用具有細菌源的酶生產發酵乳制品的新方法

專利名稱：用具有細菌源的酶生產發酵乳制品的新方法
本專利申請涉及使用具有細菌源的酶，尤其是來自迄今為止認為是牛奶污染物的細菌的酶生產發酵乳制品的新方法，也涉及由此制得的新乳制品。這種新方法更特別適用于生產酸奶和發酵乳。
本發明的方法的確具有在不引起脫水收縮(乳清滲出)現象的情況下，改進這些乳制品的質地，特別是增強粘度的優點，對于酸奶或發酵乳類型的乳制品，脫水收縮的現象是不能接受的。本發明人進行的感官分析也沒有發現在本發明生產的酸奶和發酵乳中有壞味道。依照本發明得到的這個不尋常的制品，是通過使至少一種牛乳酪蛋白，即至少κ酪蛋白發生蛋白質水解，并在發酵后對產品進行攪拌而得到的。更具體的是，在本發明中，通過細菌源的κ酪蛋白水解酶，尤其是來自至今仍認為是牛奶污染物的細菌(如蛋白水解嗜冷菌和蛋白水解乳酸菌)的κ酪蛋白水解酶(優選來自這種細菌的抗熱性酶)來進行這種酪蛋白水解。
在本申請中，術語“嗜冷菌”或者更一般地說“嗜冷微生物”是指能在7℃或以下生長的微生物，與其最佳生長溫度無關。這一定義是國際乳品聯合會(International Dairy Federation，IDF)的定義。
在本申請中，術語“抗熱性酶”是指κ酪蛋白水解活性保持不變的酶，它在巴氏殺菌的熱處理(95℃下至少5分鐘)之后仍可檢測到。
為了改進酸奶或發酵乳類型的發酵乳制品的質地，目前采用以下的步驟對奶基質進行濃縮，或加入從奶中得到的制品，以及特別是加入例如酪蛋白酸鹽、乳清蛋白質等蛋白質，或加入例如淀粉、果膠或明膠等組織改良劑(增稠劑、膠凝劑)。
在先有技術中，在酸奶和發酵乳類型的發酵乳制品的生產期間通常不希望出現酪蛋白，特別是κ酪蛋白的蛋白質水解。實際上，由于酪蛋白水解酶具有引起大量的脫水收縮現象的凝結作用，已知酪蛋白水解酶例如在凝乳酶中含有的酪蛋白水解酶，用于生產干酪和新鮮干酪。然而，盡管人們在尋找乳清形成方法，并且乳清的形成對生產干酪和新鮮干酪(回收凝乳)是必需的。另一方面，人們不希望在生產酸奶和發酵乳期間形成乳清，因為這會導致這種類型的乳制品的質地不合格(粒狀結構，有大量的乳清滲出)。因此，迄今為止，在酸奶和發酵乳的生產期間不使用酪蛋白水解酶，甚至注意避免在奶基質中出現或產生這種酶。
而且，污染微生物如嗜冷菌和乳酸菌的產生并不是乳制品，尤其是酸奶和發酵乳生產過程中尋求的現象。
乳酸菌(即所有能由糖，尤其是乳糖產生乳酸的細菌)是普遍存在的細菌，在收集牛奶時會污染牛奶，若它們繁殖的話會導致牛奶凝固。因此，多年來，為了避免牛奶在成為食品級乳制品前凝固，已經建立了在收集時立即冷藏牛奶(在農場中通常儲存在4℃)并在其送達工廠時立即進行預巴氏殺菌處理的體系。
嗜冷菌也是普遍存在的細菌。它們尤其是在奶頭的表面找到，占總菌群的95％(其中3％為假單胞菌)。當牛奶和這種菌源接觸時會導致牛奶被嗜冷菌污染。因此，當進行自動化擠奶時，最常出現的是牛奶污染的臨界期。現在，在冷藏儲存以避免乳酸菌產生的過程中，嗜冷菌部分處在有利于它們產生的條件下。例如，對假單胞菌而言(4℃的牛奶中)，其產生時間為6-8小時。在其生長期間，這些細菌合成抗熱脂肪酶和蛋白酶，已知它們會導致牛奶和乳制品發生變化。因此，認為這些微生物是牛奶中常見的微生物污染，需避免這種污染。
因此，Gassem和Franck 1991(“用蛋白酶處理由牛奶制成的酸奶的物理性質”，J.Dairy Sci.741503-1511)描述了在來自嗜冷菌的部分純化蛋白酶(劑量為200mg/l)存在下進行的試驗，并報道了所產生的酸奶具有表觀粘度和堅硬度均大于對照酸奶的表觀粘度和堅硬度，但是它們呈現了較大的脫水收縮性。作者總結得出，在生產酸奶過程中應盡可能地限制蛋白酶活性。
Cousin和Marth 1977(“Cottage Cheese and Yoghurt Mannfactured from MilksPrecultured with Psychotrophic Bacteria”，Cultured Dairy Products Journal，1977年5月，15-18頁和30頁)描述了在牛奶中接種嗜冷菌的試驗(假單孢菌或黃桿菌屬的嗜冷菌的1％培養液接種在21℃的脫脂乳中24小時)。這時，當牛奶儲存在4℃時，凝乳的張力增大，這不取決于它們是否接種了嗜冷菌。此外，感官分析顯示用接種牛奶制得的酸奶更酸和更苦。因此，作者總結得出，為了生產發酵乳制品，推薦避免在鮮牛奶中產生嗜冷菌。
