重組細菌肌醇六磷酸酶及其用途的制作方法

專利名稱：重組細菌肌醇六磷酸酶及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及新近鑒定的多核苷酸、用這種多核苷酸編碼的多肽、這種多核苷酸和多肽的用途，以及這種多核苷酸和多肽的產生和分離。更明確地說，本發明的多肽已經被鑒定為具有肌醇六磷酸酶活性的酶。
背景技術：
礦物質是所有生物生長的必需元素。膳食礦物質可以來源于許多原材料，包括植物。例如，由于植物種子含有與肌醇六磷酸分子的磷酸基團復合的離子，所以它們是礦物質的豐富來源。這些與肌醇六磷酸相關的礦物質滿足一些種類的飼養生物的膳食需求，如多胃反芻動物。因此，反芻動物不需要用無機磷酸和礦物質來進行膳食補充，這是因為瘤胃中的微生物產生了催化肌醇六磷酸(肌肉-肌醇-六磷酸)轉化到肌醇和無機磷酸的酶。在該過程中，先前與肌醇六磷酸復合的礦物質被釋放出來。然而，飼養生物中的絕大多數種類不能有效地利用與肌醇六磷酸相關的礦物質。因此，例如，在單胃動物的畜牧生產中(如豬、鳥和魚)，通常用礦物質和/或用抗生素物質來補充飼料，這改變了消費生物的消化菌落環境，從而提高了生長率。
正如這樣，有許多有問題-與營養有關的、來自離體的加工步驟、健康和醫藥、環境保護，以及資源管理-在許多應用中它們與肌醇六磷酸的不充分水解有關。下面是這些問題的非限定性實例1)用無機礦物質進行膳食補充的成本太高。
2)在許多離體應用中，未水解的肌醇六磷酸鹽的存在是不受歡迎且是成問題的(如通過引起不必要的淤渣的存在)。
3)通過增加耐抗生素的病原體的數量，用抗生素進行膳食補充對人類和動物構成了醫學威脅。
4)未吸收的糞便礦物質排放到環境中打破且損害了周圍土壤、魚類養殖水域和水域表層的整個生態系統。
5)許多潛在食品中有價值的營養供給仍然顯著地保持在未使用狀態，從而被浪費。
許多潛在的營養植物，尤其包括它們的種子，含有可觀數量的營養素，如磷酸，它們以某種方式與肌醇六磷酸相締合，即這些營養素在消費時不能被自由地利用。這些營養素的不可利用性被一些生物克服，包括牛和其它反芻動物，它們有足夠的消化能力-主要由于它們消化管道中共生的生命形式的存在-來水解肌醇六磷酸并釋放締合的營養素。然而，飼養動物中的絕多種種類，包括豬、魚、雞、火雞以及其它非反芻動物生物包括人類，在攝取后不能有效地釋放這些營養素。
因此，含肌醇六磷酸的食品需要用外源營養素和/或用肌醇六磷酸酶活性源進行補充，以便改進它們被多種生物消費時其營養素供給的欠缺。
仍然在另一方面，未水解的肌醇六磷酸的存在導致了離體加工中成問題的后果，包括但不限于，食品的加工。正如EP0321004-B1(Vaara等人)中所描述的，在僅僅一個例證中，在玉米和高粱核的加工中有一個步驟，即通過將硬核浸泡在水中來將其軟化。在該過程中濾出的水溶性物質成為玉米浸漬液的一部分，該浸漬液通過蒸發被濃縮。玉米浸漬液中未水解的肌醇六磷酸，主要是鈣鹽和鎂鹽的形式，結合有磷，并且與蛋白質和金屬離子一起沉淀出不期望的淤渣。該淤渣在玉米浸漬液的蒸發、運輸和儲存中是成問題的。因此，即將公開的肌醇六磷酸酶分子-或者單獨或者組合其它反應物(包括但不限于酶，包括蛋白酶)-不僅在本申請中有用(如用于防止不受歡迎的淤渣)而且在其它期望肌醇六磷酸水解的應用中有用。
用抗生素物質進行膳食補充在家畜生產中有許多有益的效果。例如，除了作為預防手段來驅除疾病，使用外源抗生素已經表現出使生長率增加了3～5％以上。該作用的機制也涉及-部分地-飼養動物的消化菌落環境的改變，這導致了對營養素吸收來說更理想的微菌群平衡。
然而，與過度使用抗生素有關的重大負作用是產生致病的抗生素抗性的微生物菌株庫的危險。這個危險是很危急的，人類體中耐藥病原體的出現已經與家畜中抗生素的使用聯系在一起。例如，用于動物飼料的抗生素阿沃菌素，于1997年在許多地方已經被禁止，現在動物被喂養另一種抗生素維及尼霉素，該抗生素與新藥Synercid非常類似，Synercid被用來替代用于人類的萬古霉素。然而，研究已經表明飼養動物中的一些腸道球菌對Synercid有抵抗力。因此，不管何種新抗生素被用作飼養動物的毯式預防法，不期望的耐藥性后果，如那些已經在使用阿沃菌素和萬古霉素中發現的后果可能重新出現。因此，研究者呼吁對在該行業中的藥物使用進行更嚴厲的控制。
用即將公開的肌醇六磷酸酶分子進行補充的食品飼養的動物中所達到的增長率的提高可以與-如果不是超過的話-那些用抗生素如阿沃菌素所達到的增長率相比。因此，即將公開的肌醇六磷酸酶分子-或者單獨或者組合其它反應物(包括但不限于酶，包括蛋白酶)-不僅在本申請中有用(如用于提高飼養動物的增長率)而且在其它期望肌醇六磷酸水解的應用中有用。
環境后果是，任何缺乏肌醇六磷酸酶的生物種類消費含肌醇六磷酸的食品-不管這些食品是否用礦物質進行過補充-導致由未吸收的礦物質的排泄所產生的糞便污染。該污染不僅對直接的生活環境有負面影響，因此也對周圍水域有負面影響。環境變化主要發生在食物鏈的下游，因此有潛力向生態系統的上游滲入，并滲透整個生態系統，以達到永久且災難性的破壞-尤其在持續污染數年后。這個問題有潛力在任何發生濃縮肌醇六磷酸加工的地方證明自己-包括在體內(如通過家畜生產區、動物園、野生生物保留地等地方的動物)和體外(商業玉米濕磨法、谷類浸泡加工等)加工步驟中。
使用外源加入的肌醇六磷酸酶分子的決定-不管是完全取代還是加強外源使用的礦物質和/或抗生素的用途-基本上需要通過那些生計依賴于相關應用如家畜生產的用戶的財務可行性和成本效率的檢驗。
因此，存在對于這樣的方法的需求，即在各種應用中能達到肌醇六磷酸的高效且成本有效的水解的方法。尤其是，存在對于在商業應用上能最優化肌醇六磷酸水解的方法的需求。在一個特定方面，存在這樣一個需求，即最優化改善用于人類和飼養動物消費的含肌醇六磷酸食品的營養供給的商業處理方法。
先前已有關于重組肌醇六磷酸酶的報導，但其較差的活性遠不如本發明新發現的肌醇六磷酸酶分子的活性。因此，即將公開的肌醇六磷酸酶分子被認為可以提供比先前鑒定的肌醇六磷酸酶分子如真菌起源的肌醇六磷酸酶分子具有顯著出色的商業性能。
肌醇六磷酸作為實際上所有植物種子中存儲的磷的來源而出現(Graf(Ed.)，1986)。肌醇六磷酸構成谷物和豆類種子的一個正常部分。它的功能是結合新植物在其種子發芽時所必要的營養礦物質。當肌醇六磷酸的磷酸基團被種子酶肌醇六磷酸酶去除時，肌醇六磷酸結合金屬離子的能力就會喪失，而且礦物質對植物變得可以利用。在家畜飼料谷物中，被肌醇六磷酸結合的微量礦物質對缺乏肌醇六磷酸酶活性的單胃動物來說在很大程度上是吸收不到的。
盡管一些肌醇六磷酸的水解發生在結腸中，但大部分肌醇六磷酸通過單胃動物的胃腸道，并且以排泄物被排泄出，從而在高密度家畜生產區造成了糞便磷污染問題。釋放到結腸中的無機磷對家畜來說具有可以感知的營養價值的減少，這是因為無機磷主要在小腸中被吸收-如果不是全部的話。因此，肌醇六磷酸中在營養上很重要的膳食礦物質的可以感知的量對單胃動物來說是很難利用的。
總而言之，與肌醇六磷酸相關的營養素不僅包括與肌醇六磷酸共價連接的磷酸，而且包括同樣被肌醇六磷酸螯合的其它礦物質。而且，一旦攝入，未水解的肌醇六磷酸可能進一步與其它礦物質相遇，并且與其締合。礦物質的螯合會抑制酶的活性，這些礦物質是酶的輔因子。
可以用廣泛稱作肌醇六磷酸酶的微生物酶來催化肌醇六磷酸到肌醇和無機磷的轉化。肌醇六磷酸酶如肌醇六磷酸酶#EC3.1.3.8可以催化肌醇六磷酸到D-肌醇1，2，4，5，6-五磷酸和正磷酸的水解。據報導，某些真菌肌醇六磷酸酶可以將肌醇五磷酸水解到四磷酸、三磷酸和更低磷酸。例如A.ficuum肌醇六磷酸酶據報導可以產生肌醇二磷酸和肌醇單磷酸的混合物(Ullah，1988)。產生肌醇六磷酸酶的微生物包括細菌如枯草芽孢桿菌(Powar和Jagannathan，1982)和假單胞桿菌屬(Cosgrove，1970)；酵母如sacchoromyces cerevisiae(Nayini和Markakis，1984)；真菌如曲霉菌terreus(Yamada等人，1968)。
酸性磷酸酶是催化水解多種磷酸酯的酶，通常表現出最適pH低于6.0(Igarashi& Hollander，1968)。例如#EC 3.1.3.2酶催化正磷酸單酯到正磷酸產物的水解。據報導，一種酸性磷酸酶從A.ficuum純化而來。酸性磷酸酶的去糖基化形式的表觀分子量為32.6kDa(Ullah等人，1987)。
肌醇六磷酸酶和低專一性酸性磷酸酶是真菌曲霉菌ficuum作為胞外酶產生的(Shieh等人，1969)。Ullah報導從野生型A.ficuum純化了肌醇六磷酸酶，其表觀分子量為61.7kDA(SDS-PAGE；被校正為糖基化)。最適pH為2.5和5.5；Km為大約40μm；專一性活性為大約50U/mg(Ullah，1988)。PCT專利申請WO 91/05053也報導公開了從曲霉菌ficuum分離且分子克隆肌醇六磷酸酶，其最適pH為2.5和5.5，Km為大約250μm，專一性活性為大約100U/mg蛋白質。
概括來說，所引用這些先前報導的微生物酶的專一性活性大約在50～100U/mg蛋白質之間。相反，在本發明中公開的肌醇六磷酸酶活性被測量為大約4400U/mg。這相當于活性提高了大約40倍或更高。
使用能產生作為單胃動物飼料添加劑的肌醇六磷酸酶的微生物的可能性在以前已經有所報導(USPN 3,297,548，Shieh和Ware；Nelson等人，1971)。該方法的成本效益是該商業應用和其它商業應用的主要限制。因此改進的肌醇六磷酸酶分子是高度期望的。
據報導，微生物肌醇六磷酸酶也可以用某些工業方法如小麥和玉米廢品來生產動物飼料。一方面，玉米的濕磨法加工產生了作為動物飼料出售的麩質。據報導，肌醇六磷酸酶的加入可以提高飼料產品的營養價值。例如，真菌肌醇六磷酸酶的使用及其加工條件(溫度為50℃，pH為5.5)以前在(如EP 0 321 004)中已經有所報導。簡單來說，在使用傳統浸泡法來加工大豆粗粉中，即不添加外源肌醇六磷酸酶的方法，未水解的肌醇六磷酸的存在使粗粉和廢料不適合用于飼養魚類、家禽和其它非反芻動物以及用乳汁喂養的小牛所用的飼料。據報導，肌醇六磷酸可以提高該高蛋白大豆物質的營養素和商業價值(參考Finase Enzymes byAlko，Rajamaki，Finland)。真菌肌醇六磷酸酶和最適pH為2.5的酸性磷酸酶形式A.niger的聯合已經被Alko，Ltd在它們的肌醇六磷酸降解產品Finas F和Finase S中用來對動物飼料進行補充。然而，該方法的成本效益仍然是更大范圍使用的一個主要限制。因此，一種成本低廉的肌醇六磷酸酶的來源將大大地提高作為動物飼料的大豆粗粉的價值(Shieh等人，1969)。
為了解決所公開的問題，用外源肌醇六磷酸酶對食品進行處理已經被提了出來，但該方法不是完全最優化的，尤其考慮到可行性和成本效益。該最優化需要考慮大范圍應用的存在，尤其在大規模生產中。例如，大范圍食品及其制備方法，以及接受這種食品的生物種類。
在一個特定例證中，已經意識到魚類顆粒飼料的制造需要將成分暴露在高溫和/或高壓下，以便產生遇到水時不會過早地溶解和/或降解(例如在消費之前)的顆粒。因此該制造方法所期望的是獲得在高溫和/或高壓條件下穩定的添加酶。因此，可以理解不同的肌醇六磷酸酶對于不同的應用可以是分別優選或最優化。
而且也已經公認，使酶過程最優化的主要方式是通過修飾和提高關鍵催化酶。例如，可以形成包括表達肌醇六磷酸酶分子的表達系統的轉基因植物。可以理解，通過試圖提高與所表達的分子活性不直接相關的因素，如表達水平，最大限度地獲得的最優化水平僅僅是有限且潛在不足的。因此，也存在獲得具有改進特性的分子的需求。
實現分子特性改進的特定方式是通過一種叫做定向進化的技術方法，包括Diversa Corporation的專利方法，在該公司的方法中術語DirectEvolution已經被杜撰出來且注冊。這些方法在Diversa的共有專利(美國專利5,830,696)以及在幾個共同待審批的專利申請中進一步做了詳細描述。簡單來說，DirectEvolution包括a)對一種或多種分子模板進行誘變以產生新分子，和b)在這些新分子的子代種類中選擇具有更需要特性的新分子。
然而，定向進化的力量依賴于原始模板的起始選擇，以及所選的誘變方法和所用的篩選方法。例如，在隨機選擇的分子模板和/或具有過度的次適合性能的起始分子模板上產生和評價全長誘變變換的方法常常是大得令人生畏的工作。使用這些模板最多提供一個曲折的次適合路徑，其被充分改進的子代分子產生的潛在前景非常差。另外，應該意識到我們目前關于嚴格地預測有益修飾的能力的知識體系非常局限。
因此，期望有一種發現和使用在自然界中具有預進化特性-優選預進化酶優點的分子的方法。因此在即將公開的內容中可以看到自然界提供了(通過有時被稱為“自然進化”的過程)可以直接在商業應用中使用的分子，或也就是說，可以被用于定向進化，從而實現更大改進的性質。
總而言之，存在對于新的、高活性的、有生理效應的且經濟的肌醇六磷酸酶活性來源的需求。更明確地說，存在發現新肌醇六磷酸酶的需求，該肌醇六磷酸a)在一種或多種特定應用中具有優異的活性，從而可以使這些特定應用最優化；b)可以用作定向進化的模板，從而得到更進一步改進的新分子；和c)可以用作通過某種方法如基于雜交的方法來鑒定其它相關分子的工具。本發明以新方式滿足這些需求。
發明概述本發明提供了一種多核苷酸和由其編碼的已經被鑒定為具有肌醇六磷酸酶活性的肌醇六磷酸酶和多肽。本發明的一個方面提供了一種新重組酶，及其活性片斷、類似物和衍生物。
更明確地說，本發明涉及細菌起源的重組肌醇六磷酸酶分子的用途，它們可以提高含肌醇六磷酸酶的食品的營養價值。以前的出版物已經公開了真菌肌醇六磷酸酶的用途，但用于該目的的細菌肌醇六磷酸酶的用途還是新穎的。
仍然更明確地說，本發明涉及新近鑒定的大腸桿菌(E.coli)起源的重組肌醇六磷酸酶分子的用途，它們可以提高含肌醇六磷酸的食品的營養價值。
該用途包括使用新近鑒定的分子水解食品中的肌醇六磷酸。水解可以發生在肌醇六磷酸攝入之前或攝入之后，或在攝入之前和之后都發生。該應用尤其關于，但不限于，非反芻生物，其包括所公開的新肌醇六磷酸酶分子在轉化宿主中的表達，所公開的新肌醇六磷酸酶分子與食品和其它物質中的肌醇六磷酸的接觸，以及用所公開的新肌醇六磷酸酶分子處理動物消化系統。
另外，水解可以獨立于消費發生，例如在體外應用中，如在反應容器中。因此，含肌醇六磷酸物質的處理包括大范圍物質的處理，包括那些不被意指食品的物質，如排泄物(或糞便)物質的處理。
本發明的優選分子包括從大腸桿菌(Escherichia coli)B分離出來的重組肌醇六磷酸酶，它與先前鑒定的真菌肌醇六磷酸酶相比可以提高肌醇六磷酸和肌醇六磷酸鹽中磷的釋放效率。
在本發明的一個方面，提供了一種可以加入食品中的肌醇六磷酸酶。更明確地說，提供了一種可以提高含肌醇六磷酸的食品的營養價值的肌醇六磷酸酶。仍然更明確地說，提供了這樣一種肌醇六磷酸酶，即當用于含肌醇六磷酸的食品時，可以提高消費它的生物的生長性能。理論上來說，肌醇六磷酸酶活性發揮作用的有益機理包括可感知的肌醇六磷酸的水解，即使如果不是充分的。有益的作用可以發生在含肌醇六磷酸食品的攝入之前，或可選擇地在攝入之后，或可選擇地在攝入之前和之后。在攝入后有益作用發生的情況中，本發明的一個目的是提供一種被非反芻生物消費時保持具有活性的肌醇六磷酸酶。
本發明的另一個方面是提供編碼本發明所述酶的分離核酸分子-包括mRNA、DNA、cDNA、基因組DNA，以及這些酶的活性衍生物、類似物和片斷。
仍然在本發明進一步的一個方面，提供了一種用重組技術產生此多肽的方法，該方法包括在促進所述酶的表達和所述酶的后續回收的條件下培養含有編碼本發明所述酶的核酸序列的重組原核和/或真核宿主細胞。
仍然在本發明進一步的一個方面，提供了一種在轉基因植物和植物器官中表達該酶，或編碼該酶的多核苷酸的方法，及產生這些植物的方法。這是通過將包括編碼該肌醇六磷酸酶的核酸序列的表達構建體引入植物中而實現的。
仍然在本發明進一步的一個方面，提供了一種用于商業工藝的使用這些酶、或編碼這些酶的多核苷酸的方法，例如從植物物質的肌醇六磷酸釋放礦物質的方法，或者在體外，即在飼料處理方法中，或在體內，即通過將酶施用于動物。
仍然在本發明進一步的一個方面，提供了用所公開的飼料處理方法生產的食品。
仍然在本發明進一步的一個方面，提供了用于與研究、發現及開發有關的體外目的而使用這些酶、或編碼這些酶的多核苷酸的方法。在一個非限定性例證中，這些方法包括用于從其它生物識別和分離編碼相似酶的相似序列的探針的產生。
在一個特殊的非限定性例證中，也提供了產生包括與本發明的核酸序列專一性雜交的足夠長度的核酸分子的核酸探針的方法。作為優選例證，這些探針的基于雜交的用途包括，但絕不限于，PCR、Northern和Southern雜交、RNA保護分析和原位雜交。即將公開的分子以非限定性方式進一步包括診斷應用。
根據非限定性例證，這些方法包括所公開分子的抗體的產生，及這些抗體的用途，例如，包括用于從其它生物的酶中識別且分離類似序列。在另一個非限定性例證中，這些方法包括將這些酶用作定向進化的模板，包括通過產生新分子，隨后基于篩選的方法來發現特性改進的子代分子。
也提供了轉基因非人類生物，其基因組包括一個編碼具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的異源核酸序列，其中所述轉基因導致肌醇六磷酸酶多肽的表達。
本發明也提供了編碼肌醇六磷酸酶的多核苷酸，該多核苷酸包括一個與SEQID NO7基本一樣的核苷酸序列，一個選自核苷酸390為G；391為A；核苷酸438為T；439為G；440為G；471為C；473為T；477為T；448為G；449為T；690為G；691為A；692為G；729為T；730為A；731為T；864為T；865為G；1017為G或其任意組合的修飾核苷酸序列。進一步，本發明提供了一種多核苷酸，其包括一個與SEQ ID NO7基本一樣的核苷酸序列，包括一個選自核苷酸390為G和391為A；核苷酸438為T、439為G和440為G；471為C和473為T；477為T、448為G和449為T；690為G、691為A和692為G；729為T、730為A和731為T；864為T和865為G；1017為G或其任意組合的修飾核苷酸序列。后述序列的例證是SEQ ID NO9，相應氨基酸序列是SEQ ID NO10。
根據下面的教導，本發明的這些和其它方面應該對本領域的普通技術人員是顯而易見的。
附圖描述下述附圖是對本發明實施方案的說明，并不意味著限定如權利要求所包括的發明范圍。


圖1給出了本發明的酶的核苷酸和所推斷的氨基酸序列。測序是用378自動DNA測序儀進行的(Applied Biosystems，Inc.)。
圖2給出了pH值和溫度圖，以及本發明的肌醇六磷酸酶的穩定性數據。用于這些分析的試驗是下述對肌醇六磷酸酶活性檢測通過用600μl的溶解在pH為7.5的100mM Tris HCl緩沖液中的2mM肌醇六磷酸鈉溫育150μl的酶制劑，然后在37℃用1mM CaCl2補充30分鐘，對肌醇六磷酸酶活性進行測定。溫育后，加入750μl的5％的三氯乙酸終止反應。在加入1500μl的顯色試劑(溶解在5.5％硫酸中的4體積1.5％的鉬酸銨，和1體積2.7％的硫酸亞鐵；Shimizu，1992)后，根據磷標準分光光度法在700nm測量所釋放的磷酸鹽。700nm時的OD在圖2的Y軸上表示。溫度或pH值在圖中的X軸上表示。
圖3給出了SEQ ID NO8和SEQ ID NO10(修飾的肌醇六磷酸酶)之間的耐熱性分析結果。
圖4給出了在模擬的消化性條件下的肌醇六磷酸酶的穩定性。
圖5給出了在各種宿主細胞中野生型和修飾的肌醇六磷酸酶(SEQ ID NO10)的表達。
圖6給出了在含有胃蛋白酶的SGF中的殘余的肌醇六磷酸酶活性。
圖7給出了大腸桿菌appA肌醇六磷酸酶(SEQ ID NO7)的核苷酸序列。
圖8給出了大腸桿菌appA肌醇六磷酸酶(SEQ ID NO8)和修飾肌醇六磷酸酶(SEQ ID NO10)的氨基酸序列。
發明詳述本發明提供了一種熱穩定的肌醇六磷酸酶，所述肌醇六磷酸酶具有修飾的多核苷酸和多肽序列，其修飾方式是提供一種與其它肌醇六磷酸酶相比具有熱穩定性增加的肌醇六磷酸酶。例如，這種新肌醇六磷酸酶在S.pombe或P.pastoris中的表達導致了表現出額外耐熱性的糖基化變體的產生。
本發明提供了圖1所示的純化的重組肌醇六磷酸酶。另外，本發明提供了編碼具有圖1所示的推斷氨基酸序列的成熟酶的分離核酸分子(多核苷酸)。本發明也提供了如圖8和SEQ ID NO9和10所示的修飾肌醇六磷酸酶序列。
由于其結構，本發明的肌醇六磷酸酶分子是新穎的。另外，由于活性，該肌醇六磷酸酶分子在專利性上也是新穎的。例如，使用一種分析方法(如FoodChemicals Codex，4thEd.中描述的)，與真菌(曲霉屬)肌醇六磷酸酶對照組相比，該肌醇六磷酸酶的活性被證明是非常優越的。尤其是，多種實驗表明大腸桿菌肌醇六磷酸酶的活性為大約4400單位/mg，曲霉屬肌醇六磷酸酶的活性為大約105單位/mg。這相當于活性差異超過了40倍。為了更容易地理解此處提供的實施例，下邊將描述一些頻繁出現的方法和/或術語。
在此所用，術語“抗體”指完整的免疫球蛋白分子，以及免疫球蛋白分子的片斷，如Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv和SCA片斷，它們可以與肌醇六磷酸酶多肽的表位結合。可以用本領域已知的方法(例如，參見，Harlow和Lane，見上)來制備這些抗體片斷，它們保留了一些與其所來源的抗體的抗原(如肌醇六磷酸酶抗原)選擇性結合的能力，并且下面對這些片斷做了進一步描述。
(1)Fab片斷包括抗體分子的單價抗原結合片斷，可以通過用木瓜蛋白酶來消化整個抗體分子而產生，從而產生包括一個完整的輕鏈和一個重鏈的一部分的片斷。
(2)抗體分子的Fab’片斷可以通過先用胃蛋白酶處理整個抗體分子，然后還原而獲得，從而產生包括一個完整的輕鏈和一個重鏈的一部分的分子。用這種方式處理的每個抗體分子可以得到兩個Fab’片斷。
(3)抗體分子的(Fab’)2片斷可以通過用胃蛋白酶處理整個抗體分子而獲得，不需要進行隨后的還原過程。(Fab’)2片斷是用兩個二硫化物鍵將兩個Fab’片斷結合在一起的二聚體。
(4)Fv片斷被定義為以兩個鏈進行表達的進行了遺傳工程的片斷，包括一個輕鏈的可變區和一個重鏈的可變區。
(5)單鏈抗體(“SCA”)是進行了遺傳工程的單鏈分子，包括用一個合適的柔性多肽接頭連接在一起的一個輕鏈的可變區和一個重鏈的可變區。
術語“降解有效”量是指與不接觸酶的肌醇六磷酸相比，降解至少50％的肌醇六磷酸所需酶的數量，優選地，降解至少80％的肌醇六磷酸。
DNA的“消化”指用僅在DNA中的特定序列處發揮作用的限制性內切酶進行的DNA催化裂解。此處所用的各種限制性內切酶可以通過商業通路獲得，并且正如普通技術人員所知的那樣使用反應條件、輔助因子和其它要求。為了分析目的，通常在大約20μl的緩沖液中用大約2單位的酶來消化1μg質粒或DNA片斷。為了分離用于質粒構建的DNA片斷的目的，通常在一個較大的體積中用20～250單位的酶來消化5～50μg的DNA。用于特定限制性內切酶的緩沖液和底物的適當用量由制造商指定。在37℃，通常所用的溫育時間為大約1小時，但可以按照供應商的說明書變化。在消化后，可以將反應物直接在凝膠上進行電泳以分離期望片斷。
正如在本發明中所用，術語“表位”指抗原上的抗原決定簇，如肌醇六磷酸酶多肽，抗體的抗原互補位與其相結合，如肌醇六磷酸專一性抗體。抗原決定簇通常由分子中的化學活性的表面基團組成，如氨基酸或糖側鏈，并且可以具有特異的三維結構特征，以及特殊電荷特征。
當指圖1所述酶時，術語“片斷”、“衍生物”和“類似物”包括一種保持了至少一種生物功能或活性的酶，且該生物功能或活性至少與參考酶的基本上相同。而且，術語“片斷”、“衍生物”或者“類似物”以“前形式”分子為例證，如低活性前蛋白質，它們可以通過裂解修飾而產生具有顯著較高活性的成熟酶。
術語“基因”指與產生多肽鏈有關的DNA片斷；它包括編碼區之前和之后的區域(前導區和非轉錄尾區)，以及單個編碼片斷(外顯子)之間的間插序列(內含子)。
術語“分離的”指從原始環境(例如，如果是自然發生的話，即自然環境)分離出來的物質。例如，在活的動物體中存在的自然發生的多核苷酸或酶不是分離的，但從一些或所有自然系統中的共存物質中分離出來的該相同的多核苷酸或酶是分離的。這樣的多核苷酸可以是載體的一部分和/或這樣的多核苷酸或酶可以是組合物的一部分，它們仍然是分離的原因在于這些載體或組合物不是其自然環境的一部分。
“分離的核酸”指核酸，例如DNA或RNA分子，其不與5’和3’側翼序列直接鄰接，但當存在于其來源生物的自然發生的基因組中時，通常與5’和3’側翼序列直接鄰接。例如，該術語從而描述了一種整合進載體的核酸，如質粒或病毒載體；一種整合進異種細胞(或同種細胞的基因組，但在不同于其自然發生位點的位點)的基因組的核酸；一種以分離分子存在的核酸，如通過PCR擴增或限制性酶消化而產生的DNA片斷，或通過體外轉錄產生的RNA分子。該術語也描述了一種重組核酸，其構成編碼其它多肽序列的雜交基因的一部分，例如它可以在融合蛋白的產生中使用。
“連接反應”指在兩個雙鏈核酸片斷之間形成磷酸二酯鍵的方法(Sambrook等人，1989)。除非另外的情況下，連接反應可以使用已知的緩沖液和條件實現，每0.5μg被連接的大約等摩爾的DNA片斷使用10單位的T4 DNA連接酶(“連接酶”)。
正如此處所用，“核酸分子”包括至少一個核苷酸堿基或一個核苷酸堿基對，這分別依賴于核酸分子是單鏈還是雙鏈。而且，核酸分子排他地或嵌合性地屬于任何含核苷酸分子的組中，正如下述舉例說明的核酸分子組，但不限于RNA、DNA、基因組核酸、非基因組核酸、自然存在和非自然存在的核酸，以及合成核酸。這包括，以非限定性實例的方式，與任何細胞器官結合的核酸，如線粒體，核糖體RNA，以及嵌合性地包括一個或多個組分，它們與自然存在的組分不是自然地一起存在。
另外，“核酸分子”可以部分地包括一個或多個不基于核苷酸的組分，如舉例說明，但不限于，氨基酸和糖。因此，作為例子，但不是限制性的，部分基于核苷酸和部分基于蛋白質的核酶被認為是“核酸分子”。
另外，作為例子，但不是限制性的，用可檢測的部分標記的核酸分子，如放射性或也可以是非放射性標記，被同樣地認為是“核酸分子”。
術語“編碼特定酶的核酸序列”或“特定酶的DNA編碼序列”或“編碼特定酶的核苷酸序列”-以及其它同義術語-指當處于適當調節序列的控制下時，被轉錄及翻譯為酶的DNA序列。“啟動子序列”是一個能在細胞中結合RNA聚合酶且發動下游(3’方向)編碼序列轉錄的DNA調節區。啟動子是DNA序列的一部分。該序列區在其3’末端有一個起始密碼子。啟動子序列最小數量的堿基，其中包括在高于背景結合的可檢測水平啟動轉錄所需要的元件。然而，在RNA聚合酶結合到該序列上且轉錄在起始密碼子(具有啟動子的3’末端)被發動后，轉錄在3’方向朝下游進行。在啟動子序列內將發現負責RNA聚合酶結合的轉錄起始位點(便利地通過用核酸酶S1作圖來確定)以及蛋白質結合區域(共有序列)。
術語“編碼酶(蛋白質)的核酸”或“編碼酶(蛋白質)的DNA”或“編碼酶(蛋白質)的多核苷酸”及其它同義術語包括一個僅包括編碼酶序列的多核苷酸和一個包括額外的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
在一個優選實施方案中，“特定核酸分子種類”是通過其化學結構定義的，作為舉例說明，但不限于，其一級序列。在另一個優選實施方案中，特定“核酸分子種類”是通過核酸種類的功能或通過來源于核酸種類的產物的功能而定義的。因此，作為非限定性實例，“特定核酸分子種類”可以通過可歸因于它的一個或多個活性或特性來定義，包括可歸因于其表達產物的活性或特性。
該定義“將工作核酸樣品裝配進核酸文庫”包括將核酸樣品整合進基于載體的集體中的方法，如通過連接進載體及轉化宿主。下文提供了對有關載體、宿主和其它試劑及其特定的非限定性實例的描述。該描述“將工作核酸樣品裝配進核酸文庫”也包括將核酸樣品整合進不基于載體的集體中的方法，如通過與接頭的連接。優選地接頭可以與PCR引物退火，以便有助于PCR擴增。
因此，在一個非限定性實施方案中，“核酸文庫”包括一個或多個核酸分子的基于載體的集體。在另一個優選實施方案中，“核酸文庫”包括核酸分子的不基于載體的集體。仍然在另一個優選實施方案中，“核酸文庫”包括部分基于載體和部分不基于載體的核酸分子的聯合集體。優選地，包括文庫的分子集體可以根據單一的核酸分子種類進行查找和分離。
本發明提供了“核酸構建體”或也可以是“核苷酸構建體”或也可以是“DNA構建體”。此處用術語“構建體”來描述分子，如多核苷酸(如肌醇六磷酸酶多核苷酸)可以任選地與一個或多個其它分子部分化學結合，如載體或載體的一部分。在一個特定的-但決不是限定性的-方面，核苷酸構建體的例證是適合于宿主細胞轉化的DNA表達構建體。
“寡核苷酸”指可以化學合成的單鏈多脫氧核苷酸或者兩個互補的多脫氧核苷酸鏈。這樣的合成寡核苷酸可以含有或可以不含5’磷酸。那些不含5’磷酸的合成寡核苷酸將不與另一個寡核苷酸連接，在存在激酶的情況下不需要用ATP添加磷酸。一個合成寡核苷酸將與未被脫去磷酸的片斷連接。
當RNA聚合酶將兩個編碼序列轉錄為一個單一mRNA時，一個編碼序列被“可操作地連接到”另一個編碼序列上，然后這兩個編碼序列被翻譯為一個單一多肽，其含有來自兩個編碼序列的氨基酸。編碼序列不需要彼此鄰接，只要表達序列被最終加工可以產生期望蛋白質。
