨架肌動蛋白，P-烯醇丙酮酸羧化酶(PEPCK)，磷酸甘油酸鹽(PGK)，DHFR和胸苷激酶的啟動子。也可以使用病毒長末端重復區(LTRs)的啟動子，如羅斯肉瘤病毒。當制備轉基因的動物是鳥禽類時，優選的啟動子包括雞β-球蛋白基因，雞溶菌酶基因和禽類白細胞增生病毒。在胚胎干細胞的質粒轉染中有用的構建物將采用本領域中已知的其他調控元件，如刺激轉錄的增強子元件，剪接受體，終止和聚腺苷酸化信號，和允許翻譯的核糖體結合位點。
逆轉錄病毒感染也可如上所述用于將轉基因導入到一個非人動物中。發育中的非人胚胎可以在體外培養到胚泡期。在此時間內，分裂球可以是逆轉錄感染的目標(Jaenich，R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 731260-1264，1976)。分裂球的有效感染可以通過酶性處理去除透明帶來獲得(Hogan等(1986)在處理鼠胚，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。用來導入轉基因的病毒載體系統典型地是載有轉基因的復制缺陷逆轉錄病毒(Jahner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA826927-6931，1985；Van der Putten等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 826148-6152，1985)。轉染可以通過在產生病毒的細胞單層上培養分裂球來很容易和有效地獲得。(Van der Putten，見上；Stewart等，EMBO J.6383-388，1987)。可以選擇地，感染可以在后面的時期進行。病毒或產生病毒的細胞可以被注射到囊胚腔中(D.Jahner等，Nature 298623-628，1982)。大多數先建立的是轉基因的嵌合體，因為整合僅發生在形成轉基因非人動物的一個細胞亞群中。進一步，首建者可能含有各種在基因組不同位置的轉基因逆轉錄病毒插入體，一般將在后代中分開。另外，也可能將轉基因通過對發育中的胚胎進行子宮內感染導入種系中，雖然有效性較低(D.Jahner等，見前)。
轉基因導入的第三種類型靶細胞是胚胎干細胞(ES)。ES細胞可以從體外培養的預先植入的胚胎中獲得，并與胚胎融合(M.J.Evans等，Nature292154-156，1981；M.O.Bradley等，Nature 309255-258，1984；Gossler等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 839065-9069，1986；和 Robertson等，Nature322445-448，1986)。轉基因可以通過DNA轉染或逆轉錄病毒介導的轉導被有效地導入ES細胞中。這種轉化的ES細胞此后與來自非人動物的胚泡結合。然后ES定植胚胎，并形成所得嵌合體動物的種系。(綜述見Jaenisch，R.，Science2401468-1474，1988)。
“轉化”指一種通過重組核酸技術的方法，被導入了(或進入其前體細胞)異源核酸分子的細胞。“異源”是指一個核酸序列，來源于其他物種或在其來源形式或細胞中原本表達形式上被修飾。
“轉基因”指通過技巧插入到一個細胞中的DNA任何部分，并成為生物體基因組的一部分(即穩定的整合或作為穩定的染色體外成分)，該機體是從該細胞發育而來的。這樣一個轉基因可能包括一個與轉基因生物體部分或全部異源(即外來的)的基因，或可代表與生物體內源基因同源的一個基因。包括在這個定義中的是一個通過提供一個RNA序列建立的轉基因，該序列被轉錄進入DNA，然后插入到基因組中。本發明的轉基因包括編碼肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA序列，并包括可在轉基因非人動物中表達的多核苷酸酸。這里所用的術語“轉基因”另外包括任何基因組已經被改變的生物體，通過體外處理早期胚胎或受精卵，或通過任何轉基因技術，誘導特異基因敲除。在此所用的“基因敲除”是指在體內靶向地破壞基因，并完全喪失功能，它可以通過本領域熟悉的任何轉基因技術來實現。在一個實施方案中，具有基因敲除的轉基因動物中，靶基因已經通過同源性重組將一個插入部分靶向到該基因而成為非功能性。如此所使用的，術語“轉基因”包括任何本領域熟悉的轉基因技術，它可以產生一種生物體，該生物體載有一個導入的轉基因或其中一個內源基因已變為“非功能性”或“敲除”。
在本發明的實踐中使用的轉基因是一個包括編碼肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA序列。在一個實施方案中，一個具有如SEQ ID NO1中所示序列的多核苷酸酸或編碼具有如SEQ ID NO2中所示序列的多肽的序列是一個轉基因，如在此所定義的術語一樣。如果合適，編碼具有肌醇六磷酸酶活性蛋白的DNA序列，但在核酸序列上與因基因組代碼退化者不同，也可在此使用，以可能縮短的形式，等位基因突變體和種間同源物。
在胚胎被微注射，與轉染的胚胎干細胞進行定植或被與含有轉基因的一個逆轉錄病毒感染(除了在此其他部分闡述的本發明在禽類的實例)后，胚胎被植入一個假孕雌性的輸卵管中。其后代妊娠通過Southern斑點雜交分析檢測血或采用轉基因特異探針檢測組織樣品。PCR對這種目的的實施特別有用。陽性妊娠(G0)進行雜交產生后代(G1)，它可以通過組織樣品的Northern斑點雜交來分析轉基因的表達。