因此，在先有技術中認為奶的蛋白質水解作用是技術問題的根源，并且是奶和乳制品中的缺陷，例如在酸奶的生產過程中伴隨著脫水收縮作用形成易碎的凝乳(Tamine和Robinson于1985年著“酸奶—科學和技術”，Woodhead Publishing Ltd于1999年出版，與第17頁比較)，以及在UHT熱處理期間使奶形成凝膠(Stephaniak和Sorhaug于1995年發表的文章“奶中細菌酶的熱變性”，國際乳品聯合會公報“奶中熱引起的變化”1，第349-363頁)。
通過完全反對先有技術中的技術偏見，發明者們為了生產酸奶和發酵乳類型的發酵乳制品，不僅提出了使奶中天然存在的這些酪蛋白中的至少一種，即至少使κ酪蛋白發生蛋白質水解，并在發酵之后對得到的產品進行攪拌，而且還通過細菌源的κ酪蛋白水解酶，尤其是來自至今仍認為是污染牛奶的細菌(如蛋白水解嗜冷菌和蛋白水解乳酸菌)的κ酪蛋白水解酶來進行酪蛋白水解。本發明人已證實，使用κ酪蛋白水解酶生產發酵乳和酸奶實際上是有利的，較好是使用細菌源的κ酪蛋白水解酶，且所述“污染牛奶”的細菌如蛋白水解嗜冷菌和蛋白水解乳酸菌構成了其有利的來源。在本發明優選實施方式中，使用細菌源的抗熱性κ酪蛋白水解酶(即在經受巴氏殺菌熱處理(95℃下至少5分鐘)之后仍可檢測到κ酪蛋白水解活性的酶)。
本發明者證實了這些方法能令人驚奇地和出乎意外地改進酸奶和發酵乳的質地，特別是改進酸奶和發酵乳的粘度，而不會引起在這類制品中不能接受的脫水收縮現象(沒有滲出或沉積)。本發明人進行的感官分析也沒有發現在本發明生產的酸奶和發酵乳中有壞味道。
因此，本專利申請涉及生產發酵乳制品，特別是酸奶和發酵乳的新方法，該方法的特點在于它包括以下步驟-對蛋白質含量不等于零，但小于或等于6％的牛奶基質進行乳酸發酵，并進行κ酪蛋白水解，以便在乳酸發酵的末期獲得等于或大于20％的κ酪蛋白水解程度，κ酪蛋白的水解程度等于或大于30％較好，等于或大于40％更好，等于或大于50％最好，并且-在乳酸發酵和κ酪蛋白水解處理之后，對上述基質進行攪拌。
在本申請中，術語“酸奶”和“發酵乳”具有它們慣用的含義。更具體地，這些名稱與法國在1988年12月30日的88-1203號法令(在1988年12月31日的法蘭西共和國官方刊物中公布)中定義的那些名稱相符合。此法令的正文復制在下文中實施例之后，說明書的末尾。
為了獲得在上述法國法令中定義的“酸奶或發酵乳”，即在本專利申請中所指的“酸奶或發酵乳”，尤其要提到的是不應該除去乳清，并且必須進行至少相當于巴氏滅菌法的熱處理。標準的巴氏滅菌法處理是例如在92-95℃處理5-10分鐘。由于采用至少相當于標準巴氏滅菌法的熱處理，奶基質中的乳清蛋白質完全變性(約使25-99％的乳清蛋白質變性)。
術語“κ酪蛋白水解”或“κ酪蛋白水解處理”在這里指κ酪蛋白的蛋白質水解作用。類似地，術語“κ酪蛋白水解酶”是指能夠使κ酪蛋白發生水解的酶。
有利的是，上述κ酪蛋白水解至少部分地與上述乳酸發酵相伴發生。如下文更詳細的說明所示，在所述熱處理之后(例如，在乳酸發酵的開始或在乳酸發酵期間)，或選擇在所述熱處理之前或開始時，加入或補充所述κ酪蛋白水解酶，但在后者的情況下，應該注意不要在該熱處理期間引起沉淀。
因為奶天然含有κ酪蛋白，并且天然的蛋白質含量不等于零，所以任何類型的奶基質一開始都適合用于實施本發明。盡管如此，依據要生產酸奶和發酵乳的目的，當然需要選擇蛋白質含量(在發酵之前)小于或等于6％的奶基質。選用的奶基質的蛋白質含量優選3-5％之間(包括極限)，更優選3.4-5％之間，最優選3.6-4.8％之間。測定奶基質中蛋白質含量的常規方法包含測定總氮含量，并減去采用在C.Alais于1984年出版(出版商SEPAIC)的《乳科學乳品技術的原理》“Sciencedu lait-Principes des techniques laitières”第四版中第195-196頁所述的凱氏定氮法測量的非蛋白質氮含量。
術語“奶基質”在這里指用于生產酸奶和發酵乳類型的發酵乳制品的其慣用的含義，也就是指其組成適用于進行乳酸發酵的任何類型的基質，其中所述的乳酸發酵是為了生產適合于人消耗的酸奶和發酵乳。通常，實際中使用的奶基質就是任選地采用巴氏滅菌和/或脫脂而收集的奶(例如牛奶、錦羊奶和山羊奶)。更為普遍的，特別是在工業中，是通過加入來源于奶的產品，例如脫脂奶粉、和/或乳制品蛋白粉(酪蛋白酸鹽或WPC)、和/或脂肪(例如奶油)使奶的組成“標準化”。因此，本發明所指的奶基質實際上最通常地具有符合收集到的牛奶的組成，或具有符合標準化的奶的組成，并且該奶基質可以預先巴氏滅菌(在75℃保持10-30秒)和/或脫脂。