術語“肌醇六磷酸酶專一性探針”，在本發明所述方法的上下文中，是指與編碼肌醇六磷酸酶多肽的核酸結合，或與其互補序列結合的探針，相比于編碼其它酶的核酸，或其互補序列，其具有的可檢測程度更大。
嚴格意義上來說，術語“肌醇六磷酸酯”、“肌醇六磷酸”和“肌醇六磷酸鈣鎂”可以如下進行區分“肌醇六磷酸鹽”指肌醇六磷酸的陰離子形式；“肌醇六磷酸”指肌醇六磷酸，一種在植物中自然存在的化合物，尤其包括植物葉子，并且它可以作為酶肌醇六磷酸酶的模板；“肌醇六磷酸鈣鎂”指一種肌醇六磷酸鹽，如肌醇六磷酸的鈣鎂鹽。因此，可以理解到，“肌醇六磷酸酯(phytate)”、“肌醇六磷酸(phytic acid)”和“肌醇六磷酸鈣鎂(phytin)”是化學相關的，并且具有共用化學結構的可互相轉化的形式。因此，在此所用，既然它們是高度相關、相似、化學可轉化的，那么“肌醇六磷酸酯”、“肌醇六磷酸”和“肌醇六磷酸鈣鎂”是可互換的術語，而且它們全部(或者具有或者不具有所述化學互變)可以用即將公開的新肌醇六磷酸酶來消化。因此，“肌醇六磷酸酯”、“肌醇六磷酸”和“肌醇六磷酸鈣鎂”中僅一個術語被用于此處公開的方法的描述中，可以理解到，它可以作為進一步指包括“肌醇六磷酸酯”、“肌醇六磷酸”和“肌醇六磷酸鈣鎂”的酶肌醇六磷酸酶的任何底物的代表性術語。
“多核苷酸”是包括2個或更多個核苷酸堿基或核苷酸堿基對的分子。
具有“前形式(pre-form)”或“原形式(pro-form)”的分子指經歷一個或多個共價和非共價化學修飾(如糖基化、蛋白酶剪切、二聚或寡聚作用、溫度誘導或pH誘導構象變化、與輔因子的締合等等)的任何組合的分子，在此過程中以得到一個與參考原形式分子相比，在特性上有差異(如活性增加)的更成熟的分子形式。當以“前形式”或“原形式”的前體分子能夠經歷兩個或多個化學修飾(如兩個蛋白酶剪切，或者一個蛋白酶剪切和一個糖基化變化)，在此過程以產生一個成熟分子，術語“前-原-形式”也可以用于參考前體分子。因此，前-原-酶是一種“前-原-形式”的酶。同樣地，前-原激素是一種“前-原-形式”的激素。
在此所用，術語“試劑”包括本發明的肌醇六磷酸酶分子。優選地，這樣的肌醇六磷酸酶分子催化肌醇六磷酸到肌醇和自由磷酸的水解，以便從肌醇六磷酸復合物中釋放礦物質。代表性肌醇六磷酸酶分子是來自大腸桿菌B的肌醇六磷酸酶。這種代表性酶如圖1的SEQ ID NO2中所示。因此，正如此處所用，術語“試劑”包括本發明的底物試劑分子，如肌醇六磷酸分子。優選地，這樣的肌醇六磷酸分子存在于食品、潛在食品、食品的副產物(體外副產物和體內副產物中，如體內反應產物和動物排泄物產物)、食品的前體，以及其它肌醇六磷酸來源中。
“重組”酶指通過重組DNA技術產生的酶，即用編碼期望酶的外源DNA構建體所轉化的細胞產生的酶。“合成”酶是通過化學合成制備的酶。
正如本領域所已知的，兩種酶之間的“相似性”是通過將一個酶的氨基酸序列及其保守氨基酸取代物與第二個酶的序列相比較來確定的。相似性可以通過本領域熟知的方法來確定，例如，BLAST程序(Basic Local Alignment Search Tool atthe National Center for Biological Information)。
如果比其它的非專一性分子具有更大的親和力而發生彼此結合，那么一對分子的成員(如抗體-抗原對或核酸對)被認為是彼此“專一性地結合”的。例如，由一種抗原所制備的抗體，相對于非專一性蛋白質，該抗原的結合性能更有效，那么該抗體可以被描述為專一性地與該抗原結合。(同樣地，如果核酸探針通過堿基對相互作用與靶物質形成專一性復合，那么它可以被描述為專一性地與核酸靶物質結合(參考上邊)。)“嚴格的雜交條件”指只有在序列之間有至少90％的同一性，優選至少95％，最優選至少97％時才發生的雜交。參考Sambrook等人，1989，將其完整引用于此作為參考。
本發明中也包括具有與肌醇六磷酸酶多肽的序列“基本一樣的”序列的多肽，如SEQ ID NO1之一。“基本一樣的”氨基酸序列是只在保守的氨基酸取代上不同于一個參考序列或多個序列的序列，例如，一個氨基酸取代同一類別的另一個氨基酸(如一個疏水氨基酸，如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，取代另一個；或一個極性氨基酸取代另一個，如精氨酸取代賴氨酸，谷氨酸取代天門冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬酰胺)。
而且，“基本一樣的”氨基酸序列是不同于一個參考序列或多個序列的氨基酸序列，或通過一個或多個非保守取代、缺失或插入不同的氨基酸序列，尤其當這樣的取代發生在該分子中的不是活性位點的位點，只要該多肽基本上保持了其行為特性。例如，肌醇六磷酸酶多肽可以缺失一個或多個氨基酸，這導致了多肽結構的修飾，而不顯著地改變其生物活性。例如，可以除去肌醇六磷酸酶生物活性不需要的氨基或羧基末端的氨基酸。這樣的修飾導致較小的活性肌醇六磷酸酶多肽的開發。
本發明提供了一種“基本上純化的酶”。術語“基本上純化的酶”在此處用來描述分子，如基本上不含其它蛋白質、脂類、碳水化合物、核酸及其它與其自然締合的生物物質的多肽(如肌醇六磷酸酶多肽或其片斷)。例如，基本上純化的分子，如多肽，以干重而言，可以是至少60％的相關分子。多肽的純度可以用標準方法來確定，如聚丙烯酰胺凝膠電泳(如SDS-PAGE)、柱層析法(如高效液相層析法(HPLC))和氨基末端氨基酸序列分析。
本發明提供了催化肌醇六磷酸到肌醇和自由磷酸的水解的純化的重組酶，以便從肌醇六磷酸復合物釋放礦物質。代表性純化酶是來自大腸桿菌B的肌醇六磷酸酶。該代表性酶如圖1的SEQ ID NO2所示。
本發明的酶包括，除了圖1的酶(尤其是成熟酶)以外，具有與肌醇六磷酸酶多肽的序列“基本一樣的”序列的多肽，如SEQ ID1之一。
在一個實施方案中，本發明的SEQ ID NO2的肌醇六磷酸酶的分子量為47,056千道爾頓，是用SDS-PAGE測量的，并從該基因的核苷酸序列推理而來。其pI是6.70。該酶的pH值和溫度圖及穩定性數據在圖2中給出。該純化酶可以在期望的地方用于催化肌醇六磷酸到肌醇和自由磷酸的水解。本發明的肌醇六磷酸酶具有很高的熱穩定性；因此它尤其可以用于高溫和/或高壓應用中，包括但不限于，制備魚類食品顆粒中，這種食品顆粒不會過早地溶解于水中。
在本發明中所包括的肌醇六磷酸酶多肽可以具有圖1(SEQ ID NO2)所示的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列。肌醇六磷酸酶多肽，如那些從大腸桿菌B(E.coli B)分離的，特征在于催化肌醇六磷酸到肌醇和自由磷酸的水解，以便從肌醇六磷酸復合物釋放礦物質。
在本發明中所包括的其它肌醇六磷酸酶多肽是具有與肌醇六磷酸酶多肽的氨基酸序列至少大約50％的同一性的氨基酸序列的多肽，如SEQ ID NO2中的任何肌醇六磷酸酶。確定氨基酸序列同源性的對照長度可以是，例如至少15個氨基酸，及例如至少20、25或35個氨基酸。
同源性或同一性通常是用序列分析軟件(如Sequence Analysis SoftwarePackage of the Genetics Computer Group，University of Wisconsin BiotechnologyCenter，1710 University Avenue，Madison，WI 53705)確定的。這樣的軟件通過將同源性等級分配給各種缺失、取代及其它修飾來匹配相似序列。在上下文中，術語兩個或多個核酸或多肽序列的“同源性”和“同一性”指相同序列或子序列或者，當用許多序列比較算法或通過人工對比和視覺觀察測量時，在比較窗口或指定區域比較且對比最大化對應時，或具有特定百分比的氨基酸殘基或核苷酸相同的兩個或更多個序列或者子序列。
對于序列比較，通常一個序列作為參考序列，測試序列與其進行比較，不過可以使用參考序列數據庫。當使用序列比較算法時，將測試序列和參考序列輸入計算機，如果必要，指定子序列坐標，并指定序列算法程序參數。可以使用默認程序參數，或可以指定備選參數。然后基于程序參數，用序列比較算法計算測試序列相對于參考序列的序列同一性百分比。
正如此處所用，“比較窗口”包括是指選自20～600，通常為大約50～大約200，更通常大約100～大約150的鄰接位置的任一個數目的片斷，在這些片斷中，在兩個序列被最優地對比后，一個序列可以與具有相同數目的鄰接位置的參考序列進行比較。用于比較的序列對比方法在本領域是熟知的。可以進行最優的序列對比比較，如通過local homology algorithm，由Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2482，1981提供；通過homology alignment algorithm，由Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol 48443，1970提供；通過search for similarity method，由person & Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 852444，1988提供，通過這些算法的計算機化實現(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通過人工對比和視覺觀察。例如，用于確定同源性或同一性的其它算法包括，除了BLAST程序(BasicLocal Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information)、ALIGN、AMAS(Analysis of Multiply Aligned Sequences)、AMPS(Protein MultipleSequence Alignment)、ASSET(Aligned Segment Statistical Evaluation Tool)、BANDS、BESTSCOR、BIOSCAN(Biological Sequence Comparative Analysis Node)、BLIMPS(Blocks IMProved Searcher)、FASTA、Intervals & Points、BMB、CLUSTALV、CLUSTAL W、CONSENSUS、LCONSENSUS、WCONSENSUS、Smith-Watermanalgorithm、DARWIN、Las Vegas algorithm、FNAT(Forced Nucleotide AlignmentTool)、Framealign、Framesearch、DYNAMIC、FILTER、FSAP(Fristensky SequenceAnalysis Package)、GAP(Global Alignment Program)、GENAL、GIBBS、GenQuest、ISSC(Sensitive Sequence Comparison)、LALIGN(Local Sequence Alignment)、LCP(Local Content Program)、MACAW(Multiple Alignment Construction & AnalysisWorkbench)、MAP(Multiple Alignment Program)、MBLKP、MBLKN、PIMA(Pattern-Induced Multi-sequence Alignment)、SAGA(Sequence Alignment byGenetic Algorithm)和WHAT-IF。這些算法程序也可以用來篩選基因組數據庫，以區分序列基本上一樣的多核苷酸序列。許多基因組數據庫是可利用的，例如，人類基因組的實質部分可以作為人類基因組測序項目的一部分來利用(J.Roach，http//weber.u.Washington.edu/～roach/human genome progress2.html)(Gibbs，1995)。至少21個其它基因組已經被測序，例如包括M.genitalium(Fraser等人，1995)、M.jannaschii(Bult等人，1996)、H.influenzae(Fleischmann等人，1995)、大腸桿菌(Blattner等人，1997)和酵母(S.cerevisiae)(Mewes等人，1997)和D.melanogaster(Adams等人，2000)。在模型生物的基因組的測序上已經取得了顯著的進步，如鼠、C.elegans和Arabadopsis sp。幾個含有注解有某些功能信息的基因組信息由不同的組織所保存，可以通過因特網訪問，例如www.tigr.org/tdb；www.genetics.wisc.edu；http//genome-www.stanford.edu/～ball；hiv-web.lanl.gov；www.ncbi.nlm.nih.gov；www.ebi.ac.uk；http//Pasteur.fr/other/biology；和www.genome.wi.mit.edu。
一個有用算法的實例是BLAST和BLAST 2.0算法，對它們的描述分別在Altschul等人，Nuc.Acids Res.253389-3402，1977和Altschul等人，J.Mol.Biol.215403-410，1990中。完成BLAST分析的軟件可以通過NationalCenter for Biotechnology Information(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。該算法首先涉及通過識別查詢序列中的長度W的短單詞來識別高計分序列對(HSP)，當在數據庫序列中用相同長度的單詞對比時，該高記錄序列對或者匹配或者滿足一些正閾值T。T優選指相鄰單詞分數閾值(Altschul等人，見上文)。這些起始的相鄰單詞命中作為尋找包括它們的更長HSP的初始搜索的種子。這些單詞命中在兩個方向沿著每一個序列一直延伸，直到累積對比值增加。對于核苷酸序列，用參數M(一對匹配殘基的得分；通常＞0)對累積值進行計算。對于氨基酸序列，用計分矩陣來計算累積值。當發生下列情況時暫停在每一方向的單詞命中的延伸累積對比值隨著數量X從其最大獲得值下降；由于一個或多個負得分參加對比值的累積，累積值達到零或零以下；或者達到了任一序列的末端。BLAST算法參數W、T和X確定對比的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的默認值為單詞長度(W)為11，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4，以及兩個鏈的比較。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默認值為單詞長度為3，期望值(E)為10，BLOSUM62計分矩陣(參考Henikoff &Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915，1989)對比值(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4，以及兩個鏈的比較。
BLAST算法也進行兩個序列之間相似性的統計分析(如參考Karlin&Altchul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873，1993)。由BLAST算法提供的相似性的一個測量是最小的總計幾率(P(N))，該值提供了幾率指標，通過它兩個核苷酸或氨基酸序列之間的匹配將偶然地發生。例如，如果測試核酸與參考核酸的比較中最小的總計幾率小于大約0.2，更優選小于大約0.01，最優選小于大約0.001，那么核酸被認為與參考序列是相似的。
在一個實施方案中，用Basic Local Alignment Search Tool(“BLAST”)來評價蛋白質和核酸序列同源性。尤其是，使用五個特定BLAST程序來完成下述任務(1)BLASTP和BLAST3將氨基酸查詢序列與蛋白質序列數據庫進行比較；(2)BLASTN將核苷酸查詢序列與核苷酸序列數據庫進行比較；(3)BLASTX將查詢核苷酸序列(兩個鏈)的六讀框概念翻譯產物與蛋白質序列數據庫進行比較；(4)TBLASTN將查詢蛋白質序列與以總共六個閱讀框(兩個鏈)翻譯的核苷酸序列數據庫進行比較；和(5)TBLASTX將核苷酸查詢序列的六讀框翻譯與核苷酸序列數據庫的六讀框翻譯進行比較。
BLAST程序通過識別查詢氨基酸或核酸序列與測試序列之間相似片斷，在此處被稱作“高計分片斷對”，來識別同源序列，其中測試序列優選從蛋白質或核酸序列數據庫獲得。高計分片斷對優選通過計分矩陣方法來識別(即對比)，其中大部分方法在本領域是已知的。優選地，所用的計分矩陣是BLOSUM62矩陣(Gonnet等人，Science 2561443-1445，1992；Henikoff和Henikoff，Proteins 1749-61，1993)。不太優選地，也可以使用PAM或PAM250矩陣(如參考Schwartz和Dayhoff編著，1978，Matrices for Detecting Distance RelationshipsAtlas of Protein Sequence andStructure.WashingtonNational Biomedical Research Foundation)。BLAST程序可以通過美國National Library of Medicine獲得。
可以根據序列長度和所研究的同源性程度對上述算法所用的參數進行修改。在一些實施方案中，在沒有用戶說明書的情況下，這些參數可以是這些算法所用的默認參數。
本發明進一步涉及一種具有圖1的推斷氨基酸序列的酶，以及這種酶的類似物、衍生物和片斷。
圖1所示酶的類似物、衍生物或片斷可以是(a)其中用沒有用遺傳密碼編碼的氨基酸殘基取代的一個或多個氨基酸殘基的類似物、衍生物或片斷，或(b)其中一個或多個氨基酸殘基包括一個取代基團的類似物、衍生物或片斷，或(c)其中用另一種化合物來融合成熟酶的類似物、衍生物或片斷，如可以增加酶的半衰期的化合物(例如聚乙二醇)，或(d)提供一個標記或標志，如6xHis標志或綠色熒光蛋白質標志，(e)其中另外的氨基酸被融合到成熟酶上的類似物、衍生物或片斷，如前導序列或分泌序列或用于純化成熟酶的序列或前蛋白質序列。根據下面的教導，這些類似物、衍生物和片斷被認為在本領域普通技術人員的知識范圍內。
變體，如“片斷”、“類似物”或“衍生物”酶，以及參考酶可以在氨基酸序列上不同，不同的方式有一個或多個取代、添加、缺失、融合和截短，這些方式可以任意組合而存在。
在優選變體中是那些通過保守氨基酸取代參考序列的變體。這些取代是，多肽中的一個給定氨基酸被另一個具有類似特征的氨基酸取代。通常看作保守取代的是，在脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中用一個替代另一個；帶有羥基殘基的Ser和Thr的互換，帶有酸性殘基的Asp和Glu的交換，帶有氨基殘基的Asn和Gln之間的取代，帶有堿性殘基的Lys和Arg的交換，帶有芳族殘基的Phe、Tyr中的替代。
因此，在一個特定的非限定性例證中，取代可以包括一個氨基酸被另一個具有類似特性的氨基酸取代。在另一個特定的非限定性例證中，取代可以包括一個氨基酸被一個不相似的氨基酸取代，在此處該變化是非抑制的或沉默的或對于酶的至少一種性質而言是改進的。
因此，在一個非限定性例證中，添加可以包括或者在蛋白質的氨基末端或羧基末端，或者可選擇地在末端位點之間添加，在此處該變化是非抑制的或沉默的或對于酶的至少一種性質而言是改進的。
在另一個特定的非限定性例證中，在用參考多核苷酸(SEQ ID NO1)編碼的酶中，變化可以包括多種修飾，包括取代、添加、缺失、融合和/或截短，這樣，不考慮單一修飾的效果，當一起看作一組時，修飾的效果是非抑制的或沉默的或對于酶的至少一個特性而言是改進的。
最優選的是基本上保留了與它變化而來的參考多肽具有相同生物功能和活性的變體。
術語“變體”指(分別)在一個或多個堿基對、密碼子、內含子、外顯子或氨基酸殘基上發生修飾的本發明的多核苷酸或多肽，但仍然保持本發明的肌醇六磷酸酶的生物活性。可以通過許多方法來產生變體，例如包括如下面更詳細討論的方法易錯PCR、改組、寡核苷酸定向誘變、裝配PCR、有性PCR誘變、體內誘變、盒式誘變、遞推集團誘變、指數集團誘變、位點特異性誘變、連接重裝配、GSSM及其任意組合。
本發明的一個方面是，提供了分離的核酸分子(多核苷酸)，其編碼具有圖1所示的推斷氨基酸序列的成熟酶。
正如下邊所描述的，編碼SEQ ID NO2的多核苷酸最初由從大腸桿菌B回收的基因組DNA分離而來。它包括一個編碼432個氨基酸殘基的蛋白質的可讀框。
本發明的另一個方面是，提供了一種分離的多核苷酸，其編碼本發明(SEQ IDNO1)的代表性酶，包括圖1所示DNA。
本反應也涉及不同于參考多核苷酸的多核苷酸，例如變化是沉默變化，例如變化不改變由多核苷酸編碼的氨基酸序列。本發明也涉及多肽變化，這些變化在由參考多核苷酸(SEQ ID NO1)編碼的酶中導致氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。在本發明的一個優選方面，這些酶保持了與由參考多核苷酸編碼的酶大概相同的生物作用。
本發明也提供分離的核酸分子，其編碼上述肌醇六磷酸多肽。例如，編碼SEQID NO2的核酸包括在本發明中。這些核酸可以包括天然存在的核苷酸序列，或不同于那些編碼肌醇六磷酸的天然序列，但由于遺傳密碼的簡并性而編碼相同氨基酸的核酸的序列。本發明的核酸可以包括DNA或RNA核苷酸，或其組合或修飾。本發明的代表性核酸在SEQ ID NO1中給出。
本發明的多核苷酸可以是DNA形式，其包括cDNA、基因組DNA以及合成DNA。DNA可以是雙鏈或單鏈的，并且如果是單鏈，可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。編碼成熟酶的編碼序列可以與圖1所示的編碼序列和/或保藏克隆(SEQ IDNO1)的編碼序列相同，或可以是一個不同的編碼序列，其作為遺傳密碼的冗余或簡并的結果，編碼與圖1(如SEQ ID NO1)的DNA編碼相同的成熟酶。
編碼圖1(如SEQ ID NO2)的成熟酶的多核苷酸可以包括但不限于僅有成熟酶的編碼序列；成熟酶的編碼序列和附加編碼序列，如前導序列或前蛋白質序列；成熟酶(以及任選地附加編碼序列)的編碼序列和非編碼序列，如內含子或成熟酶的編碼序列的5’端和/或3’端非編碼序列。
本發明進一步涉及上文描述的多核苷酸的變體，其編碼具有圖1(如SEQ IDNO2)的推斷氨基酸序列的酶的片斷、類似物和衍生物。多核苷酸的變體可以是多核苷酸的天然存在的等位基因變體或多核苷酸的非天然存在的變體。
因此，本發明包括編碼與圖1所示相同的成熟酶的多核苷酸，以及這些多核苷酸的變體，這些變體編碼圖1的酶的片斷、衍生物或類似物。這樣的核苷酸變體包括缺失變體、取代變體和添加或插入變體。
正如上文所說明的，多核苷酸可以具有一個編碼序列，它是圖1所示的編碼序列的天然存在的等位基因變體。正如本領域所已知的，等位基因變體是可以具有一個或多個核苷酸的取代、缺失或添加的多核苷酸序列的可替代形式，它實質上不改變所編碼酶的功能。
正如此處所討論的，可以通過許多方法來產生變體，例如包括易錯聚合酶鏈式反應、改組、寡核苷酸定向誘變、裝配PCR、有性PCR誘變、體內誘變、盒式誘變、遞推集團誘變、指數集團誘變、位點特異性誘變、連接重裝配、GSSM及其任意組合。
一方面，定義為合成連接重裝配(SLR)的非隨機方法可以用來產生變體，該方法在某種程度上與隨機改組相關，只是核酸構筑模塊不被隨機地改組或連接或嵌合，而是被非隨機性地裝配。
SLR方法不依賴于被改組的多核苷酸之間的高水平同源性的存在。本發明可以被用來非隨機地產生包括超過10100個不同嵌合體的子代分子文庫(或集合)。可以想象，SLR甚至可以被用來產生包括超過101000個不同子代嵌合體的文庫。
因此，一方面，本發明提供了一種非隨機方法，該方法產生一組最終嵌合的核酸分子，該核酸分子具有由設計所選定的總裝配次序，該方法包括下述步驟通過設計來產生多種具有有用的相互匹配可連接末端的多個特定核酸構筑模塊，和裝配這些核酸構筑模塊，這樣就獲得了計劃的總裝配次序。
被裝配的核酸構建模塊(building block)的相互匹配可連接末端被認為對這種類型的有序裝配是“有用的”，如果它們可以使構筑模塊以預定次序耦聯。因此，一方面，其中核酸構筑模塊可以被耦聯的總裝配次序由可連接末端的設計規定，如果使用了一個以上的裝配步驟，那么其中核酸構筑模塊可以被耦聯的總裝配次序也可以由裝配步驟(多個裝配步驟)的連續次序來規定。在本發明的一個實施方案中，用酶如連接酶(如T4 DNA連接酶)來處理退火的構筑片段以實現構筑片段的共價鍵合。
在另一個實施方案中，核酸構筑模塊的設計是在分析了一組祖先核酸模板的序列的基礎上得到的，這些模板可以作為產生最終嵌合核酸分子的子代組的基礎。因此，這些祖先核酸底物作為一種序列信息的來源，其有助于設計被誘變即被嵌合或被改組的核酸構筑模塊。
在一個例證中，本發明提供了相關基因家族和其相關產物的編碼家族的嵌合。在一個特定例證中，被編碼產物是酶。本發明的酶和多肽可以按照下面描述的方法來誘變。
因此根據本發明的一方面，將多種祖代核酸模板的序列進行對比，以便于選擇一個或多個分界點，這些分界點可以位于一個同源區。這些分界點可以被用來描繪所產生的核酸構筑模塊的分界。因此，在祖代分子中識別和選擇的分界點在子代分子的裝配中作為潛在的嵌合點。
通常有用的分界點是由至少兩個祖代模板共享的一個同源區(包括至少一個同源核苷酸堿基)，但分界點可以是由至少半個祖代模板，至少三分之二個祖代模板，至少四方之三個祖代模板，優選地至多全部祖代模板共享的一個同源區。更優選地，有用的分界點仍然是由全部祖代模板共享的一個同源區。
在一個實施方案中，徹底地進行連接重裝配過程，以便產生一個完整文庫。換句話說，核酸構筑模塊的所有可能的有序組合都出現在最終嵌合核酸分子集合中。同時，每一組合中的裝配次序(即每一最終嵌合核酸的5’到3’序列中的每一構筑模塊的裝配次序)是經過設計的(或非隨機的)。由于該方法的非隨機特性，大大降低了不必要的副產品的可能性。
在另一個實施方案中，該方法提供了系統地進行連接重裝配過程，例如為了產生一個被系統地區室化的文庫，其具有可以被系統地，如一個接一個地進行篩選的區室。換句話說，本發明提供了通過特定核酸構筑模塊的選擇和明智使用，以及與順序地階段進行的裝配反應的選擇和明智使用相結合，可以實現在幾個反應容器中的每一個中制備子代產物的特定集合的實驗設計。這樣使系統檢驗和篩選過程可以得到進行。從而，允許在較小的群體中對潛在的大量子代分子進行系統檢驗。
由于其以高度靈活但同樣全面且系統的方式進行嵌合的能力，尤其當在祖先分子中有低水平同源性時，本發明提供了產生包括大量子代分子的文庫(或集合)。由于該連接重裝配發明的非隨機特性，所產生的子代分子優選地包括一個最終嵌合核酸分子文庫，其具有根據設計選定的總裝配次序。在一個特定實施方案中，這樣產生的文庫包括超過103～101000個不同的子代分子種類。
一方面，如所描述產生的最終嵌合核酸分子的集合包括編碼多肽的多核苷酸。根據一個實施方案，該多核苷酸是基因，它可以是人造基因。根據另一個實施方案，該多核苷酸是基因通路，它可以是人造基因通路。本發明所產生的一個或多個人造基因可以被整合進人造基因通路中，如可以在真核生物(包括植物)中操作的通路。
在另一個例證中，產生構筑模塊步驟的合成特性允許設計和引入核苷酸(如一個或多個核苷酸，例如它們可以是密碼子或內含子或調節序列)，其隨后可以任選地在體外過程(如通過誘變)或體內過程(如通過利用宿主生物的基因剪接能力)去除。應該意識到在許多情況下，除了產生有用分界點的潛在好處之外，由于許多其它原因也期望引入這些核苷酸。
因此根據另一個實施方案，本發明提供，可以用核酸構筑模塊來引入內含子。因此，本發明提供可以將功能內含子引入本發明的人造基因。本發明也提供可以將功能內含子引入本發明的人造基因通路。因此，本發明提供了產生嵌合多核苷酸，其為一個含有一個(或多個)人工引入的內含子的人造基因。
因此，本發明也提供了產生嵌合多核苷酸，其為一個含有一個(或多個)人工引入的內含子的人造基因通路。優選地，人工引入的內含子在一個或多個宿主細胞內對于基因剪接是有功能的，主要是以自然存在的內含子在基因剪接中所發揮功能性作用的方式進行。本發明提供了一種產生含有人造內含子的多核苷酸的方法，其中所述多核苷酸將被引入宿主生物用于重組和/或剪接。
用本發明產生的人造基因也可以作為與另一個核酸進行重組的底物。同樣地，用本發明產生的人造基因通路也可以作為與另一個核酸進行重組的底物。在一個優選的情況中，重組是由含有人造內含子的基因和作為重組配對體的核酸之間的同源區來促進的，或者在該區發生的。在一個尤其優選的情況中，重組配偶體也可以是用本發明所產生的核酸，包括人造基因或人造基因通路。重組可以由在人造基因中一個(或多個)人工引入的內含子中存在的同源區來促進，或在該區發生。
