一種嗜鐵解磷細菌的分離篩選方法
【專利摘要】本發明公開了一種嗜鐵解磷細菌的分離篩選方法，包括以下步驟：(1)采集作物根圍土壤，去雜，接種于滅菌水中，25-35℃條件下培養2-3小時，分離上清液；(2)制備CAS-P檢測平板，將CaCl2溶液、MgSO4·7H2O溶液、質量濃度為8-12％的酸水解酪蛋白溶液混合均勻，向其中加入Ca3(PO4)2，調節pH為6.8-7.0，用水定容；加入瓊脂粉，滅菌，滅菌后待溫度降至50-60℃時，再加入CAS藍色檢測液，混勻后倒平板，即得；(3)將步驟(1)的上清液接種于CAS-P檢測平板上，接種量為100-200uL/平板，25-35℃條件下培養3-5天，在該檢測平板上生長的菌株即為嗜鐵解磷細菌。采用本發明的篩選方法，簡化了分離篩選步驟，大大縮短篩選時間，提高了嗜鐵解磷細菌的分離篩選效率。
【專利說明】一種嗜鐵解磷細菌的分離篩選方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種嗜鐵解磷細菌的分離篩選方法。
【背景技術】
[0002]鐵是大多數生物必需的微量元素之一，雖然在地殼中鐵元素的含量占第四位，但大部分不能被植物直接利用，需要一套高效的鐵轉運機制獲取它們所需的鐵離子。在低鐵環境下，大多數細菌能夠合成并分泌嗜鐵素，供其自身和植物利用，促進植物生長；并通過與病原微生物爭奪有限的鐵營養，抑制病原微生物的生長繁殖，起到生物防治的作用。
[0003]磷是植物生長不可缺少的營養元素之一，盡管每年都向土壤中施入大量可溶性磷肥，然而，磷酸鹽在土壤中常以磷酸三鈣為主，這類磷酸鹽溶解性差，難于被植物吸收利用，作物對磷肥的當季利用率一般只有5%~10%，加上作物的后效，利用率不超過25%。分離篩選出具有高效解磷作用的微生物菌株并制成微肥，是解決磷肥利用率低，控制濫用肥料帶來的環境污染問題的有效方法。
[0004]對于具有嗜鐵或/和解磷能力的植物根際促生菌(Plant Growth-PromotingRhizobacteria,簡稱PGPR)的篩選，并用于農業生產中解決植物缺鐵黃化以及磷肥利用率低等問題，已有一些相關報道。然而現有的技術中，嗜鐵細菌和解磷細菌是分開篩選的，即使有些菌株具有嗜鐵和解磷等多種防病促生機制，其嗜鐵能力或解磷能力是分別檢測的，步驟復雜，篩選效率低，費時費力。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種嗜鐵解磷細菌的分離篩選方法，在一種培養基上即可短時間內篩選獲得同時具有嗜鐵和解磷能力的細菌菌株，簡化了分離篩選步驟，大大縮短篩選時間，提高了嗜鐵解磷細菌的分離篩選效率。
[0006]為實現上述目的，本發明采用下述技術方案:
[0007]一種嗜鐵解磷細菌的分離篩選方法，包括以下步驟:
[0008](I)采集作物根圍土壤，去雜，接種于滅菌水中，接種量為0.5-1.5g/100mL水，25-35°C條件下培養2-3小時，靜置，分離上清液，備用；
[0009](2)制備CAS-P檢測平板，將CaCl2溶液、MgSO4.7H20溶液、質量濃度為8_12%的酸水解酪蛋白溶液混合均勻，向其中加入Ca3(PO4)2,調節pH為6.8-7.0，用水定容，每10mL定容溶液中含有CaCl2溶液0.1-0.3mL, MgSO4.7H20溶液0.1-0.3mL,酸水解酪蛋白溶液4-8mL，Ca3(PO4)20.3-0.8g ;加入瓊脂粉，瓊脂粉的加入量為l_3g/100mL定容溶液，滅菌，滅菌后待溫度降至50-60°C時，再加入CAS藍色檢測液，CAS藍色檢測液的加入量為3-8mL/100mL定容溶液,混勻后倒平板，即得；
[0010] (3)將步驟(1)的上清液接種于CAS-P檢測平板上，接種量為100-200uL/平板，25-35°C條件下培養3-5天，在該檢測平板上生長的菌株即為嗜鐵解磷細菌。
[0011]步驟(1)中，培養時，以150-200r/min進行振蕩培養；
[0012]步驟(2)中，所述CaCl2溶液和MgSO4.7H20溶液的濃度均為lmmol/L ；