本發明的新方法可以進行任何乳酸發酵。乳酸發酵法的步驟可以常規地用示意圖表述如下—收集之后，通常將奶在75℃預巴氏滅菌10-30秒，脫脂，并用冷藏的方式儲存直到使用時，—通過采用該領域熟練技術人員已知的方法，具體是通過添加脫脂奶粉、乳制品蛋白粉(酪蛋白酸鹽或WPC)和任選地加入脂肪(例如奶油)，以獲得所需的組成，從而使脫脂乳中蛋白質標準化。
—在粉末的再水合邊攪拌30分鐘至1小時之后，對由此得到的奶混合物在92-95℃進行5-10分鐘的巴氏殺菌熱處理，然后對該牛奶混合物在稱為“下行相”壓力下進行均質化，或者可以在熱處理之前進行均質化，即稱為“上行相”，—然后將奶混合物冷卻至比發酵溫度高1℃或2℃溫度，并用乳酸菌接種；依照傳統方法進行發酵，pH值為4-5之間，優選pH值為4.5-4.7之間時停止發酵。
當奶混合物用由保加利亞乳酸酐菌菌株和嗜熱性鏈球菌菌株組成的酵素接種時，產物是酸奶。除了前述菌株外，當向該奶混合物中接種其他種類的乳酸菌，特別是雙岐桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌或瑞士乳桿菌時，最終的產物是發酵乳。
κ酪蛋白水解應以控制方式進行，即主要蛋白質水解反應應不在于將酪蛋白水解成其不同組成的氨基酸，而應該將酪蛋白水解成肽、多肽或蛋白質大小的片段。這當然不排除那些一旦通過控制的κ酪蛋白水解作用產生，然后能夠在該過程期間進一步修飾和/或水解的片段。然而，最初依照本發明進行的酪蛋白水解導致釋放至少一個肽、多肽或蛋白質片段，而不是一組各種氨基酸。為此，將依照本發明使用κ酪蛋白水解劑，該κ酪蛋白水解劑具有凝結奶的特性，即具有使膠束去穩定的性質，因此引起奶的凝結。詞句“奶的凝結”這里指絮凝或沉淀。測定一種試劑是否具有凝結奶的性質的常規方法是Berridge試驗(國際乳品聯合金標準1761996，41，square Vergote，B-1040，布魯塞爾)，或修改的Berridge試驗(不向待測的奶中加入CaCl2)。
作為說明，這種試劑通常從κ酪蛋白上釋放至少一個片段，該片段的尺寸小于或等于10kDa，優選小于或等于8kDa。
為了在食物介質中進行κ酪蛋白水解，有利地使用κ酪蛋白水解酶。為了進行如上文所述的受控的κ酪蛋白水解，最好選擇具有凝結奶的性質的κ酪蛋白水解酶(凝固κ酪蛋白水解酶)。
在本發明中，可以選擇至少一種細菌源的凝固κ酪蛋白水解酶。對生產這種酶有利的細菌尤其包括迄今為止認為是牛奶污染物且其產生和代謝受限制的細菌。
這種細菌尤其包括污染奶的蛋白酶解嗜冷菌，在Robin C.MC Kelar，1989《粗食物中嗜冷生物的酶》(Enzymes of Psychrotrophs in raw food)，出版商CRC Press中可以找到許多實施例所有嗜冷菌的蛋白酶(已經標注日期)是凝固κ酪蛋白水解酶，因此適合進行本發明。在靜止期開始時，所述蛋白酶解嗜冷菌通常在指數生長的末期產生這些酶。通過這些細菌實施例，尤其要注意如下幾點
-需氧/微需氧的革蘭氏陰性細菌，如假單孢菌科的那些(例如，假單胞菌屬，如綠針假單孢菌(例如ATCC 13985)、熒光假單孢菌、莓實假單胞菌(例如，ATCC 4973))，如醋桿菌屬、黃桿菌屬、噬纖維菌屬、產堿菌屬和無色桿菌屬的那些；-兼性厭氧革蘭氏陰性細菌，如腸桿菌科(例如，腸桿菌屬和沙雷氏菌屬)以及氣單胞菌屬；-非形成孢子的革蘭氏陽性細菌(例如，鏈球菌屬、乳桿菌屬、微球菌屬、葡萄球菌屬、棒桿菌屬、微桿菌屬)；-內生形成孢子的革蘭氏陽性細菌(桿菌屬、梭菌屬)。
在蛋白水解乳酸菌如鏈球菌或乳桿菌屬中，實際上找到的是產生凝固κ酪蛋白水解酶的細菌。
在本申請中，術語“蛋白水解細菌”應理解為在牛奶中產生時會水解蛋白質，尤其是酪蛋白的細菌，在此牛奶中，它釋放肽(和對照牛奶相比較)。
本領域的那些技術人員可以逐個核實指定的菌株是否產生了凝固κ酪蛋白水解酶。將候選菌株置于包含κ酪蛋白的底物上，然后核實這種酪蛋白是否水解，由這種菌株(從生物量或從這種菌株的培養物提取)產生的酶是否確實具有凝固牛奶的性質(上述Berridge試驗)。
如上所述，較好的是選擇切割至少一個κ酪蛋白及最普通的其它酪蛋白的細菌源的凝固κ酪蛋白水解酶。
甚至更好的是選擇抗熱性(即在95℃經受至少5分鐘之后還具有可檢測的κ酪蛋白水解活性)的細菌源的凝固κ酪蛋白水解酶。
本發明中，以純或部分純的形式、或者生物提取物的形式或者包含這種酶的微生物培養液的提取物(如微生物培養基的蛋白質提取物)的形式提供所述κ酪蛋白水解酶。所述κ酪蛋白水解酶也可以以酶源的形式提供，如產生這種酶的微生物，它可以直接加入奶基質中，并置于有利于其代謝的條件下，使這種微生物合成所述凝固κ酪蛋白水解酶。