本發明的合成連接重裝配法使用了多種核酸構筑模塊，其中每一個優選地具有兩個可連接末端。在每一核酸構筑模塊上的兩個可連接末端可以是兩個鈍端(即每一個沒有核苷酸的懸端)，或優選地是一個鈍端和一個懸端，或優選地仍然是兩個懸端。
用于該目的的有用的懸端可以是一個3’懸端或一個5’懸端。因此，核酸構筑模塊可以具有一個3’懸端或可選擇地具有一個5’懸端或可選擇地具有兩個3’懸端或可選擇地具有兩個5’懸端。通過有目的的實驗設計確定總次序，而不是隨機的，核酸構筑模塊是以這種次序進行裝配以形成一個最終嵌合核酸分子。
根據一個優選實施方案，核酸構筑模塊是通過兩個單鏈核酸(也稱為單鏈寡核苷酸)的化學合成，然后接觸來產生，這樣使它們退火以形成一個雙鏈核酸構筑模塊。
雙鏈核酸構筑模塊可以是可變長度的。這些構筑模塊的長度可小可大。構筑模塊的優選尺寸在1個堿基對(不包括任何懸端)～100,000堿基對(不包括任何懸端)之間。也提供了其它的優選尺寸范圍，其下限為1bp～10,000bp(包括其中的每一個整數)，上限為2bp～100,000bp(包括其中的每一個整數)。
存在許多方法，通過它們可以產生對本發明有用的雙鏈核酸構筑模塊；這些方法在本領域是已知的，并且熟練技術人員可以很容易地完成。
根據一個實施方案，雙鏈核酸構筑模塊是這樣產生的，即首先產生兩個單鏈核酸，使它們退火從而形成一個雙鏈核酸構筑模塊。雙鏈核酸構筑模塊的兩個鏈在每一個遠離任何形成懸端的位點上的核苷酸是互補的；從而在遠離任何懸端(或多個懸端)的地方不含失配。根據另一個實施方案，雙鏈核酸構筑模塊的兩個鏈在小于每一個遠離任何形成懸端的位點上是互補的。因此，根據該實施方案，可以用雙鏈核酸構筑模塊來引入密碼子簡并。優選地，用此處描述的位點飽和誘變，用一個或多個N，N，G/T盒或可選擇地用一個或多個N，N，N盒來引入密碼子簡并。
本發明的體內重組法可以以盲法在一個未知雜交或特定多核苷酸或序列的等位基因庫上進行。然而，不必要知道特定多核苷酸的實際DNA或RNA序列。
在基因的混合種群內使用重組的方法對于任何有用蛋白質例如白細胞介素I、抗體、tPA和生長激素的產生都是有用的。該方法可以被用來產生具有被改變的專一性或活性的蛋白質。該方法也可以被用于產生雜交核酸序列，例如啟動區、內含子、外顯子、增強子序列、基因的3’非翻譯區或5’非翻譯區。因此該方法可以被用來產生具有增加的表達率的基因。該方法也可以用于重復DNA序列的研究。最后，該方法可以用來突變核酶或aptamer。
一方面，此處描述的多核苷酸和多肽的變體是通過使用還原性重配、重組和選擇的重復循環而獲得的，它們允許高復合線性序列的定向分子進化，如DNA、RNA或蛋白質完全重組。
分子的體內改組在提供變體中有用，可以用細胞的自然特性來重組多體而進行。雖然體內重組提供了分子多樣性的主要自然通路，遺傳重組仍然是一個相當復雜的過程，其包括1)同源性的識別；2)鏈裂解、鏈侵入和導致產生了重組交叉的代謝步驟；和最后3)交叉分解形成分離的重組分子。交叉的形成需要同源序列的識別。
在另一個實施方案中，本發明包括一個從至少第一個多核苷酸和第二個多核苷酸產生雜交多核苷酸的方法。通過將共享至少一個部分序列同源區的至少第一個多核苷酸和第二個多核苷酸引入一個合適的宿主細胞中，本發明可以被用來產生雜交多核苷酸。部分序列同源區可以促進導致產生雜交多核苷酸的序列再組織的過程。在此所用，術語“雜交多核苷酸”是用本發明的方法產生的任何核苷酸序列，其含有來自至少兩個原始多核苷酸序列的序列。這樣的雜交多核苷酸可以從促進DNA分子間序列整合的分子間重組事件來產生。另外，這樣的雜交多核苷酸可以從分子內還原性重配方法來產生，其中該方法使用重復序列來改變DNA分子內的核苷酸序列。
本發明提供一種產生可以編碼生物活性雜交多肽(如雜交肌醇六磷酸酶)的雜交多核苷酸的方法。一方面，原始多核苷酸編碼生物活性多肽。本發明的方法通過使用整合原始多核苷酸序列的細胞方法產生新的雜交多肽，這樣所產生的雜交多核苷酸編碼表現了來自原始生物活性多肽的活性的多肽。例如，原始多核苷酸可以編碼來自不同微生物的特定酶。用來自生物或變體的第一種多核苷酸編碼的酶，例如，在特定環境條件，如高鹽度下可以有效地發揮作用。用來自不同生物或變體的第二種多核苷酸編碼的酶可以在不同環境條件，如極高溫下有效地發揮作用。含有來自第一種和第二種原始多核苷酸的序列的雜交多核苷酸可以編碼表現出由原始多核苷酸編碼的兩種酶的特征的酶。因此，雜交多核苷酸編碼的酶在由第一種和第二種多核苷酸編碼的每一種酶共享的環境條件，如高鹽度和極高溫下可以有效地發揮作用。
原始多核苷酸編碼的酶包括但不限于肌醇六磷酸酶。用本發明的方法產生的雜交多肽可以表現出在原始酶中沒有表現出來的特定酶活性。例如，在編碼水解酶活性的多核苷酸的重組和/或還原性重配之后，可以對所得到的由雜交多核苷酸編碼的雜交多肽進行篩選，以篩選從每一原始酶獲得的專一性水解酶活性，即水解酶在其上發揮作用的鍵類型和水解酶發揮作用的溫度。因此，例如可以對水解酶進行篩選以確定這些區分雜交水解酶和原始水解酶的化學官能度，例如官能度為(a)酰胺(肽鍵)，即蛋白酶；(b)酯鍵，即酯酶和脂肪酶；(c)縮醛，即糖苷酶，以及例如溫度、pH或雜交多肽發揮作用的鹽濃度。
原始多核苷酸的材料分離自單一生物(“隔離群”)、在已知成分培養基(“富集培養基”)中培養的生物集合或未培養生物(“環境樣品”)。使用不依賴于培養的方法從環境樣品中得到編碼新的生物活性的多核苷酸是最優選的，由于該方法允許人們得到未使用的生物多樣性材料。
“環境文庫”是從環境樣品產生的，它代表可以在合適的原核宿主中繁殖的克隆載體中存儲的自然存在的生物的集體基因組。由于克隆DNA最初是從環境樣品直接提取的，所以該文庫不限于可以在純培養物中培養的原核生物的小片斷。因此，在這些樣品中存在的環境DNA的規格化可以允許比原始樣品中存在的所用種類的DNA更相等的表現度。與優勢種相比，這可以顯著地增加從可能以幾個數量級的程度低度存在的樣品中的少數成分中發現有價值的基因的效率。
例如，對從一個或多個未培養微生物產生的基因文庫進行篩選，以篩選出有價值的活性。編碼有價值的生物活性分子的潛在通路首先被原核細胞以基因表達文庫的形式捕獲。從這樣的文庫中分離出編碼有價值的活性的多核苷酸，并將其引入宿主細胞。在下述條件下培養宿主細胞，即可以促進產生具有新活性或增強活性的潛在活性生物分子的重組和/或還原性重配。
可以制備多核苷酸的微生物包括原核微生物，如黃色桿菌屬、真細菌類和古細菌，低級真核微生物如真菌、一些藻類和原生動物。可以從環境樣品中分離多核苷酸，其中不需要對生物進行培養就可以回收核酸或從一種或多種培養生物中回收核酸。一方面，這樣的微生物可以是極端生物，如超嗜熱生物、嗜冷生物、嗜冷菌、嗜鹽生物、嗜壓微生物和嗜酸生物。尤其優選的是從極端微生物分離出來的編碼酶的多核苷酸。這樣的酶可以在如下條件下發揮作用在陸地溫泉和深海熱出口中高于100℃的溫度下，在北極水域中低于0℃的溫度下，在死海的飽和鹽環境中，在煤藏和地熱富含硫的溫泉中pH大約為0的情況下，或者在污水污泥中pH值大于11的情況下。例如，從極端生物克隆和表達的幾種酯酶和脂肪酶在整個大范圍的溫度和pH值下都表現出高活性。
將如上所述選擇和分離的多核苷酸引入合適的宿主細胞中。合適的宿主細胞是能促進重組和/或還原性重配的任何細胞。所選擇的多核苷酸優選地已經在包括適當控制序列的載體中。宿主細胞可以是高級真核細胞如哺乳動物細胞，或低級真核細胞如酵母細胞，或優選地宿主細胞可以是原核細胞如細菌細胞。可以通過磷酸鈣轉染、DEAE-右旋糖苷介導轉染或電穿孔將構建體引入宿主細胞(Davis等人，1986)。
作為適當宿主的代表性實例，這里提及到細菌細胞，如大腸桿菌、鏈酶菌屬、鼠傷寒沙門氏桿菌；真菌細胞，如酵母；昆蟲細胞，如果蠅屬S2和秋粘蟲Sf9；動物細胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；和植物細胞。根據下面的教導，適當宿主的選擇被認為在本領域熟練技術人員的知識范圍內。
特別參考可用于表達重組蛋白的各種哺乳動物細胞培養系統，哺乳動物表達系統的實例包括猴腎成纖維細胞的COS-7系，描述于“SV40-transformed simiancells support the replication of early SV40 mutants”(Gluzman，1981)，和其它能夠表達相容載體的細胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK細胞系。哺乳動物表達載體將包括復制起點、合適的啟動子和增強子，也包括任何必需的核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點、轉錄終止序列和5’側冀非轉錄序列。來自SV40剪接的DNA序列和聚腺苷酸化位點可以被用來提供所需的非轉錄基因元件。
含有相關多核苷酸的宿主細胞可以在常規營養培養基中培養，這些培養基經過了修飾以適合于激活啟動子、選擇轉化體或擴增基因。培養條件如溫度、pH等等，為先前在選擇用于表達的宿主細胞的培養中所用的條件，這些條件對普通技術人員也是顯而易見的。然后對已經識別出具有特定酶活性的克隆進行測序，以識別編碼具有增強活性的酶的多核苷酸序列。
另一方面，可以用一些方法從一個或多個操縱子或基因簇或其部分產生新的編碼生物通路的多核苷酸。例如，細菌和許多真核細胞對于調控基因具有協調機理，調控基因的產物與相關過程有關。基因是成簇的，在結構上被稱作“基因簇”，它們位于一個單個染色體上或彼此直接相鄰，并且在單個調控序列的控制下被一起轉錄，調控序列包括一個單一啟動子，其起始整個基因簇的轉錄。因此，基因簇是一群相鄰基因，它們或者相同或者相關，通常是在功能上相同或者相關。由基因簇編碼的生化通路的一個實例是聚酮化合物。聚酮化合物(polyketide)是這樣的分子具有生物活性的分子的極豐富來源，其中包括抗生素(如四環素和紅霉素)、抗癌試劑(道諾霉素)、免疫抑制劑(FK506和納巴霉素)和獸用產品(莫能菌素)。許多聚酮化合物(由聚酮化合物合酶產生)作為治療藥劑是有價值的。聚酮化合物合酶是多功能酶，其催化在長度和官能度類型和環化程度上不同的多種碳鏈的生物合成。聚酮化合物合酶基因屬于基因簇，并且至少一種類型(類型I)的聚酮化合物合酶的基因和酶都較大，這使得基因操作和這些基因/蛋白質的體外研究變得復雜。
基因簇DNA可以從不同生物體分離，并且可以連接進載體，尤其是含有表達調控序列的載體，這些表達調控序列可以控制和調節從連接的基因簇產生可檢測蛋白質或蛋白質相關排列活性。使用具有特別大容量的外源DNA引入的載體尤其適合于使用這樣的基因簇，并且在此處以實施例的方式進行描述以包括大腸桿菌的f-因子(或致育因子)。該大腸桿菌的f-因子是質粒，它在接合過程中影響其本身的高頻轉移，并且它可以理想地獲得且穩定地繁殖大DNA片斷，如來自混合微生物樣品的基因簇。一旦連接進一個適當的載體，兩個或多個含有不同肌醇六磷酸酶基因簇的載體可以被引入合適的宿主細胞。由基因簇共享的部分序列同源區將促進導致產生了雜交基因簇的序列再組織的過程。然后對新的雜交基因簇進行篩選，以增強在原始基因簇中不存在的活性。
因此，在一個實施方案中，本發明涉及一種產生生物活性的雜交多肽且以通過如下步驟篩選這樣的多肽以便增強活性的方法1)在合適的宿主細胞中引入至少可操作連接的第一種多核苷酸和可操作連接的第二種多核苷酸，所述第一種多核苷酸和第二種多核苷酸共享至少一個部分序列同源區；2)在可以導致序列再組織的條件下培養宿主細胞，產生了可操作連接的雜交多核苷酸；3)表達由雜交多核苷酸編碼的雜交多肽；4)在可以促進識別增強生物活性的條件下篩選雜交多肽；以及5)分離編碼雜交多肽的多核苷酸。
篩選各種酶活性的方法對本領域的熟練技術人員是已知的，并且在本發明整個說明書中對其進行了討論。當分離本發明的多肽和多核苷酸時可以使用這樣的方法。
作為可以在那些方法中使用的表達載體的代表性實例可以是所提及的病毒顆粒、桿狀病毒、噬菌體1插入載體或取代載體、噬菌體、質粒、噬菌質粒、粘粒、fosmid、細菌人工染色體(BAC)、病毒DNA(如疫苗、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病和SV40的衍生物)、基于P1的人工染色體(PAC)、酵母質粒、酵母人工染色體(YAC)和對特定目的宿主(如桿狀菌、曲霉菌和酵母)而言任何特定的其它載體。因此，例如DNA可以被包括在表達多肽的多種表達載體中的任一個。這樣的載體包括染色體、非染色體和合成DNA序列。大量合適的載體對本領域熟練技術人員是已知的，而且可以通過商業通路獲得。下述載體是通過實施例的方式提供的細菌pQE載體(Qiagen)、pBlusescript質粒、pNH載體、(lambda-ZAP載體(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia)；真核pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia)。然而，可以使用任何其它質粒或其它載體，只要它們在宿主中可以復制且可以生存。低拷貝數載體或高拷貝數載體可用于本發明中。
用于本發明中的優選類型的載體包括f-因子起點復制。大腸桿菌中的f-因子(或致育因子)是質粒，它在接合過程中影響其本身的高頻轉移和細菌染色體本身的低頻轉移。尤其優選的實施方案使用了克隆載體，被稱作“fosmids”或細菌人工染色體(BAC)載體。它們衍生自能穩定地整合基因組DNA大片斷的大腸桿菌f-因子。當與來自混合未培養的環境樣品的DNA整合時，這使得其獲得穩定“環境DNA文庫”形式的大基因組片斷成為可能。
用于本發明中的另一種類型的載體是粘粒載體。粘粒載體最初是設計用于克隆和繁殖基因組DNA大片斷的。克隆進粘粒載體在“Molecular CloningA laboratoryManual”(Sambrook等人，1989)中有詳細描述。
表達載體中的DNA序列可操作地連接到一個適當的表達控制序列(啟動子)上，以指導RNA合成。特別指定的細菌啟動子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸腺嘧啶核苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、來自逆轉錄酶病毒的LTR啟動子和小鼠金屬硫蛋白-I啟動子。適當載體和啟動子的選擇恰在本領域普通技術水平之內。表達載體也包括用于翻譯起始的核糖體結合位點和轉錄終止子。載體也包括用于擴增表達的適當序列。可以從任何使用了帶有可選擇標記的CAT(氯霉素轉移酶)載體或其它載體的期望基因來選擇啟動子區。另外，表達載體優選地包括一個或多個可選擇標記基因，以提供用于選擇轉化宿主細胞的表型特征，如二氫葉酸還原酶或用于真核細胞培養的新酶素抗性，或四環素或大腸桿菌中的氨芐青霉素抗性。
體內重配主要指“分子間”方法，總稱為“重組”，它在細菌中通常被看作“RecA-依賴性”現象。本發明可以依賴宿主細胞的重組過程對序列進行重組和重配，或者依賴細胞的能力來調控還原過程，以便通過缺失降低細胞中準重復序列的復雜性。“還原重配”方法通過“分子間”、RecA-非依賴性方法發生。
因此，在本發明的另一方面，可以通過還原重配方法產生變體多核苷酸。該方法包括產生含連續序列(原始編碼序列)的構建體，將這些構建體插入適當載體，以及隨后將它們引入適當宿主細胞。單一分子間識別的重配通過具有同源區的構建體中連續序列間的組合過程或準重復單元間的組合過程發生。重配法重組與和/或減小了重復序列的復雜性和程度，并且導致新分子種類的產生。可以用各種處理來提高重配比率。這些處理包括使用紫外線、或破壞DNA的化合物、和/或使用表現出“遺傳不穩定性”水平增強的宿主細胞系。因此重配法可以用同源重組或準重復序列的自然特性來指導它們自己的進化。
重復或“準重復”序列在遺傳不穩定性中發揮作用。在本發明中，“準重復”是不限于它們原始單元結構的重復。準重復單元可以以構建體中的一排序列而存在；類似序列的連續單元。一旦被連接，連續序列間的連接變得基本上不可見，所得構建體的準重復特性現在在分子間水平是連續的。細胞中的缺失過程降低了準重復序列間所得構建體操作的復雜性。準重復單元提供了實際上無限的模板的所有組成成分，在這些模板上發生滑動事件。包括準重復的構建體從而有效地提供了充分的分子間彈性，這樣缺失(和潛在插入)事件可以實際上在準重復單元內的任何地方發生。
當在同一方向連接所用準重復序列時，例如朝著尾部或反之亦然，細胞不能區分單一單元。因此，還原性過程可以在整個序列中發生。相反，例如當這些單元頭對頭存在，而不是頭對尾存在時，倒位確定了相鄰單元的終點，這樣缺失的形成將有利于不連續單元的損失。因此，本發明方法優選的是，這些序列朝相同方向。準重復序列的隨機方向將導致重配效率的損失，而這些序列的一致方向將提供最高的效率。然而，雖然在相同方向具有較少的鄰接序列降了效率，它仍然可以提供充分的彈性來有效地回收新分子。可以以相同方向用準重復序列制備構建體，以實現較高效率。
可以用多種方法中的任一種以頭對尾方向裝配這些序列，這些方法包括a)可以使用包括多聚腺苷酸頭和多聚胸腺嘧啶核苷酸尾的引物，當多聚腺苷酸頭和多聚胸腺嘧啶核苷酸尾成為單鏈時，可以提供定向作用。這是通過含有從RNA制備的引物的前幾個堿基實現的，從而容易地去除RNAseH。
b)可以使用包括獨特的限制性裂解位點的引物。將需要多個位點、一連串獨特序列、重復合成和連接步驟。
c)引物內部的幾個堿基可以被硫醇化，并且用核酸外切酶來產生適當的有尾分子。
重配序列的回收依賴于用還原RI識別克隆載體。然后通過擴增回收重配編碼序列。將產物再克隆和表達。可以用下述情況來影響用還原RI回收克隆載體1)當該構建體的復雜性減少時，所用的載體才是穩定地被保持下來。
2)用物理方法對變短的載體進行回收。在這種情況下，可以使用標準質粒分離方法回收克隆載體，并用低分子量截流應用標準方法在瓊脂糖凝膠或柱上進行大小分離。
3)當插入尺寸減少時，可以選擇含有打斷基因的載體的回收。
4)對表達載體和適當的選擇使用直接選擇技術。
來自相關生物的編碼序列(例如，基因)可以表現出高度同源性，并且編碼相當不同的蛋白質產物。這些類型的序列作為準重復在本發明中尤其有用。然而，雖然下述說明的實施例表明幾乎相同的原始編碼序列(準重復)的重配，但該方法不限于這些幾乎相同的重復。
下述實施例對本發明的方法進行了說明。對衍生自三個獨特種類的編碼核酸序列(準重復)進行了描述。這些序列中的每一個，在該序列中的特定位置具有一個或幾個堿基對的不同，分別稱為“A”“B”和“C”。準重復序列時分別地或集體擴增，并且被連接進隨機集合體中，這樣在連接分子種群中可以得到所有可能的置換和重組。準重復單元的數量可以通過裝配條件來控制。構建體中準重復單元的平均數量被定義為重復指數(RI)。
一旦形成，可以根據已出版的方法在瓊脂糖凝膠上對構建體進行大小分級分離或不進行大小分級分離，插入克隆載體，并且轉染進適當的宿主細胞。然后繁殖細胞，實現了“還原重配”。如果期望，通過引入DNA破壞來刺激還原重配方法的比率。不管RI降低是使用“分子間”機理通過重復序列間的缺失形成來調節的，還是通過“分子間”機理通過類似重組的事件來調節的，都是不重要的。最終的結果是這些分子被重配進所有可能的重組中。
可選地，該方法包括篩選改組庫中的文庫成員的進一步的步驟，以便識別具有結合或相互作用，或催化特定反應的能力的單一改組文庫成員(例如催化鹵代烷烴的水解)。
從這些文庫中鑒定出的多肽可以用于治療、診斷、研究和相關的用途(例如，催化劑，增加水溶液的滲透性的溶質，等等)和/或用于一個或多個改組和/或選擇的進一步循環。
另一方面，在重組或重配之前或其過程中，本發明的多核苷酸或用此處所述方法產生的多核苷酸可以被用于可促進突變引入原始多核苷酸的試劑或方法。這些突變的引入將增加所得到的雜交多核苷酸和用其編碼的多肽的多樣性。可以促進誘變的試劑和方法包括但不限于(+)-CC-1065或合成類似物如(+)-CC-1065-(N3-Adenine，參考Sun和Hurley，1992)；能抑制DNA合成的N-乙酰化或N-去乙酰化4’-氟-4-氨基二苯加成物(例如，參考van de Poll等人，1992)；或能抑制DNA合成的N-乙酰化或N-去乙酰化4-氨基二苯加成物(例如，同樣參考van de Poll等人，1992，第751-758頁)；三價鉻、三價鉻鹽、能抑制DNA復制的多環芳族碳氫化合物(“PAH”)DNA加成物，如7-溴甲基-苯[α]蒽(“BMA”)、三(2，3-二溴丙基)磷酸(“Tris-BP”)、1，2-二溴-3-氯丙烷(“DBCP”)、2-溴丙烯醛(2BA)、苯[α]芘-7，8-二羥基二醇-9-10-環氧化物(“BPDE”)、鉑(II)鹵鹽、N-羥基-2-氨基-3-甲基咪唑[4，5-f]-喹啉(“N-羥基-IQ”)和N-羥基-2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4，5-f]-吡啶(“N-羥基-PhIP”)。減緩或中斷PCR擴增的尤其優選的方法包括UV光(+)-CC-1065和(+)-CC-1065-(N3-Adenine)。特別包括的方法是，DNA加成物或含有來自多核苷酸或多核苷酸庫的DNA加成物的多核苷酸，在進一步處理之前，它們可以通過包括加熱含有多核苷酸的溶液的方法釋放或去除。
本發明的另一方面是關于一種產生具有生物活性的重組蛋白質的方法，該方法是在根據本發明所述提供雜交或重配多核苷酸的產生的條件下，通過處理包括編碼野生型蛋白質的雙鏈模板多核苷酸的樣品而實現的。
本發明也提供使用專利密碼子引物(含有簡并N，N，N序列)將點突變引入多核苷酸，從而產生一組子代多肽，其中在每一氨基酸位置(基因位點飽和突變(GSSM))再現了全長單一氨基酸取代。所用的寡核苷酸連續地包括第一個同源序列、一個簡并N，N，N序列和優選但不必需的第二個同源序列。由于N，N，N序列的簡并包括所有20個氨基酸的密碼子，所以來自使用了該寡核苷酸的下游子代翻譯產物沿著多肽的每一氨基酸位點包括所有可能的氨基酸變化。
一方面，使用一個這樣的簡并寡核苷酸(包括一個簡并N，N，G/T盒子)將親本多核苷酸模板中的每一原始密碼子用于全長密碼子取代。另一方面，使用至少兩個簡并N，N，G/T盒子-或者在同一寡核苷酸或不同寡核苷酸中，將親本多核苷酸模板中的至少兩個原始密碼子用于全長密碼子取代。因此，一個寡核苷酸中可以包括一個以上的N，N，G/T序列，以便在一個以上的位點引入氨基酸突變。多種N，N，G/T序列可以直接鄰接，或被一個或多個其它核苷酸序列隔斷。另一方面，可以單獨使用或與含有N，N，G/T序列的密碼子組合使用對于引入添加和缺失有用的寡核苷酸，以便引入氨基酸添加、缺失和/或取代的任意組合或置換。
在一個特定例證中，用含有鄰接N，N，G/T三聯體，即簡并(N，N，G/T)n序列的寡核苷酸來同時誘變兩個或多個鄰接氨基酸位置是可能的。
另一方面，本發明提供使用比N，N，G/T序列具有更低簡并的簡并盒子。例如，在一些情況下可能期望使用(如在寡核苷酸中)僅包括一個N的簡并三聯體序列，其中所述N可以在三聯體的二分之一或三分之一位置。可以在保持三聯體的兩個位置中使用包括其任何組合和置換的任何其它堿基。另外，在一些情況下可能期望使用(如在寡核苷酸中)簡并N，N，N三聯體序列或N，N，G/C三聯體序列。
然而，應該意識到，正如在本發明中所公布地，使用簡并三聯體(如N，N，G/T或N，N，G/C三聯體序列)是有利的，這有幾個原因。一方面，本發明提供一種方法，該方法可以系統地且相當容易地產生全長可能氨基酸(總共20個氨基酸)到多肽中每一氨基酸位置的取代。因此，對于100個氨基酸多肽，本發明提供一種方式來系統地且相當容易地產生2000個不同種類(即每個位置20個可能的氨基酸乘以100個氨基酸位置)。應該意識到，通過使用含有簡并N，N，G/T或N，N，G/C三聯體序列的寡核苷酸，此處提供了32個編碼20個可能氨基酸的單一序列。因此，在一個使用一個該寡核苷酸將親本多核苷酸序列用于飽和誘變的反應容器中，產生了32個編碼20個變體多肽的不同的子代多核苷酸。相反，在位點定向誘變中使用非簡并寡核苷酸導致了每個反應容器中僅有一個子代多肽產物。
本發明也提供使用非簡并寡核苷酸，它可以被任選地與所公開的簡并引物組合使用。應該意識到在某些情況下，使用非簡并寡核苷酸在工作多核苷酸中產生特定點誘變是有利的。這提供了一種產生特定沉默點誘變、導致相應氨基酸變化的點誘變、引起產生終止密碼子和多肽片斷的相應表達的點誘變的方法。
因此，在一個實施方案中，每一飽和誘變反應容器含有編碼至少20個子代多肽分子的多核苷酸，這樣在一個與親本多核苷酸中誘變的密碼子位置相應的特定氨基酸位置再現了所有20個氨基酸。從每一飽和誘變反應容器中產生的32倍簡并子代多肽可以被用于克隆擴增(例如，用表達載體克隆進一個合適的大腸桿菌中)且用于表達篩選。當通過篩選識別單一子代多肽以便在特性上表現出有利的變化(當與親本多肽比較時)，可以對其進行測序以識別其中所含的相對有利的氨基酸取代。
應該意識到，正如此處所公開的一旦用飽和誘變在親本多肽中誘變每一個氨基酸位置，可以在一個以上的氨基酸位置識別有利的氨基酸變化。產生含有這些有利的氨基酸取代的部分或全部的組合的一個或多個新子代分子。例如，如果在多肽中3個氨基酸位置中每一個位置中確定出有2個特定有利的氨基酸變化，置換在每一位置(與原始氨基酸沒有變化，以及兩個有利變化的每一個)包括3種可能性和3個位置。因此，總共有3×3×3或27種可能性，包括先前檢驗的7種-6個單一點誘變(即3個位置中每一個上有兩個)以及任何位置沒有變化。
仍然在另一方面，位點飽和誘變可以連同篩選與改組、嵌合、重組和其它誘變方法一起使用。本發明提供以迭代方式使用任何誘變方法，包括飽和誘變。在一個例證中，任何誘變方法的迭代使用是與篩選一起組合使用的。
因此，在一個非限定性例證中，本發明的多核苷酸和多肽可以用飽和誘變組合其它誘變方法來衍生，如兩種或多種相關多核苷酸被引入合適的宿主細胞中的方法，這樣就通過重組和還原重配產生了雜交多核苷酸。
除了沿著基因的整個序列進行誘變之外，誘變可以被用于在多核苷酸序列中取代許多堿基中的每一個，其中被誘變的堿基的數量優選地從15～100,000的每一個整數。因此，可以將每個堿基或離散數目的堿基(優選地是總數從15～100,000的子集)進行誘變，而不是沿著分子誘變每一位置。優選地，用分離核苷酸沿著多核苷酸序列來誘變每一位置或每一組位置。一組被誘變的3個位置可以是密碼子。優選地用含有異源盒子，也稱作誘變盒子的誘變引物來引入突變。優選的盒子可以具有1～500個堿基。在這樣的異種盒子中的每一核苷酸位置是N、A、C、G、T、A/C、A/G、A/T、C/G、C/T、G/T、C/G/T、A/G/T、A/C/T、A/C/G或E，其中E是除A、C、G或T()之外的任意堿基(E可以被稱作設計者寡核苷酸)。
總的來說，飽和誘變包括在被誘變的限定多核苷酸序列中(其中被誘變的序列的長度優選為大約15～100,000堿基)誘變一完整組的誘變盒子(其中每一盒子的長度優選為大約1～500個堿基)。因此，一群突變(1～100個突變)被引入被誘變的每一盒子中。在使用飽和誘變的一個循環中，被引入盒子的第一種突變定群可以與被引入第二個盒子中的第二種定群突變不同或相同。這些定群的例證為缺失、添加、特定密碼子定群和特定核苷酸盒子定群。
被誘變的限定序列包括完整基因、通路、cDNA、完整開放閱讀框(ORF)和完整啟動子、增強子、阻遏蛋白/反式激活蛋白、復制起點、內含子、操縱基因或任何多核苷酸功能基團。通常，用于該用途的“限定序列”可以是長度在15～15,000個堿基之間(本發明特別定義了其間的每一個整數)的15堿基多核苷酸序列和多核苷酸序列的任何多核苷酸。在選擇定群的密碼子中應該考慮到的元素包括由簡并誘變盒子編碼的氨基酸類型。
在一個特別優選的例證中，可以被引入誘變盒子的突變定群，本發明突變提供了在每一位置編碼2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20氨基酸的簡并密碼子取代(用簡并寡核苷酸)，及其用它們編碼的多肽文庫。
本發明也包括多核苷酸，其中可以在同一閱讀框中將成熟酶的編碼序列融合為多核苷酸序列，該多核苷酸序列有助于表達和從宿主細胞釋放酶，例如，控制酶從細胞向外的轉運的前導序列。具有前導序列的酶的一個實例是前蛋白，并且可以包括由宿主細胞裂解的前導序列以形成成熟形式的酶。多核苷酸也可以編碼先蛋白，其例證為成熟蛋白質加其它5’氨基酸殘基。具有前序列的其它成熟蛋白質的例證為該蛋白質的非活性形式的先蛋白。一旦該前序列發生裂解，就會剩下活性的成熟蛋白質。
因此，例如本發明的所核苷酸可以編碼成熟酶，或編碼具有前序列的酶，或編碼具有先序列和前序列(如前導序列)的酶。
本發明的肌醇六磷酸酶的編碼序列是通過制備大腸桿菌B基因組DNA，例如從基因組DNA、編碼肌醇六磷酸活性的DNA回收(例如通過PCR擴增)來識別的。這些回收方法在本領域是熟知的。例如，一種方法包括設計擴增引物以回收編碼序列，從基因組DNA擴增基因，將DNA亞克隆進載體，將所得到的構建體轉化進宿主菌株，表達用于評價的肌醇六磷酸酶。這些方法在本領域是熟知的，例如在Sambrook等人，1989中提供了這些方法，此處將其完整引用于此作為參考。