因此，本發明包括增加轉基因動物磷攝取和/在轉基因生物體中減少污染量大約15％，典型的大約20％，更典型的大約20％至大約50％的方法。
考慮在本發明的實踐中使用的動物一般被認為是家養動物，包括寵物(如犬，貓，鳥禽類等)和那些用于食品加工的動物，即，鳥禽類如肉食和產蛋雞和火雞，羊如羔羊，牛如肉牛和奶牛，魚和豬。對于本發明的目的，當這個動物具有異源DNA序列，或一個或多個其他的在染色體上整合到動物的胚細胞中的，正常為動物內源性的DNA(在此全部是指“轉基因”)的這些動物被稱為“轉基因”的。轉基因動物(包括其后代)也將具有偶然整合到體細胞染色體上的轉基因。
6.3.18-在基因傳遞中的使用在一些情況下，局部輸送和表達本發明的肌醇六磷酸酶序列可能是有優勢的(如，在一種特殊的組織或細胞類型中)。例如，在動物消化道中肌醇六磷酸酶或消化性酶的局部表達將分別有助于，例如，肌醇六磷酸酶和磷的消化和攝取。例如，核酸序列可能直接輸送到唾液腺，組織和細胞中和/或消化道的上皮細胞層。這樣的輸送方法在本領域中是已知的，包括電穿孔，病毒載體和直接DNA攝取。任何具有肌醇六磷酸酶活性的多肽可以在本發明的方法中應用(如，那些在本節6.3.18中特別描述的，以及在發明中其他章節中所描述的)。
例如，本發明的一個核酸構建物將包括適合在一種宿主組織中攝入靶細胞形式的核酸分子。核酸分子可能以裸DNA或RNA分子的形式，其中分子可能包括一個或多個結構基因，一個或多個調控基因，反義鏈，能夠形成三倍體的鏈，或類似物。一般，核酸構建物將包括至少一個在合適調控區的轉錄和翻譯控制下的結構基因。更常見的是，本發明的核酸構建物將包括加入一個輸送載體中以提高轉染效率的核酸，其中的輸送載體將分散于更大的顆粒中，該顆粒包括一種干燥的親水賦形劑材料。
一種這樣的輸送載體由病毒載體組成，如逆轉錄病毒，腺病毒和腺相關病毒，它們已經被滅活以防止自我復制，但保持了與靶宿主細胞結合的天然病毒能力，將基因物質輸送到靶宿主細胞的細胞質中，并促進結構或已被摻入到顆粒中的其他基因的表達。介導基因轉移的合適的逆轉錄病毒載體在Kahn等，(1992)CIRC.RES.711508-1517中描述，它的公開在此加入作為參考。一個合適的腺病毒基因傳遞在Rosenfeld等(1991)SCIENCE 252431-434中描述，它的公開在此加入作為參考。逆轉錄病毒和腺病毒傳遞系統在Friedman(1989)SCIENCE2441275-1281中均有描述，它的公開在此加入作為參考。
第二種核酸傳遞載體由脂質體轉染囊泡組成，包括陰離子和陽離子脂質體構建物。陰離子脂質體的使用需要核酸包被在脂質體中。陽離子脂質體不需要核酸包被其中，而代之以通過核酸和脂質體的簡單混合就可以形成。陽離子脂質體熱烈地結合到陰性電荷的核酸分子，包括DNA和RNA，產生復合體，在許多細胞類型中產生適當的轉染效率。見，Farhood等(1992)BIOCHEM.BIOPHYS.ACTA.1111239-246，它的公開在此加入作為參考。形成脂質體囊泡的一種特別優選的材料是lipofectin，它由二油酸磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二油酸羥丙基-N-三乙氨基乙醇(DOTMA)組成，如在Felgner和Ringold(1989)NATURE 337387-388中所述，它的公開在此引入作為參考。
也可能將這兩種傳遞系統聯合。例如，Kahn等(1992)，見上，講授了一種逆轉錄病毒載體可與一種陽離子DEAE-葡聚糖囊泡結合以進一步增強轉化效率。也可能將核蛋白并入病毒和/或脂質體傳遞囊泡中，以進一步改善轉染效率。見，Kaneda等(1989)SCIENCE 243375-378，它的公開在此引入作為參考。
6.3.19-在飲食輔劑中的使用在另一個實施方案中，提供了一種含有作為單一活性成分或與一種或多種其他制劑和/或酶組合的酶的消化性輔劑(如在待批的申請，美國系列號第____中所描述的，題目為“飲食輔劑及其使用方法”，2000年5月25日提交，其公開部分在此整體引入作為參考)。在家畜或家養動物的消化輔劑中使用酶和其他制劑不僅改善了動物的健康和預期壽命，還有助于增加家畜的健康，并從家畜中產生食品。
目前，一些類型的家畜飼料(如某些家禽飼料)大量地添加了大量礦物質(如無機磷)，酶，生長因子，藥物，和其他輸送給家畜的制劑。這些添加物，例如，可以替代了許多在谷物中存在的卡路里和天然營養物。
通過從飼料本身減少或消除無機磷添加物和其他添加物(如微量礦物鹽，生長因子，酶，抗生素)，飼料將能夠帶來更多的營養和能量。相應地，剩余的飲食中將含有更多可利用的能量。例如，谷物—含油種子餐膳食一般每公斤飲食含有大約3,200kcal可代謝能量，礦物鹽不提供任何可代謝能量。因此去除不需要的礦物質，以谷物代替之將增加飲食中可利用的能量。因此本發明將不同于通常使用的含有肌醇六磷酸酶的飼料。例如，在一個實施方案中，使用了一種可以抵抗生物體胃腸道消化的生物相容性物質。
在許多生物體中，包括，例如，家禽或鳥類，如，例如雞，火雞，鵝，鴨，鸚鵡，孔雀，鴕鳥，野雞，鵪鶉，鴿，鴯鹋，幾維，潛鳥，澳州鸚鵡，美冠鸚鵡，金絲雀，企鵝，火烈鳥和鴿子，消化道包括儲存和使用硬的生物相容物體(如，巖石和含殼魚的殼)的胗來幫助消化種子或其他鳥食用的種子。這個生物體大家族的典型的消化道，包括含有稱為嗉囊的袋的食道，食物在其中保存較短的時間。從嗉囊，食物下移到真正的胃中，或前胃中，在此鹽酸和胃蛋白酶開始消化的過程。下一步，食物轉移到胗中，胗為卵圓形、厚壁且具有強有力的肌肉。胗的主要功能是研磨和破碎食物顆粒—一個通過鳥類吞入小量精細的碎石和砂礫來輔助的過程。從胗，食物轉移到十二指腸中。鳥類的小腸與哺乳動物類似。有兩個大約4-6英寸長的盲袋或盲腸在小腸和大腸的連接處。大腸很短，大多由長度約為3-4英寸的直腸組成。直腸排空到泄殖腔中，糞便通過排泄口排出。