細菌源的凝固κ酪蛋白水解酶可以是市售的，例如，酶EC 3.4.24.33(RocheDiagnostics GmbH銷售，參考號內切蛋白酶Asp-N“測序級”目錄號1054589)，酶EC3.4.21.62(carlsberg，由Sigma銷售，名稱枯草桿菌蛋白酶；參考號P5380)。
或者，可以從細菌培養基中按照Robert K.Scopes所述的方法(Robert K.Scopes，1987，Springer-Verlag出版，《蛋白質純化、原理和實踐》(Proteinpurification.Principles and Practice)第二版)純化所述凝固κ酪蛋白水解酶。也可以選擇不完全地純化所述酶，并使用細菌的生物提取物或者細菌培養基的蛋白質提取物。
也可以選擇為奶基質提供產生酶的細菌本身。
當然，也可以選擇遺傳轉化宿主細胞，例如，細菌如大腸桿菌，或酵母如釀酒酵母或巴斯德畢赤氏酵母，使它們產生(較好是超產)這種酶(見《新編分子生物學實驗指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，J.Wiley and Sons，1994，Frederick M.Ausubel，Roger Brent，Robert E.Kingston，David D.Moore，J.G.Seidman，Kevin Struhl編)。然后可以選擇將這些克隆的生物提取物或其培養基的蛋白質提取物加入奶基質中；或者預先純化所述克隆的蛋白質，以純形式將它們加入奶基質中。
所述κ酪蛋白水解步驟不一定是和乳酸發酵不同的步驟所述κ酪蛋白水解步驟也可以通過乳酸發酵來產生。或者，除了加入合適的酶或合適的酶源以外，實際上可以選擇使用乳酸菌進行κ酪蛋白水解，所述乳酸菌產生(自然地或遺傳轉化之后)這種酶，同時發揮其乳酸發酵的功能。
較好的是，選擇加入抗熱性酶或者抗熱性酶源(它可以在進行95℃至少5分鐘之后仍保持κ酪蛋白水解活性)，如莓實假單胞菌ATCC 4973的蛋白酶。
κ酪蛋白水解酶加入形式以及加入奶基質時機的選擇取決于這種基質的溫度和pH條件。事實上，可以選擇在收集牛奶和乳酸發酵結束之間的生產工藝的任何時刻加入酶或觸發其產生，例如在撇去泡沫和預巴氏殺菌步驟(通常對收集的牛奶進行的)之后、在冷藏步驟期間、在牛奶標準化期間或者在巴氏殺菌之后，例如在冷卻、乳酸酵素的接種期間或乳酸發酵期間。因此，必需選擇在工藝過程中所述基質的pH范圍和溫度范圍內有活性的酶。為了使產率更好，本領域技術人員較好選擇與酶的最佳活性的pH和溫度值相符合的pH和溫度值。
附

圖1圖解性地顯示了生產發酵乳和酸奶的方法，并舉例說明了本發明中選自加入蛋白酶和/或蛋白水解微生物期間的一些步驟。當使用抗熱性的酶時，可以在巴氏殺菌之前加入，例如在稱為牛奶標準化的步驟中(附圖1中的“工藝1”)或者在冷藏環境中牛奶儲存過程中(附圖1中的“工藝3”)。
當所述酶以能產生酶的微生物的形式提供時，當然較好是在有利于其代謝，尤其有利于產生蛋白酶的條件(具體是溫度和pH條件)下加入牛奶之前或期間加入這些微生物。
所加入或產生(適當時候)合適量的酶部分取決于酪蛋白含量，尤其取決于基質的κ酪蛋白含量，也取決于在所選pH和溫度時酶的活性。
在本發明中，必需獲得κ酪蛋白水解度至少為20％。這種20％值是最小閾值，但是優選較高的值(高達100％)。然而應注意到，當在巴氏殺菌之前進行κ酪蛋白水解時，較好在巴氏殺菌前將κ酪蛋白水解度限制在小于或等于70％，以避免巴氏殺菌過程中的沉淀現象。
使用細菌源的κ酪蛋白水解酶時，本發明人注意到除了預期的κ酪蛋白水解以外，還存在其它酪蛋白的蛋白水解，尤其β-和α-酪蛋白的蛋白水解。因此，將細菌源的κ酪蛋白水解酶加入奶基質中會κ酪蛋白水解，它通常伴隨著β-和/或α-酪蛋白水解。在這些情況下，在巴氏殺期間為了避免沉淀現象，所述酶加入牛奶底物時較好在巴氏殺菌前將伴隨的酪蛋白水解(α-和/或β-酪蛋白水解)限制在小于或等于70％。
為了測定奶基質中的κ酪蛋白水解度，本領域熟練技術人員掌握了可用的標準技術，例如Recio等1997年提出的電泳法(“電泳在研究酪蛋白的蛋白質水解中的應用”，J.Dairy Res.64221-230)。這樣，通過測量與酶處理之后觀察到的κ酪蛋白峰的表面積相比較在酶處理之前觀察到的κ酪蛋白峰的表面積的減少量，可計算出κ酪蛋白的水解度。應注意的是，在依據本發明所進行的方法的末期，這種電泳方法通常不會觀察到κ酪蛋白水解所產生的全部κ酪蛋白片段(這些片段可能用作乳酸菌生長的酵素)。因此，建議監測κ酪蛋白峰的減小，而不是監測κ酪蛋白水解片段的峰的出現。