在一個優選實施方案中，本發明的酶是通過下述技術從大腸桿菌B基因組DNA中分離出來的大腸桿菌B基因組DNA可以通過商業通路獲得(SigmaCatalog#D-2001，St.Louis，New Jersey)。下述引物被用來直接從基因組DNA對基因進行擴增5’引物gtttctgaattcaaggaggaatttaaATGAAAGCGATCTTAATCCCATT(SEQ IDNO3)；和3’引物gtttctggatccTTACAAACTGCACGCCGGTAT(SEQ ID NO4)根據制造商的方法來使用Pfu聚合酶(Stratagene Cloning Systems，Inc.，LaJolla，CA)。
PCR產物和pQE60載體(Qiagen)都是根據制造商的方法用EcoRI和BglII限制性內切酶(New England Biolabs)來消化。連接和轉化進宿主細胞，以及M15pREP4宿主細胞(Qiagen)中的表達產生了羧基端用6X-His標記的蛋白質。
然后可以對分離的核酸序列和其它酶進行測量，對照本發明的酶，以測量它們的生物活性保留時間，例如在一項檢測肌醇六磷酸酶活性的分析中(FoodChemicals Codex，4thEd)。這樣的酶包括肌醇六磷酸酶的截短形式，和變體如缺失和插入變體。
這種分析的體外實例是用于檢測肌醇六磷酸酶活性的下述分析通過將150μl的酶制劑與600μl的2mM溶解在pH為7.5的100mM Tris HCl緩沖液中的肌醇六磷酸鈉在37℃溫育30分鐘，其中補充了1mM CaCl2，然后對肌醇六磷酸酶活性進行測量。溫育后，加入750μl的5％的三氯乙酸終止反應。在加入1500μl的顯色試劑(溶解在5.5％硫酸中的4體積1.5％的鉬酸銨，和1體積2.7％的硫酸亞鐵；Shimizu，1992)后，根據磷酸鹽標準分光光度法在700nm測量所釋放的磷酸鹽。一個單位的酶活性被定義為在分析條件下每分鐘釋放1μmol Pi所需酶的數量。專一性活性可以以每毫克蛋白中酶活性單位來表示。
本發明的酶具有將肌醇六磷酸水解為肌醇和自由磷酸的酶活性。
本發明的酶和多核苷酸優選地以分離形式提供，并且優選地被純化到同質性。本發明的肌醇六磷酸酶多肽可以通過幾種標準方法中的任一種來獲得。例如，肌醇六磷酸酶多肽可以在標準重組表達系統中(參考下面)產生，可以被化學合成(該方法可能限于小肌醇六磷酸酶肽片斷)，或者從它們被自然表達的生物體純化。有用的重組表達方法包括使用哺乳動物宿主、微生物宿主和植物宿主。
該肌醇六磷酸酶分子的重組表達可以組合一種或多種其它分子，例如其它酶來獲得。該方法可用于產生組合產物，如含有該肌醇六磷酸酶分子以及一種或多種其它分子的植物或植物部分-優選地所述肌醇六磷酸酶分子和所述其它分子在組合處理中有用。所得到的重組表達分子可以以同質和/或純化形式或可選擇地以相對未純化形式(如當與用于催化肌醇六磷酸降解的其它食品混合時，作為有用的可消費植物部分)使用。
總的來說，在一個非限定性實施方案中，本發明提供了一種在宿主中表達的重組酶。在另一個非限定性實施方案中，本發明提供了一種基本上純化的肌醇六磷酸酶。因此，本發明的酶可以是重組酶、自然酶或合成酶，優選地是重組酶。
本發明也涉及包括本發明所述多核苷酸的載體、用本發明的載體進行了遺傳工程的宿主細胞和通過重組技術產生本發明的酶。
用含有本發明所述多核苷酸的載體對宿主細胞進行遺傳工程(如轉導或轉化或轉染)。這樣的載體可以是，例如克隆載體或表達載體。例如，載體可以是以質粒、病毒微粒、噬菌體、朊病毒形式等等。工程宿主細胞可以在常規營養培養基中培養，這些培養基經過了修飾以適合于激活啟動子，和/或選擇轉化體或擴增本發明的基因。培養條件如溫度、pH等等，為先前在選擇用于表達的宿主細胞的培養中所用的條件，這些條件對普通技術人員也是顯而易見的。
本發明的多核苷酸可以被用來通過重組技術產生酶。因此，例如多核苷酸可以被包括在用于表達酶的多種表達載體中的任一種之中。這樣的載體包括染色體、非染色體和合成DNA序列，如SV40的衍生物；細菌質粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質粒；衍生于質粒和噬菌體DNA組合的載體，病毒DNA如牛痘、腺病毒、禽痘病毒和假狂犬病。然而，可以使用任何其它載體，只要它們在宿主中可以復制且可以生存。
可以通過多種方法將適當的DNA序列插入載體中。概括來說，用本領域已知的方法將DNA序列插入適當的限制性內切酶位點。在這個意義上，該方法包括的是使用可以通過使用限制性消化以及限制性消化非依賴性方法產生的鈍端分子。可選擇地，可以通過稱作“連接酶非依賴性”方法將插入物整合進載體中。在一個特定方面，“連接酶非依賴性”方法的例證是在室溫下使用拓撲異構酶介導連接，例如根據可通過商業通路獲得的稱作TOPO-TA Cloning(InvitrogenCorporation Carlsbad，CA)的試劑盒。可選擇的酶包括拓撲異構酶的異構體以及相關性更遠的重組酶(如重組酶)，也可以被用來調節這種類型的“連接酶非依賴性”整合。在另一個特定方面，“連接酶非依賴性”方法的例證是使用宿主修復機理。這樣的方法和其它方法被認為在本領域的熟練技術人員的知識水平范圍內。
表達載體中的DNA序列可操作地連接到一個適當的表達控制序列(啟動子)上，以指導mRNA合成。作為這些啟動子的代表性實例，此處提及到LTR或SV40啟動子、大腸桿菌lac或trp、噬菌體λPL啟動子和已知在原核或真核細胞或它們的病毒中控制基因病毒的其它啟動子。表達載體也包括用于翻譯起始的核糖體結合位點和轉錄終止子。載體也包括用于擴增表達的適當序列。
另外，表達載體優選地包括一個或多個可選擇標記基因，以提供用于選擇轉化宿主細胞的表型特征，如用于真核細胞培養的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或如大腸桿菌中的四環素或氨芐青霉素抗性。
正如此處描述的含有適當DNA序列的載體，以及適當的啟動子或控制序列，可以被用來轉化適當宿主以允許宿主表達蛋白質。
作為適當宿主的代表性實例，這里提及到細菌細胞，如大腸桿菌、鏈酶菌屬、枯草芽孢桿菌；真菌細胞，如酵母；昆蟲細胞，如果蠅屬S2和秋粘蟲Sf9；動物細胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物細胞等等。根據下面的教導，適當宿主細胞的選擇被認為在本領域熟練技術水平范圍內。
更明確地說，本發明也包括重組構建體，其包括一個或多個上邊廣泛描述的序列。構建體包括一個載體，如質粒或病毒載體，其中本發明的序列以正向或反向被插入該載體中。在該實施方案的一個優選方面，構建體進一步包括調節序列，例如包括一個可操作地與該序列連接的啟動子。也可以整合一個或多個其它插入物，以導致一個或多個其它分子的表達，如另一個肌醇六磷酸酶或蛋白酶，優選地所述一個或多個其它分子可以與本發明的肌醇六磷酸酶組合用于組合處理中。
大量合適的載體和啟動子對本領域熟練技術人員是已知的，而且可以通過商業通路獲得。“質粒”用小寫字母p來指定，其前和/或其后是大寫字母和/或數字。起始質粒在此處或者可以通過商業通路以及在無約束的基礎上從公開通路獲得，或者可以根據已公開的方法用可利用的質粒構建。另外，與那些描述的質粒等效的質粒在本領域是已知的，并且對普通技術人員是顯而易見的。
下述載體是通過實施例的方式提供的細菌pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBlusescript II(Stratagene)；pTRC99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia)；真核pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia)。然而，可以使用任何其它質粒或其它載體，只要它們在宿主中可以復制且可以生存。
可以使用CAT(氯霉素轉移酶)載體或其它帶有可選擇標記的載體從任何期望基因中選擇啟動區。兩個適當的載體是pKK232-8和pCM7。特別指定的細菌啟動子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸腺嘧啶核苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、來自逆轉錄酶病毒的LTR啟動子和小鼠金屬硫蛋白-I啟動子。適當載體和啟動子的選擇恰在本領域普通技術水平之內。
在另一個實施方案中，本發明涉及含有上述構建體的宿主細胞。宿主細胞可以是高級真核細胞如哺乳動物細胞，或低級真核細胞如酵母細胞，或者宿主細胞可以是原核細胞如細菌細胞。可以通過磷酸鈣轉染、DEAE-右旋糖苷介導轉染或電穿孔將構建體引入宿主細胞(Davis，1986)。
可以以傳統方式用宿主細胞中的構建體產生由重組序列編碼的基因產物。可選擇地，本發明的酶可以通過傳統肽合成儀合成產生。
在適當啟動子的控制下，可以在哺乳動物細胞、酵母、細菌或其它細胞中對成熟蛋白質進行表達。也可以用衍生于本發明的DNA構建體的RNA通過不含細胞的翻譯系統來產生這樣的蛋白質。對使用原核和真核宿主的適當的克隆和表達載體已經有所描述(如Sambrook等人，1989，此處引用其公開內容作為參考)。
通過將增強子序列插入載體中增加了用高級真核生物轉錄編碼本發明所述酶的DNA。增強子是DNA的順式作用元件，通常大約從10到300bp，它作用于啟動子來增加其轉錄。實例包括復制起點下游堿基對100到270的SV40增強子、細胞肥大病毒早期啟動子增強子、復制起點下游的多形瘤增強子和腺病毒增強子。
通常，重組表達載體將包括復制起點和允許宿主細胞轉化的可選擇標記，如大腸桿菌中的氨芐青霉素抗性和啤酒酵母TRP1基因和衍生自高表達基因的啟動子，以指導下游結構序列的轉錄。這樣的啟動子可以衍生于在其它生物中編碼糖解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)的操縱子、A-因子、酸性磷酸酶或熱休克蛋白。異種結構序列被裝配在具有翻譯起始序列和翻譯終止序列的適當的相中，優選地是能指導翻譯的酶釋放的前導序列。任選地，異種序列可以編碼融合酶，包括一個能賦予期望特征的N-末端識別肽，例如穩定性或表達重組產物的簡單純化。
用于細菌用途的有用的表達載體通過如下方式構建的，即將編碼期望蛋白質的結構DNA序列，和合適的翻譯起始信號和終止信號一起插入具有功能啟動子的可操作閱讀相中。載體將包括一個或多個表型可選擇標記和一個復制起點，以確保維持載體，并且如果期望，在宿主內提供擴增。用于轉化的合適的原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌和假單胞桿菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬中的不同種類，盡管作為選擇對象也可以使用其它原核宿主。
作為代表性但非限定性實例，用于細菌用途的有用的表達載體包括可選擇標記和衍生自商業通路獲得的質粒的細菌復制起點，其中該質粒含有熟知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)的遺傳元件。例如，這樣的商業載體包括pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。這些pBR322“骨架”部分是與適當的啟動子和被表達的結構序列組合的。
在轉化合適的宿主菌株之后，將宿主菌株培養到適當的細胞密度之后，用適當的方法(如變溫或化學誘導)誘導所選擇的啟動子，并且將細胞再培養一段時間。
一般用離心法收獲細胞，用物理或化學方法破裂細胞，保留所得到的粗糙提取物，用于進一步純化。
可以用任何便利的方法來破裂用于蛋白質表達的微生物細胞，包括冷凍-融化循環、超聲處理、機械破碎，或使用細胞裂解試劑，這些方法對本領域熟練技術人員是已知的。
也可以用各種哺乳動物細胞培養系統來表達重組蛋白質。正如(Gluzman，1981)所述，哺乳動物表達系統的實例包括猴腎成纖維細胞的COS-7系，和其它能表達相容載體的細胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK細胞系。哺乳動物表達載體包括復制起點、合適的啟動子和增強子，也包括任何必需的核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體位點和剪接受體位點、轉錄終止序列和5’側冀非轉錄序列。可以用衍生自SV40剪接的DNA序列和聚腺苷酸化位點提供所需的非轉錄遺傳元件。
可以用如下方法從重組細胞培養物中回收且純化酶硫酸銨或乙醇沉淀、酸性提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水交互層析、親水層析、羥磷灰石層析和凝集素層析。當需要時，可以在完成成熟蛋白質的構型中使用蛋白質重折疊步驟。最后，可以在最后的純化步驟使用高效液相層析(HPLC)。
本發明的酶可以是自然純化的產品，或者是化學合成步驟的產品，或者通過重組技術從原核或真核宿主(例如，通過培養物中的細菌、酵母、高級植物、昆蟲和哺乳動物細胞)產生。依賴于重組產生步驟中所用的宿主，本發明的酶可以被糖基化或不被糖基化。本發明的酶可以包括或不包括原始甲硫氨酸殘基。
在一個優選實施方案中，本發明的酶是肌醇六磷酸酶，它在加熱時很穩定，耐熱，并且可以催化肌醇六磷酸的酶性水解，即該酶在很短(即5～30秒)或更長的時間之后可以復性且恢復活性，例如暴露于高達50℃或稍高于50℃的溫度下數分鐘或數小時。
參考此處所包括的實施例對本發明做了進一步描述；然而，應該理解到本發明不限于這些實施例。除非另外指出，所有份數或數量以重量計算。
本發明也提供了一種分離的變體肌醇六磷酸酶多核苷酸，或其寡核苷酸部分，其中包括此處所公開的突變。在此所用，當用于多核苷酸、寡核苷酸或多肽時，術語“分離的”或“純化的”指，該物質存在的形式不同于其通常自然存在的形式。因此，多核苷酸或多肽存在于自然中的細胞中時，分離的多核苷酸或純化的多肽可以是，從與其通常相關的物質分離出來的，至少是部分分離出來的多核苷酸或多肽。一般而言，分離的多核苷酸或純化的多肽存在的形式是，它構成組合物的至少大約5％～10％，通常20％～50％，尤其大約50～75％，優選地大約90％～95％或更多。用于分離多核苷酸或多肽的方法是本領域已知且常規的。
作為分離的一部分或在分離之后，多核苷酸可以被連接到其它多核苷酸上，如DNA分子，例如，用于誘變研究，以形成融合蛋白，或用于宿主中多核苷酸的繁殖或表達。可以將單獨或連接有其它多核苷酸如載體的分離的多核苷酸引入宿主細胞中，引入培養物中或引入整個生物體中。由于它們不是以其自然形式存在，所以當被引入培養物中的宿主細胞或整個生物體中的宿主細胞中時，這樣的多核苷酸仍然被認為是“分離的”。同樣地，多核苷酸、寡核苷酸和多肽可以存在于組合物中，如培養基配方中(將多核苷酸、寡核苷酸或多肽引入細胞或組合物或溶液中用于化學或酶反應的溶液，該溶液不是自然存在的組合物)，并且正如此處所用，它們在該術語意思范圍內仍然是分離的多核苷酸、寡核苷酸或多肽。分離的多核苷酸可以是不與核苷酸序列直接鄰接的多核苷酸，它可以與核苷酸序列在基因組或其它自然界中自然存在的細胞DNA分子中直接鄰接。因此，重組多核苷酸，可以包括一個被整合進載體、自主復制質粒或病毒的多核苷酸；或整合進通常不表達特定多肽的原核或真核生物的基因組DNA中。
在此所用，術語“多核苷酸”或“寡核苷酸”或“核苷酸序列”或相似物指兩種或多種核苷酸或核苷酸類似物的聚合物。多核苷酸可以是核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)分子，并且可以是單鏈或雙鏈DNA或RNA，或雙鏈的DNA:RNA雜交體。多核苷酸或寡核苷酸可以含有一個或多個修飾堿基，例如肌苷堿基或三苯甲酯堿基。在聚合物中連接核苷酸的鍵通常是磷酸二酯鍵，但可以是日常用于連接核苷酸的其它鍵，例如包括硫代磷酸鍵、硫酯鍵等等。多核苷酸也可以是經過化學、酶或代謝修飾的形式。
在此所用，術語“突變體或變體多核苷酸”指，例如與SEQ ID NO1、7或9中所示的核苷酸序列相比，有一個或幾個核苷酸發生了變化的核苷酸序列。核苷酸變化可以是缺失、插入或取代，并且可以是沉默的，這樣在由野生型多核苷酸編碼的多肽的閱讀框中沒有變化，或者可以是導致氨基酸變化或將終止密碼子引入多核苷酸的變化，或者是涉及多核苷酸的轉錄或翻譯的核苷酸序列中的變化，例如一種導致基因轉錄物成為mRNA的剪接更改的變化。
為了便于討論且用作參考框架，在SEQ ID NO1或SEQ ID NO7中列出的肌醇六磷酸酶核苷酸序列被稱為“野生型”多核苷酸或“野生型”基因序列，并且同樣地，SEQ ID NO2或SEQ ID NO8中所示的多肽被稱為野生型肌醇六磷酸酶多肽。
變體肌醇六磷酸酶多核苷酸的實例包括實質上在SEQ ID NO7中所示的序列，其中多核苷酸具有一個在以下所示的多核苷酸序列a)SEQ ID NO9；b)SEQ IDNO9中所示的核苷酸序列，其中所有的T是U(RNA)；其中編碼肌醇六磷酸酶的核酸的表達導致產生了所述基本上純化的肌醇六磷酸酶；和c)SEQ ID NO7，其中390為G；391為A；核苷酸438為T；439為G；440為G；471為C；473為T；477為T；448為G；449為T；690為G；691為A；692為G；729為T；730為A；731為T；864為T；865為G；1017為G，或其任意組合。更明確地說，關于c)部分，本發明提供了一個與SEQ ID NO7基本上相同的核苷酸序列，并具有一個選自核苷酸390為G和391為A；核苷酸438為T、439為G和440為G；471為C和473為T；477為T、448為G和449為T；690為G、691為A和692為G；729為T、730為A和731為T；864為T和865為G；1017為G或其任意組合的修飾核苷酸序列。
本發明的變體肌醇六磷酸酶多核苷酸的實例也包括一個編碼具有基本上在SEQ ID NO8中列出的多肽的多核苷酸，但具有W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R180Y、N226C、Y277D或其任意組合，并且保持了肌醇六磷酸酶活性。
本發明的突變體多核苷酸的其它實例包括的多核苷酸序列為它們可以與這些多核苷酸序列的互補鏈，或它們的寡核苷酸部分可選擇地雜交，正如此處所公開的，在高度嚴格雜交條件下，如在65℃的溫度下，在0.5MNaHPO4、7％十二烷基磺酸鈉(SDS)、1mM EDTA中與濾膜結合DNA雜交，并且在68℃的溫度下，在0.1x SSC/0.1％ SDS中洗滌，(Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，(Green Publishing Associates，Inc.，和John Wiley&Sons，Inc.，New York 1989)，和補遺參考第2.10.3頁；Sambrook等人，Molecular CloningA laboratory manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)，將它們引用于此作為參考)，以及編碼基本上在SEQ ID NO8中列出的肌醇六磷酸酶多肽的多核苷酸，但具有一個或多個突變；或一個與這樣的多核苷酸相應的RNA(如SEQ ID NO9)。
與SEQ ID NO1或SEQ ID NO7的肌醇六磷酸酶多核苷酸或SEQ ID NO2或SEQ ID NO8的多肽序列“基本上相同”的多核苷酸或多肽序列一般是至少80％或85％，通常至少大約90％，尤其至少大約95％，優選地至少大約99％分別與SEQ ID NO1、7或9或SEQ ID NO2、8或10中列出的核苷酸序列或氨基酸序列相同。在本發明的一個方面，基本上與SEQ ID NO1、7或9或2、8或10相同的多核苷酸序列或多肽序列在具有一個突變的一個或多個位點有所變化，例如存在于上段中列出的變體肌醇六磷酸酶多核苷酸中的突變體。可以用序列分析軟件(如Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group，University ofWisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison WI 53705)來測量序列同一性。
本發明的多核苷酸或其寡核苷酸部分是有用的，例如作為擴增反應的探針或引物。關于多核苷酸的“寡核苷酸部分”指變體或小于全長多核苷酸的突變體多核苷酸的核苷酸序列。一般而言，作為探針或引物有用的寡核苷酸包括至少大約10個核苷酸，通常包括大約15～30個核苷酸或更多(例如，參考表1和表2)。可以用任何合適的方法來制備多核苷酸和寡核苷酸，例如包括通過適當多核苷酸的限制性酶消化法，通過使用下述方法的直接化學合成，這些方法如磷酸三酯法(Narang等人，1979，Meth.Enzymol.，6890-99)；磷酸二酯法(Brown等人，1979，Meth.Enzymol.，68109-151)；二乙基亞磷酰胺法(Beaucage等人，1981，TetrahedronLett.，221859-1862)；三酯法(Matteucci等人，1981，J.Am.Chem.Soc.，1033185-3191)，包括通過自動合成法；或通過固相支持法(例如，參考美國專利4,458,066)。另外，可以用此次公開的或本領域已知的重組DNA法來制備多核苷酸或寡核苷酸。
本發明的寡核苷酸可以包括肌醇六磷酸酶多核苷酸的一部分，例如包括與SEQ ID No7的序列基本上相同的序列，除了其中核苷酸390為G；391為A；核苷酸438為T；439為G；440為G；471為C；473為T；477為T；448為G；449為T；690為G；691為A；692為G；729為T；730為A；731為T；864為T；865為G；1017為G，或其中寡核苷酸含有涉及SEQ ID NO7中的取代的組合。因此，正如此處所公開的，寡核苷酸可以是任意長度，并且可以包括一個或多個上述突變。
本發明的寡核苷酸可以選擇性地與此處所公開的突變體肌醇六磷酸酶多核苷酸序列雜交。在此所用，“選擇性地雜交”指寡核苷酸(或多核苷酸)探針與突變體多核苷酸雜交，但基本上不與野生型序列雜交的能力。正如此處所描述的，可以通過改變雜交條件的嚴格性得到允許選擇雜交的條件，而且允許選擇雜交的條件部分依賴于探針的長度、相對的G∶C含量、鹽濃度等等(參考Sambrook等人，見上文，1989)。例如，高度嚴格的雜交條件包括，在大約37℃的溫度下(對于含有14個核苷酸的DNA探針)，在大約48℃的溫度下(對于含有17個核苷酸的探針)，在大約55℃的溫度下(對于一個含有20個核苷酸的探針)，在大約60℃的溫度下(對于一個含有23個核苷酸的探針)，在6x SSC/0.05％焦磷酸鈉中洗滌。
本發明的寡核苷酸可以被用作探針來篩選相關的特定變體或突變體。另外，本發明的寡核苷酸包括一個有用的反義分子，例如在多核苷酸序列包括突變體肌醇六磷酸酶多核苷酸序列的多核苷酸調控和擴增反應中有用。而且，這樣的寡核苷酸可以被用作核酶的一部分，或用于肌醇六磷酸酶基因調控的三股螺旋序列。仍然進一步，這樣的寡核苷酸可以被用作診斷方法的組分，這樣可以確定肌醇六磷酸酶的轉錄水平。而且，可以使用這樣的寡核苷酸，例如用于從其它種類篩選且識別肌醇六磷酸酶同系物。
術語“引物”或“PCR引物”指分離的天然或合成寡核苷酸，當處于合適引物延伸的條件下時，可以作為DNA合成的起始點。引物延伸產物的合成是在合適的溫度下在適當的緩沖液中，在存在核苷三磷酸酯和聚合酶的情況下開始的。引物可以包括多個引物，例如其中在有關預合成的靶區的一端或兩端的信息中存在不明確性。例如，如果核酸序列是從蛋白序列確定出來的，所產生的用于合成編碼該蛋白序列的核酸序列的引物可以包括一個引物集合，其中包括代表基于遺傳密碼簡并性的所有可能的密碼子變異的序列。該集合中的一個或多個引物將與靶序列的末端或靶序列的側冀序列是同源的。另外，如果保守區在一個種群中表現出顯著水平的多態性，那么可以制備引物的混合物，用于擴增相鄰序列。
在PCR擴增中，用相關靶序列的引物對側冀來擴增靶序列。引物對通常包括一個與靶序列的5’端雜交的正向引物，和一個與靶序列的3’端雜交的反向引物。本發明的引物對包括至少一個正向引物和至少一個反向引物，該引物對允許產生擴增產物，該產物可以是大范圍的肌醇六磷酸酶專一性擴增產物或該擴增產物的嵌套擴增產物，包括一個正向引物和一個反向引物，前提是參考靶多核苷酸序列，正向引物是反向引物的5’端(或下游)，并且這些引物足夠接近，這樣就可以產生擴增產物。
可以產生編碼融合蛋白的核酸序列，并且可以將其可操作地連接到表達控制序列。這樣的融合蛋白和組合物在開發抗體中有用，或者可以產生且純化相關肽和多肽。在此所用，術語“可操作性地連接”指并置，其中這樣描述的組分的關系是允許它們以預定的方式發揮作用。例如，將一個表達控制序列可操作地連接到一個編碼序列上的連接導致編碼序列的表達，其條件在于與表達控制序列相適應的條件下，然而可以連接兩個可操作地連接的編碼序列，這樣它們處于同一閱讀框中，從而編碼融合蛋白。
在此所用，術語“表達控制序列”指調控與其可操作地連接的核酸序列的表達的核酸序列。當表現控制序列控制且調控核酸序列的轉錄和適當的翻譯時，表達控制序列被可操作地與核酸序列連接。因此，表達控制序列可以包括適當的啟動子、增強子、轉錄終止子、編碼蛋白的基因前面的起始密碼子(即ATG)、內含子的剪接信號、維持該基因的正確的閱讀框以允許mRNA的正確翻譯，以及終止密碼子。控制序列以最小量包括因其存在可以影響表達的組分，并且也包括其它因其存在是有利的組分，例如前導序列和融合配偶體序列。表達控制序列可以包括一個啟動子。
本發明的多核苷酸可以包括重組核酸分子的一部分，例如其可以編碼融合蛋白。可以將多核苷酸或重組核酸分子插入載體中，該載體可以是表達載體，并且可以衍生自質粒、病毒等等。表達載體通常包括一個復制起點、一個啟動子、一個或多個允許含有載體的轉化細胞的表型選擇的基因。適合用于本發明的載體包括但不限于，用于在細菌中表達的基于T7的表達載體(Rosenberg等人，Gene56125，1987)、用于在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee和Nathans，J.Biol.Chem.2633521，1988)；用于在昆蟲細胞中表達的衍生于桿狀病毒的載體；及類似物。
載體的選擇也依賴于多核苷酸序列的大小以及在本發明的方法中所用的宿主細胞。因此，用于本發明的載體可以包括質粒、噬菌體、粘粒、噬菌質粒、病毒(如反轉錄病毒、副流感病毒、呼腸孤病毒、副粘病毒等等)，或其選擇的部分(如外被蛋白、刺突糖蛋白、衣殼蛋白)。例如，通常在被分析或修飾的特定核酸序列很大時使用粘粒和噬菌質粒，這是因為這些載體能穩定地繁殖大的多核苷酸。粘粒和噬菌質粒尤其適合于SEQ ID NO1或7的肌醇六磷酸酶多核苷酸或SEQ IDNO9的突變體肌醇六磷酸酶多核苷酸的表達或操作。
在酵母中，可以使用許多含有組成型啟動子或誘導型啟動子的載體(參考Ausubel等人，見上文，1989；Grant等人，Meth.Enzymol.153516-544，1987；和TheMolecular Biology of the Yeast Saccharomyces，Eds.Strathern等人，Cold SpringHarbor Press，Vols.I和II，1982)。可以使用組成型酵母啟動子如ADH或LEU2或誘導型啟動子如GAL(“Cloning in Yeast，”第三章，“DNA Cloning”第11卷，A PracticalApproach，ed.Glover，IRL Press，1986)。可選擇地，可以使用可促進外源DNA序列整合進酵母染色體中的載體。轉染細胞中表達載體的構建和基因的表達涉及使用同樣在本領域已知的分子克隆技術(參考Sambrook等人，見上文，1989；Ausubel等人，見上文，1989)。這些方法包括體外重組DNA技術、合成技術和體內重組/遺傳重組。
可以在載體中包括多核苷酸或寡核苷酸，并且可以通過細胞的轉化或轉染將其引入細胞中。通過“轉化”或“轉染”指整合了新DNA(即細胞外源的DNA)之后，在細胞中誘導的永久(穩定)或瞬時遺傳變化。在細胞是哺乳動物細胞的場合，通常通過將DNA引入細胞的基因組中實現永久遺傳變化。
轉化細胞或宿主細胞可以是任何原核或真核細胞，其中已經通過重組DNA技術將本發明的多核苷酸序列或其片斷引入該轉化細胞或宿主細胞(或引入其祖細胞)中。可以用本領域熟練技術人員熟知的傳統技術來進行宿主細胞的轉化。在宿主是原核生物如大腸桿菌的場合，可以用本領域熟知的方法用指數生長期后收獲的細胞，隨后用CaCl2或用MgCl2或RbCl法對其進行處理制備能吸收DNA的感受態細胞。
當宿主是真核生物時，這些轉染方法包括使用磷酸鈣共沉淀、傳統的機械方法如顯微注射、電穿孔、插入嵌入脂質體中的質粒、或使用病毒載體、或其它本領域已知的方法。一種方法使用真核病毒載體如猿猴腎病毒40(SV40)或牛乳頭瘤病毒，瞬時地感染或轉化真核細胞且表達蛋白質。(Eukaryotic Viral Vectors，ColdSpring Harbor Laboratory，Gluzman ed.，1982)。優選地，真核宿主被用作此處描述的宿主細胞。真核細胞可以是酵母細胞(如釀酒酵母)，或可以是哺乳動物細胞，包括人類細胞。