在胗內食用的(或另外引入的)和存在的硬質、生物相容的物體提供了一個傳遞各種酶、化學的、治療性的和抗生素藥劑的有用載體。這些硬物質的壽命周期為數小時至數天，并在一段時間后通過。因此，本發明提供了包被的、飽和的(如飽和的基質和膜)重建飲食輔劑以輸送有用的消化或治療藥物到一種生物體中。這種飲食輔劑包括特定地被生物體攝取以輔助胗內消化的物質(如巖石或沙礫)。本發明提供了其上包被或其內飽和了藥劑的生物相容物體，它可用于生物體的消化輔劑或用于輸送治療性或藥用物質或化學制劑。
在第一個實施方案中，本發明提供了具有生物相容成分的飲食輔劑，其生物相容成分設計為釋放輔助消化的藥劑，其中生物相容成分設計為經口食用并在生物體的消化道(如胃)內釋放。“生物相容”是指該物質在與宿主機體(如鳥)接觸時不引起足以導致該物質排斥或使其失效的有害反應。這種失效性的發生可通過如，在該物質周圍形成纖維性結構限制飽和的藥劑彌散到宿主機體內，或形成因毒性或感染而導致機體死亡率或發病率增加的物質。生物相容的物質可以是非生物可降解的或是生物可降解的。在一個實施方案中，生物相容的成分對胃腸道的降解或消化具有抵抗性。在另一個實施方案中，生物相容的成分具有巖石或石頭的密度。
用于本發明的非生物可降解的材料是一種允許飲食輔劑附著或飽和的物質。這種非生物可降解的材料包括，例如，熱塑性塑料如丙烯酸類、變性聚丙烯睛、聚酰胺、聚碳酸酯、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚砜、聚醚砜和聚偏二氟乙烯。合成橡膠也是可用的材料并包括，例如，聚酰胺、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氨酯、聚乙烯醇和硅樹脂(如以硅為基礎的或含二氧化硅)。本發明提供了可以包括這些原料的生物相容的成分，它們可以被諸如混合或層化以形成混合物、聚合物或它們兩者的組合。
如這里所用，一種“生物可降解的”材料是指將在體內浸蝕或降解以形成較小化學物的成分。降解可通過如酶的、化學的或物理的方法而發生。考慮在本發明中使用的合適的生物可降解材料包括聚(交酯)類、聚(甘油酯)類、聚(乳酸)類、聚(乙醇酸)類、聚原酸酯類、聚醚酯類、聚己酸內酯、聚酰胺酯、聚碳酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚氨酯、聚丙烯酸酯。這些材料可被混合或層化以形成混合物、聚合物或它們兩者的組合。
幾種不同的生物相容物質可同時地或以各種組合的方式(如，在另一種之前的一種物質)被攝取或另外提供給同一種生物體。另外，生物相容的物質可被設計為緩慢通過消化道。例如，大的或脂肪物質傾向于更慢地通過消化道，因而可以使用具有大體積的生物相容材料以防止快速通過消化道。這種大物質可以是非生物可降解與生物可降解物質的結合體。例如，一種小的非生物可降解的物質被生物可降解的物質包圍，這樣經過一段時間，生物可降解部分將被降解，使非生物可降解部分得以通過消化道。此外，公認的是，任何數目的調味料可供給生物相容的物質以輔助食用。
任何數目的試劑單獨或與其它試劑結合，可被包被在生物相容的物質上，后者包括例如多肽(如酶、抗體、細胞因子或治療性小分子)和抗生素。特殊的有用試劑的例子列于下面表1和2。還考慮到，細胞可被封裝進本發明的生物相容材料內，并用于輸送酶或治療藥。例如，可以設計多孔的物質，其孔的大小足以讓細胞在其中生長和通過，然后這些多孔材料可被服用進消化道。例如，生物相容的物質可包括大多數的微生態環境(如不同的孔隙度、pH等)以為大多數細胞類型提供支持。細胞可以是經基因工程設計的以輸送特殊的藥物、酶或化學藥物到機體。細胞可以是真核的或原核的。
表1
表2.治療制劑
某些藥物可被設計成在一定的條件下(如在一定的pH下、存在激活劑等)活化或失活。另外，在本發明的成分中應用酶原是有益的。例如，酶原可被一種蛋白酶活化(如在消化道內存在的或人工導入機體消化道的唾液蛋白酶)。預期，用本發明的生物相容成分傳遞的藥物可通過添加激動劑而被活化或失活，后者可由機體攝取或另外傳遞給機體。另一種在消化道內控制藥物的機制是一種環境敏感劑，它在消化道的適當部位被活化。例如，一種藥物可在低pH失活但在中性pH活化。因而，該藥物將在胃管內無活性但在腸道內活化。可選擇地，藥物可對存在微生物特異因子(如存在于腸道的微生物)反應而變得有活性。
總之，本發明的潛在益處包括，例如(1)在動物(包括魚)每日飼料或谷物中使用礦物補充料(如無機磷補充劑)、酶或治療藥物的需要減少或可能消除，從而增加飼料中的熱量和營養素，和(2)增強家養和非家養動物的健康和生長，包括如家禽、豬、牛、馬、犬和貓科動物。