本領域技術人員能根據各具體情況所需進行調整，以獲得所需的酪蛋白水解度。
當它是在巴氏殺菌前加入奶中的分泌蛋白質水解的嗜冷菌時，可以例如往其中加入104-106細菌/ml，并將由此接種的奶保存在有利于這些微生物代謝的條件下(約4-15℃的溫度)足夠長時間使κ酪蛋白水解酶釋放到此奶中，這通常發生在細菌群為106-1010細菌/ml之間，較好為107-109細菌/ml之間。
除了κ酪蛋白水解之外，依照本發明的方法還包括對發酵產品進行攪拌。可以依照常規技術進行這種攪拌，例如采用通過過濾器的方式光滑化(由A.Y.Tamine和R.K.Robinson著的“酸奶的科學與技術”，出版商Woodhead Publishing Ltd.1999)。
依照本發明的方法的優點是與用κ酪蛋白的水解度不至少為20％和/或不需要攪拌的類似方法產生的酸奶和發酵乳相比，它能使產生的酸奶和發酵乳類型的發酵乳制品具有改良的質地。它特別可生產與對照的酸奶和發酵乳相比，表觀粘度(在64s-1、10s和10℃的條件下，用同軸圓筒式粘度計進行測量)增加20％到70％的酸奶和發酵乳。
因此，該方法會限制、甚至避免加入組織改良劑(例如明膠、淀粉或果膠)，組織改良目前是用來使發酵乳和酸奶類型的制品具有適宜的質地。該方法也會限制蛋白質在使用的奶基質中的含量奶基質具有較低濃度的蛋白質，同時保持令人滿意的表觀粘度效果。例如，發明者已經能夠證明，為了獲得表觀粘度值(通過將本發明的方法應用在含有4.1％的蛋白質的奶混合物中獲得)，在不進行κ酪蛋白水解處理的情況下，需要將奶基質中的蛋白質含量增加到4.6％。使用本發明的方法，在質地方面獲得同等結果的條件下，可使酸奶和發酵乳類型的乳制品的生產需要較少量的組織改良劑和蛋白質。
在一特別顯著的方式中，依照本發明的方法不會引起脫水收縮現象，而脫水收縮現象對于發酵乳或酸奶類型的制品是不可接受的。這樣，發明者就能觀察到不會出現任何的沉積或滲出現象，即使在10℃儲存28天之后。該制得的產品也具有并保持完全光滑和均勻的質地，且沒有壞味道。
本申請也涉及采用本發明的方法獲得發酵乳和酸奶。具體地，采用本發明的方法獲得的發酵乳和酸奶的特點在于，其κ酪蛋白的含量顯著小于在先有技術的類似產品中通常觀測到的κ酪蛋白含量。當發酵乳和酸乳酪的成品是由經過至少等同于標準巴氏滅菌的熱處理(例如在92-95℃加熱5-10分鐘)的奶或奶基質制得的，那么該成品的乳清蛋白會完全變性(約有25-99％的乳清蛋白變性)。更具體地，本發明的酸奶和發酵乳的特征在于，其κ酪蛋白水解度至少為20％，其水解度至少為30％較佳，至少為40％更佳，至少為50％最佳。依照Recio等1997年提出的方法(“電泳在研究酪蛋白的蛋白質水解中的應用”，J.Dairy Res.64221-230)，采用毛細管電泳能夠測定上述κ酪蛋白水解的百分率。該方法的測定原理是，在本發明方法生產的酸奶和發酵乳的過程中，κ酪蛋白峰的表面積減小，并以標準峰(例如，在該方法的過程中，含量不發生明顯變化的一種參考化合物的峰)為基準。例如，β-乳球蛋白峰可以用作標準峰。因此，以下計算可以評估本發明方法制備的發酵乳的κ酪蛋白水解度κ酪蛋白水解度(％)＝1-((ake*aβlgc/aβlge)/akc)*100其中ake＝酸奶樣品的κ酪蛋白峰的面積akc＝對照奶的κ酪蛋白峰的面積aβlge＝酸奶樣品的參考化合物的峰(β-乳球蛋白峰)的面積aβlgc＝對照奶的參考化合物(β-乳球蛋白S1峰)的面積術語“對照奶”是指已經過脫脂和巴氏滅菌(在92-95℃加熱10分鐘)的整體混合的奶。
這種酸奶或發酵乳也通常包含已經用于κ酪蛋白水解的細菌源的κ酪蛋白水解酶。
或者，如果在酸奶或發酵乳中檢測到明顯存在的κ酪蛋白水解酶，那就可以由此推測出這種酸奶或發酵乳是遵照本發明制得的。明顯存在的這種酶可以通過C.E.Fajardo-Lira和S.S.Nielsen，1998(“嗜冷微生物對奶中纖溶酶系統的影響”，J.Dairy Sci..81901-908)所述的酪蛋白SDS-Page型(直接施加到除纖溶酶以外的蛋白酶上)的酶譜進行確定。為了識別任何并非源自乳酸酵素的蛋白酶，不得不將這種酶譜和所述產品的乳酸酵素在新鮮牛奶培養物的樣品進行比較。