可以用多種宿主表達載體相同來表達肌醇六磷酸酶多核苷酸序列，如SEQ IDNO1或SEQ ID NO7、SEQ ID NO1的編碼序列或突變體肌醇六磷酸酶多核苷酸如SEQ ID NO9。這樣的表達系統代表可以用來產生且隨后純化相關核苷酸序列的工具，當用編碼序列的適當核苷酸轉化或轉染時，也代表可以表達蛋白質的細胞，包括其原位變體或突變體多核苷酸或其多肽部分。這樣的細胞包括但不限于，微生物如用含有多核苷酸或其寡核苷酸部分(野生型、變體或其它突變體)的重組噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA表達載體轉化的細菌(如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌)；用含有多核苷酸或其寡核苷酸部分(野生型、變體或其它突變體)的重組酵母表達載體轉化的酵母(如釀酒酵母、Pichia)；用含有多核苷酸或其寡核苷酸部分(野生型、變體或其它突變體)的重組病毒表達載體(如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；用含有多核苷酸或寡核苷酸部分的重組病毒表達載體(花椰菜花葉病毒或煙草花葉病毒)感染或用含有多核苷酸或寡核苷酸部分的重組質粒表達載體(如Ti質粒)轉化的植物細胞系統；或含有重組表達構建體的哺乳動物細胞系統(如COS、CHO、BHK、293、3T3)，其中重組表達構建體含有衍生自哺乳動物細胞的基因組的啟動子(如金屬硫蛋白啟動子)或衍生自哺乳動物病毒的基因組的啟動子(如腺病毒晚期啟動子；牛痘病毒7.5K啟動子)。
在細菌系統中，可以依賴使用被表達的肌醇六磷酸酶蛋白質(肌醇六磷酸酶的野生型、變體或其它突變體)有利地選擇多種表達載體。例如，當將要產生出用于產生抗體或篩選肽文庫的大量這樣的蛋白質時，介導被很容易地純化的高水平融合蛋白產物表達的載體是期望的。這樣的載體包括但不限于，大腸桿菌表達載體pUR278(Ruther等人，1983，EMBO J.21791)，其中肌醇六磷酸酶多核苷酸或其寡核苷酸部分(野生型、變體或其它突變體)可以被單獨地連接進lacZ編碼區框架中的載體中，這樣就產生了融合蛋白；pIN載體(Inouye和Inouye，Nucl.AcidsRes.133101-3109，1985；Van Heeke和Schuster，J.Biol.Chem.2645503-5509，1989)；等等。pGEX載體也可以用于將外源多肽表達為與谷胱甘肽S-轉移酶(GST)融合的融合蛋白。一般而言，這樣的融合蛋白是可溶的，且可以通過吸附到谷胱甘肽-瓊脂糖顆粒上容易地從裂解的細胞中純化蛋白質，隨后在自由谷胱甘肽存在的情況下得到蛋白質。pGEX載體被設計包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位點，這樣所克隆的肌醇六磷酸酶蛋白、變體或突變體就可以從GST部分釋放出來。
在昆蟲系統中，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)被用作載體來表達外源基因。該病毒生長在草地夜蛾細胞中。肌醇六磷酸酶多核苷酸、或其寡核苷酸部分可以被單獨克隆進該病毒的非必需區(例如多角體蛋白基因)，并且置于AcNPV啟動子(例如多角體蛋白啟動子)的控制下。成功插入肌醇六磷酸酶多核苷酸或其寡核苷酸部分將導致多角體基因失活和非包含體型重組病毒(即缺乏通過多角體基因編碼的蛋白質表膜外殼)的產生。然后將這些重組病毒用于感染其中表達所插入基因的草地夜蛾細胞(參考Smith等人，1983，J.Virol.46584；美國專利4,215,051)。
在哺乳動物宿主細胞中，可以使用許多基于病毒的表達系統。在腺病毒被用作表達載體的情況中，肌醇六磷酸酶多核苷酸或其寡核苷酸部分可以被連接到腺病毒轉錄/翻譯控制復合物中，如晚期啟動子和三聯前導序列。然后通過體外或體內重組將該嵌合基因插入腺病毒基因組中。插入病毒基因組的非必需區如E1或E3區中在被感染宿主中產生了活的且能夠表達肌醇六磷酸酶蛋白(如野生型、變體或其突變體)的重組病毒(Logan和Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.美國813655-3659，1984)。被插入肌醇六磷酸酶序列的充分翻譯也需要特定起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子和相鄰序列。在包括其本身的起始密碼子和相鄰序列的整個多核苷酸被插入適當的表達載體中的情況下，不需要其它翻譯控制信號。然而，在僅有一部分插入的情況下，必需提供外源翻譯控制信號，例如包括ATG起始密碼子。而且，起始密碼子必需與目標編碼序列的閱讀框同相，以確保翻譯整個插入物。這些外源翻譯控制信號和起始密碼子可以有多種來源，天然的和合成的均可。可以通過包含適當的轉錄增強子元件、轉錄終止子等等來提高表達效率(參考Bittner等人，Meth.Enzymol.153516-544，1987)。
另外，可以選擇宿主細胞株，其調節插入序列的表達、或以特定方式修飾且加工被表達的多肽。對蛋白產物的這種修飾(如糖基化)和加工(如裂解)對蛋白質的功能很重要。不同宿主細胞對于蛋白質的翻譯后加工和修飾具有特有的且專一的機理。可以選擇適當的細胞系和宿主系統，以確保對將表達的外源蛋白質的正確的修飾和加工。為此目的，可以使用擁有多肽的初級轉錄、糖基化和磷酸化的正確加工細胞結構的真核宿主細胞。這樣的哺乳動物宿主細胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38等等。
為了長期、高產量的產生重組蛋白，優選的是穩定的表達。例如，可以對穩定地表達蛋白質的細胞系進行基因工程，該細胞系包括肌醇六磷酸酶的野生型、變體或突變體。使用含有病毒復制起點的表達載體，可以用受適當的表達控制元件(如啟動子和/或增強子序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點等等)控制的DNA和可選擇標記來轉化宿主細胞。在引入外源DNA之后，將進行了基因工程的細胞在富集培養基中培養1～2天，然后轉入選擇性培養基中。重組質粒中的可選擇標記使其具有選擇抗性，并且允許細胞將質粒穩定地整合進它們的染色體中并且生長到形成轉化灶，該轉化灶可以被克隆且擴展為細胞系。該方法可以被有利地用于對表達肌醇六磷酸酶變體或突變體多肽的細胞系進行基因工程。這樣進行了基因工程的細胞系在篩選和評價影響變體或突變體肌醇六磷酸酶多肽的內源活性的化合物中尤其有用。這樣進行了基因工程的細胞系也可以用來區別具有專一性或者非專一性影響的因子。尤其是，突變體細胞系應該缺少關鍵功能，并且不同突變體可以被用來用體內試驗識別關鍵功能域。
可以使用許多選擇系統，包括但不限于，單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell 11223，1977)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 482026，1962)和腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy等人，Cell 22817，1980)基因可以被分別用于tk-、hgprt-或aprt-細胞。而且，抗代謝物抗性可以被用作選擇如下基因的基礎，這些基因包括dhfr，它賦予氨甲蝶呤抗性(Wilgler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 773567，1980；O’Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527，1981)；gpt，它使得對霉酚酸具有抗性(Mulligan和Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072，1981)；neo，它使得對氨基糖苷G-418具有抗性(Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.1501，1981)；和hygro，它使得對潮霉素具有抗性(Santerre等人，Gene 30147，1984)。因此，本發明提供了一種載體，其含有一個突變體肌醇六磷酸霉多核苷酸、或其寡核苷酸部分、或一個或多個引物或它們的互補物，包括任意的含有與調節元件可操作相關的前述序列的表達載體，其中所述調節元件指導編碼序列或引物的表達；也提供了一種宿主細胞，其含有任意的與調節元件單獨或可操作相關的前述序列，其中所述調節序列可以指導由多核苷酸編碼的多肽適當的表達。
突變體肌醇六磷酸酶多核苷酸序列的同源物可以用兩個寡核苷酸引物通過進行聚合酶鏈式反應(PCR；參考美國專利4,683,202，將其引用于此作為參考)來分離，其中所述兩個寡核苷酸引物包括基于肌醇六磷酸酶多肽的氨基酸序列設計的簡并引物集合體，諸如SEQ ID NO8中闡明的或此處所公開的其突變體。反應模板可以是通過mRNA的反向轉錄獲得的cDNA，其中mRNA是從已知表達肌醇六磷酸酶或相應物的生物體制備的。可以對PCR產物進行亞克隆和測序或用許多方式操作(如通過嵌套式PCR進一步操作)，以確保擴增的序列表示肌醇六磷酸酶的序列或突變體多核苷酸序列。然后可以將PCR片斷用于通過標記擴增片斷且篩選核酸文庫(如噬菌體cDNA文庫)來分離全長cDNA克隆(包括含有突變體多核苷酸序列的克隆)。可選擇地，可以用標記的片斷篩選基因組文庫(對于克隆策略的綜述，例如參考Sambrook等人，見上文，1989；Ausubel等人，見上文，1989)。
已經從野生型氨基酸序列修飾的肌醇六磷酸酶多肽包括氨基酸殘基取代，例如負電荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；正電荷氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；包括具有相似親水值的不帶電的極性頭部基團的氨基酸包括下述亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。然而，在許多情況下，核苷酸取代可以是沉默的，不會在所編碼的多肽中引起變化。
與肌醇六磷酸酶多肽SEQ ID NO2或SEQ ID NO8或其肽部分基本上相同的突變體肌醇六磷酸酶多肽及其肽部分都包括在本發明的范圍之內。
可以用化學合成來制備合成多肽或肽，例如所熟知的固相化學肽合成法(例如，參考Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，852149-2154，1963；Stewart和Young，Solid PhasePeptide Synthesis，Second ed.，Pierce Chemical Co.，Rockford，I 11.，第11-12頁)，并且這些合成多肽或肽已經被用于可通過商業通路獲得的實驗室肽設計和合成試劑盒(Cambridge Research Biochemicals)。這樣的可通過商業通路獲得的實驗室試劑盒通常使用了Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，813998(1984)的教導，并且提供了在多個棒(rods)或針(pins)的頂端上合成肽，每一個肽均與一個單板相連。當使用這樣的系統時，由棒或針構成的板被顛倒過來而且插入到與其具有對應的孔或儲存池第二個板中，其含有用于吸附或固定適當的氨基酸至針或棒的頂端的溶液。通過重復該過程步驟，即顛倒和將針或棒的頂端插入適當的溶液中，從而使氨基酸合成為期望肽。
許多可得到的FMOC肽合成系統是有用的。例如，可以用AppliedBiosystems，Inc.，Model 431A自動肽合成儀在固相支持體上裝配多肽或片斷。該設備提供了快速得到本發明的肽，或者通過直接合成或者通過合成一系列可以用其它已知技術偶聯的片斷。因此，多肽和肽的化學合成方法對本領域的普通技術人員是熟知的，如可以通過固相技術合成肽，可以從樹脂裂解肽，和通過制備型高效液相層析純化肽(例如，參考Creighton，1983，ProteinsStructures and MolecularPrinciples，W.H.Freeman&Co.，N.Y.，第50-60頁)。合成肽的組分可以通過氨基酸分析或測序來確定，如使用Edman降解法(例如，參考Creighton，1983，見上文，第34-49頁)。因此，可以化學合成肌醇六磷酸酶多肽、變體或突變體的片斷。
在本發明的一方面，提供了一種產生如圖1所示的那些肌醇六磷酸酶的方法。該方法包括在允許核酸表達的條件下培養含有編碼酶(如SEQ ID No1、7或9)的多核苷酸的宿主細胞，并且任選地分離由核酸編碼的酶。培養宿主細胞的方法在實施例中進行了描述，并且這些方法對本領域的熟練技術人員是已知的。
在一個特定實施方案中，本發明提供了在轉基因植物或植物器官中表達肌醇六磷酸酶及其生產方法。在能夠指導肌醇六磷酸酶表達的調節序列的控制下，所提供的DNA表達構建體用于用編碼肌醇六磷酸酶的基因轉化植物。這些調節序列包括能夠在植物中指導轉錄的序列，或者以組成型，或者以階段專一和/或組織專一的方式。
表達的方式部分依賴于使用的植物或其部分。可以將本發明提供的轉基因植物和植物器官用于多種工業方法中，或者直接地，例如在動物飼料中，或者可選擇地，可以提取所表達的肌醇六磷酸酶，并且如果期望，可以在應用之前對其進行純化。可選擇地，可以直接使用重組宿主植物或植物部分。在一個特定方面，本發明提供了用含有增強量的肌醇六磷酸酶的種子催化肌醇六磷酸水解反應的方法。該方法涉及用含肌醇六磷酸的底物接觸轉基因、非野生型種子，種子優選地以殘渣形式或壓碎形式，并且涉及用種子中的酶增加反應率。通過將種子直接加入含肌醇六磷酸的底物中，本發明提供了一種針對提取且純化該酶的昂貴且成問題的方法的溶液。在一個特定的-但決不是限定性的-例證中，本發明也提供了處理方法，其中對缺少足夠酶供給的生物體使用含有該酶增強量的種子的形式。在一個優選實施方案中，將酶施用于生物體的時機的選擇是與含肌醇六磷酸的食品的消費相協調的。
可以用多種方法實現肌醇六磷酸酶在植物中的表達。尤其是，例如可以用于轉化大量植物種類的技術，所述大量植物種類包括雙子葉種類(如煙草、馬鈴薯、西紅柿、矮牽牛花、蕓苔)。因此，例如在植物中表達外源基因的策略是可用的。因此，仍然來自植物基因的調節序列已經被識別出，它們可以用于可在植物和植物細胞中功能性表達的嵌合基因的構建(如Klee等人，1987；Clark等人，1990；Smith等人，1990)。
可以用幾種技術，包括用根瘤農桿菌或毛根農桿菌轉化，實現將基因構建體引入植物中。從而可以被轉化的植物組織的非限定性實例包括原生質體、小孢子或花粉，外植體如葉子、莖干、根莖、下胚軸和cotyls。而且，可以通過顯微注射、電穿孔、粒子轟擊和直接DNA吸收將DNA直接引入原生質體和植物細胞或組織中。
可以通過多種表達系統在植物中產生蛋白質。例如，組成型啟動子如花椰菜花葉病毒的35S啟動子(Guilley等人，1982)對于在轉基因植物的實質上所有器官中的已表達蛋白的積累是有用的。可選擇地，高度組織專一和/或階段專一的引物在本發明中是有用的(Higgins，1984；Shotwell，1989)，以使表達偏向于目標組織和/或偏向于目標發育時期。與在本發明所述肌醇六磷酸酶分子的植物中的表達相關的進一步詳述已經公開，如美國專利5,770,413(Van Ooijen等人)和美國專利5,593,963(Van Ooijen等人)，盡管這些參考沒有教導本發明的發明分子，而是教導了真菌肌醇六磷酸酶的使用。
總的來說，與本發明相關的是，可以用多種方法來實現肌醇六磷酸酶在轉基因植物或植物部分中的重組表達。這樣的轉基因植物和植物部分可以作為重組表達的肌醇六磷酸酶的來源，可以被直接加入含肌醇六磷酸的材料中。可選擇地，可以將重組植物表達的肌醇六磷酸酶從植物材料中分離出，如果期望，在接觸肌醇六磷酸酶底物之前將其純化。
在本發明的上下文中，所選擇的植物包括但不限于，產生可食用花的農作物，如花椰菜(Brassica oleracea)、朝鮮薊(Cynara scolymus)，水果如蘋果(Malus，如domesticus)、香蕉(Musa，如acuminata)、漿果(如黑醋栗，Ribes如domesticus)、櫻桃(如甜櫻桃，Prunus，如avium)、黃瓜(Cucumis，如sativus)、葡萄(Vitis，如vinifera)、檸檬(Citrus limon)、甜瓜(Cucumis melo)、堅果(如胡桃，Juglans，如regia；花生，落花生hypogeae)、桔子(柑桔，如maxima)、桃子(Prunus，如persica)、梨(Pyra，如communis)、李子(Prunus，如domestica)、草莓(Fragaria，如moschata)、西紅柿(Lycopersicon，如esculentum)，葉子如紫花苜蓿(Medicago，如sativa)、卷心菜(如Brassica oleracea)、菊苣(Cichoreum，如endivia)、韭蔥(蔥屬植物，如porrum)、萵苣(Lactuca，如sativa)、菠菜(菠菜，如oleraceae)、煙草(煙草，如tabacum)，根莖如竹芋(竹芋，如arundinacea)、甜菜(Beta，如vulgaris)、胡蘿卜(Daucus，如胡蘿卜(carota)、木薯(木薯，如esculenta)、蕪箐甘藍(蕓苔，如rapa)、蘿卜(Raphanus，如sativus)、山藥(薯蕷屬，如esculenta)、甘薯(番茄屬白薯(Ipomoea batatas))，和種子如豆(Phaseolus，如vulgaris)、豌豆(Pisum，如sativum)、大豆(Glycin，如max)、小麥(小麥屬植物，如aestivum)、大麥(大麥屬，如vulgare)、玉米(Zea，如mays)、稻米(Oryza，如sativa)、油菜籽(Brassica napus)、粟(黍L.)、向日葵(Helianthus annus)、燕麥(Avena sativa)，塊莖如大頭菜(蕓苔如oleraceae)、馬鈴薯(茄屬植物，如tuberosum)等等。
應該理解到，可以在本發明的上下文中使用其它植物以及非植物表達系統。植物種類的選擇主要是通過植物或其部分的目標用途以及植物種類對于轉化的可控制性決定的。
幾種技術可以用于將含有編碼肌醇六磷酸酶的DNA序列的表達構建體引入靶植物中。這樣的技術包括但不限于用鈣/聚乙二醇法、電穿孔或顯微注射或(有被)粒子轟擊來轉化原生質體(Potrykus，1990)。除了這些所謂的直接DNA轉化法，涉及載體的轉化系統是可以廣泛得到的，如病毒載體(如來自花椰菜花葉病毒(CaMV))和細菌載體(如來自農桿菌屬)(Potrykus，1990)。在選擇和/或篩選之后，可以用本領域已知的方法將已經被轉化的原生質體、細胞或植物部分再生成為整個植物(Horsch等人，1985)。轉化和/或再生技術的選擇對本發明不是關鍵性的。
對于雙子葉植物，本發明的優選實施方案使用了二元載體系統(Hoekema等人，1983；EP 0120516 Schiperoort等人)的原則，其中該系統使用了含有帶有毒力基因的vir質粒和含有被轉化的基因構建體的相容質粒的農桿菌菌株。該載體可以在大腸桿菌和農桿菌中復制，并且衍生自二元載體Bin19(Bevan，1984)，該載體在細節上做了一些變化，這些變化與本發明無關。在該實施例中所用的這些二元載體在T-DNA的左邊界序列和右邊界序列之間，含有一個編碼卡那霉素抗性的同一NPT II-基因(Bevan，1984)和一個在必需的基因構建體中用于克隆的多克隆位點。
單子葉作物的轉化和再生不是一個標準方法。然而，最近的科學進展表明單子葉植物大體上能適合轉化，而且表明可以從轉化細胞再生能育的轉基因植物。這些作物的再生性組織培養系統以及用于將遺傳物質引入植物細胞中的有效方法的開發已經促進了轉化。目前，所選擇的用于轉化單子葉植物的方法是外植體或懸浮細胞的微粒轟擊，和直接DNA吸收或原生質體的電穿孔。例如，已經用編碼潮霉素抗性的細菌hph基因作為選擇標記成功地獲得了轉基因水稻植物。基因是通過電穿孔引入的(Shimamoto等人，1993)。已經通過用微粒轟擊將編碼膦絲菌素乙酰轉移酶(阻止除草劑膦絲菌素活動的酶)的鏈霉菌屬hygroscopicus bar基因引入玉米懸浮培養物的胚胎細胞中獲得了轉基因玉米植物(Gordon-Kamm等人，1990)。已經報導了將遺傳物質引入其它單子葉作物如小麥和大麥的糊粉原生質體中(Lee等人，1989)。已經通過僅選擇老化的致密物和結節狀胚胎懸浮培養物從胚胎懸浮培養物中再生出小麥植物，用于建立胚胎懸浮培養物(Vasil等人，1972Vasil等人，1974)。將轉化系統結合用于這些作物可以使本發明應用于單子葉植物。這些方法也可以被用于雙子葉植物的轉化和再生。
肌醇六磷酸酶構建體的表達涉及這樣的細節，如通過植物聚合酶轉錄基因，mRNA的翻譯等，這些細節在重組DNA技術領域對熟練技術人員是已知的。下面僅對與本發明的正確理解有關的細節做了描述。可以將已知或被發現引起肌醇六磷酸酶的表達的調節序列用于本發明。所用的調節序列的選擇依賴于相關靶農作物和/或相關靶器官。這樣的調節序列可以從植物或植物病毒獲得，或者可以化學合成。這樣的調節序列是在植物中指導轉錄的啟動子，依賴于使用的植物或其器官，或者組成型，或者階段專一和/或組織專一。這些啟動子包括但不限于表現出組成型表達的啟動子，如花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子(Guiley等人，1982)；那些用于葉子專一性表達的啟動子，如核酮糖二磷酸羧化酶小亞基基因的啟動子(Coruzzi等人，1984)；那些用于根專一性表達的啟動子，如來自谷氨酰胺合酶基因的啟動子(Tingey等人，1987)；那些用于種子專一性表達的啟動子，如來自Brassica napus的cruciferin A啟動子(Ryan等人，1989)；那些用于塊莖專一性表達的啟動子，如來自馬鈴薯的I級patatin啟動子(Koster-Topfer等人，1989；Wenzler等人，1989)或那些用于果實專一性表達的啟動子，如來自西紅柿的多聚半乳糖醛酸酶(PG)啟動子(Bird等人，1988)。
其它調節序列如終止序列和聚腺苷酸化信號包括任何在植物中發揮指導轉錄作用的序列，選擇哪種在熟練技術人員的知識水平之內。這樣的序列的實例是根瘤農桿菌的胭脂氨酸合酶(nos)基因的3’側冀區(Bevan，見上文)。調節序列也包括增強子序列，如在CaMV的35S啟動子中發現的增強子序列，和mRNA穩定序列如苜蓿花葉病毒(AIMV)RNA4的前導序列(Brederode等人，1980)，或任何以類似方式發揮作用的其它序列。
應該在允許表達蛋白的穩定性的環境中表達肌醇六磷酸酶。可以依賴于肌醇六磷酸酶的生物物理參數，選擇細胞區室如胞質溶膠、內質網、液泡、蛋白體或周質間隙用于本發明中，以創造這樣的穩定環境。這樣的參數包括但不限于，最適pH、對蛋白酶的靈敏度或對優選區室摩爾濃度的靈敏度。
為了達到在細胞的細胞質中的表達，被表達的酶不應該含有分泌信號肽或任何其它定向序列。為了在葉綠體和線粒體中表達，被表達的酶應該含有用于輸入到這些細胞器官中的專一性所謂轉運肽。可以附加在相關酶上以實現該目的的定向序列是已知的(Smeekens等人，1990；van den Broeck等人，1985；Wolter等人，1988)。如果在液泡中期望酶具有活性，那么必需存在分泌信號肽，以及指導該酶到達這些液泡的專一性定向序列(Tague等人，1990)。這對于種子中的蛋白體也是如此。編碼相關酶的DNA序列以這樣的一種方式被修飾，即該酶可以在細胞中期望位置發揮作用。
為了實現肌醇六磷酸酶的胞外表達，本發明的表達構建體使用了分泌信號序列。盡管與植物宿主物種同源(天然的)的信號序列是優選的，但也可以使用異源信號序列，即那些來源于其它植物物種或起始于微生物起源的信號序列。這樣的信號序列對本領域的熟練技術水平的人員是已知的。可用于本發明上下文中的適當的信號序列在下述文獻中已經公開Blobel等人，1979；Von Heijne，1986；Garcia等人，1987；Sijmons等人，1990；Ng等人，1984；和Powers等人，1996。
如果期望，可以用本領域熟練技術水平人員已知的方法對本發明相關DNA構建體(啟動子、調節序列、分泌序列、穩定序列、定向序列或終止序列)的所有部分進行修飾，以影響它們的控制特性。在此指出，可以使用含有通過本發明獲得的肌醇六磷酸酶的植物，以獲得更具有較高肌醇六磷酸酶水平的植物或植物器官。例如，通過使用體細胞克隆變異技術或通過雜交育種技術獲得這樣的植物或植物器官是可能的。這樣的技術對于本領域的熟練技術水平人員是熟知的。
在一個實施方案中，本發明提供了一種獲得用于肌醇六磷酸酶和其它分子的高效率過量表達系統的方法(及其產物)。在一個優選實施方案中，本發明提供了一種獲得用于木霉菌屬的肌醇六磷酸酶和pH為2.5的酸性磷酸酶的高效率過量表達系統的方法(及其產物)。該系統產生了在動物飼料行業尤其有用的酶組合物。關于該方法的其它細節在公共文獻中和/或對熟練技術人員是已知的。在一個特定的非限定性例證中，這樣的可以公開獲得的文獻包括EP 0659215(WO 9403612 A1)(Nevalainen等人)，盡管這些參考文獻沒有教導本申請的發明分子。
在一個實施方案中，本發明提供了一種方法(及其產物)，該方法產生了具有肌醇六磷酸酶活性的穩定的含水液體配方，該配方對酶活性的加熱滅活表現出增強的抗性，并且在長時間的存儲中保持了它們的肌醇六磷酸酶活性。液體配方是通過加入作為穩定劑的尿素和/或多元醇如山梨糖醇和丙三醇穩定的。本發明也提供了用于單胃動物的飼料制劑及其產生方法，所述飼料制劑是使用這樣的穩定含水液體配方產生的。關于該方法的其它細節在公共文獻中和/或對熟練技術人員是已知的。在一個特定的非限定性例證中，這種可以公開獲得的文獻包括EP 0626010(WO 9316175 A1)(Barendse等人)，盡管這種可通過公開通路獲得文獻中的參考沒有教導本申請的發明分子。
在一個實施方案中，本發明提供了一種水解肌醇六磷酸的方法，包括將肌醇六磷酸與一種或多種此處公開的新肌醇六磷酸酶分子接觸。因此，本發明提供了一種催化肌醇六磷酸到肌醇和自由磷酸的水解方法，以便從肌醇六磷酸復合物釋放礦物質。該方法包括將肌醇六磷酸底物與本發明的降解有效量的酶接觸，如SEQID NO2中所示的酶。術語“降解有效”量指，與不用酶接觸的肌醇六磷酸相比，降解至少50％的肌醇六磷酸的所需酶的數量，優選地，降解至少80％的肌醇六磷酸。
在另一個實施方案中，本發明提供了一種在肌醇六磷酸中水解磷-單-酯鍵的方法。該方法包括使用有效量的本發明所述肌醇六磷酸酶分子(例如，SEQ ID NO2)，以產生肌醇和自由磷酸。“有效”量指，與不用酶接觸的肌醇六磷酸相比，降解至少50％的磷-單-酯鍵所需酶的數量，優選地，降解至少80％的鍵。
在一個特定方面，當期望時，肌醇六磷酸酶分子可以與其它試劑組合使用，如其它催化劑；以便影響肌醇六磷酸分子和/或底物來源的其它分子中的化學變化(如水解)。根據該方面，優選地肌醇六磷酸酶分子和其它試劑(或多種試劑)將不會互相抑制，更優選地肌醇六磷酸酶分子和其它試劑(或多種試劑)將產生總加成效應，更優選地仍然肌醇六磷酸酶分子和其它試劑(或多種試劑)將產生總協同效應。
底物肌醇六磷酸分子的相關來源包括食品、潛在食品、食品的副產品(體外副產品和體內副產品，如體內反應產物和動物的糞便產物)、食品的前體和任何其它肌醇六磷酸物質來源。
在一個非限定性方面，重組肌醇六磷酸酶可以被生物體消費，并且在消費時保持活性。在另一個例證中，可以用轉基因方法來實現重組肌醇六磷酸酶的表達-優選地以可控方式(可以用來以階段專一性和組織專一性方式控制轉基因分子的表達的方法)。
在一個特定例證中，在消費時來源物質(如轉基因植物來源或重組原核宿主)中的肌醇六磷酸酶活性可能增加；這種活性增加可能發生，例如，在原形式的前體肌醇六磷酸酶分子轉化為更成熟形式的活性更顯著的酶時，其中所述轉化可能由，例如肌醇六磷酸酶來源的攝入和消化產生。在肌醇六磷酸酶與肌醇六磷酸接觸時，肌醇六磷酸底物的水解可能在任意時間發生；例如，水解可能在底物或酶或兩者攝入之前，或攝入之后，或攝入之前和攝入之后發生。因此應該意識到，肌醇六磷酸底物可以與-除了肌醇六磷酸酶-一種或多種其它試劑接觸，如另一種酶，它們也可以被直接應用或從其它來源物質純化之后應用。
應該意識到，肌醇六磷酸酶來源物質可以直接與肌醇六磷酸來源物質接觸；如肌醇六磷酸酶來源和肌醇六磷酸來源之一或者兩個的體外或體內研磨或咀爵。可選擇地，在肌醇六磷酸酶分子與肌醇六磷酸底物接觸之前，肌醇六磷酸酶分子可以從來源物質純化，或者肌醇六磷酸底物可以從來源物質純化，或者肌醇六磷酸酶分子和肌醇六磷酸底物可以從來源物質純化。應該意識到，可以組合使用純化和未純化試劑-包括酶或底物或兩者。
應該意識到，可以將一種以上的來源物質用作肌醇六磷酸酶活性來源。這可以作為一種方式來實現試劑從來源物質(或多種來源物質)的定時釋放，其中從它們的來源物質的不同試劑中的釋放的發生了不同，例如當被攝入的來源物質在體內被消化，或者當來源物質在體外應用中被處理。在可能遭遇的條件范圍及其波動下-如pH值、溫度、鹽度和時間間隔-例如在一個應用的不同處理步驟中，也可以用一種以上的肌醇六磷酸酶活性來源物質來獲得肌醇六磷酸酶活性。為了得到不同的試劑，也可以使用不同的來源物質，例如肌醇六磷酸酶和/或肌醇六磷酸和/或其它物質的一種或多種形式或異構體。