大量的酶可被用于本發明的方法和成分。這些酶包括食用食物的完全消化或完全代謝、經消化道傳遞給動物的化合物、前體藥物或其它藥物或化合物的活化或誘導所必需的酶。可被傳遞或摻入本發明成分中的酶的例子包括，例如，飼料強化酶包括α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶、特別是乳糖酶，肌醇六磷酸酶，β-葡聚糖酶、特別是內-β-1，4-葡聚糖酶和內-β-1，3(4)-葡聚糖酶，纖維素酶，木糖苷酶，半乳聚糖酶、特別是阿拉伯糖內-1，4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯糖內-1，3-β-半乳糖苷酶，葡聚糖內切酶、特別是內-1，2-β-葡聚糖酶、內-1，3-α-葡聚糖酶和內-1，3-β-葡聚糖酶，果膠降解酶、特別是果膠酶，果膠甲酯酶，果膠裂合酶，多聚半乳糖醛酸酶，阿拉伯糖酶，鼠李糖半乳糖酶，鼠李聚糖半乳糖醛酸乙酰酯酶，鼠李聚糖半乳糖醛酸-α-鼠李糖苷酶，果膠酸裂合酶，和α-galacturonisidases，甘露聚糖酶，β-甘露糖苷酶，甘露聚糖乙酰酯酶，木聚糖乙酰酯酶，蛋白酶，木聚糖酶，樹膠木聚糖酶和脂肪分解酶如脂肪酶、磷脂酶和角質酶。在SEQ ID NO1和2及下面表3陳述的肌醇六磷酸酶是優選的。表3中描述的序列是具有如這里所述的氨基酸取代和核苷酸取代的SEQ ID NO1和2。
表3
用于本發明的酶可被修飾以增強其活性、輸送、激活和降解。這種修飾可在體內或體外進行，并使用如下更充分描述的本領域一般知道的方法和步驟。這種方法通常采用自動化機器合成的、或克隆表達的、或用重組DNA技術控制的多核苷酸或多肽序列。
在一個優選的實施方案中，本發明成分中使用的酶是對熱穩定、耐熱并催化肌醇六磷酸酶水解的肌醇六磷酸酶，即該酶能夠在短暫的(即5至30秒)或較長時間，如數分鐘或數小時，暴露于50℃以上溫度后復性或獲得活性。
“飼料”和“食物”分別是指任何天然或人工的飲食、膳食或類似物，或打算或適于分別被動物和人類吃、服、攝取的這些膳食的成份。這里所用的“飲食輔劑”是指，例如，含有供給動物或機體治療藥或消化劑藥物的組合物。“飲食輔劑”典型地不是機體熱量的來源，換句話說，飲食輔劑典型地不是機體能量的來源，而是在典型的“飼料”或“食物”之外服用的組合物。
藥物或酶(如肌醇六磷酸酶)可分別在體外或體內發揮作用，即在服用前或在機體的胃或胃管中。而且也可能聯合作用。
盡管任何酶可被摻進飲食輔劑中，這里參考肌醇六磷酸酶作為本發明方法和成分的范例。本發明的飲食輔劑包括酶(如肌醇六磷酸酶)。總體上，含有肌醇六磷酸酶成分的飲食輔劑為液體或干性的。
液體組分不需要含有除酶(如肌醇六磷酸酶)以外的任何成分，優選為高純度形式。然而，通常還加入穩定劑如甘油、山梨醇或單丙烯乙二醇。液體組分也可含其它添加劑如鹽、糖、防腐劑、pH調節劑、蛋白、肌醇六磷酸鹽(肌醇六磷酸酶底物)。代表性的液體組分是水或油質的淤泥。液體組分可被加入生物相容的成份中以緩慢釋放。優選地，酶加入生物相容材料(如生物可降解的或非生物可降解的)的飲食輔劑結構中，包括其中添加了重組體細胞者，如多孔玻璃細珠。
干性組分可以是噴霧干燥的組分，在這種情況下該組分不需含干性狀態的酶以外的任何成分。然而，干性組分通常是所謂的顆粒，易于與食物或塑料混合，或更優選地，形成一種預混合的成分。酶顆粒的粒度大小優選為與混合物中其它成分相當。或者為將酶摻入動物飼料中提供了一種安全和方便的方法。優選地，這些顆粒是生物相容的，更優選地，他們是非生物可降解的生物相容顆粒。
被酶包被的凝集顆粒可采用凝聚技術在一種高速剪切混合器內制備，吸收顆粒通過具有載體材料核心而制備以吸收/被酶包被。優選地，載體材料是生物相容的非生物可降解材料，以模擬動物胗內石頭和沙礫的作用。用于凝聚技術的代表性填充材料包括鹽，如硫酸鈉。其它填充料是高嶺土、滑石粉、硅酸鋁鎂和纖維素纖維。粘合劑如糊精也可隨意地包含在凝集顆粒中。載體材料可以是任何生物相容的材料包括生物可降解的和非生物可降解的材料(如巖石、石頭、陶瓷、各種多聚物)。顆粒被覆蓋混合物隨意地包被。這種混合物包括涂布劑，優選疏水性涂布劑如氫化棕櫚油和牛脂，如果需要的其它添加劑如碳酸鈣或高嶺土。
此外，飲食輔劑成分(如肌醇六磷酸酶飲食輔劑成分)可含有其它替代物如著色劑、芳香化合物、穩定劑、維生素、礦物、其它飼料或食品強化酶等。代表性的添加劑通常包括一種或多種化合物如維生素、礦物或飼料強化酶和適當的載體和/或賦形劑。
在一個實施方案中，本發明的飲食輔劑成分另外包括有效量的一種或多種飼料強化酶，特別是下面的飼料強化酶α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶、特別是乳糖酶，其它肌醇六磷酸酶，β-葡聚糖酶、特別是內-β-1，4-葡聚糖酶和內-β-1，3(4)-葡聚糖酶，纖維素酶，木糖苷酶，半乳聚糖酶、特別是阿拉伯糖內-1，4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯糖內-1，3-β-半乳糖苷酶，葡聚糖內切酶、特別是內-1，2-β-葡聚糖酶、內-1，3-α-葡聚糖酶和內-1，3-β-葡聚糖酶，果膠降解酶、特別是果膠酶，果膠甲酯酶，果膠裂合酶，多聚半乳糖醛酸酶，阿拉伯糖酶，鼠李糖半乳糖酶，鼠李聚糖半乳糖醛酸乙酰酯酶，鼠李聚糖半乳糖醛酸-α-鼠李糖苷酶，果膠酸裂合酶，和α-galacturonisidases，甘露聚糖酶，β-甘露糖苷酶，甘露聚糖乙酰酯酶，木聚糖乙酰酯酶，蛋白酶，木聚糖酶，arabinoxylanases和脂肪分解酶如脂肪酶、磷脂酶和角質酶。
本發明的飲食輔劑是在進食前或同時補充給單胃動物的。在一個實施方案中，本發明的飲食輔劑是與飲食同時補充給單胃動物的。在另一種實施方案中，飲食輔劑以顆粒或穩定的液體形式添加進飲食中。
本發明的飲食輔劑中，酶的有效劑量是從大約10-20,000；優選大約10-15,000，更優選大約10-10,000，特別是大約100-5,000，尤其是大約100-2,000FYT/kg飲食輔劑。