本領域技術人員會發現，在由A.Y.Tamine和R.K.Robinson著的第二版《酸奶一科學與技術》(Yoghurt-Science and Technology)Woodhead Publishing Ltd)中的內容作為參考已納入本申請中。這本書為實施本發明的實施方式提供了重要的技術信息。
以下實施例純粹是用于說明的目的。
實施例1對從生產者直接收集得到的整體混合的奶預先巴氏滅菌和脫脂，然后接種各劑量的蛋白水解提取物。這種蛋白水解提取物通過沉淀來自綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)ATCC 13985的培養基中的蛋白質獲得。所述蛋白水解活性為200單位/ml。這種活性通過偶氮酪蛋白(azocasein)試驗來得(Kohlmann，K.L.，Nielesen，S.S.，Steenson.L.R.和Ladisch，M.R.1991，“由嗜冷微生物生產蛋白酶”，J.Dairy Sci.743275-3283)。1單位代表每小時接種在366nm處吸光度增加0.01。
這些接種的奶可以在4℃下儲存幾小時，在所述條件下，都不會超過酪蛋白水解極限、熱處理的臨界點(對κ酪蛋白的最大極限為70％，對β酪蛋白的極限為50％)。
制備具有這些接種奶的攪拌酸奶以及沒有接種的相同奶。對于各試驗來說，根據蛋白質和脂肪，借助脫脂奶粉和奶油使奶標準化，以制得包含4.5％蛋白質和3.2％脂肪的奶基質。然后通過測量蛋白質含量和脂肪含量來控制這種奶基質的組成(Determination de la teneur en matieres grassesmethode d′extraction ethero-chlorhydrique[脂肪含量的測定乙氫氯酸撮的方法]NF V04215-Official Journal ofSept.1969)。
將由此制得的奶基質進行巴氏殺菌(95℃-8分鐘)，然后進行均質化(250巴，2次)。在冷卻到44℃之后，用乳酸酵素接種奶基質，然后在43℃發酵。在四次試驗中，在4小時30分鐘(±15分鐘)之后達到“脫乳凝結”pH(4.65)。然后，使所述產品光滑，并在包括進料泵、過濾器(350微米目)和平板冷卻器的平臺上冷卻到20℃。然后包裝在125ml罐中。
在冷藏儲存過程中，對4個產品進行粘度和滲出測量。結果歸納在下表1中。給出具有相應標準偏差的4次測量的平均值。
表1在冷藏儲存過程中對不同試驗對應的酸奶進行粘度和滲出測量
這些結果證實，粘度隨著牛奶中加入蛋白水解提取物的劑量顯著增大。在加入酶提取物劑量之后短時間冷藏儲存的奶似乎不會顯著影響產品。所述產品沒有出現沉積和滲出。
實施例2將整體混合的奶預先巴氏殺菌和脫脂，然后用Pseudomonas fragi ATCC 4973接種，然后儲存在4℃7天。在儲存7天后，所述奶(用2×104細菌/ml接種)具有6×109嗜冷菌/ml的細菌負載。通過毛細管電泳測量這些奶的β-和κ-酪蛋白水解的形成。κ-酪蛋白峰的表面積降低25％，β-酪蛋白峰的表面積總數降低35％。β-酪蛋白的蛋白水解部分可能是由于纖溶酶所造成的。
按照實施例1所述的相同方法，由儲存7天的這種接種奶、儲存7天的未接種奶以及接種但未儲存的對照奶制備攪拌的酸奶(Veloute型)。對于由所述對照奶制備的產品，在43℃接種5小時之后達到“脫乳凝結”pH(pH4.7)；對于由蛋白水解奶制備的產品，在4小時30分鐘之后達到“脫乳凝結”pH(pH4.7)。
在表2中列出了四次粘度測量的平均值，均具有相應標準偏差，并進行沉積和滲出測量。
表2在冷藏儲存過程中對在4℃用莓實假單胞菌接種0和7天的產品進行粘度和滲出測量
這些結果證實，粘度顯著增大(40％數量級)與儲存牛奶的物理化學效果無關。。所述產品沒有出現沉積和滲出。
實施例3在此實施例中，所述預先巴氏殺菌和脫脂處理的整體混合奶不進行儲存，并且沒有加入蛋白水解嗜冷菌菌株。按照實施例1所述的相同方法制備所述攪拌的酸奶。在接種乳酸酵素時，所述奶基質中加入少量來自嗜冷菌的蛋白酶(見下表3)。其它制備步驟沒有變化。
從幾種蛋白水解嗜冷菌(實施例1的ATCC 13985和實施例2的ATCC 4973)的培養液純化所述蛋白酶。此實施例中所用的蛋白水解提取物是其蛋白水解活性為600單位/ml的蛋白酶混合物。這種活性通過偶氮酪蛋白試驗獲得(見實施例1)。
下表3中列出了對產品進行的粘度、沉積和滲出測量的平均值。
表3在冷藏儲存過程中對攪拌的酸奶進行粘度和滲出測量
在所有試驗的蛋白水解提取物的劑量下均觀察到粘度顯著增大。