應該意識到，一種單一來源物質，如轉基因植物物種(或其植物部分)可以是一種肌醇六磷酸酶和肌醇六磷酸的來源物質；并且酶和底物可以在所述單一來源中被不同地區室化-如分泌型與非分泌型，在不同植物部分或器官或組織或在同一植物部分或器官或組織的亞細胞區室中，被差別表達和/或具有差別豐度。其中所含的肌醇六磷酸酶分子的純化可以包括，一個或多個期望植物部分或器官或組織或亞細胞區室的分離和/或進一步處理。
在一個特定方面，本方面提供了一種用含有增強量的酶的種子催化體內和/或體外反應的方法。該方法包括將轉基因、非野生型種子，優選地以研磨形式，加入反應混合物中，并且使得種子中的酶增加反應率。通過將種子直接加入反應混合物中，該方法給更昂貴且更麻煩的提取且純化酶的方法提供了一種溶液。由此這些處理方法也提供了將一種缺少足夠酶供給的生物體以種子形式施用該酶，其中種子來源于一種或多種植物物種，優選地是轉基因植物物種，含有增強量的酶。關于該方法的其它細節在公共文獻中和/或對熟練技術人員是已知的。在一個特定的非限定性例證中，這種可以公開獲得的文獻包括美國專利5,543,576(Van Ooijen等人)和美國專利5,714,474(Van Ooijen等人)，盡管這些參考文獻沒有教導本申請的發明分子，而是教導了真菌肌醇六磷酸酶的使用。
在一個特定的非限定性實例中，本發明所述肌醇六磷酸酶分子可用于產生重組消化系統生命形式(或微生物或植物群)，并且在將所述重組消化系統生命形式施用于動物中有用。施用可以任選地單獨進行或組合其它酶和/或其它可以在消化系統中提供酶活性的生命形式進行，其中所述其它酶和所述生命形式可以是重組的或其它的。例如，施用可以組合木聚糖水解細菌進行。
在一個非限定性方面，本方面提供了一種在存在含有一種或多種肌醇六磷酸鈣鎂降解酶的酶制劑的情況下，將玉米或高粱粒浸漬于含有二氧化硫的溫水中的方法，優選地該酶制劑的量要使得玉米或高粱中存在的肌醇六磷酸鈣鎂被基本上降解。酶制劑可以包括肌醇六磷酸酶和/或酸性磷酸酶以及任選地其它植物物質降解酶。浸漬時間可以是12～18小時。可以用中間的研磨步驟中斷浸漬，以降低浸漬時間。在一個優選實施方案中，在存在一種酶制劑包括一種或多種肌醇六磷酸鈣鎂降解酶，如肌醇六磷酸和酸性磷酸酶的情況下，將玉米或高粱粒浸漬于含有二氧化硫的溫水中，以除去或大大地降低肌醇六磷酸和肌醇六磷酸的鹽。關于該方法的其它細節在公共文獻中和/或對熟練技術人員是已知的。在一個特定的非限定性例證中，這種可以公開獲得的文獻包括美國專利4,914,029(Caransa等人)和EP 0321004(Vaara等人)，盡管這些參考文獻沒有教導本申請的發明分子。
在一個非限定性方面，本方面提供了一種方法，以獲得具有期望物理特性如非粘著性和彈性的面包面團，以及一種高質量的面包產品，如包括將肌醇六磷酸酶加入面包面團的特定體積。在一個優選實施方案中，本發明的肌醇六磷酸酶分子被加入到隨后形成且烘干的工作面包面團制劑中。關于該方法的其它細節在公共文獻中和/或對熟練技術人員是已知的。在一個特定的非限定性例證中，這種可以公開獲得的文獻包括日本專利03076529(Hara等人)，盡管該參考文獻沒有教導本申請的發明肌醇六磷酸酶分子。
在一個非限定性方面，本發明提供了一種產生提高大豆食品的方法。將大豆與本發明的肌醇六磷酸酶分子組合，以便從大豆中去除肌醇六磷酸，從而產生用于消費生物體的在其微量營養要素供給中和其蛋白質的消化性中得到改進的大豆食品。在一個優選實施方案中，在大豆奶的產生中，將本發明的肌醇六磷酸酶分子加入大豆中，或與大豆接觸，以便降低肌醇六磷酸含量。在一個非限定性例證中，可以通過在加熱下攪拌大豆奶和酶，或者通過用固定酶在攪拌容器中進行混合型反應來加速應用過程。關于該方法的其它細節在公共文獻中和/或對熟練技術人員是已知的。在一個特定的非限定性例證中，這種可以公開獲得的文獻包括日本專利59166049(Kamikubo等人)，盡管該參考文獻沒有教導本申請的發明分子。
一方面，本發明提供了一種產生用于飲用水或動物飼料的液體形式的混合產物的方法，該方法包括使用礦物質混合物和維生素混合物，并且也使用了本發明的新肌醇六磷酸酶分子。在一個優選實施方案中，得到了一種正確劑量和組成的用于消費生物體必需的營養素混合物，而沒有任何重要礦物質/維生素的沉淀和破壞風險，同時實現了飼料中肌醇六磷酸鈣鎂束縛的磷酸的最適利用。關于該方法的其它細節在公共文獻中和/或對熟練技術人員是已知的。在一個特定的非限定性例證中，這種可以公開獲得的文獻包括EP 0772978(Bendixen等人)，盡管該參考文獻沒有教導本申請的發明分子。
應該意識到，也可以基于使用霉菌和/或基于谷物和/或基于其它植物，用本發明的肌醇六磷酸酶分子產生其它酒精和非酒精可飲用食品(或飲料)。這些可飲用食品包括酒精飲料、葡萄酒、混合酒精飲料(如葡萄酒冷卻器、其它酒精咖啡如愛爾蘭熱咖啡等)、啤酒、薄啤酒、果汁、提取物、均漿和濃湯。在一個優選例證中，用即將公開的肌醇六磷酸酶分子來產生可用于產生這些可飲用食品的轉基因型霉菌和/或谷物和/或其它植物。在另一個優選例證中，在這些可飲用食品的制造過程和/或最終含量中，即將公開的肌醇六磷酸酶分子被用作其它成分。關于該方法的其它細節在公共文獻中和/或對熟練技術人員是已知的。然而-由于本發明的新穎性-可以公開獲得的文獻的參考中沒有教導即將公開的發明分子。
在另一個非限定性例證中，本發明通過了一種方法，獲得具有降低量的肌醇六磷酸鈣鎂和增加含量的肌醇的精制日本米酒。這種日本米酒對于肝病、動脈硬化和其它疾病可能具有-通過直接和/或心理效應-預防作用。在一個優選實施方案中，這種日本米酒是通過繁殖具有高肌醇六磷酸酶活性的大米日本酒曲霉菌用作為原材料的大米日本酒曲產生的。應該意識到，可以用本發明的肌醇六磷酸酶分子來產生一種有用的霉菌，其具有增強活性(優選地是轉基因霉菌)和/或被外源加入來增強日本酒曲霉菌效果。該菌株被加入煮熟的大米中，并且日本酒曲是通過傳統方法產生的。在一個優選實施方案中，使用了所制備的日本酒曲，在兩個階段制備全米，在15℃的恒定溫度下產生日本米酒，以便產生目標精制日本米酒，其中肌醇六磷酸鈣鎂的量有所降低且肌醇的量有所增加。關于該方法的其它細節在公共文獻中和/或對熟練技術人員是已知的。在一個特定的非限定性例證中，這種可以公開獲得的文獻包括日本專利06153896(Soga等人)和日本專利06070749(Soga等人)，盡管這些參考文獻沒有教導本申請的發明分子。
在一個非限定性方面，本發明提供了一種獲得能促進礦物質吸收的吸收劑的方法，其中礦物質包括不需要被胃液或腸液以低成本消化的被攝取的鈣。在一個優選的實施方案中，所述礦物質吸收劑含有一種肌醇六磷酸的部分水解產物作為活性成分。優選地，肌醇六磷酸的部分水解產物是通過用本發明的肌醇六磷酸酶分子水解肌醇六磷酸或其鹽而產生的。具有所述的肌醇六磷酸酶分子的處理可以單獨發生和/或在組合處理中發生(以抑制或增強最終效果)，隨后在只要不釋放所有肌醇六磷酸自由基的范圍內抑制水解。關于該方法的其它細節在公共文獻中和/或對熟練技術人員是已知的。在一個特定的非限定性例證中，這種可以公開獲得的文獻包括日本專利04270296(Hoshino)，盡管可以通過公開通路獲得的文獻中的參考沒有教導本申請的發明分子。
在一個非限定性方面，本發明提供了一種方法(及其產物)，產生一種具有加成或優選地協同肌醇六磷酸水解活性的酶組合物；所述組合物包括本發明的新肌醇六磷酸酶分子和一種或多種其它試劑，以得到一種在組合處理中有用的組合物。在一個優選的實施方案中，本發明的組合處理是用至少兩種具有不同位置專一性的肌醇六磷酸酶，即1-、2-、3-、4-、5-和6-肌醇六磷酸酶的任意組合。通過組合不同位置專一性的肌醇六磷酸酶，就可以達到加成或協同效應。在組合中包括這些肌醇六磷酸酶的組合物如食物和飼料，或食物和飼料添加劑也包括在本發明中，以及用于它們制備的方法也包括在本發明中。關于該方法的其它細節在公共文獻中和/或對熟練技術人員是已知的。在一個特定的非限定性例證中，這種可以公開獲得的文獻包括WO 830681(Ohmann等人)，盡管可以通過公開通路獲得的文獻中的這些參考沒有教導本申請的發明分子。
在另一個優選的實施方案中，本發明的組合處理是通過使用具有肌醇六磷酸水解活性的酸性磷酸酶實現的，在pH值為2.5，以相對于pH值為2.5∶5.0的低比率使用，活性分布從大約0.1∶1.0～10∶1，優選地從大約0.5∶1.0～5∶1，更優選地仍然從大約0.8∶1.0～3∶1，更優選地仍然從大約0.8∶1.0～2∶1。所述酶組合物優選地通過熱處理表現出較高的協同肌醇六磷酸水解效率。可以將所述酶組合物用于食品(可飲用的和固體食物、飼料和飼料產物)處理中，以提高肌醇六磷酸水解。關于該方法的其它細節在公共文獻中和/或對熟練技術人員是已知的。在一個特定的非限定性例證中，這種可以公開獲得的文獻包括美國專利5,554,399(Vanderbeke等人)和美國專利5,443,979(Vanderbeke等人)，盡管這些參考文獻沒有教導本申請的發明分子，但相反教導了真菌(尤其是Aspegillus)肌醇六磷酸酶的使用。
在一個非限定性方面，本方面提供了一種產生組合物的方法(及其產物)，該組合物包括作用于本發明新肌醇六磷酸的酶，組合了一種或多種其它作用于多糖的酶。這些多糖可以選自arabinan、果聚糖、脫氧半乳聚糖、半乳聚糖、聚半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、果聚糖、巖藻聚糖、角叉藻聚糖、半乳卡洛糖、果膠、果膠酸、直鏈淀粉、出芽短梗霉聚糖、糖原、支鏈淀粉、纖維素、羧基甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、右旋糖酐、石耳素、幾丁質、瓊脂糖、角質素、軟骨素、皮膚素、透明質酸、褐藻酸，以及含有至少一種醛糖、酮糖、酸或氨基的多糖，它們選自赤蘚糖、蘇糖、核糖、樹膠醛醣、木糖、來蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔羅糖、赤蘚酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖酸、葡糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡萄糖胺、半乳糖胺和神經氨糖酸。
在一個特定方面，本方面提供了一種方法(及其產物)，該方法用來產生具有協同肌醇六磷酸水解活性的組合物，該組合物包括本發明的一種或多種新肌醇六磷酸酶分子、纖維酶(優選地包括但不僅僅是木聚糖酶)，任選地蛋白酶，和任選地一種或多種其它試劑。在一個優選的實施方案中，這樣的組合處理可以用于處理食品、木材制品，如紙制品，以及作為清潔用溶液和固體。
在另一個非限定性例證中，本發明的肌醇六磷酸酶分子可以與多纖維素酶體組分組合使用。已知許多纖維素分解細菌的纖維素酶被組織成為離散多酶復合物，稱作多纖維素酶體。多纖維素酶體的多個亞單位由許多功能域構成，它們互相作用并且與纖維素底物互相作用。這些亞單位中的一個亞單位包括一種獨特的新類別的非催化支架多肽，其選擇性地將各種纖維素酶和木聚糖酶亞單位整合進內聚復合物中。多纖維素酶體雜交的巧妙應用和多纖維素酶體域的嵌合構建體應該使得更好的使用纖維素生物量，并且可以在研究、醫藥和工業上提供廣泛的新應用。
在另一個非限定性例證中，本發明的肌醇六磷酸酶分子是有用的-或者單獨或者在組合處理中-在期望降低傳統上用于成漿和造紙行業的對環境有害的化學藥品使用量的生物成漿和生物漂白領域。在生物酶已經表現出有效，不僅在脫色領域而且在將潛在有害的物質生物轉化進有用的生物產品中的領域，廢水處理代表著另一種廣泛的應用領域。
在另一個非限定性例證中，本發明的肌醇六磷酸酶分子是可以用來產生能提供至少一種酶活性的生命形式-或者單獨或者在組合處理中-在生物體的消化系統處理中。被處理的顯著相關的生物體包括非反芻生物。更明確地說，應該意識到可以單獨或者組合其它生物分子(例如木聚糖酶)進行該方法，以產生一種可以表達多種生物分子的重組宿主。也應該意識到，本發明的肌醇六磷酸酶分子和/或表達本發明肌醇六磷酸酶分子的重組宿主的施用可以單獨或組合其它生物分子，和/或組合能在消化系統中提供酶活性的生命形式進行-其中所述酶和所述生命形式可以是重組的或其它形式。例如，施用可以組合木聚糖水解細菌進行。
例如，除了肌醇六磷酸，許多生物體也不能充分地消化半纖維素。半纖維素或木聚糖是植物物質的主要成分(35％)。對于反芻動物，大約50％的膳食木聚糖被降解，但在非反芻動物和人類的下腸道中僅有少量木聚糖被降解。在瘤胃中，主要的木聚糖水解種類是溶纖維丁酸弧菌和居瘤胃擬桿菌。在人類結腸中，類菌體卵圓形和類菌體脆壁亞種“a”是主要的木聚糖水解細菌。木聚糖是化學復合物，它們的降解需要多種酶。這些酶的通過腸道細菌的表達在這些種類中變化很大。溶纖維丁酸弧菌使得胞外木聚糖酶除類菌體種類具有細胞結合木聚糖酶活性。來自腸道細菌的木聚糖水解酶的生物化學特性還沒有完全搞清楚。已經從溶纖維丁酸弧菌113克隆了木糖苷酶基因。使用克隆于溶纖維丁酸弧菌49的木糖苷酶基因的DNA雜交數據表明該基因可能存在于其它溶纖維丁酸弧菌菌株中。從居瘤胃擬桿菌克隆的木聚糖酶被轉移進脆弱擬桿菌和單形擬桿菌，并且在其中被高度表達。來自卵形假桿菌的阿拉伯糖苷酶和木糖苷酶基因已經被克隆，并且兩者的活性表現出被一種單一、雙官能、新酶催化。
因此，應該意識到，本發明的肌醇六磷酸酶分子可用于1轉移進合適的宿主中(如溶纖維丁酸弧菌或居瘤胃擬桿菌)；2)在所獲得的重組宿主中實現充分的表達；和3)將所述重組宿主施用于生物體，以提高被處理生物降解肌醇六磷酸的能力。在遺傳和生物化學領域的持續研究將提供在腸道水平操縱消化的知識和洞察力，提高對結腸纖維消化的理解。
關于該方法的其它細節在公共文獻中和/或對熟練技術人員是已知的。在一個特定的非限定性例證中，這種可以公開獲得的文獻包括美國專利5,624,678(Bedford等人)、美國專利5,683,911(Bodie等人)、美國專利5,720,971(Beauchemin等人)、美國專利5,759,840(Sung等人)、美國專利5,770,012(Cooper等人)、美國專利5,786,316(Baeck等人)、美國專利5,817,500(Hansen等人)和雜志文章(Jeffries，1996；Prade，1996；Bayer等人，1994；Duarte等人，1994；Hespell & Whitehead，1990；Wong等人，1988)，盡管這些參考文獻沒有教導本申請的發明分子，也沒有教導將肌醇六磷酸酶分子加入食品、木材制品如紙制品的生產中，以及作為清潔用溶液和固體。相反，本發明教導了肌醇六磷酸酶分子-優選地本發明的發明肌醇六磷酸酶分子-可以被加入所公開的試劑(或多種試劑)中，以便得到具有其它肌醇六磷酸酶活性的制劑。優選地，所述試劑(或多種試劑)其它肌醇六磷酸酶分子將不互相抑制，更優選地所述(或多種試劑)其它肌醇六磷酸酶分子將具有總加成效應，更優選地仍然所述(或多種試劑)其它肌醇六磷酸酶分子將具有總協同效應。
在一個非限定性方面，本發明提供了一種方法(及其產物)，該方法通過給動物施用一種含有羥基化維生素D3衍生物的飼料組合物，用于在動物尤其是家禽中增強肌醇六磷酸磷的利用和處理以及阻止脛骨軟骨發育障礙。優選地將維生素D3衍生物施用于含有低水平的鈣和磷的動物飼料中，以增強肌醇六磷酸磷的利用。因此，優選地將維生素D3衍生物與本發明的新肌醇六磷酸酶分子組合使用，以進一步增強肌醇六磷酸磷的利用。關于該方法的其它細節在公共文獻中和/或對熟練技術人員是已知的。在一個特定的非限定性例證中，這種可以公開獲得的文獻包括美國專利5,516,525(Edwards等人)和美國專利5,366,736(Edwards等人)、美國專利5,316,770(Edwards等人)，盡管這些參考文獻沒有教導本申請的發明分子。
在一個非限定性方面，本方面提供了一種生產食品的方法(及其產物)，以獲得食品1)包括在生物體容易被吸收且以肌醇的形式被利用的肌醇六磷酸鈣鎂；2)能以糞便方式降低磷；和3)從而可以改善環境污染。所述食品包括一種含有肌醇六磷酸鈣鎂的谷物的混合物，一種產生乳酸的微生物和一種本發明的新肌醇六磷酸酶分子。在一個優選的實施方案中，所述食品是通過將含有肌醇六磷酸鈣鎂的谷物(優選地，例如米糠)與具有嗜酸特性的有效的微生物種群混合而產生的，從而產生乳酸，不產生丁酸，不具有致病性，且具有肌醇六磷酸酶。有效的微生物種群的實例包括，例如屬于放線菌種群的鏈霉菌屬sp.(ATCC 3004)和屬于乳桿菌素種群的乳桿菌屬sp.(IFO 3070)。進一步，根據基于谷物物質的細菌體重量，有效的微生物種群的優選添加量是0.2wt.％。而且，基于谷物物質中肌醇六磷酸鈣鎂的量，肌醇六磷酸酶的添加量優選地是1～2wt.％。關于該方法的其它細節在公共文獻中和/或對熟練技術人員是已知的。在一個特定的非限定性例證中，這種可以公開獲得的文獻包括日本專利08205785(Akahori等人)，盡管在這種可以公開獲得的文獻中的參考沒有教導本申請的發明分子。
在一個非限定性方面，本發明提供了一種提高蔬菜蛋白質溶解性的方法。更明確地說，本發明涉及用于溶解蔬菜蛋白質材料中的蛋白質的方法，這些方法包括用有效量的一種或多種肌醇六磷酸酶-包括本發明的肌醇六磷酸酶分子-處理蔬菜蛋白質材料，以及用有效量的一種或多種蛋白水解酶處理蔬菜蛋白質材料。另一方面，本發明提供了包括肌醇六磷酸酶和一種或多種蛋白水解酶的動物飼料添加劑。關于該方法的其它細節在公共文獻中和/或對熟練技術人員是已知的。在一個特定的非限定性例證中，這種可以公開獲得的文獻包括EP 0756457(WO9528850 A1)(Nielsen和Knap)，盡管在這種可以公開獲得的文獻中的參考沒有教導本申請的發明分子。
在一個非限定性方面，本發明提供了一種產生植物蛋白制劑的方法，該方法包括將蔬菜蛋白質材料物質分散于pH值在2～6之間的水中，并且將本發明的肌醇六磷酸酶分子混合于其中。分離出含有可溶性蛋白質的酸性提取物，并將其干燥以得到一種具有期望特性的固體蛋白質。也可以用一種或多種蛋白酶來提高蛋白質的特性。關于該方法的其它細節在公共文獻中和/或對熟練技術人員是已知的。在一個特定的非限定性例證中，這種可以公開獲得的文獻包括美國專利3,966,971(Morehouse等人)，盡管在這種可以公開獲得的文獻中的參考沒有教導本申請的發明分子。
在一個非限定性方面，本發明提供了一種方法(及其產物)，該方法用來激活土壤和/或混合肥料中的惰性磷，以提高氮化合物的使用率，并且通過將三種試劑、肌醇六磷酸酶、皂苷和脫乙酰殼多糖加入混合肥料中來抑制致病霉菌的繁殖。在一個非限定性實施方案中，該方法可以包括通過如下方式處理混合肥料1)將含有肌醇六磷酸酶的微生物加入介質中-優選地是能過量表達本發明的新肌醇六磷酸酶分子的重組宿主-例如在100ml介質/100kg濕混合肥料；2)也可選擇地加入含有肌醇六磷酸酶的植物材料-如麥麩-例如在0.2～1kg/100kg濕混合肥料；3)加入含有皂苷的材料-如泥炭、艾屬植物和絲蘭植物-例如0.5～3.0g/kg；4)加入含有脫乙酰殼多糖的物質-如蝦、蟹等粉碎的殼-如在100～300g/kg濕混合肥料。在另一個非限定性實施方案中，重組材料使用了三種試劑-肌醇六磷酸酶、皂苷和脫乙酰殼多糖。關于該方法的其它細節在公共文獻中和/或對熟練技術人員是已知的。在一個特定的非限定性例證中，這種可以公開獲得的文獻包括日本專利07277865(ToyaTaisuke)，盡管在這種可以公開獲得的文獻中的參考沒有教導本申請的發明分子。
本發明全長基因的片斷可以被用作cDNA或基因組文庫的雜交探針，以分離全長DNA，并且分離其它具有與該基因具有高序列相似性或與其具有相似生物活性的DNA。這種類型的探針具有至少10個堿基，優選地至少15個，甚至更優選地至少30個，并且含有，例如至少50個或更多個堿基。該探針也可以被用于識別與全長轉錄和基因組克隆或含有包括調節區和啟動區、外顯子和內含子的完整基因的克隆相應的DNA克隆。
本發明提供了識別編碼肌醇六磷酸酶多肽家族除SEQ ID NO1之外的成員的核酸分子的方法。在這些方法中，用肌醇六磷酸酶專一性探針，例如肌醇六磷酸酶專一性核酸探針篩選含有編碼肌醇六磷酸酶多肽的核酸的樣品，例如核酸文庫如cDNA文庫。肌醇六磷酸酶專一性核酸探針是核酸分子(例如含有DNA或RNA核苷酸的分子，或其組合或修飾)，該核酸分子與編碼肌醇六磷酸酶多肽的核酸特定地雜交，或與其互補序列雜交。術語“肌醇六磷酸酶專一性探針”，在本發明所述方法上下文中，指編碼肌醇六磷酸酶多肽的核酸或與其互補序列結合的探針，且結合程度比結合編碼其它酶或其互補序列的核酸更大。
本發明促進了肌醇六磷酸酶專一性核酸探針的產生。可以基于圖1所示氨基酸序列設計獲得這樣的探針的方法。可以用幾種標準方法中的任一種來產生這些可以含有至少12個核苷酸，例如至少15、25、35、50、100或150個核苷酸的探針(參考，例如Ausubel等人，見上文)。例如，優選地，這些探針是用PCR擴增方法產生的。在這些方法中，設計這些引物使得它們符合肌醇六磷酸酶保守序列(參考圖1)，它們可以包括肌醇六磷酸酶專一性氨基酸，并且所得到的PCR產物被用作探針來篩選核酸文庫，如cDNA文庫。
可以用本發明來分離與編碼圖1(SEQ ID NO1)中所公開的肌醇六磷酸酶的分離核酸分子基本上類似的核酸序列。如果分離核酸序列(i)能在此處描述的嚴格條件下與SEQ ID NO1雜交；或(ii)由于遺傳密碼的簡并性(例如與SEQ IDNO1簡并)，它們編碼SEQ ID NO2中闡明的肌醇六磷酸酶多肽，它們是基本上類似的，。
簡并DNA序列編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列，但在核苷酸編碼序列中有所變化。在此所用，“基本上類似”指與本發明的序列具有類似同一性的序列。可以通過雜交或通過序列比較來識別基本上類似的核苷酸序列。可以通過下述的一種或多種來識別基本上類似的酶序列蛋白水解消化、凝膠電泳和/或微量測序。
一種分離編碼肌醇六磷酸酶的核酸分子是使用本領域認可的方法，用天然或人工設計的探針來探查基因組基因文庫(參考，例如Ausubel等人，見上文)。本領域的熟練技術人員應該意識到，SEQ ID NO1或其片斷(包括至少15個相鄰核苷酸)是尤其有用的探針。用于該用途的其它尤其有用的探針是與SEQ ID NO1序列可雜交的片斷(即包括至少15個相鄰核苷酸)。
也可以理解，這些探針可以是并且是優選地用分析檢測試劑標記的，以促進探針的識別。有用的試劑包括但不限于放射性、熒光染料或能催化可檢測產物形成的酶。因此這些探針可用于從動物材料分離DNA的互補拷貝，或者用于篩選用于相關序列的這種材料。
關于與此處公開的特定核酸序列雜交的核酸序列，雜交可以在非嚴格、中等嚴格或甚至嚴格條件下進行。作為寡核苷酸雜交的一個實例，首先將含有固定化變性核酸的聚合物膜在45℃的溫度下，在含有0.9M NaCl、50mM NaH2PO4、pH為7.0、5.0mM Na2EDTA、0.5％SDS、10X Denhardt’s和0.5mg/mL多核糖腺苷酸的溶液中預雜交30分鐘。然后將大約2×107cpm(比活性4-9×108cpm/ug)的32P末端標記的寡核苷酸探針加入上述溶液中。在溫育12～16小時后，在含有0.5％SDS的1×SET(150mM NaCl、20mM Tris HCl、pH為7.8、1mM Na2EDTA)中在室溫下將膜洗滌30分鐘，隨后在新鮮的1X SET中在Tm-10℃下將寡核苷酸探針洗滌30分鐘。然后將膜暴露于自放射照相薄膜上用于檢測雜交信號。
在產生肌醇六磷酸酶基因產物(例如肌醇六磷酸酶RNA和肌醇六磷酸酶多肽)的標準方法中，本發明的核酸分子可以被用作模板。另外，編碼肌醇六磷酸酶多肽(及其片斷)和相關核酸的核酸分子-如(1)含有與編碼肌醇六磷酸酶多肽或其片斷(例如，含有至少12、15、20或25個核苷酸的片斷)的核酸互補或與雜交的序列的核酸；和(2)含有與編碼肌醇六磷酸酶多肽或其片斷(例如，含有至少12、15、20或25個核苷酸的片斷)的核酸互補的序列雜交的序列的核酸-可以被用于研究其雜交特性的方法中。例如，正如在此處進一步的詳述中所描述的，這些核酸分子可以被用于下述方法中用于合成肌醇六磷酸酶核酸的PCR法、用于檢測樣品中肌醇六磷酸酶核酸存在的方法、用于識別編碼新肌醇六磷酸酶家族成員的核酸的篩選方法。基于雜交的用途包括Southern-型、Northern-型、RNA保護和任何核酸被用作雜交配偶體的雜交方法。
本發明的多核苷酸的片斷或部分可以被用來合成本發明的全長多核苷酸。因此，本發明所述酶的片斷或部分可以被用來通過肽合成產生相應的全長酶；因此，這些片斷可以被用作中間體，用于產生全長酶。正如文獻中所描述的，通常用8％聚丙烯酰胺凝膠來進行裂解片斷的大小選擇(例如，通過Goeddel等人，1980)。
本發明提供酶、以及片斷、其它衍生物及其類似物，和用于定向進化的相應核苷酸。與單一模板蛋白質的定向進化相比，正如此處所公開的，多種模板的發現和使用可以顯著地增加定向進化的潛在產量。因此，發現的需求基于下述前提自然界在分子定群的不同但相關的成員中提供大量潛在達不到的或不可預知的特征，并且對這些特征的利用可以大大地促進定向進化。因此，一方面，相關但不同的分子可以作為用于目標特性的定向進化的唯一起始模板。另一方面，它們可以作為結構功能信息庫，包括但不限于，多種共有基元。兩種用途有助于在任意給定分子上避免進行對極度廣泛的突變置換進行迅速研究的邏輯上不切實際的工作。例如，在含有100個氨基酸的蛋白質上的全長突變置換有超過10130種可能性(假定在每一位置有20種氨基酸可能性)，這是一個對于實際研究來說太大的數據。
因此，尤其由于邏輯和技術限制，一種期望的方法-在進行“定向進化”中-用于發現且利用具有預進化差異的多種相關起始模板。這些模板可被用于多種誘變操縱中，包括通過非限定性例證的方式，DNA誘變和組合酶開發，該方法進一步詳述在共同未決的美國專利5,830,696(Short等人)中。
然后通過多種方法篩選所產生的新分子的酶活性，包括通過非限定性例證的方式a)分子淘選；b)重組克隆篩選；和c)提取物篩選。
本發明提供了酶、及其片斷、其它衍生物和其類似物，以及表達它們的細胞，其可以被用作免疫原產生針對它們的抗體。這些抗體可以是，例如多克隆或單克隆抗體。本發明也包括嵌合、單鏈和人源化抗體，以及Fab片斷、或Fab表達文庫的產物。可以用本領域已知的各種方法來產生這樣的抗體和片斷。
對于相應于本發明的序列的酶的抗體的產生，可以通過將酶直接攝入動物或施用于動物，優選非人類動物來獲得。然后如此獲得的抗體將與該酶本身結合。用這種方式，甚至僅編碼酶的一個片斷的序列可以被用來產生結合整個天然酶的抗體。然后用這些抗體從編碼上述酶的細胞來分離酶。
為了制備單克隆抗體，可以使用任何能提供由連續細胞系培養物產生的抗體的方法。實例包括雜交瘤技術(Kohler和Milstein，1975)、三元雜交瘤技術、人類B-細胞雜交瘤技術(Kozbor等人，1983)和產生人類單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(Cole等人，1985，第77-96頁)。
可以用描述用于產生單鏈抗體的技術(美國專利4,946,778 Ladner等人)進行修改來產生本發明的免疫原酶產物的單鏈抗體。而且，可以用轉基因小鼠來表達本發明的免疫原酶產物的人源化抗體。
用本發明的酶產生的抗體可以被用于從其它生物體和樣品篩選類似酶。這些篩選技術在本領域是已知的。抗體也可以被用作探針來篩選從該生物或其它生物產生的基因文庫，以識別這種或交叉反應活性。
可以用適合于特定系統的傳統方法來進行在上邊所述系統中產生的多肽的分離和純化。例如，可以采用使用了抗體，如單克隆或多克隆抗體的制備型層析和免疫分離。
正如上邊所提到的，可以被用于產生肌醇六磷酸酶專一性抗體的抗原包括肌醇六磷酸酶多肽，例如圖1多肽片斷中所示的任意肌醇六磷酸酶。可以通過標準重組、化學合成或純化方法獲得用于免疫動物的多肽或肽。正如本領域所熟知的，為了增加免疫原性，可以用抗原結合載體蛋白質。通常使用的載體包括匙孔血藍蛋白(KLH)、甲狀腺球蛋白、牛血清清蛋白(BSA)和破傷風類毒素。然后將偶聯肽用于免疫動物(如小鼠、大鼠或兔)。除了這些載體，可以用已知的佐劑和抗原一起使用，以促進強烈免疫反應的誘導。
可以對肌醇六磷酸酶專一性多克隆和單克隆抗體進行純化，例如通過與含有肌醇六磷酸酶多肽的基質結合，或從含有肌醇六磷酸酶多肽的基質洗脫，例如針對肌醇六磷酸酶多肽(或其片斷)的抗體已經得到。其它抗體純化和濃縮方法是本領域已知的，并且可以用本發明的肌醇六磷酸酶專一性抗體來實施(參考，例如Coligan等人，1986)。
與肌醇六磷酸酶專一性抗原相應的抗獨特型抗體也包括在本發明中，并且可以用標準方法產生。這些抗體是針對肌醇六磷酸酶專一性抗體的，并且因此模擬了肌醇六磷酸酶專一性抗原決定簇。
本發明也包括肌醇六磷酸酶多肽的片斷的其它用途，其中肌醇六磷酸酶多肽保留了至少一種肌醇六磷酸酶專一性活性或抗原決定簇。可以通過檢驗肌醇六磷酸催化為肌醇和自由磷酸來分析肌醇六磷酸酶活性。通過比較圖1中發現的肌醇六磷酸酶的序列，可以容易地識別這些片斷。