本發明的肌醇六磷酸酶其它特殊用途的實例是大豆加工和肌醇及其衍生物的生產。
本發明還涉及一種降低動物肥料中肌醇六磷酸鹽水平的方法，這里的動物喂食了含本發明的有效劑量肌醇六磷酸酶的飲食輔劑。如在本申請開始中所闡述的，由此的一個重要作用是減少了環境的肌醇六磷酸鹽污染。
在另一個實施方案中，飲食輔劑是磁性載體。例如，一種有酶(如肌醇六磷酸酶)分布在其內、其上或其間的磁性載體(如多孔的磁珠)，可分布在一種高肌醇六磷酸鹽的區域內，并在一段時間后被磁體收集。這種小珠的分布和重回收減少了額外的污染并使小珠可以重新利用。此外，這種磁珠的體內應用使得飲食輔劑定位于消化道內的一點，例如肌醇六磷酸酶活性可以發揮的地方。例如，在動物食用磁載體飲食輔劑后，通過在動物胃旁邊并列一種磁體可以將本發明的含消化酶的飲食輔劑定位在動物胃。磁體在一段時間后可被撤走，使得飲食輔劑通過消化道。此外，磁載體在處死后適合去除或輔助收集。
當飲食輔劑是多孔顆粒時，這種顆粒典型地為期望緩慢釋放的物質充滿以形成緩釋顆粒。這種緩釋顆粒不僅可通過將期望釋放的物質攝取多孔顆粒而制備，而且可通過將需要的物質首先溶入第一分散相而制備。在此情況下，采用要釋放的物質首先溶入第一分散相方法而制備的緩釋顆粒也在本發明的范疇和精神內。例如，中空的多孔顆粒可被緩釋物質充滿，如醫用藥、農藥或酶。特別是，當充滿酶的中空多孔顆粒是由生物可降解的聚合物制造時，顆粒本身可用作農藥或肥料，且它們對環境沒有副作用。在一個實施方案中，多孔顆粒實際上是有磁性的。
中空的多孔顆粒可被用作生物反應器支架，特別是酶支架。因此，采用緩釋方法制備飲食輔劑是有益的，例如，通過將作用物酶包裹在微囊泡如脂質體內，藥劑在數天的過程中從其中釋放，優選地大約3-20天。可選擇地，藥物(如酶)可被設計為緩慢釋放，例如加入緩釋聚合物中，從中藥物(如酶)劑量在數天過程中緩慢釋放，例如2至30天，而且其范圍可以與動物生命平行。
如本領域已知的，脂質體一般來自磷脂或其他脂類物質。脂質體由分散在水性介質中的單-或多層含水液體結晶形成。任何可形成脂質體的非毒性、生理學可接受和可代謝脂類均可應用。本脂質體形式的成分除藥物外可包含穩定劑、防腐劑、賦形劑等。優選的脂類是磷脂和磷脂酰膽堿(卵磷脂)，包括天然和合成的。形成脂質體的方法為本領域所知。見，例如，Prescott主編，細胞生物學方法，XIV卷，Academic Press，New York，N.Y.(1976)，33頁及以下等。
在制備食品或飼料制劑或添加劑方法中應用本發明的肌醇六磷酸酶也在本發明的范疇內，即肌醇六磷酸酶僅在加工過程中發揮其肌醇六磷酸酶活性，而在最終食品或飼料產品中沒有活性。例如此方面與生面團制作和烘焙相關。因而，肌醇六磷酸酶或重組體酵母表達的肌醇六磷酸酶可被加入磁性載體之內、之上或之間，分布在生面團或食品媒介中，并被磁體收回。
本發明的飲食輔劑可用生物相容的(如生物可降解的或非生物可降解的)載體單獨給予動物，或與其它消化添加劑一起使用。由此，本發明的飲食輔劑可以容易地作為頂肥給予，或直接將其混合進動物飼料，或通過單獨口服、注射或經皮方式與飼料分開供給，或與其它生長相關的可食用化合物組合，在組合中每種化合物的比例依據特定的機體或要解決的問題和所希望的反應程度而定。應當理解，在任何給定情況下給予的特殊飲食劑量將根據要給予的特定化合物、要處理的問題、受者的狀態和其它可能改變有效成分活性或受者反應的相關實際而被調整，正如本領域中那些技術人員所熟知的那樣。大體上，可使用單次每日劑量或分開的每日劑量，如本領域熟知的。
如果與動物飼料分開給予，飲食輔劑的形式可通過將其與非毒性藥學可接受的可食用載體結合而制成速釋或緩釋劑型，如本領域熟知的。這種可食用載體可以是固體或液體，如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、大豆碎片、花生油、橄欖油、芝麻油和丙二醇。如果使用固體載體，化合物的藥劑形式可能是片劑、膠囊、粉劑、錠劑或糖錠或以微型可分散形式的頂肥。如果使用液體載體，藥劑形式可能是軟凝膠膠囊、或糖漿或液體懸液、乳劑或溶液。藥劑形式還可包含佐劑，如防腐劑、穩定劑、潤濕或乳化劑、溶液輔劑等。它們也可包含其它有治療價值的物質。
因此，本發明的顯著優點包括，例如1)輕松生產帶有生物相容組分的活性成分；2)由于其涉及的聚合物和/或可能使用的活性成分種類而具有多功能性；3)高產量和裝載效率；和4)提供在體內釋放活性、完整活性藥物的持續釋放制劑，因而在延伸的時間范圍內提供活性藥物的控制釋放。此外，另一個優點在機體消化道內(如胃)局部傳遞藥物。如這里所用的短語“包含在其中”代表一種方法，以將藥物設計為用于在藥物延伸的時間范圍內控制釋放的結構。
在本發明的持續釋放或緩釋結構中，將使用有效劑量的藥物(如酶或抗生素)。如這里所用的，持續釋放或緩釋是指藥物在延伸的時間范圍內從一種生物相容的材料中釋放。持續釋放可以是連續的或不連續的、線性的或非線性的，它可以采用一種或多種生物可降解或非生物可降解的結構、裝載藥物、選擇賦形劑或其它修飾而實現。然而，要認識到，可能希望提供“快速”釋放結構，準備一旦被機體食用就迅速釋放。還要理解，“釋放”并不一定指藥物從生物相容載體中釋放。更確切地，在一個實施方案中，緩釋包括存在于生物相容組分上的藥物緩慢激活或連續激活。例如，肌醇六磷酸酶不必從生物相容組分上釋放而起效。在此實施方案中，肌醇六磷酸酶在生物相容組分上固定不動。