實施例4用接種了莓實假單胞菌ATCc 4973的蛋白水解提取物的整體混合并預先巴氏殺菌和脫脂奶制備低脂攪拌的酸奶，并制備沒有接種的相同奶。這種莓實假單胞菌的蛋白水解提取物以和實施例1中綠針假單胞菌提取物的相同方法獲得，并具有400單位/ml的蛋白水解活性。
為了得到包含4.95蛋白質的奶基質，使用脫脂奶粉按照蛋白質將所述奶標準化。然后通過測量蛋白質含量來控制這種基質的組成(NF V04215，參見實施例1)。
將由此制備的基質進行巴氏殺菌(95℃，8分鐘)，然后進行均質化(150巴，2次)。在冷卻到42℃之后，用乳酸酵素接種基質，然后在40℃發酵。在2次試驗中，在5小時(±15分鐘)之后達到“脫乳凝結”pH(4.70)。然后，使所述產品光滑，并在包括進料泵、過濾器(350微米目)和平板冷卻器的平臺上冷卻到20℃。然后包裝在125ml罐中。
在冷藏儲存過程中對所述產品進行粘度和滲出測量。結果列于下表4中。列出了4次測量的具相應標準偏差的平均值。
表4在冷藏儲存過程中對不同試驗對應的酸奶進行粘度和滲出測量
此實施例顯示，對不含脂肪的產品，粘度顯著增大。所述產品沒有出現沉積，但在D+28時出現少量的滲出。
1988年12月30日的88-1203號法令關于發酵乳和酸奶的法令NORECOC8800150D在國務部長、經濟事務、財政和預算部長、大法官、司法部長、農林業部長和聯合、健康和社會福利部長、政府發言人的報告上，在1905年8月1日關于產品或服務的欺詐和歪曲事實方面的法律，特別是該項法律的第11條，與1919年1月22日制定的使用所述法律的修改法令方面；在1934年6月29日關于保護乳制品的法律方面；在1935年7月2日制定的組織和改善奶市場的法律方面；在1912年4月15日的使用上述1905年8月1日關于食品方面的法律的修改法令方面；在1924年3月25日的使用1905年8月1日有關奶和乳制品的法律的修改法令方面；在1984年12月7日的使用上述1905年8月1日有關食品的商標和說明的法律的第88-1147號法令方面，總理已經聽取了政府(財政部)的意見。
第1條名稱“發酵乳”專用于用脫脂乳或未脫脂乳或煉乳或脫脂奶粉或未脫脂奶粉等富含或不富含奶成分的物質制備得的乳制品，該乳制品須經過至少等同于巴氏滅菌法的熱處理，以及用屬于各制品特性的物種的微生物接種。
應該由使用的微生物的活性來產生發酵乳的凝結，而不應該用其他方法獲得發酵乳的凝結。
在銷售時，乳制品中含有的游離乳酸的數量不應該小于0.6克/100克。相對于含奶部分所表示的蛋白質含量不應該小于正常奶中蛋白質含量。
截止銷售給消費者之時為止，應將發酵乳放置在能夠防止其變質的溫度下保存，負責農業、健康和消費者事務的部長們將制定聯合命令。
條款2名稱“酸奶”專用于依照合理和傳統的慣例，通過只有特定的嗜熱乳酸菌的生長而獲得的發酵乳，上述特定的嗜熱乳酸菌被稱為保加利亞乳酐菌和嗜熱鏈球菌，這兩種菌必須同時接種，并在成品中有活性。相對于含奶部分所表示的上述特定的嗜熱乳酸菌的比率為至少1千萬個乳酸菌/克。
銷售時，酸奶中游離乳酸的含量不應該小于0.7克/100克。
第3條可以將以下制品補加到發酵乳中香料提取物、天然食用香料和限度為成品的30重量％內的糖和其它賦予特殊香味的食品。
禁止加入非奶來源的脂肪和蛋白質作為替代品。
禁止對發酵乳進行除去所用奶中的組成成分，特別是凝塊瀝干的任何處理。
以在上述1912年4月15日法令的第一條中規定的形式發布的命令陳述了在本法令所述的制品的生產和制備過程中準許使用的其他物質和其它種類食用香料的清單和使用條件。
第4條對1997年4月3日頒布的法令97-298 1997-03-27第2條的修正除了在上述消費者法規的第R.112-6到R.112-31的條款中提供的信息外，發酵乳的貼標還包括—除商品名稱外，只要發酵乳不是牛奶，要注明該奶來源的動物種類的信息；—注釋“在……下保存”注明要觀測的溫度的信息；—如果以含奶部分計算制品中的脂肪含量小于1重量％，在商品名稱后面要注明“低脂肪”；—根據情況，如果要給發酵乳加糖或調味，要注明“加糖”或使用的調味物質的名稱；—在加入一種或多種在第3條中規定的成分情況下，必須在商品名稱上加上這種或這些成分的注釋。
如果以含奶部分計算脂肪含量至少等于3重量％，該發酵乳的貼標上可以在商品名稱旁附加“脂肪”的注釋。
第5條如果制品含有的“酸奶”符合以上第2條中規定的定義，那么名稱“酸奶”可以只出現在該食品的貼標上。
第6條負責農業、健康和消費者事務的部長們的聯合命令在適當時候規定在本法令中定義的制品保持其特性的時間。