在一個非限定性例證中，在肌醇六磷酸酶專一性抗體的產生中，含有，例如至少8～10個氨基酸的肌醇六磷酸酶多肽片斷可以被用作免疫原。該片斷可以含有，例如在肌醇六磷酸酶中的氨基酸序列中是保守的氨基酸序列，并且該氨基酸序列可以含有在肌醇六磷酸酶中是保守的氨基酸。在另一個非限定性例證中，可以在免疫分析，如ELISA中使用上邊所述肌醇六磷酸酶片斷，以檢測樣品中肌醇六磷酸酶專一性抗體的存在。
可以使用多種方法制備本發明的轉基因動物。總的來說，可以使用三種方法。在一種這樣的方法中，從雌性動物收獲前核階段的胚胎(“單細胞胚胎”)，將轉基因微量注射進胚胎中，在這種情況下轉基因將被整合進所得到的成熟動物的生殖細胞和體細胞的染色體中。在一種這樣的方法中，分離胚胎干細胞，并且通過電穿孔、質粒轉染或微量注射將轉基因引入胚胎干細胞中，隨后將干細胞重新引入胚胎中，在那里它們移植且成為生殖細胞系。微量注射哺乳動物種類的方法在美國專利4,873,191中有所描述。仍然在另一個這樣的方法中，用含有轉基因的反轉錄病毒感染胚胎細胞，其中胚胎的干細胞含有整合進染色體的轉基因。當被轉基因的動物是鳥時，由于鳥的受精卵通常在輸卵管中在最開始的20小時里進行細胞分裂，所以由于不能得到前核，因而將受精卵的前核微量注射進是有問題的。因此，在上面一般性描述到的用于制備轉基因動物的方法中，對于鳥類而言優選的是反轉錄病毒感染，例如在美國專利5,162,215中描述的。然而，如果微量注射，可以使用由Love等人(Biotechnology，12，1994年1月)出版的方法，其中胚胎是從下了前一個所述雞蛋之后大約2～1.5小時的供體母雞獲得的，將轉基因微量注射進胚盤的細胞質中，并且將胚胎在宿主卵殼中培養，直到成熟。當被轉基因的動物是牛或豬時，由于卵的不透明性會阻礙微量注射，從而使得難以用傳統鑒別性干擾-相差顯微鏡術來識別細胞核。為了克服這個問題，首先將卵離心以分離前核，以便于更好的觀察。
本發明的“非人類動物”是牛、豬、羊和鳥類動物(例如母牛、豬、綿羊、雞)。本發明的“轉基因非人類動物”是通過將“轉基因”引入非人類動物的生殖系而產生的。可以用各種發育階段的胚胎靶細胞來引入轉基因。使用不同的方法依賴于胚胎靶細胞的發育階段。受精卵是微量注射最好的靶物質。將受精卵作為基因轉移的靶物質有一個主要優點，即在許多情況下被注射的DNA將在第一次卵裂前被引入宿主基因中(Brinster等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 824438-4442，1985)。結果，轉基因非人類動物的所有細胞將攜帶有被整合的轉基因。由于50％的干細胞將包含轉基因，所以通常這也將在表現在轉基因由起始代向子代的有效傳遞中。
術語“轉基因”被用來描述，在其所有細胞中包括外源遺傳物質的動物中。“轉基因”動物可以通過雜交兩種嵌合動物而產生，其中嵌合動物在其用于繁殖的細胞中包括外源遺傳物質。所得到的子代中的25％將是轉基因的，即在其兩個等位基因中的所有細胞中包括外源遺傳物質的動物，所得到的動物的50％在其一個等位基因中將包括外源遺傳物質，25％將不包括外源遺傳物質。
在用于主題發明的實踐中的微量注射方法中，轉基因被消化并且純化，不含任何載體DNA，例如通過凝膠電泳。優選地，轉基因包括一個可操作聯合的啟動子，它與涉及轉錄的細胞蛋白質相互作用，最終導致結構表達。在這點上有用的啟動子包括那些來自巨細胞病毒(CMV)的啟動子、來自莫洛尼氏白血病毒(MLV)的啟動子和來自皰疹病毒的啟動子，以及那些來自編碼金屬硫蛋白、骨骼肌動蛋白、P-烯酮丙酮酸羧化酶(PEPCK)、磷酸甘油酸(PGK)、DHFR和胸苷激酶的基因的啟動子。也可以使用用于病毒長末端重復序列(LTR)如勞斯肉瘤病毒的啟動子。當被轉基因的動物是鳥時，優選的啟動子包括那些用于雞珠蛋白基因、雞溶菌酶基因和鳥白血病病毒的啟動子。在胚胎干細胞的質粒轉染中有用的構建體將使用本領域熟知的其它調節元件，如刺激轉錄的增強子元件、剪接受體、終止和多腺苷酸化信號，以及允許翻譯的核糖體結合位點。
正如上邊所描述的，反轉錄病毒感染也可以被用來將轉基因引入非人類動物。可以在體外將正在發育的非人類胚胎培養到胚泡階段。在此時期，用于反轉錄病毒感染的靶物質可以是卵裂球(Jaenich，R.Proc.Natl.Acad.Sci USA731260-1264，1976)。用酶處理來達到卵裂球的有效感染，以去除透明帶(Hogan等人，(1986)，Manipulating the Mouse Embryo，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。用于引入轉基因的病毒載體系統通常是攜帶有轉基因的復制缺陷型反轉錄病毒(Jahner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 826927-6931，1985；Van der Putten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 826148-6152，1985)。通過在一個單層病毒產生細胞上培養卵裂球，可以容易且有效地實現轉染(Van der Putten，見上文；Stewart等人，EMBO J.6383-388，1987)。可選擇地，可以在后期進行感染。可以將病毒或病毒產生細胞攝入囊胚腔(D.Jahner等人，Nature 298623-628，1982)。由于整合僅發生在形成轉基因非人類動物的亞群細胞中，許多起始代將是轉基因的嵌合體。進一步，起始代可以包括在基因組中不同位置的轉基因的各種反轉錄病毒插入，所述基因組通常在子代將分離。另外，通過妊娠中胚胎的子宮內反轉錄病毒感染將轉基因引入生殖系也是可能的，雖然效率比較低(D.Jahner等人，見上文)。
用于轉基因引入的第三種類型的靶細胞是胚胎干細胞(ES)。ES細胞是從在體外培養的前移植胚胎獲得的，并且將其與胚胎融合(M.J.Evans等人，Nature292154-156，1981；M.O.Bradley等人，Nature 309255-258，1984；Gossler等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 839065-9069，1986；和Robertson等人，Nature322445-448，1986)。通過DNA轉染或通過反轉錄病毒介導的轉導，可以將轉基因有效地引入ES細胞中。隨后將這樣的轉化ES細胞隨后與來自非人類動物的胚泡結合。ES細胞隨后移植進胚胎，并且成為所得到的嵌合動物的生殖系(參考綜述Jaenisch，R.，Science 2401468-1474，1988)。
“轉化”指一種細胞，其中(或其祖先)已經通過重組核酸技術引入了異種核酸分子。“異種”指或者來源于另一物種的核酸序列，或者是從其原始形式或主要在細胞中被表達的形式修飾而來的核酸序列。
“轉基因”指通過人工手段被插入到細胞中的DNA的任何片斷，并且成為從此細胞發育而來的生物體基因組的一部分(即或者被穩定地整合，或者作為一個穩定的染色體外因子)。這樣的轉基因可以包括與轉基因生物體部分或完全不同(即外源)的基因，或者可以表示與生物體的內源基因同源的基因。通過提供一個RNA序列而產生的基因也包括在該定義中，其中所述RNA序列是被轉錄進DNA，然后被整合進基因組的RNA序列。本發明的轉基因包括編碼肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA序列，并且包括可以在轉基因非人類動物中表達的多核苷酸。在此所用，術語“轉基因的”進一步包括任何生物體，該生物體的基因組已經通過早期胚胎或受精卵的體外操縱被改變，或者通過任何轉基因技術被改變，以誘導特定基因敲除。在此所用，術語“基因敲除”指在體內具有完全功能損失的基因的定向破壞，這已經通過本領域熟知的任何轉基因技術實現。在一個實施方案中，具有基因敲除的轉基因動物是那些其中，靶基因已經通過同源重組將靶向欲使其喪失功能的該基因的插入物插入，使其喪失功能。在此所用，術語“轉基因的”包括任何本領域熟知的轉基因技術，這些技術可以產生攜帶有被引入的轉基因的生物體，或其中內源基因被喪失了功能的或“敲除的”生物體。
用于本發明實施中的轉基因是DNA序列，其包括一個編碼肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的序列。在一個實施方案中，根據此處所定義的術語，具有一個SEQ ID NO1中闡明的序列、或一個編碼具有SEQ ID NO2中闡明的序列的多肽序列的多核苷酸是轉基因。在適當的地方，此處也可以使用編碼具有肌醇六磷酸酶活性但由于遺傳密碼的簡并性使得核酸序列有所不同的DNA序列，可以是截短形式、等位基因變體和種間同源物。
在胚胎已經被微量注射之后，用轉染的胚胎干細胞移植或用含有轉基因的反轉錄病毒感染(除了在本文的其它地方論述到的鳥類用于本發明實施之外)，將胚胎植入假懷孕母體的輸卵管中。通過血液或使用了轉基因專一性探針的組織樣品的DNA印跡分析，測試所得子代轉基因的整合情況。在這方面，PCR尤其有用。將陽性子代(G0)雜交以產生子代(G1)，通過組織樣品的Northern印跡分析，分析G1的轉基因表達情況。
因此，本發明包括用于提高轉基因動物中磷的吸收和/或降低轉基因生物體的糞便中的污染物的方法，提高或降低量為大約15％，通常大約20％，更通常地大約20％～大約50％。
準備用于本發明的實踐中的動物是那些通常認為是馴養動物包括寵物(例如犬、貓、鳥類等等)的動物，和那些用于食品加工的動物，即鳥如肉雞和蛋雞和火雞，羊如小羊，牛如菜牛和奶牛，魚和豬。對于本發明的用途，當這些動物已經具有一個異種DNA序列、或一個或多個通常內源于動物中的其它DNA序列(此處集體地被稱作“轉基因”)，整合該動物的生殖細胞的染色體中時，這些動物指“轉基因的”。轉基因動物(包括其子代)也將具有被偶然地整合進體細胞的染色體中的轉基因。
在一些情況下，局部(例如在特定組織或細胞類型中)給予且表達本發明的肌醇六磷酸酶序列是有利的。例如，肌醇六磷酸酶或消化酶在動物腸道中的局部表達將分別有助于消化和吸收，例如肌醇六磷酸和磷的消化和吸收。例如，核酸序列可以被直接給予唾液腺、組織和細胞和/或給予排列于腸道中的上皮細胞。這樣的給予方法是本領域已知的，其包括電穿孔、表達載體和直接DNA吸收。在本發明的方法中可以使用任何具有肌醇六磷酸酶活性的多肽(例如，那些此處特別描述的多肽，以及那些在本發明的其它部分所描述的多肽)。
例如，本發明的核酸序列構建體將包括適合吸收進宿主組織內的靶細胞的形式的核酸分子。核酸可以是裸DNA或RNA分子的形式，其中這些分子可以包括一個或多個結構基因、一個或多個調節基因、反義鏈、能形成三股形式的鏈等等。一般地，核酸構建體將包括至少一個在合適調節區的轉錄和翻譯控制下的結構基因。更通常地，本發明的核酸構建體將包括被結合進釋放載體中的核酸，以提高轉染效率，其中將釋放載體分散于包括干燥親水性賦形劑物質的較大微粒中。
一種這樣的釋放載體包括病毒載體，如反轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒，這些載體已經被失活，以阻止自身復制，但它們保留了如下天然病毒能力結合靶宿主細胞，將遺傳物質傳遞到靶宿主細胞的細胞質中，和促進已經被結合進微粒中的結構基因和其它基因的表達。Kahn等人(1992)的CIRC.RES.711508-1517中對用于調節基因轉移的合適的反轉錄病毒載體做了描述，將其公開引用于此作為參考。Rosenfeld等人(1991)的SCIENCE 252431-434中對合適的腺病毒基因傳遞做了描述，將其公開引用于此作為參考。Friedman(1989)的SCIENCE2441257-1281中對反轉錄病毒和腺病毒傳遞系統做了描述，也將其公開引用于此作為參考。
第二種類型的核酸釋放載體包括脂質體轉染小泡，其包括陰離子和陽離子脂質體構建體。陰離子脂質體的使用要求核酸被包裹進脂質體中。陽離子脂質體不需要核酸包裹，相反可以通過簡單地混合核酸和脂質體來形成。陽離子脂質體與負電荷核酸分子密切結合，包括DNA和RNA，以便在許多細胞類型中產生能提供合理轉染效率的復合物。參考Farhood等人(1992)BIOCHEM.BIOPHYS.ACTA.1111.239-246，將其公開引用于此作為參考。正如Felgner和Ringold(1989)的NATURE 337387-388中所描述的，用于形成脂質體小泡的尤其優選的物質是脂質轉染物，其包括二油烯基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二油烯基丙氧基-三乙基銨(DOTMA)的等摩爾混合物，將其公開引用于此作為參考。
將這兩種類型的傳遞系統組合也是可能的。例如，Kahn等人(1992)，見上文，教導了可以將反轉錄病毒載體結合進陽離子DEAE-葡聚糖小泡中，以進一步提高轉化效率。將核蛋白結合進病毒和/或脂質體傳遞小泡中也是可能的，以更進一步提高轉染效率。參考Kaneda等人(1989)的SCIENCE 243375-378，將其公開引用于此作為參考。
在另一個實施方案中，提供了一種含有一種酶的消化助劑，所含的酶或者作為唯一的活性成分，或者組合一種或多種其它試劑和/或酶(如共同未決的美國申請09/580,937中描述的，標題為“Dietary Aids and Methods of Use Thereof”，日期為2000年5月25日，將其公開引用于此作為參考)。家畜和馴養動物的消化助劑中的酶和其它試劑的使用不僅提高了動物的健康和平均壽命，而且有助于提高家畜的健康和有助于從家畜生產食品。
目前，用于家畜的一些類型的飼料高度添加了多種礦物質(例如無機磷)、酶、生長因子、藥物和其它用于家畜的試劑。例如，這些補充物取代了谷物中存在的許多熱量和天然營養素。
通過從飼料本身降低或除去無機磷補充物和其它補充物(例如，微量礦物質鹽、增長因子、酶、抗體)，飼料將含有更多的營養素和能量。因此，剩余食物將含有更多可用的能量。例如，谷物-含油種子粗粉食物中，每千克食物通常含有3,200千卡代謝能，并且礦物質鹽不提供代謝能。所以去除這些不必要的礦物質且用谷物取代將增加食物中可用的能量。因此，本發明可以大大不同于一般所用的含肌醇六磷酸酶的飼料。例如，在一個實施方案中，使用了一種生物相溶性物質，它對通過生物體的腸胃道消化具有抗性。
在許多生物體中，例如包括家禽或鳥如，例如雞、火雞、雌鵝、鴨、鸚鵡、孔雀、鴕鳥、雉、鶉、鴿子、鴯鹋、幾維、潛鳥、澳洲鸚鵡、金絲雀、企鵝、火烈鳥和斑鳩，其消化道包括一個儲存和消化堅硬的生物相溶性物質(例如，砂礫和帶殼魚的殼)的砂囊，該胃幫助鳥類消費的種子和其它飼料的消化。一般而言，這些生物種類的消化道包括含有一個囊的食道，稱作嗉囊，在這里食物可以暫時存儲一段時間。食物從嗉囊移動到真正的胃里，或前胃，在這里鹽酸和胃蛋白酶開始消化過程。接著，食物移動到橢圓形而且壁很厚的砂囊中，它帶有有力的肌肉。該砂囊的主要功能是磨碎或壓碎食物顆粒-一個幫助吞下少量細小的砂礫或粗砂的鳥類的過程。食物從砂囊移動到十二指腸。鳥的小腸類似于哺乳動物。在小腸和大腸的接合處有兩個隱蔽的囊或盲囊，長度大約4～6英寸。大腸較短，主要含有長度大約3～4英寸的直腸。直腸的東西全部進入泄殖腔，并且通過肛門排泄糞便。
消費(或換句話說，即攝入)并存在于砂囊中的堅硬且生物相溶性的物體為各種酶、化學、治療和抗生素試劑的傳遞提供了有用的載體。這些堅硬物質的存在時間范圍為幾小時到幾天，在一段時間之后被排泄出來。因此，本發明提供了用于將有用的消化或治療試劑傳遞給生物體的包被的、浸漬的(例如，浸漬基質和膜)修飾食物助劑。這樣的食物助劑包括通常被生物體攝取用于幫助砂囊中的消化作用的物體(例如，石塊或砂礫)。本發明提供了其上包被或其中浸漬用作生物體的消化助劑或用于傳送治療或醫藥試劑或化合物的試劑。
在一個實施方案中，本發明提供了一種食物助劑，其含有一種生物相溶性組合物，設計用于幫助消化作用的試劑的釋放，其中所述生物相溶性組合物是設計為口服消費，并且在生物的消化道(例如砂囊)中釋放。“生物相溶性”是指一旦與宿主生物(例如，鳥)接觸，不會引發足以導致該物質被排斥或者使該物質不能發揮作用的有害反應的物質。例如，這樣的不起作用的情況可以通過在該物質的周圍形成纖維質結構限制浸漬的試劑在宿主生物中的擴散，或者通過形成一種物質因為毒性或者感染導致該生物中的致死率和致病率上升。生物相溶性物質可以是非生物可降解的或者是生物可降解的。在一個實施方案中，生物相溶性組合物對于胃腸道的降解或消化具有抗性。在另一個實施方案中，生物相溶性組合物具有石塊或石頭的堅固性。
本發明可用的一種非生物可降解的材料是可以允許附著或者浸漬食物試劑的材料。例如，這種非生物可降解的材料包括熱塑性塑料，例如丙烯酸，改良丙烯酸，聚酰胺，聚碳酸酯，聚酯，聚乙烯，聚丙烯，聚苯乙烯，聚砜，聚醚砜和聚偏1，1-二氟乙烯。彈性體也是有用的材料，例如，包括聚酰胺，聚酯，聚乙烯，聚丙烯，聚苯乙烯，聚氨酯，聚乙烯醇和硅氧烷(例如，硅氧烷基或者含有硅氧烷的二氧化硅)。本發明提供了生物相溶性組合物可以包含多種這樣的材料，例如，其可以被摻合或者層覆形成摻合物，共聚物或者其組合。
在此所用，“可生物降解的”材料是指這種組合物可以在體內消蝕或者降解形成較小的化學物質。例如，降解可以通過酶、化學或物理過程發生。考慮用于本發明的適當的可生物降解的材料包括聚(交酯)，聚(乙醇酸交酯)，聚(乳酸)，聚(乙二醇酸)，聚酐，聚原酸酯，聚醚酯，聚己酸內酯，聚酰胺酯，聚碳酸酯，聚氰基丙烯酸酯，聚氨酯，聚丙烯酸酯。這種材料可以被摻合或者層覆形成摻合物，共聚物或者其組合。
考慮到不同數量的生物相溶性物質可以被攝取，或者換句話說，同時提供給相同生物體，或者以各種組合的形式(例如，一種物質在其它物質之前)。另外，生物相溶性物質可以被設計為緩慢通過消化道。例如，大的或者脂肪物質趨于更緩慢地通過消化道，因此，可以使用具有較大尺寸從而阻止了其快速通過消化道的生物相溶性物質。這樣的大物質可以是非生物降解物質和生物降解物質的組合。例如，小的非生物降解物質可以被生物降解物質包裹，這樣在一段時間內，生物降解部分將被降解，從而使非生物降解部分通過消化道。并且，已經公認可以將任何數目的作料提供給這種生物相溶性物質，以幫助消費。
可以將多種試劑單獨或者組合其它試劑涂敷到這種生物相溶性物質上，例如，包括多肽(例如，酶、抗體、細胞因子或者治療用小分子)和抗生素。特別有用的試劑的實例列于下邊的表1和2。也可以考慮到可以將細胞包入本發明所述的生物相溶性物質中將其用于傳送酶和治療劑。例如，可以設計有孔物質，其中具有的孔大到足以使細胞在其中生長以及通過，這些多孔物質然后可以被攝取進入消化道。例如，生物相溶性物質可以包括多種微生物環境(例如，不同孔隙率，pH等)，其提供了對多種細胞類型的支持。細胞可以被進行遺傳工程，給生物體傳送特定藥物、酶或者化學藥品。細胞可以是真核的或原核的。
表1



表2治療配方



某些試劑可以被設計為在一定條件下變成活性的或者失活的(例如，在一定的pH值下，在存在一種激活劑下，等等)。并且，在本發明的組合物中使用酶原是有益的(例如，一種存在于消化道的唾液蛋白酶，或者可以人為地引入生物消化道的唾液蛋白酶)。考慮到被本發明所述生物相溶性組合物所傳送的試劑可以通過添加一種可以被攝取或者換句話說是可以被傳送給該生物體的激活劑激活或者失活。另外一個控制消化道中試劑的機制是環境敏感試劑，其可以在消化道的適當部位被激活。例如，一種試劑可以在較低的pH值處失活，而在中性pH值處顯示活性。相應地，這種試劑將在胃中為失活狀態，但是在腸道中為活性狀態。替代性地，該試劑可以響應于微生物專一性因子的存在而變成為活性形式(例如，存在于消化道中的微生物)。
總之，本發明的潛在益處包括，例如，(1)減少或者可能去除對動物(包括魚)從日常飼料或谷物中獲取礦物質添加(例如，無機磷的補充)，酶，或治療藥物的需要，從而增加飼料中的熱量和營養物質的量，和(2)增進家畜或非家畜動物的健康和生長，包括，例如，家禽、豬、牛、馬、犬和貓科的動物。
多種酶可以用于本發明所述的方法和組合物中。這些酶包括適當消化或適當代謝所消費的食物的必要的酶，化合物激活或者衍生，通過消化道傳送給該動物的前體藥物或者其它試劑或者化合物。可以交付或者摻入本發明所述組合物中的酶的實例包括，例如，飼料增強酶，選自α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶，尤其是乳糖酶、肌醇六磷酸酶，β-葡聚糖酶，尤其是內切-β-1，4-葡聚糖酶和內切-β-1，3(4)-葡聚糖酶、纖維素酶、木糖苷酶、半乳聚糖酶，尤其是阿拉伯半乳聚糖內切-1，4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖內切-1，3-β-半乳糖苷酶、內切葡聚糖酶，尤其是內切-1，2-β-葡聚糖酶、內切-1，3-α-葡聚糖酶和內切-1，3-β-葡聚糖酶，果膠降解酶，尤其是果膠酶、果膠酯酶、果膠裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶、arabinanase、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-α-鼠李糖苷酶、果膠酸裂解酶和α-galacturonisidase、甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、木聚糖乙酰酯酶、蛋白水解酶、木聚糖酶、阿拉伯木聚糖酶和脂解酶如脂酶、磷脂酶和角質酶。SEQ ID NO1和2和表3中所示的肌醇六磷酸酶是優選的。正如此處所描述的，表3中描述的序列是此處描述的具有氨基酸取代和核苷酸取代的SEQ ID NO1和2。
表3

本發明中所用酶可以被修飾以便提高它們的活性、傳送、激活和降解。這種修飾可以在體內或者體外進行，并且使用本技術領域一般公知的方法和工藝，正如下面所詳細描述的那樣。這種方法一般使用多核苷酸或者多肽序列，它們或者是用自動合成儀合成或者是用重組DNA技術進行克隆、表達或者操作的。
在一個優選實施方案中，用于本發明所述組合物(例如，一種食物助劑)中的酶是肌醇六磷酸酶，其是熱穩定的，并且具有抗熱性，催化肌醇六磷酸的酶解水解，也就是，該酶可以在經歷短暫的(即，5～30秒)，或者較長的，例如，幾分鐘到幾小時，暴露于高于50℃的溫度中之后，能夠再次復性，再次獲得活性。
“飼料”和“食物”，分別地，是指任何自然或者人工的飲食、膳食或者類似物或者這些膳食的成分，打算或者適合于被動物和人類分別食用、攝取、消化。“食物助劑”在此用于表示，例如，其中含有給動物或者生物提供治療或者消化試劑的含組合物試劑。“食物助劑”一般不是生物熱量吸收的來源，換句話說，食物助劑一般不是生物的能量來源，而是一種組合物，其隨著一般意義的“飼料”或者“食物”被攝取。
一種試劑或者酶(例如，肌醇六磷酸酶)在體外或者體內發揮其作用，即，在被吸收前或者分別地在生物的胃或者砂囊中。聯合作用也是可能的。
雖然任何酶可以被摻入食物助劑，但是在此使用肌醇六磷酸酶作為本發明所述的方法和組合物的例示性參考例證。本發明所述的食物助劑包括酶(例如，肌醇六磷酸酶)。一般而言，含食物助劑肌醇六磷酸酶的組合物是液體或者干燥態。
液體組合物不需要含有任何除了該酶以外的任何物質(例如，肌醇六磷酸酶)，優選地，以高度純化形式。但是，通常也加入穩定劑，例如甘油、山梨糖醇或者單丙二醇。液體組合物也可包括其它添加劑，例如，鹽、糖、防腐劑、pH值調節劑、蛋白質、肌醇六磷酸(肌醇六磷酸酶的底物)。一般的液體組合物是含水或油基漿狀物。液體組合物可被加入生物相溶性組合物中，以便緩慢釋放。優選地，將酶加入食物助劑組合物中，其是生物相溶性物質(例如，生物可降解或非生物可降解的)，并且包括將重組細胞加入，例如，多孔微珠中。
干組合物可以是噴霧干燥組合物，在這種情況下，該組合物不需要含有除了酶之外的任何干燥型物質。然而，通常干組合物是所謂的顆粒化的，其可以容易地與食物或飼料成分混合，或更優選地形成一種預混合物的成分。酶顆粒的顆粒大小優選地是與該混合物中的其它成分相容。這提供了一種將酶摻入動物飼料中的安全且便利的方法。優選地顆粒是生物相溶性的，更優選地這些生物相溶性的顆粒是非生物降解的。
可以用凝聚技術在高剪切力混合機中制備被酶包被的凝聚顆粒。吸附性顆粒可以通過將載體材料的包核體吸附/或者被酶涂敷而制備。優選地載體材料是生物相溶性非生物降解物質，其模擬了動物砂囊中石頭或砂礫的作用。用于凝聚技術的一般填充劑材料包括鹽，如硫酸二鈉。其它填充劑是高嶺土、滑石粉、硅酸鋁鎂和纖維素纖維。任選地，粘合劑如糊精也包括在凝聚顆粒中。載體物質可以是包括生物可降解和非生物可降解的任何生物相溶性物質(例如，石塊、石頭、陶瓷、各種聚合物)。任選地，用涂敷混合物涂敷顆粒。這樣的混合物包括涂層劑，優選地是疏水涂層劑，如氫化棕櫚油和牛脂，并且如果期望有其它添加劑，如碳酸鈣或高嶺土。
更進一步而言，食物助劑組合物(例如肌醇六磷酸鎂食物助劑組合物)可以含有其它組成成分，如著色劑、香味化合物、穩定劑、維生素、礦物質、其它飼料或食物增強酶等。一般的添加劑通常包括一種或多種化合物如維生素、礦物質或飼料增強酶和合適的載體和/或賦形劑。
在一個實施方案中，本發明的食物助劑組合物進一步包括有效量的一種或多種飼料增強酶，特別是選自如下的飼料增強酶α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶，尤其是乳糖酶、其它肌醇六磷酸酶，β-葡聚糖酶，尤其是內切-β-1，4-葡聚糖酶和內切-β-1，3(4)-葡聚糖酶、纖維素酶、木糖苷酶、半乳聚糖酶，尤其是阿拉伯半乳聚糖內切-1，4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖內切-1，3-β-半乳糖苷酶、內切葡聚糖酶，尤其是內切-1，2-β-葡聚糖酶、內切-1，3-α-葡聚糖酶和內切-1，3-β-葡聚糖酶，果膠降解酶，尤其是果膠酶、果膠酯酶、果膠裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶、arabinanase、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-α-鼠李糖苷酶、果膠酸裂解酶和α-galacturonisidase、甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、木聚糖乙酰酯酶、蛋白水解酶、木聚糖酶、阿拉伯木聚糖酶和脂解酶如脂酶、磷脂酶和角質酶。
本發明的動物食物助劑補充給單胃動物，早于或與食物同時供給。在一個實施方案中，本發明的食物助劑補充給單胃動物，與食物同時供給。在另一個實施方案中，將食物助劑以顆粒狀或穩定的液態形式加入到食物中。
本發明的食物助劑中的有效量的酶是每一千克食物助劑中大約10～20,000；優選地是大約10～15,000；更優選地是大約10～10,000，特別是大約100～5,000，尤其是大約100～大約2,000FYT。
本發明的肌醇六磷酸酶的其它特定用途的實例是在醬油加工中，和肌醇或其衍生物的制造中。
本發明也涉及一種用于降低動物肥料中肌醇六磷酸水平的方法，其中給動物喂養一種含有本發明的有效量的肌醇六磷酸酶的食物助劑。正如在本申請開頭申明的，其一個重要效果是降低磷酸的環境污染。
在另一個實施方案中，食物助劑是磁性載體。例如，含有一種酶(例如肌醇六磷酸酶)的磁性載體，該酶分別于其中、其上或貫穿于載體(例如多孔磁珠)中，該磁性載體可以被分布在一個含有肌醇六磷酸較高的區域中，一段時間后用磁鐵收集磁珠。這種分布和珠子的再收集降低了進一步的污染，并且允許對珠子進行再利用。而且，這種磁珠的體內利用允許將食物助劑定位在消化道的某一點上，例如，肌醇六磷酸酶活性可以發揮的地方。例如，本發明的含有消化酶(例如，肌醇六磷酸酶)的食物助劑可以被定位到動物的砂囊中，通過在動物消費了磁性載體的食物助劑之后，將一個磁鐵并置于靠近動物砂囊的地方而實現。一段時間之后可以移去磁鐵，使食物助劑通過消化道排泄出。而且，在宰殺之后，磁性載體適合于從生物體中去除或者輔助收集。
當食物助劑使多孔顆粒時，這種顆粒一般用一種物質浸漬，憑借這種物質期望緩慢釋放以形成一種緩慢釋放顆粒。不僅可以通過用期望釋放的物質浸漬多孔顆粒，而且可以通過首先將期望物質溶解在第一種分散相中來制備這樣的緩慢釋放顆粒。在這種情況下，用這種方法制備大的緩慢釋放顆粒也在本發明的范圍和精神之內，其中在所述方法中被釋放的物質首先被溶解在第一種分散相中。多孔中空顆粒可以，例如被緩慢釋放物質如藥物、農藥或酶浸漬。特別是，當被酶浸漬的多孔中空顆粒是由生物可降解聚合物構成時，這些顆粒本身可以被用作農藥或肥料，并且它們對環境沒有不利影響。在一個實施方案中，多孔顆粒是有磁性的。
多孔中空顆粒可以被用作生物反應器的支持物，特別是酶載體。因此，用緩慢釋放方法制備食物助劑是有優點的，例如通過將酶制劑包入微膠囊中，如脂質體，藥物是在一個長達幾天的時間區段內從微膠囊中釋放出來，優選大約3～20天。可選擇地，試劑(例如，一種酶)可以被配成制劑，以便于緩慢釋放，如摻入一種緩慢釋放聚合物中，試劑(例如酶)的劑量可以在一個長達幾天的時間區段內釋放出來，例如從2～30天，并且可以直達動物的整個生命期。
