專利名稱：一種羽毛角蛋白降解菌的固定化方法
技術領域：
本發明涉及微生物菌種的固定化領域，特別是涉及一種羽毛角蛋白降解菌的固定化方 法及其固定化發酵條件。
背景技術：
在現代農業中，大規模的家禽養殖產生了大量的蛋白質廢物，其中羽毛廢棄物產量最 多。隨著工業進步、人民生活水平的提高、醫療保健的加強及畜牧業的發展，動物蛋白質 資源的短缺逐漸明顯，已慢慢成為我國飼料工業發展的制約因素，國內氨基酸原料(蛋白質) 的短缺越來越嚴重，因此，大力的研究開發動物蛋白質、氨基酸及其連鎖產品非常有必要。 目前，處理角蛋白多數是用物理(高溫、高壓)和化學(強堿、強酸)水解法，但是存在 能耗多，破壞氨基酸、三廢不易處理、環境污染嚴重、經濟效益不高等問題。為了更好地 利用角蛋白資源并且保護環境，許多研究者試圖采用生物技術來處理羽毛粉，以提高其蛋 白品質，從而節省家禽口糧中大豆、魚粉的用量，促進家禽業的發展，或作其他用途。
用微生物降解羽毛，可裂解二硫鍵，完全降解羽毛，脫水干燥即得成品，但目前國內 的研究多停留在菌種篩選，角蛋白酶分離提純及降解機理上，尚未得到工業化生產應用， 隨著發酵工程的進一步發展，此類方法在未來的羽毛粉加工中將會有廣闊的前景。
在2006年11月15日公開的專利號為200610051886.8的《一種微生物降解羽毛的方法》 中提及利用地衣芽孢桿菌ZJUEL31410降解羽毛的工藝，但是該專利未對菌種固定化，給 產業化帶來不便。
固定化細菌能夠保持細胞內酶系的原始狀態與天然環境，有效地利用游離細菌細胞的 完整酶系統和細胞的選擇通透性，既有固定化酶的優點，又具有自身的優越性。省去酶的 分離費用；多酶系統，無需輔酶再生；細菌生長停滯時間短，細胞多，反應快；對污染的 抵抗力強；可連續發酵；蒸餾或提取前不用分離出細胞，保持酶的原始狀態，從而加強了 穩定性，可連續使用，節約養料；使用固定化細胞反應塔， 一邊進料， 一邊排出發酵液， 避免反饋抑制和產物消耗，因此，越來越廣泛地應用于食品與發酵工業中。
殼聚糖因其來源豐富，價格低廉，機械性能和生物相容性好等特點，可以應用于固定 化的載體。在2007年10月3日公開的專利號為200710067561.3的《一種廢水處理用微生 物固定化材料的制備方法》中是利用殼聚糖及膨潤土等為材料制成的固定化材料用于微生 物固定化水處理技術，但不涉及具有某種特殊降解功能的菌種發酵的固定化。
本發明人認為利用固定化微生物發酵法降解羽毛極具開發前景，關鍵在于能選擇高效的菌株和合適的固定化材料，固定化工藝，并優化出最佳發酵條件。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種羽毛角蛋白降解菌的固定化方法，該方法方便 可行，產品壽命長，易回收，不污染環境。
本發明的一種羽毛角蛋白降解菌的固定化方法，包括
(1) 將1 wt%~6 wt。/。的殼聚糖的醋酸溶液逐滴注入到20 wt%NaOH、 30 wt% CH3OH 的凝結液中，得到白色球形殼聚糖，水洗至中性，丙酮洗滌脫色，用濾紙吸去其表面水分；
(2) 用滅過菌的蒸餾水把羽毛角蛋白降解菌嗜麥芽寡養單胞菌DHHJ從斜面培養基 上洗下，加入到裝有40 120mL增殖培養基的250mL搖瓶中，置于30 70。C， 120~160rpm 的搖床增殖10~20h;