動物飼料可以是通常用于滿足動物飲食需要的任何含蛋白的有機膳食。許多這種含蛋白膳食典型地主要包括玉米、大豆粉或玉米/大豆粉混合。例如，喂食家禽的代表性商業銷售產品包括Land O’Lakes AG Services的家禽飼料產品EggMaker Complete、和Agwa，Inc的產品Country Game&Turkey Grower(也見PhilipMinnaar和Maria Minnaar的The Emu Farmer的手冊)。這些商業銷售的產品都是動物飼料的代表性例子，本飲食輔劑和/或肌醇六磷酸酶可被摻入其中以減少或消除在這種組成中需要攝入的磷、鋅、鎂和鐵的補充量。
本發明可應用于許多動物的飲食，這里定義為包括哺乳動物(包括人)、家禽和魚。特別是，該飲食可被用于商業上重要的哺乳動物如豬、牛、綿羊、山羊、實驗室嚙齒動物(大鼠、小鼠、倉鼠和沙鼠)、被毛動物如貂和狐貍、動物園動物如猴和猿、家養哺乳動物如貓和狗。代表性的商業上重要的鳥禽類包括雞、火雞、鴨、鵝、野雞、鴯鹋、鴕鳥、潛鳥、幾維、鴿子、鸚鵡、澳洲鸚鵡、大冠鸚鵡、金絲雀、企鵝、火烈鳥和鵪鶉。商業養殖的魚如鱒魚也受益于這里公開的飲食輔劑。其它能受益的魚包括，例如食用魚(特別是在魚池或魚缸培育環境下，如熱帶魚)、金魚和其它觀賞性鯉魚、鯰魚、鱒魚、鮭魚、鯊魚、鷂魚、比目魚、鰨魚、羅非魚、青鳉、虹鳉、任一種帆鰭鱸、新月魚、劍尾魚、斑魚和泥鰍。
除非另外聲明，如Sambrook，Fritsch和Maniatus，1989描述的方法進行轉化。下面的實例是想舉例說明，并不是限制本發明。雖然實例中描述的方法是可被用以執行本發明某一方面者的代表，但本領域技術人員已知的其它方法也可使用。
實例1肌醇六磷酸酶的分離、細菌表達和純化大腸桿菌B基因組DNA從Sigma獲得(目錄號#D-2001)，St.Louis，New Jersey.下面的引物用于對直接來自基因組DNA基因的PCR擴增。
5’引物 gtttctgaattcaaggaggaatttaaATGAAAGCGATCTTAATCCCATT(SEQIN NO3)；和3’引物 gtttctggatccTTACAAACTGCACGCCGGTAT(SEQ IN NO4)PCR反應中的Pfu聚合物酶和擴增按照制造商手冊進行(Stratagene CloningSystems，Inc.，La Jolla，CA)。
PCR產物被純化，純化的產物和pQE60載體(Qiagen)均按照制造商手冊用EcoRI和BglII限制性核酸內切酶(New England Biolabs)消化。用標準的方法進行過夜進行連接反應以產生pQE60。
擴增的序列在框架內插入編碼RBS的序列中。然后，連接反應的混合物通過電穿孔被用來轉化大腸桿菌菌株M15/pREP4(Qiagen，Inc.)。M15/pREP4含質粒pREP4的多個拷貝，后者表達lacI阻遏物，還賦予卡那霉素抗性(Kanr)。質粒DNA被分離并通過限制性分析確認。含所需構建物的克隆在補充了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB培養基的液體培養基內過夜生長。O/N培養物被用來以1∶100至1∶250的比例接種給大培養基。該細胞生長至光密度600(O.D.600)0.4至0.6之間。然后加入IPTG(“異丙基-B-D-硫基半乳糖苷”)至終濃度為1mM。IPTG通過失活lacI阻遏物、清除P/O先導而誘導基因表達的增加。細胞再生長3至4小時。然后通過離心收獲細胞。
上面陳述的引物序列還可通過上面描述的雜交技術用于從沉淀物質中分離靶基因。
根據上面的講述，對本發明的許多修改和變化是可能的，因此，在所附的權利要求范圍內，本發明可不特定描述實施。還要理解，雖然本發明已經如上被進行了詳細的描述，但前面的描述是舉例說明，并不是限制本發明的范圍。另一方面，本發明的優點和修改在下面權利要求的范圍內。所有出版物、專利申請、專利和其它這里提到的文獻被整體引用作為參考。
本發明也提供從所有其它大腸桿菌菌株(是有毒或無毒，包括K12，W，C)以及所有細菌分離和應用肌醇六磷酸酶分子(核酸及其編碼的酶)。這些包括所有屬于以下的已知種屬和菌株棲熱袍菌屬(Thermotogales)綠色非硫磺細菌藻青菌屬&葉綠體低G+C革蘭氏—陽性細菌梭菌屬高G+C革蘭氏—陽性細菌Gytophaga/屈撓細菌/類桿菌屬組絲狀桿菌(Fibrobacteria)Spriochaetes浮霉狀菌屬(Planctomyces)/衣原體屬組紫色細菌(Proteobacteria)包括以下亞門δ&ε，包括乙酸氧化脫硫單胞菌(Desulfuromonas acetoxidans)可變脫硫八疊球菌(Desulfosarcina variabilis)斯氏蛭弧菌侵蝕侏囊菌(Nannocystis exedens)橙色標樁菌(Stigmatella aurantiaca)黃色粘球菌(Myxococcus xanthus)脫硫脫硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)sp.卵硫菌(Thiovulum sp.)空腸彎曲桿菌產琥珀酸沃林菌幽門纏繞桿菌α包括Methylobacterium extorquens印度拜葉林無氏菌(Beijerinckia indica)普通生絲微菌(Hyphomicrobium vulgare)土壤膨脹桿菌流產布氏桿菌五日熱羅卡利馬體海紅菌(Rhodopseudomonasmarina subsp.agilis)Zea mays-線粒體立式立克次體立式埃里希體尖音庫蚊沃爾巴克氏體(Wolbachia pipientis)邊緣無形體長赤細菌(Erythrobacter longus)需鹽紅螺菌(Rhodospirillum salexigens)莢膜紅細菌(Rhodobacter capsulatus)生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)γ包括沙氏外硫紅螺菌(Ectothiorhodospira shaposhnikovii)酒色著色菌(Chromatium vinosum)甲烷甲基單胞菌(Methylomonas methanica)