第7條對1997年4月3日JORF(法蘭西共和國官方雜志)頒布的法令97-298 1997-03-27第2條的修正與采用消費者法規的第R.215-1至R.215-15條調查并可能確定欺詐罪的量度無關，負責農業、健康和消費者事務的部長們以聯合命令的方式規定發酵乳的微生物特性和檢查這些特性的方式。
第8條[本條款正在修正]第9條國務部長、經濟事務財政和預算部長、大法官、司法部長、農林業部長、聯合、健康和社會福利部長、政府發言人，以及國務部分的國務秘書、負責消費者事務的經濟事務、財政和預算部長各自都按照賦予他們的責任貫徹執行本法令。該法令將公布在法蘭西共和國的官方雜志上。
權利要求
1.一種生產選自發酵乳和酸的的乳制品的方法，該方法的特征在于—對蛋白質含量不等于零，但小于或等于6％的奶基質進行至少相當于巴氏殺菌的熱處理，借助于選自具有凝結奶特性的κ酪蛋白水解酶的酶進行乳酸發酵和κ酪蛋白水解，以便在乳酸發酵的末期獲得等于或大于20％的κ酪蛋白水解度，在收集奶和乳酸發酵的末期之間引發所述κ酪蛋白水解；條件是若在所述熱處理之前引發κ酪蛋白水解，則須注意不要在該熱處理期間產生沉淀，并且—在乳酸發酵和κ酪蛋白水解處理之后，對所述基質攪拌。
2.權利要求1所述的方法，其特征在于，奶基質中的蛋白質含量在3-5％之間，3％和5％也包括在內。
3.權利要求1或2所述的方法，其特征在于，κ酪蛋白水解度等于或大于30％。
4.權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，κ酪蛋白水解度等于或大于40％，較好等于或大于50％。
5.權利要求1至4中任一項所述的方法，其特征在于，所述凝結κ酪蛋白水解酶以純成部分純化的形式，或以生物提取物的形式，或以微生物培養基的蛋白質提取物的形式，或以微生物產物如酶的形式提供。
6.權利要求1至5中任一項所述的方法，其特征在于，所述細菌源的凝固κ酪蛋白水解酶是由選自蛋白水解乳酸菌和蛋白水解嗜冷菌的細菌產生的。
7.權利要求1至6中任一項所述的方法，其特征在于，所述細菌源的凝固κ酪蛋白水解酶是由選自假單胞菌屬的蛋白水解嗜冷菌產生的。
8.權利要求7所述的方法，其特征在于，所述細菌源的凝固κ酪蛋白水解酶是由選自綠針假單胞菌、熒光假單胞菌和莓實假單胞菌的蛋白水解嗜冷菌產生的。
9.權利要求1至6中任一項所述的方法，其特征在于，所述細菌源的凝固κ酪蛋白水解酶是由選自鏈球菌和乳桿菌屬的蛋白水解乳酸菌產生的。
10.權利要求1至9中任一項所述的方法，其特征在于，所述細菌源的凝固κ酪蛋白水解酶具有在95℃熱處理至少5分鐘之后仍舊保持可檢測κ酪蛋白水解活性的性質。
11.權利要求10所述的方法，其特征在于，所述細菌源的凝固κ酪蛋白水解酶是在所述熱處理前加入的。
12.權利要求10或11所述的方法，其特征在于，在所述熱處理前，κ酪蛋白水解度小于70％，α-和β-酪蛋白的水解度各自小于或等于70％。
13.權利要求10至12中任一項所述的方法，其特征在于，在冷藏儲存奶之前或期間，以產生這種酶的細菌形式在奶基質中加入所述細菌源的凝固κ酪蛋白水解酶。
14.權利要求10至12中任一項所述的方法，其特征在于，在牛奶標準化步驟時以純酶或者生物提取物或者微生物培養基的蛋白質提取物的形式在奶基質中加入所述細菌源的凝固κ酪蛋白水解酶。
15.一種酶的用途，該酶選自具有凝結奶特性的κ酪蛋白水解酶，通過至少相當于巴氏滅菌的熱處理，通過乳酸發酵和通過κ酪蛋白水解，以生產選自發酵乳和酸奶的攪拌乳制品，在收集奶和乳酸發酵的末期之間引發所述κ酪蛋白水解；條件是若在上述熱處理之前引發κ酪蛋白水解，則須注意不要在該熱處理期間產生沉淀。
16.一種攪拌的乳制品，其選自發酵乳和酸奶，其特征在于，所述κ酪蛋白水解度與新鮮奶相比大于或等于20％，它包含所述細菌源的κ酪蛋白水解酶。
17.一種攪拌的乳制品，它選自發酵乳和酸奶，它由權利要求1-14中任一項所述的方法制得。
全文摘要
本發明涉及生產發酵乳產品的新方法，通過具有細菌源的奶凝固酶水解奶的至少一種酪蛋白即至少一種κ酪蛋白，然后在發酵之后攪拌產物。本發明方法尤其適合生產發酵乳產品，如酸奶和發酵型奶，其中，所述產品具有改良的質地，尤其是改良的粘度，且不會引起脫水收縮或產生壞味道。
文檔編號A23C9/123GK1646024SQ03808374
公開日2005年7月27日 申請日期2003年1月17日 優先權日2002年2月15日
發明者N·德格里夫特萊爾, C·奎古納, F·格魯格爾, D·帕奎特 申請人:蓋爾瓦達農公司