(3) 將上述球形殼聚糖經12rC滅菌20-30min，稱取1~5 g，于無菌條件下加入到40 mL 120mL增殖培養基，再置于30 70'C， 12(K160rpm的搖床中固定化1~5天，過濾得殼 聚糖固定羽毛角蛋白降解菌DHHJ的成品，將其加入到發酵培養基中發酵培養，測定發酵 液中的可溶蛋白含量和氨基酸含量，以確定降解效果。
所述的步驟(1)中殼聚糖溶液是3wt。/。的殼聚糖的醋酸溶液。
所述的步驟(2)中斜面培養基(g/100mL)為0.5g牛肉膏，lg蛋白胨，0.5g氯化鈉， 2g瓊脂，pH=7.4~7.6。
所述的步驟(2)中的增殖培養基為50mL。
所述的步驟(2)、 (3)的增殖培養基(g/100mL)為牛肉膏0.5g，蛋白胨lg，氯化鈉 0.5g， pH=7.4~7.6。
所述的步驟(3)中球形殼聚糖與增殖培養基的投加量為2.5g/50mL，固定化2天。
所述的步驟(3)中最優發酵條件為發酵溫度40'C，發酵培養基pH=7.4-7.6，搖床 轉速150卬m，種齡12h，固定化時間2天，投加量2.5g/50mL。
所述的步驟(3)中發酵培養基(g/100mL)為羽毛粉2.0g，葡萄糖lg，干酪素0.2g， KC10.04g， NaC10.03g，吐溫80 0.4g，磷酸氫二鈉磷酸二氫鉀=0.4: 0.03， pH=7.4-7.6。
本發明是利用殼聚糖表面吸附法固定羽毛角蛋白降解菌DHHJ,固定化機理是當球形 殼聚糖加到角蛋白降解菌的培養液中時，由于球形殼聚糖表面的吸附作用，在其周圍形成 了一個潛在的豐富營養源。同時，角蛋白降解菌孢子可通過擴散、對流或主動運輸方式轉 移到球形殼聚糖表面，在水動力及物化作用下，吸附在其表面，然后利用其周圍形成的營 養源進行生長、繁殖，就形成固定化的角蛋白降解菌。本發明首次利用殼聚糖為主要原料來固定化本實驗室分離純化的一種高降解能力的 羽毛角蛋白降解菌，并優化了發酵條件，為工業連續發酵降解羽毛提供了良好的條件，其 中3%的殼聚糖的醋酸溶液制成的殼聚糖成球性能較好，固定化時間2天，50mL增殖培養 基中加入2.5g殼聚糖小球載體的固定化效果最好。且在發酵培養基中加入干酪素可以誘導 固定在殼聚糖中的羽毛角蛋白降解菌DHHJ產生角蛋白酶，進而在羽毛這種非均相環境下 發生降解現象。殼聚糖材料及制備的殼聚糖凝膠小球具有一定的生物相容性，且殼聚糖小 球在發酵過程中具有較強的機械性能，壽命遠大于實驗進行的10批發酵，具備韌性高， 使用壽命長的特點。
所選用的嗜麥芽寡養單胞菌DHHJ (&e"o/ro;^omo"as ma/to/7/w7/tf DHHJ)是由本課題組 分離純化得到的，其降解羽毛能力較強，分解羽毛效果顯著，菌株及其代謝產物——角蛋 白酶，不產生有害物質，其降解羽毛產物——可溶蛋白和氨基酸，能作為安全的飼料添加 劑及其他用途。
菌種的分離和來源見申請號為200710171939.4的《一種產角蛋白酶的菌株及其應 用》。該微生物的培養方法該嗜麥芽寡養單胞菌降解羽毛的種子培養方法和發酵培養方 法見下將菌株DHHJ接種于活化培養基，于4(TC恒溫活化培養12h。取活化后的培養液 以4%的濃度比接種于只含雞毛的發酵培養基中，于4(TC、 150ipm培養。活化培養基為牛 肉膏0.5g，蛋白胨lg，氯化鈉0.5g。
有益效果