人心桿菌嗜麥芽黃單胞菌伯氏柯克斯體嗜肺軍團菌嗜肺亞屬線型海洋螺菌(Oceanospirillum linum)乙酸鈣不動桿菌綠膿假單胞菌流感嗜血桿菌副溶血弧菌普通變形桿菌胡蘿卜歐文菌大腸桿菌包括β包括齒蝕艾肯菌淋病奈瑟球菌Vitreoscilla stercoraria青色素桿菌糞產堿桿菌膠狀紅長命菌(Rubrivivax gelatinosus)睪丸酮假單胞菌歐洲亞硝化單胞菌迂回螺菌這種肌醇六磷酸酶分子可用已知的方法從這些細菌中分離，包括庫篩選方法如表達篩選，雜交方法，PCR(如，見Sammbrook，1989)。
7.引用的文獻(本申請中引用的所有文獻的講授內容在這里以文獻整體加入作為參考，除非另外說明。)Association of Official Analytical ChemistsOfficial Methods of Analysis.Associatoinof Official Analytical Chemists，Washingtong，DC.，1970.Ausubel FM等。分子生物學現代方法。Greene Publishing Assoc.，Media，PA.1987，1989，1992.Barnes WM從λ噬菌體模板高保真和高產量的對直至35-kb DNA的PCR擴增。
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Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His290 295 300Pro Pro Gln Lys Gln Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu305 310 315 320Phe Ile Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu325 330 335Glu Leu Asn Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly340 345 350Gly Glu Leu Val Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln355 360 365Trp Ile Gln Val Ser Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp370 375 380Lys Thr Pro Leu Ser Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr385 390 395 400Leu Ala Gly Cys Glu Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala405 410 415Gly Phe Thr Gln Ile Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu420 425 430Arg Ser His His His His His His435 440<210>3<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物序列<400>3gtttctgaat tcaaggagga atttaaatga aagcgatctt aaccccatt 49<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物序列<400>4gtttctggat ccttacaaac tgcacgccgg tat 3權利要求
1.改善含肌醇六磷酸鹽食品營養價值的方法，包括以下步驟用實質上純的肌醇六磷酸酶與所述的含肌醇六磷酸鹽的食品接觸，該肌醇六磷酸酶具有選自SEQ ID NO2的氨基酸序列，使得所述實質上純的肌醇六磷酸酶催化無機磷從所述的含肌醇六磷酸鹽食品中的肌醇六磷酸鹽中釋放。
2.權利要求1所述的方法，其中所述的實質上純肌醇六磷酸酶是通過含編碼肌醇六磷酸酶的核酸的重組表達系統產生的，該核酸具有選自下述序列的核苷酸序列a)SEQ ID NO1，和b)SEQ ID NO1其中T也可以是U；其中編碼肌醇六磷酸酶的核酸的表達導致所述實質上純的肌醇六磷酸酶的產生。
3.權利要求1所述的方法，其中所述無機磷從所述含肌醇六磷酸鹽食品中的肌醇六磷酸鹽中的釋放，發生于所述含肌醇六磷酸鹽食品被接受生物體攝取之前。
4.權利要求1所述的方法，其中所述無機磷從所述含肌醇六磷酸鹽食品中的肌醇六磷酸鹽中的釋放，發生于所述含肌醇六磷酸鹽食品被接受生物體攝取之后。