正如本領域已知的，脂質體通常衍生于磷脂或其它脂類物質。脂質體可以用單層或多層水合液晶來形成，這些水合液晶分散在含水介質中。可以使用任何能夠形成脂質體的無毒的、生理上可接受的和可代謝的脂類。脂質體形式的本發明的組合物可以含有穩定劑、防腐劑、賦形劑和加入到該試劑中的等等物質。優選的脂質體是天然和合成的磷脂和磷脂酰膽堿(卵磷脂)。形成脂質體的方法在本領域是已知的。例如參考Prescott，Ed.Methods in Cell Biology，第XIV卷，AcademicPress，New York，N.Y.(1976)，第33頁以及下列等等。
在制備食品或飼料制劑或添加劑中使用本發明的肌醇六磷酸酶也在本發明的范圍內，即肌醇六磷酸酶僅在制造過程中發揮其肌醇六磷酸酶活性，在最終食品或飼料產品中是無活性的。例如，這一方面在面團的加工和烘焙中有關。另外，肌醇六磷酸酶或表達肌醇六磷酸酶的重組酵母可以被浸漬于磁性載體之中、之上或貫穿于之中，分布于面團或食品介質之中，并且可以通過磁鐵收回。
可以將本發明的食物助劑生物相溶性(例如，生物可降解或非生物可降解)載體中單獨用于動物或組合其它消化添加劑應用于動物。本發明所述的食物助劑可以被用作頂敷料，或者將它們直接混合到動物飼料中或與飼料分開提供，通過分開的口服劑，通過注射或者通過經皮方式或者與其它生長相關可食化合物組合使用，組合物中的每種這樣的化合物的比例取決于特定生物或者要解決的問題和期望的響應程度。應該理解的是在任何給定的情況下使用的特定食物劑量將根據下述因素調整所使用的特定的化合物，所要處理的問題，主體的條件和其它相關的事實，它們可以改變有效成分的活性或者主體的反應，正如本領域的技術人員所熟知的那樣。一般地，正如本技術領域的技術人員所熟知的那樣，可以使用單一的日劑量或者分開的日劑量。
如果使用時是與動物的飼料分開，那么食物助劑的形式可以通過將它們與非毒性的藥物學上可以接受的可食的載體組合而制備，以便制備立即釋放或者緩慢釋放的制劑，這一點也是本領域已知的。這種可食的載體可以是固體或者液體，例如，舉例而言，玉米淀粉、乳糖、蔗糖、大豆片、花生油、橄欖油、芝麻油和丙二醇。如果使用了固體載體，那么該化合物的劑量形式可以是片劑、膠囊、粉劑、錠劑或者糖錠或者頂敷料作為微分散形式。如果使用了液體載體，那么軟凝膠膠囊、或者糖漿或者液體懸浮液、乳狀液或者溶液可以是劑量形式。劑量形式也可以包括輔助劑，例如防腐、穩定、濕潤或者乳化劑，溶液促進劑，等等。它們也可以含有其它具有治療價值的物質。
所以，本發明的顯著優點在于，例如，1)易于荷載活性成分的生物相溶性組合物；2)有關聚合物的種類和/或可以使用的活性成分具有普遍性；3)較高的產量和較高的荷載效率；4)提供了持續釋放制劑，其可以在體內釋放活性的、完整的活性試劑，從而提供了在延長的一段時間內一種活性試劑的控制型釋放。并且，另外一個優點在于可以使試劑在生物的消化道內(例如，砂囊)局部釋放。在這里所用的短語“其中含有”是指一種將試劑配入組合物中的方法，將其用于該試劑在延長的一段時間里的控制型釋放。
在本發明的組合物的持續釋放或者緩慢釋放中，使用了一種試劑的有效量(例如，酶或者抗生素)。在這里所用，持續釋放或者緩慢釋放是指一種試劑在一段延長的時間內從生物相溶性材料中的逐漸釋放。持續釋放可以是連續的或是不連續的，線性的或者非線性的，并且，這一點可以通過使用一種或者多種生物可降解或者非生物可降解組合物、藥物填料、賦形劑的選擇、或者其它修飾。但是，已經認識到提供一種“快速”釋放組合物也是需要的，一旦被生物消費，這種組合物提供了迅速的釋放。也應該理解到通過“釋放”并不必定意味著這種試劑是從生物相溶性載體中釋放出來。而在一個實施方案中，緩慢釋放包括存在于所述生物相溶性組合物中的試劑的緩慢激活或者持續激活。例如，肌醇六磷酸不必從生物相溶性組合物中釋放出來才是有效的。在這個實施方案中，肌醇六磷酸酶是固定在這種生物相溶性組合物上。
動物飼料可以是任何含有蛋白質的有機膳食，通常用于滿足動物的食物需要。這些含有蛋白質的膳食中的許多一般是主要包括玉米、大豆粗粉或者玉米/大豆粗粉混合物。例如，一般的商業通路可以得到的用來飼喂家禽的產品包括Egg MakerComplete，這是一種由Land O’Lakes AG Services提供的家禽飼料產品；以及Country Game & Turkey Grower，這是一種Agwa，Inc.公司提供的產品。(也可以參考由Phillip Minnaar和Maria Minnaar所著的The Emu Farmer’s Handbook)。這兩種商業通路可以獲得的產品是動物飼料的典型實例，本發明中的食物助劑和/或這種酶即肌醇六磷酸酶可以被摻入以便減少或者消除在這種組合物中需要加入的磷、鋅、錳和鐵的補充量。
本發明可用于無數動物的食物，在此定義，其包括哺乳動物(包括人)，禽類和魚類。特別地，該食物可以被用于具有商業意義的哺乳動物，例如豬、牛、綿羊、山羊、實驗室里的嚙齒動物(大鼠、小鼠、豚鼠和沙鼠)、被毛動物如貂和狐貍、和動物園動物例如猴子和猿，以及家養動物例如貓和狗。典型的具有商業價值的鳥類種類包括雞、火雞、鴨子、鵝、雉、鴯鹋、鴕鳥、潛鳥、幾維、鴿子、鸚鵡、澳洲鸚鵡、美冠鸚鵡、金絲雀、企鵝、火烈鳥和鶉。商業上飼養的魚類諸如鮭魚也將可以從此處公開的食物助劑中獲得益處。能獲得益處的其它魚類包括，例如，魚(特別是在魚缸或者水產養殖環境中，例如熱帶魚)、金魚或者其它觀賞鯉魚、鯰魚、鮭魚、大麻哈魚、鯊魚、鰩、比目魚、鰈魚、羅非魚、鳉、虹鳉、帆鰭鱸、新月魚、swordtail、斑馬魚和泥鰍。
除非有相反的申明，轉化是以Sambrook，Fritsch和Maniatus，1989所述的方法的描述而進行。下述實施例是用于說明本發明，而不是限制本發明。實施例中所述的方法是可以用于實施本發明一定方面的方法中的代表，其它本領域技術人員所知的方法也可以被使用。
實施例1分離、細菌表達和純化肌醇六磷酸酶大腸桿菌B的基因組DNA是從Sigma(Catalog #D-2001)，St.Louis，New Jersey獲得的。
下述引物用于PCR擴增直接來自基因組DNA的該基因。
5’引物gtttctgaattcaaggaggaatttaaATGAAAGCGATCTTAATCCCATT(SEQ ID NO3)；和3’引物gtttctggatcc TTACAAACTGCACGCCGGTAT(SEQ ID NO4)；用于PCR反應的Pfu聚合酶，以及擴增是根據生產商提供的方法進行(Stratagene Cloning Systems，Inc.，La Jolla，CA)。
PCR產品被純化，將純化產品和pQE60載體(Qiagen)都用EcoR I和Bgl II限制內切酶(New England Biolabs)根據生產商提供的方法消化。使用標準方法進行過夜連接產生pQE60。
將擴增序列與編碼RBS的序列插入閱讀框。然后用連接混合物通過電穿孔來轉化大腸桿菌菌株M15/pEP4(Qiagen，Inc.)。M15/pEP4含有質粒pEP4的多個拷貝，其表達lacI阻遏物并且也具有卡拉霉素抗性(Kanr)。質粒DNA進行分離，并且用限制酶切分析來確認。將含有期望構建體的克隆在LB培養基中進行液體過夜培養(O/N)，其中LB培養基同時補充了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)。用O/N培養物作為接種物，以1∶100～1∶250的比率接種到大的培養基中。將細胞生長到600納米的波長(O.D.600)的光學密度在0.4～0.6之間。然后將IPTG(“異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷”)加入培養物中，使最終濃度達到1mM。IPTG通過使lacI阻遏子失活進行誘導，清除P/O導致基因表達增加。將細胞再培養3～4小時。然后通過離心方法收獲細胞。
通過上述的雜交技術，上述列出的引物序列也可以被用于從沉淀物質中分離靶基因。
參考上邊的教導，本發明的無數修飾和改變是可能的，因此也百所附權利要求的范圍之內，本發明可以用與這些詳細描述不同的方式進行實施。應該理解到，雖然已經參考上邊的詳細描述對本發明進行了描述，但上述描述意在說明，而不是限定本發明的范圍。本發明的其它方面、優點和修飾也在下述權利要求范圍之內。將所有的出版物、專利申請、專利和其它本文提及的參考資料完整引用于此作為參考。
本發明也提供了分離和使用肌醇六磷酸酶分子(核酸及其編碼的肌醇六磷酸酶)的方法，其中肌醇六磷酸酶分子來自大腸桿菌(毒性或非毒性的，包括K12、W、C)的所有其它菌株，以及所有細菌。這些包括所有屬于下述的種類和菌株Thermotogale綠非硫細菌藍細菌&葉綠體低G+C含量的革蘭氏陽性細菌梭細菌高G+C含量的革蘭氏陽性細菌嗜纖維菌屬/屈撓細菌/類菌體組成纖維細菌Spriochaete浮霉狀菌屬/衣原體組紫色細菌(蛋白細菌)，包括下述亞門δ&ε，包括乙酸氧化脫硫單胞菌可變脫硫八疊球菌斯托氏蛭弧菌侵蝕侏囊菌橙色標樁菌黃色粘球菌脫硫脫硫弧菌卵硫菌種空腸彎曲桿菌空腸亞種產琥珀酸沃林氏菌幽門螺旋桿菌α，包括Methylobacterium extorquens印度拜葉林克氏菌普通生絲微菌萬尼氏紅微菌根癌農桿菌流產布魯氏菌文氏巴爾通氏體海紅菌亞種AgilisZea mays-mitochondrion立氏立克次氏體里氏埃里希氏體尖音庫蚊沃爾巴克氏體邊緣無形體長赤細菌需鹽紅螺菌莢膜紅細菌生脂固氮螺菌γ，包括沙氏外硫紅螺菌酒色著色菌甲烷甲基單胞菌成都變種人心桿菌Xanthomonas maltophilia伯氏考克斯氏體嗜肺軍團菌嗜肺亞種線形海洋螺菌乙酸鈣不動桿菌綠膿桿菌流感桿菌副溶血弧菌普通變形菌胡蘿卜軟腐歐文氏菌大腸桿菌，包括β，包括嚙嗜艾肯氏菌淋病奈瑟氏球菌糞透明顫菌紫色色桿菌糞產堿菌膠狀紅長命菌睪丸酮絲毛單胞菌歐洲亞硝化單胞菌迂回螺菌可以用已知的方法從這些細菌分離這樣的肌醇六磷酸酶分子，這些方法包括文庫篩選方法，例如表達篩選，雜交方法，PCR(如參考Sammbrook，1989)。
實施例1耐熱性試驗將來自大腸桿菌(菌株K12)的野生型appA和稱作819PH59的誘變形式(SEQID NO9和10)在大腸桿菌中進行表達，并且純化到同質性。在耐熱性試驗中，將100μL的溶解在100mM MOPS/pH7.0中的0.01mg/mL的蛋白質加熱到表明的溫育溫度，在RJ研究用熱循環儀中保持5分鐘。一旦完成了在該溫度下保持5分鐘，將樣品冷卻到4℃，并且在冰塊上溫育。在37℃的溫度下，用40μl的溶解在1.5mL的100mM NaOAc/4mM肌醇六磷酸/pH4.5中的該酶溶液進行活性分析。以2分鐘的間隔從中取出60μl等量溶液，并將其加入60μl用于TNO分析的顯色劑/終止溶液中。顯然，含有8個氨基酸變化的被修飾的酶，SEQ ID NO10，比野生型酶能承受更高的溫度。(參見圖3)。
實施例2在模擬消化性條件下肌醇六磷酸酶的穩定性體外消化的大腸桿菌K12和非糖基化819pH59肌醇六磷酸酶的殘余活性百分比(基于初始反應速率)對時間作圖。按照所述，制備含有2mg/ml NaCl、6M HCl和3.2mg/mL胃蛋白酶的標準濃度的模擬胃液。溶液的pH值大約是1.4，沒有對pH值進行調節。按照1∶4(體積∶體積)比例將肌醇六磷酸酶加入消化溶液，并在37℃的溫度下直接溫育來開始消化反應，從而進行體外消化性分析。在多個時間間隔里從消化反應混合物中取出等量溶液，用TNO分析法分析殘余的肌醇六磷酸酶活性。每一種分析至少進行兩次。本數據符合按照y＝Ae-kt方程式的指數曲線。用方程式t1/2＝ln2/k來確定蛋白的半衰期。大腸桿菌K12肌醇六磷酸酶的半衰期僅僅為2.7±0.2分鐘，而非糖基化819pH59肌醇六磷酸酶的半衰期為8.4±1.1分鐘。因此，野生型大腸桿菌K12肌醇六磷酸酶中的突變增加了模擬體外消化條件下的該酶的穩定性。
參看圖4。
實施例3表達宿主的比較將來自819pH59的GSSM DNA構建體插入大腸桿菌、P.pastoris和S.pombe中進行表達。將表達的蛋白純化至同質性。在耐熱試驗中，將溶解在100mM MOPS，pH為7.0的0.01mg/mL的蛋白質100μl加熱到表明的溫育溫度，在RJ研究用熱循環儀中保持5分鐘。一旦完成了在該溫度下保持5分鐘，將樣品冷卻到4℃，并且在冰塊上溫育。在37℃的溫度下，用40μl的溶解在1.46mL的100mM NaOAc/4mM肌醇六磷酸/pH4.5中的該酶溶液進行活性分析。以2分鐘的間隔從中取出60μl等量溶液，并將其加入60μl用于TNO分析的顯色劑/終止溶液中。(參見圖5)。
實施例4在不同表達宿主細胞中表達的819pH59肌醇六磷酸酶的體外消化的殘余活性百分比(基于初始反應速率)對時間作圖。819pH59肌醇六磷酸酶在大腸桿菌(非糖基化)中進行了表達，也在S.pombe和P.pastoris中進行表達(糖基化)。按照S.O.P中的描述，制備含有2mg/ml NaCl、6M HCl和3.2mg/mL胃蛋白酶的標準濃度的模擬胃液。溶液的pH值大約是1.4，沒有對pH值進行調節。按照1∶4(體積∶體積)比例將肌醇六磷酸酶加入消化溶液，并在37℃的溫度下直接溫育來開始消化反應，從而進行體外消化性分析。在多個時間間隔里從消化反應混合物中取出等量溶液，用TNO分析法分析殘余的肌醇六磷酸酶活性。每一種分析至少重復三次。本數據符合按照y＝Ae-kt方程式的指數曲線。用方程式t1/2＝ln2/k來確定蛋白的半衰期。表達在大腸桿菌中的非糖基化819pH59肌醇六磷酸酶的半衰期為8.4±1.1分鐘，而表達在S.pombe中的糖基化819pH59肌醇六磷酸酶的半衰期為10.4±0.9分鐘，表達在P.pastoris中的相同肌醇六磷酸酶的半衰期為29.2±6.7分鐘。因此，819pH59肌醇六磷酸酶的糖基化增加了模擬體外消化條件下的該酶的穩定性。(參見圖6)。
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權利要求
1.一種提高含有肌醇六磷酸的食品的營養價值的方法，該方法包括將所述含有肌醇六磷酸的食品與具有SEQ ID NO2中的氨基酸序列的基本上純化的肌醇六磷酸酶接觸，以使所述基本上純化的肌醇六磷酸酶在所述含有肌醇六磷酸的食品中催化無機磷酸從肌醇六磷酸的釋放。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述基本上純化的肌醇六磷酸酶是通過重組表達系統產生的，該系統包括一個具有選自如下核苷酸序列的編碼肌醇六磷酸酶的核酸a)SEQ ID NO1，和b)SEQ ID NO1，其中T也可以是U；其中編碼肌醇六磷酸酶的核酸的表達導致了所述基本上純化的肌醇六磷酸酶的產生。
3.如權利要求1所述的方法，其中在所述含有肌醇六磷酸的食品中無機磷酸從肌醇六磷酸的釋放發生在所述含有肌醇六磷酸的食品被受體生物體攝取之前。
4.如權利要求1所述的方法，其中在所述含有肌醇六磷酸的食品中無機磷酸從肌醇六磷酸的釋放發生在所述含有肌醇六磷酸的食品被受體生物體攝取之后。
5.如權利要求1所述的方法，其中在所述含有肌醇六磷酸的食品中無機磷酸從肌醇六磷酸的釋放部分發生在所述含有肌醇六磷酸的食品被受體生物體攝取之前，部分發生在所述含有肌醇六磷酸的食品被受體生物體攝取之后。
6.一種用于權利要求2所述方法中的重組表達系統，其中所述重組表達系統包括在宿主細胞中，并且表達編碼肌醇六磷酸酶的核苷酸序列，其中肌醇六磷酸酶具有表示于SEQ ID NO2中的氨基酸序列，并且其中編碼所述酶的核苷酸序列被可操作地連接到所述宿主細胞中的轉錄控制序列上。
7.一種包括如權利要求6所述表達系統的載體。
8.如權利要求6所述的表達系統，其中所述控制序列包括一個組成型啟動子。
9.如權利要求6所述的表達系統，其中所述控制序列包括一個組織特異性啟動子。
10.如權利要求6所述的表達系統，其中所述宿主細胞是原核細胞。
11.如權利要求6所述的表達系統，其中所述宿主細胞是真核細胞。
12.如權利要求6所述的表達系統，其中所述宿主細胞是植物細胞。
13.如權利要求6所述的表達系統，其中在所述核苷酸序列之前存在編碼可操作地連接到所述核苷酸序列上的信號肽的多核苷酸序列。
14.如權利要求13所述的表達系統，其中所述信號肽是來自煙草的PR蛋白質PR-S信號肽。
15.一種被修飾含有權利要求6所述表達系統的原核細胞。
16.一種被修飾含有權利要求6所述表達系統的真核細胞。
17.一種被修飾含有權利要求6所述表達系統的植物細胞、植物部分或植物。
18.一種產生含有微生物肌醇六磷酸酶的動物飼料的方法，該方法包括a)在其中所述核苷酸序列是被表達的條件下培養權利要求17所述的植物細胞、植物部分或植物；和b)將所述的植物細胞、植物部分或植物轉化進適合于動物飼料的組合物中。
19.一種用于動物的飼料組合物，其中包括與含有肌醇六磷酸的食品混合為混合物的權利要求17所述的植物細胞、植物部分或植物。
20.一種處理人類或動物、使其能夠從消化性外源性肌醇六磷酸酶活性增強中獲得益處的方法，其中該方法包括給所述人類或動物使用一定量的轉基因植物的植物種子、植物細胞、植物部分或植物，其中所述轉基因植物被修飾含有一種表達編碼肌醇六磷酸酶的核苷酸序列的表達系統，其表達量是在所述人類或動物的消化道中提供了肌醇六磷酸酶活性的有效量。
21.一種非人類轉基因生物體，其基因組包括一個編碼具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的異源核酸序列，其中所述轉基因導致了肌醇六磷酸酶多肽的表達。
22.一種產生變體的方法，其包括獲得含有表示于SEQ ID NO1中的序列、與該序列基本上相同的序列、與該序列互補的序列、含有該序列的至少30個連續核苷酸的片斷和包括與SEQ IDNO1互補的序列中至少30個連續核苷酸的片斷的核酸；和修飾所述序列中的一個或多個核苷酸成為另一個核苷酸，在所述序列中刪除一個或多個核苷酸或給所述序列添加一個或多個核苷酸。
23.如權利要求22所述的方法，其中通過選自下述的方法進行修飾易錯PCR、改組、寡核苷酸定向誘變、裝配PCR、有性PCR誘變、體內誘變、盒式誘變、遞推集團誘變、指數集團誘變、位點特異性誘變、連接重裝配、GSSM及其任意組合。
24.如權利要求22所述的方法，其中所述的修飾是通過易錯PCR介導的。
25.如權利要求22所述的方法，其中所述的修飾是通過改組介導的。
26.如權利要求22所述的方法，其中所述的修飾是通過寡核苷酸定向誘變介導的。
27.如權利要求22所述的方法，其中所述的修飾是通過裝配PCR介導的。
28.如權利要求22所述的方法，其中所述的修飾是通過有性PCR誘變介導的。
29.如權利要求22所述的方法，其中所述的修飾是通過體內誘變介導的。
30.如權利要求22所述的方法，其中所述的修飾是通過盒式誘變介導的。
31.如權利要求22所述的方法，其中所述的修飾是通過遞推集團誘變介導的。
32.如權利要求22所述的方法，其中所述的修飾是通過指數集團誘變介導的。
33.如權利要求22所述的方法，其中所述的修飾是通過位點特異性誘變介導的。
34.一種計算機可閱讀的媒介物，在其上已經存儲了SEQ ID NO1中所示的核酸序列以及與該序列序列基本上相同的序列，或SEQ ID NO2中所示的多肽序列，以及與該多肽序列基本上相同的序列。
35.一種包括一個處理器和一個數據存儲裝置的計算機系統，其中已經在所述數據存儲裝置上存儲了SEQ ID NO1中所示的核酸序列，以及與該核酸序列基本上相同的序列，或SEQ ID NO2中所示的多肽序列，以及與該多肽序列基本上相同的序列。
36.如權利要求35所述的計算機系統，該系統進一步包括一個序列比較算法和一個數據存儲裝置，其中在所述數據存儲裝置上已經存儲了至少一個參考序列。
37.如權利要求36所述的計算機系統，其中所述的序列比較算法包括一個表明了多態性的計算機程序。
38.如權利要求35所述的計算機系統，該系統進一步包括在所述序列中識別特性的標識符。
39.一種將第一種序列與參考序列或序列數據庫進行比較的方法，其中所述第一種序列是SEQ ID NO1中所示的核酸序列，和與該核酸序列基本上相同的序列，或一個SEQ ID NO2中所示的多肽序列，和與該多肽序列基本上相同的序列，該方法包括通過使用比較這些序列的計算機程序來閱讀第一種序列和參考序列或序列數據庫；和用計算機程序確定第一種序列和參考序列或序列數據庫之間的差別。
40.如權利要求39所述的方法，其中所述的確定第一個序列和參考序列之間的差別包括識別多態性。
41.一種編碼肌醇六磷酸酶的分離的多核苷酸，所述肌醇六磷酸酶具有一個SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列，和一個或多個選自W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R180Y、N226C、Y277D或其任意組合的氨基酸修飾。
42.一種分離的多核苷酸或其寡核苷酸部分，其包括一個與SEQ ID NO7的核苷酸序列或與其互補的核苷酸序列至少大約10個核苷酸基本上相同的鄰接序列，該鄰接核苷酸序列包括如下核苷酸變化，其中至少核苷酸390為G；391為A；核苷酸438為T；439為G；440為G；471為C；473為T；477為T；448為G；449為T；690為G；691為A；692為G；729為T；730為A；731為T；864為T；865為G；1017為G或其任意組合。
43.如權利要求41所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸與SEQ ID NO9中所示序列有90％同源性的核苷酸序列。
44.如權利要求41所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸的多核苷酸序列如SEQ ID NO9中所示。
45.一種分離的多核苷酸，其包括與SEQ ID NO7基本上相同的核苷酸序列，并且其中核苷酸390為G；391為A；核苷酸438為T；439為G；440為G；471為C；473為T；477為T；448為G；449為T；690為G；691為A；692為G；729為T；730為A；731為T；864為T；865為G；1017為G或其任意組合。
46.如權利要求45所述的多核苷酸，其包括與SEQ ID NO7基本上相同的核苷酸序列，并且具有一個選自核苷酸390為G和391為A；核苷酸438為T、439為G和440為G；471為C和473為T；477為T、448為G和449為T；690為G、691為A和692為G；729為T、730為A和731為T；864為T和865為G；1017為G或其任意組合的被修飾的核苷酸序列。
47.一種表達載體，其含有權利要求41、44或46中任一項所述的多核苷酸。
48.如權利要求47所述的載體，其中所述載體是病毒載體。
49.如權利要求47所述的載體，其中所述載體是細菌載體。
50.一種宿主細胞，其含有權利要求47所述的載體。
51.如權利要求50所述的宿主細胞，其中所述細胞是原核細胞。
52.如權利要求51所述的宿主細胞，其中所述細胞是大腸桿菌、P.pastoris或S.pombe。
53.如權利要求50所述的宿主細胞，其中所述細胞是真核細胞。
54.一種基本上純化的多肽，其具有與SEQ ID NO8基本上相同的氨基酸序列，并且具有一個或多個選自W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R180Y、N226C、Y277D或其任意組合的氨基酸修飾，其中所述多肽具有肌醇六磷酸酶活性。
55.如權利要求54的多肽，其中所述多肽活性可以耐受至少60℃的溫度。
56.如權利要求54的多肽，其中所述多肽活性可以耐受至少70℃的溫度。
57.如權利要求54的多肽，其中所述多肽活性可以耐受至少80℃的溫度。
58.如權利要求54的多肽，其中所述多肽在胃液中的半衰期比相應野生型多肽大至少大約2倍。
59.一種基本上純化的多肽，其具有SEQ ID NO10中所示的氨基酸序列。
60.一種提高含有肌醇六磷酸的食品的營養價值的方法，所述方法包括將含有肌醇六磷酸的食品與基本上純化的具有如權利要求15所述的多肽的氨基酸序列的肌醇六磷酸酶接觸，以使所述基本上純化的肌醇六磷酸酶在所述含有肌醇六磷酸的食品中催化無機磷酸從肌醇六磷酸的釋放。
61.如權利要求60所述的方法，其中所述基本上純化的肌醇六磷酸酶是通過重組表達系統產生的，該系統含有具有選自如下核苷酸序列的編碼肌醇六磷酸的核酸a)SEQ ID NO9；b)SEQ ID NO9，其中T也可以是U；其中編碼肌醇六磷酸酶的核酸的表達導致了所述基本上純化的肌醇六磷酸酶的產生；和c)SEQ ID NO7，其中390為G；391為A；核苷酸438為T；439為G；440為G；471為C；473為T；477為T；448為G；449為T；690為G；691為A；692為G；729為T；730為A；731為T；864為T；865為G；1017為G或其任意組合。
62.如權利要求60所述的方法，其中在所述含有肌醇六磷酸的食品中無機磷酸從肌醇六磷酸中的釋放發生在所述含有肌醇六磷酸的食品被受體生物體攝取之前。
63.如權利要求60所述的方法，其中在所述含有肌醇六磷酸的食品中無機磷酸從肌醇六磷酸中的釋放發生在所述含有肌醇六磷酸的食品被受體生物體攝取之后。
64.如權利要求60所述的方法，其中在所述含有肌醇六磷酸的食品中無機磷酸從肌醇六磷酸中的釋放部分發生在所述含有肌醇六磷酸的食品被受體生物體攝取之前，部分發生在所述含有肌醇六磷酸的食品被受體生物體攝取之后。
65.一種用于權利要求61所述的方法中的重組表達系統，其中所述重組表達系統被包括在一個宿主細胞中，并且表達編碼具有如SEQ ID NO9中所示的氨基酸序列的肌醇六磷酸酶的核苷酸序列，并且其中編碼所述酶的核苷酸序列被可操作地連接到在所述宿主細胞中可操作的轉錄控制序列上。
66.一種載體，其包括如權利要求65所述的表達系統。
67.如權利要求65所述的表達系統，其中所述的控制序列包括一個組成型啟動子。
68.如權利要求65所述的表達系統，其中所述的控制序列包括一個組織專一性啟動子。
69.如權利要求65所述的表達系統，其中所述宿主細胞是原核細胞。
70.如權利要求65所述的表達系統，其中所述宿主細胞是真核細胞。
71.如權利要求65所述的表達系統，其中所述宿主細胞是植物細胞。
72.如權利要求65所述的表達系統，其中在所述核苷酸序列之前有一個編碼信號肽的多核苷酸序列，其中信號肽被可操作地連接到所述核苷酸序列上。
73.如權利要求72所述的表達系統，其中所述信號肽是來自煙草的PR蛋白質PR-S信號肽。
74.一種被修飾含有權利要求65所述的表達系統的原核細胞。
75.一種被修飾含有權利要求65所述的表達系統的真核細胞。
76.一種被修飾含有權利要求65所述的表達系統的植物細胞、植物部分或植物。
77.一種產生含有微生物肌醇六磷酸酶的動物飼料的方法，其包括a)在所述核苷酸序列被表達的條件下培養權利要求76所述植物細胞、植物部分或植物；和b)將所述植物細胞、植物部分或植物轉化進一種適合于動物飼料的組合物中。
78.一種用于動物的飼料組合物，其包括與含有肌醇六磷酸的食品混合成混合物的權利要求76的植物種子、植物細胞、植物部分或植物。
79.一種產生變體的方法，其包括獲得一種含有表示于SEQ ID NO9中的序列，與該序列基本上相同的序列，與該序列互補的序列，含有該序列的至少30個連續的核苷酸的片斷，和包括與SEQID NO9互補的序列的至少30個連續的核苷酸的片斷的核酸；和將所述序列中的一個或多個核苷酸修飾成為另一個核苷酸，在所述序列中刪除一個或多個核苷酸，或在所述序列中添加一個或多個核苷酸。
80.如權利要求79所述的方法，其中通過選自下述的方法進行修飾易錯PCR、改組、寡核苷酸定向誘變、裝配PCR、有性PCR誘變、體內誘變、盒式誘變、遞推集團誘變、指數集團誘變、位點特異性誘變、連接重裝配、GSSM及其任意組合。
81.如權利要求79所述的方法，其中所述的修飾是通過易錯PCR介導的。
82.如權利要求79所述的方法，其中所述的修飾是通過改組介導的。
83.如權利要求79所述的方法，其中所述的修飾是通過寡核苷酸定向誘變介導的。
84.如權利要求79所述的方法，其中所述的修飾是通過裝配PCR介導的。
85.如權利要求79所述的方法，其中所述的修飾是通過有性PCR誘變介導的。
86.如權利要求79所述的方法，其中所述的修飾是通過體內誘變介導的。
87.如權利要求79所述的方法，其中所述的修飾是通過盒式誘變介導的。
88.如權利要求79所述的方法，其中所述的修飾是通過遞推集團誘變介導的。
89.如權利要求79所述的方法，其中所述的修飾是通過指數集團誘變介導的。
90.如權利要求79所述的方法，其中所述的修飾是通過位點特異性誘變介導的。
全文摘要
本發明提供了一種來自大腸桿菌K12 appA肌醇六磷酸酶的純化的和修飾的肌醇六磷酸酶。與野生型酶相比，該酶具有肌醇六磷酸酶活性和更高的耐熱性。另外，在低pH值下，該酶具有更高的對蛋白水解酶的穩定性。修飾的肌醇六磷酸酶的糖基化提供了一種被進一步改進的酶，其具有更高的耐熱性和對蛋白水解酶的穩定性。該酶可以從天然和重組宿主細胞產生，并在需要的地方可以被用來幫助肌醇六磷酸酶的消化。尤其是，本發明的肌醇六磷酸酶可以被用于食品中，以提高富含肌醇六磷酸酶成分的飼用價值。
文檔編號A23L1/03GK1561391SQ01812774
公開日2005年1月5日 申請日期2001年5月24日 優先權日2000年5月25日
發明者J·M·肖特, K·A·克雷茨, K·A·格雷, N·R·巴頓, J·B·加勒特, E·奧多諾休 申請人:戴弗薩公司