(1) 本發明方便可行，易回收，不污染環境；
(2) 制備的球形殼聚糖具有一定的生物相容性和較強的機械性能，韌性高，壽命長。
圖1為球形殼聚糖固定化羽毛角蛋白降解菌DHHJ的流程圖。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而 不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。
實施例1
3wt。/。殼聚糖的醋酸溶液用移液管逐滴注入到20y。NaOH、 30%CH3OH凝結液中，得到白色球形殼聚糖，水洗至中性，丙酮洗滌脫色，用滅過菌的蒸餾水把羽毛角蛋白降解菌 DHHJ從斜面培養基上洗下，加入到裝有增殖培養基(50mL)的250mL搖瓶中，置于4(TC， 130rpm的搖床增殖15h，用濾紙把制得的殼聚糖小球表面水分吸去，稱取10g，經121°C 滅菌30min，在無菌條件下向50mL增殖培養基加入己滅菌得球形殼聚糖2.5g，置搖床中， 40'C， 130rpm固定化3天，過濾得殼聚糖固定羽毛角蛋白降解菌DHHJ的成品。
將成品連續分批發酵得第一批羽毛角蛋白分解率最高，達70%，而后依次下降，當發 酵進行到第三批時，羽毛分解率趨于穩定， 一直保持到發酵進行到第10批，仍無明顯下 降，均接近60%。
實施例2
3wt。/。殼聚糖溶液用移液管逐滴注入到20%NaOH、 30%CH3OH凝結液中，得到白色球 形殼聚糖，水洗至中性，丙酮洗滌脫色，用滅過菌的蒸餾水把羽毛角蛋白降解菌DHHJ從 斜面培養基上洗下，加入到裝有增殖培養基(50mL)的250mL搖瓶中，置于40'C, 130ipm 的搖床增殖12h，用濾紙把制得的殼聚糖小球表面水分吸去，稱取5g，經121'C滅菌30min， 在無菌條件下向50mL增殖培養基加入已滅菌得球形殼聚糖2.5g，置搖床中，40'C， 150rpm 固定化2天，過濾得殼聚糖固定羽毛角蛋白降解菌DHHJ的成品。將成品連續分批發酵得 發酵第一批的蛋白質和氨基酸含量較高，分別達50.6mg/mL和0.49mg/mL，而后有些許下 降，當發酵進行到第三批時，蛋白質和氨基酸含量趨于穩定， 一直保持到發酵進行到第10 批，仍無明顯下降，分別接近48.3mg/mL0.41mg/mL。
實施例3
3wto/。殼聚糖溶液用移液管逐滴注入到20Q/。NaOH、 30%CH3OH凝結液中，得到白色球 形殼聚糖，水洗至中性，丙酮洗滌脫色，用滅過菌的蒸餾水把羽毛角蛋白降解菌DHHJ從 斜面培養基上洗下，加入到裝有增殖培養基(50mL)的250mL搖瓶中，置于4(TC， 130rpm 的搖床增殖18h，用濾紙把制得的殼聚糖小球表面水分吸去，稱取5g左右，經121'C滅菌 30min，在無菌條件下向50mL增殖培養基加入已滅菌得球形殼聚糖2.5g，置搖床中，40'C， 150rpm固定化2天，過濾得殼聚糖固定羽毛角蛋白降解菌DHHJ的成品。將成品連續分批 發酵得羽毛角蛋白降解菌生長較為穩定，始終保持著較高的菌體濃度和酶活力，分別為 2.8DO660和12.2U/mL由于菌體濃度和酶活力與羽毛降解能力有著直接的關系，因此也說 明了固定化的角蛋白降解菌能連續穩定降解羽毛的原因。
實驗中經過IO批發酵的殼聚糖小球形態保持穩定，無腐爛現象。
權利要求