5.權利要求1所述的方法，其中所述無機磷從所述含肌醇六磷酸鹽食品中的肌醇六磷酸鹽中的釋放，部分發生于所述含肌醇六磷酸鹽食品被接受生物體攝取之前，部分發生于攝取之后。
6.權利要求2所述方法中使用的重組表達系統，其中所述的重組表達系統包含在宿主細胞內并表達編碼具有SEQ ID NO2所述氨基酸序列的肌醇六磷酸酶的核苷酸序列，其中編碼所述的酶的核苷酸序列可操作地與所述宿主細胞內可運行的轉錄控制序列相連。
7.一個載體，包括權利要求6所述的表達系統。
8.權利要求6所述的表達系統，其中所述控制序列包括結構啟動子。
9.權利要求6所述的表達系統，其中所述控制序列包括組織特異的啟動子。
10.權利要求6所述的表達系統，其中所述的宿主細胞是原核細胞。
11.權利要求6所述的表達系統，其中所述的宿主細胞是真核細胞。
12.權利要求6所述的表達系統，其中所述的宿主細胞是植物細胞。
13.權利要求6所述的表達系統，其中所述的核苷酸序列之前是可操作地連接在所述核苷酸序列上的編碼一個信號肽的多核苷酸序列。
14.權利要求13所述的表達系統，其中所述的信號肽是來自煙草的PR蛋白PR-S信號肽。
15.經修飾的含有權利要求6所述表達系統的原核細胞。
16.經修飾的含有權利要求6所述表達系統的真核細胞。
17.經修飾的含有權利要求6所述表達系統的植物細胞、植物部分或植物。
18.一種產生含微生物肌醇六磷酸酶的動物飼料的方法，包括a)在所述核苷酸序列被表達的條件下培養權利要求17所述的植物細胞、植物部分或植物；和b)將所述的植物細胞、植物部分或植物轉變成適合動物飼料的組分。
19.動物飼料組合物，其包括權利要求17所述的植物種子、植物細胞、植物部分或植物與含肌醇六磷酸鹽的食品的混合物。
20.一種能夠通過外源肌醇六磷酸酶的活性增強消化而受益的治療人或動物的方法，該方法包括給予所述的人或動物一定量的轉基因植物的植物種子、植物細胞、植物部分或植物，其中所述的轉基因植物經修飾含有一個表達系統，該表達系統以在所述人或動物消化道內提供有效量的肌醇六磷酸酶活性，表達編碼肌醇六磷酸酶的核苷酸序列。
21.轉基因的非人生物體，其基因組包括編碼具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的異種核酸序列，其中所述的轉基因導致肌醇六磷酸酶多肽的表達。
22.一種產生變異體的方法，包括獲得核酸，該核酸包括SEQ ID NO1中所述的序列，基本上與其相同的序列，與其互補的序列，包含其至少30個連續核苷酸的片段，和包含SEQ ID NO1互補序列的至少30個連續核苷酸的片段；和修飾所述序列的一個或多個核苷酸成為另一個核苷酸，刪除所述序列中的一個或多個核苷酸，或添加給所述序列一個或多個核苷酸。
23.權利要求22所述的方法，其中所述修飾是由選自下面的方法引導的錯誤傾向PCR、移動、寡核苷酸定向突變、組合PCR、有性PCR突變、體內突變、盒式突變、循環集合突變、指數集合突變、位點特異的突變、連接重裝、GSSM和它們任何的組合。
24.權利要求22所述的方法，其中所述修飾是由錯誤傾向PCR引導的。
25.權利要求22所述的方法，其中所述修飾是由移動引導的。
26.權利要求22所述的方法，其中所述修飾是由寡核苷酸定向突變引導的。
27.權利要求22所述的方法，其中所述修飾是由組合PCR引導的。
28.權利要求22所述的方法，其中所述修飾是由有性PCR突變引導的。
29.權利要求22所述的方法，其中所述修飾是由體內突變引導的。
30.權利要求22所述的方法，其中所述修飾是由盒式突變引導的。
31.權利要求22所述的方法，其中所述修飾是由循環集合突變引導的。
32.權利要求22所述的方法，其中所述修飾是由指數集合突變引導的。
33.權利要求22所述的方法，其中所述修飾是由位點特異的突變引導的。
34.具有其上儲存有下列核酸序列的計算機可讀媒體SEQ ID NO1中所述的核酸序列和基本上與其相同的序列，或SEQ ID NO2中所述的多肽序列和基本上與其相同的序列。
35.包括處理器和數據儲存裝置的計算機系統，其中所述的數據儲存裝置上儲存有SEQ ID NO1中所述的核酸序列和基本上與其相同的序列，或SEQ ID NO2中所述的多肽序列和基本上與其相同的序列。
36.權利要求35所述的計算機系統，進一步包括序列比較算法和其上至少儲存了一個參考序列的數據儲存裝置。
37.權利要求36所述的計算機系統，其中序列比較算法包括表示多形性的計算機程序。
38.權利要求35所述的計算機系統，進一步包括鑒別所述序列特征的識別器。
39.一種將第一序列與參考序列或序列數據庫比較的方法，其中所述的第一序列是SEQ ID NO1中所述的核酸序列，和基本上與其相同的序列，或SEQ ID NO2中所述的多肽序列，和基本上與其相同的序列，該方法包括通過使用比較序列的計算機程序讀取第一序列和參考序列或序列數據庫；和用計算機程序確定第一序列和參考序列或序列數據庫之間的不同。
40.權利要求39所述的方法，其中確定第一序列和參考序列之間的不同包括鑒別多形性。
全文摘要
來源于大腸桿菌B的純化重組肌醇六磷酸酶。酶的分子量大約為47.1千道爾頓且有肌醇六磷酸酶活性。此酶可以從天然或重組宿主細胞內產生,可以用于幫助需要的肌醇六磷酸鹽消化。尤其是,本發明的肌醇六磷酸酶可以在食品中應用以改善富含肌醇六磷酸鹽成分的喂養價值。
文檔編號C12N5/02GK1351666SQ00808022
公開日2002年5月29日 申請日期2000年5月25日 優先權日1999年5月25日
發明者J·M·肖特, K·A·克雷茨 申請人:戴弗薩公司