1.一種羽毛角蛋白降解菌的固定化方法，包括(1)將1wt％～6wt％的殼聚糖的醋酸溶液逐滴注入到20wt％NaOH、30wt％CH3OH的凝結液中，得到白色球形殼聚糖，水洗至中性，丙酮洗滌脫色，用濾紙吸去其表面水分；(2)用滅過菌的蒸餾水把羽毛角蛋白降解菌嗜麥芽寡養單胞菌DHHJ從斜面培養基上洗下，加入到裝有40～120mL增殖培養基的250mL搖瓶中，置于30～70℃，120～160rpm的搖床增殖10～20h；(3)將上述球形殼聚糖經121℃滅菌20-30min，稱取1～5g，于無菌條件下加入到40mL～120mL增殖培養基，再置于30～70℃，120～160rpm的搖床中固定化1～5天，過濾得殼聚糖固定羽毛角蛋白降解菌DHHJ的成品，將其加入到發酵培養基中發酵培養。
2. 根據權利要求l所述的羽毛角蛋白降解菌的固定化方法，其特征在于所述的步驟(l) 中殼聚糖溶液是3 wtc/。的殼聚糖的醋酸溶液。
3. 根據權利要求l所述的羽毛角蛋白降解菌的固定化方法，其特征在于所述的步驟(2) 中斜面培養基g/100mL為0.5g牛肉膏，lg蛋白胨，0.5g氯化鈉，2g瓊脂，pH=7.4~7.6。
4. 根據權利要求l所述的羽毛角蛋白降解菌的固定化方法，其特征在于所述的步驟(2) 中的增殖培養基為50mL。
5. 根據權利要求1所述的羽毛角蛋白降解菌的固定化方法，其特征在于所述的步驟(2)、 (3)的增殖培養基g/100mL為牛肉膏0.5g，蛋白胨lg，氯化鈉0.5g， pH=7.4~7.6。
6. 根據權利要求l所述的羽毛角蛋白降解菌的固定化方法，其特征在于所述的步驟(3) 中球形殼聚糖與增殖培養基的投加量為2.5g/50mL，固定化2天。
7. 根據權利要求l所述的羽毛角蛋白降解菌的固定化方法，其特征在于所述的步驟(3) 中發酵條件為發酵溫度40'C，發酵培養基pI^7.4-7.6，搖床轉速150rpm，種齡12h，固 定化時間2天，投加量2.5g/50mL。
8. 根據權利要求l所述的羽毛角蛋白降解菌的固定化方法，其特征在于所述的步驟(3) 中發酵培養基g/100mL為羽毛粉2.0g，葡萄糖lg，干酪素0,2g， KC10.04g， NaC10.03g, 吐溫80 0.4g,磷酸氫二鈉磷酸二氫鉀=0.4: 0.03， pH=7.4-7.6。
全文摘要
本發明涉及了一種羽毛角蛋白降解菌的固定化方法及其固定化發酵條件，包括(1)將殼聚糖的醋酸溶液逐滴注入到NaOH、CH<sub>3</sub>OH的凝結液中，得到白色球形殼聚糖，水洗至中性，丙酮洗滌脫色，用濾紙吸去其表面水分；(2)用滅過菌的蒸餾水把羽毛角蛋白降解菌嗜麥芽寡養單胞菌DHHJ從斜面培養基上洗下，加入到裝有增殖培養基的搖瓶中，置于搖床增殖10～20h；(3)將上述球形殼聚糖經滅菌，于無菌條件下加入到增殖培養基，再置于搖床中固定化1～5天，過濾，即得殼聚糖固定羽毛角蛋白降解菌DHHJ的成品，將其加入到發酵培養基中發酵培養。本發明方便可行，產品具有一定的生物相容性，壽命長，易回收，不污染環境。
文檔編號C12N11/00GK101302506SQ20081003945
公開日2008年11月12日 申請日期2008年6月24日 優先權日2008年6月24日
發明者周美華, 曹張軍, 晶 王, 丹 魯 申請人:東華大學