[0013]步驟⑵中，所述CAS藍色檢測液的制備方法為:將0.07g的鉻天青(Chromeazurol S, CAS)溶于50mL去離子水中，再加入10mT, lmmol/L的FeCl3溶液(含有1mmol/L的HCL),為溶液A ;將0.06g的溴化十六烷基三甲銨(Hexadecyltrimethylammoniumbromide, HDTMA)溶于40mL去離子水中，為溶液B ;將溶液A緩緩加入到B溶液中，輕輕晃動，使得溶液A與溶液B混合均勻，即得到CAS藍色檢測液。
[0014]步驟(2)中，調節pH所用的試劑為生物緩沖液1，4-哌嗪二乙磺酸。
[0015]步驟(2)中，所述定容用的水為去離子水、純化水或蒸餾水。
[0016]步驟(2)中，所述滅菌的溫度為121°C，滅菌時間為15分鐘。
[0017]優選的，步驟(1)中，接種量為1.0g/100mL。
[0018]優選的，步驟⑵中,所述CAS-P檢測平板的制備方法為:將lmmol/L的CaCl2溶液
0.2mL、lmmol/L的MgSO4.7H20溶液0.2mL、質量濃度為10%的酸水解酪蛋白溶液6mL混合均勻，向其中加入Ca3(PO4)20.5g，調節pH為6.8-7.0，用去離子水定容至10mL,加入2g瓊脂粉，滅菌，滅菌后待溫度降至50-60°C時，再加入3-8mL CAS藍色檢測液，混勻后倒平板，即得。
[0019]本發明的有益效果:
[0020]本發明的嗜鐵解磷細菌的分離篩選方法，在一種培養基上即可短時間內篩選獲得同時具有嗜鐵和解磷能力的細菌菌株，簡化了分離篩選步驟，大大縮短篩選時間，提高了嗜鐵解磷細菌的分離篩選效率。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1為本發明所采用的CAS-P檢測平板的篩選結果；
[0022]圖2為細菌嗜鐵能力的檢測結果，圖中a為菌株在CAS檢測平板上產生的嗜鐵圈子；b為陰性對照，即無嗜鐵能力的菌株在CAS檢測平板上的生長情況；c為空白CAS檢測平板；
[0023]圖3為固體平板細菌解磷能力的檢測結果；
[0024]圖4為液體培養條件下細菌解磷能力的檢測結果。
【具體實施方式】
[0025]下面通過具體實例對本發明進行進一步的闡述，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發明，并不對其內容進行限定。
[0026]實施例中所用到的的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0027]實施例1
[0028]一種嗜鐵解磷細菌的分離篩選方法，包括以下步驟:
[0029](I)采集作物根圍土壤，去雜，接種于滅菌水中，接種量為1.0g/100mL，30°C條件下培養2.5小時，靜置，分離上清液，備用；
[0030](2)制備 CAS-P 檢測平板，先配制好 lmmol/L 的 CaCl2 溶液、lmmol/L 的 MgSO4.7Η20溶液、質量濃度為10%的酸水解酪蛋白溶液(121°C，15分鐘單獨滅菌)；再分別取0.2mL的CaCl2溶液、0.2mL的MgSO4.7H20溶液、6mL的10 %的酸水解酪蛋白溶液，向其中加入Ca3 (PO4) 20.5g,用生物緩沖液 1，4-哌嗪二乙橫酸[piperazine-N, N-bis (2-ethanesulfonic acid)，Pipes]，調ρΗ6.8~7.0。去離子水定容到100mL。加入2g瓊脂粉，121°C，15分鐘滅菌。滅完菌后，當溫度降低到60°C時，以5mL CAS藍色檢測液/每10mL培養基的量沿著三角瓶壁加入，混合均勻后倒平板，即得，注意不要產生氣泡，影響平板檢測實驗；
[0031](3)將步驟⑴的上清液接種于CAS-P檢測平板上，接種量為150uL/平板，30°C條件下培養5天，觀察平板上菌落的生長情況，結果見圖1。結果顯示:在CAS-P檢測平板上長出少數幾個細菌菌落，沒有明顯的暈圈
[0032]步驟(2)中,CAS藍色檢測液的制備方法為:將0.07g的鉻天青(Chrome azurol S，CAS)溶于50mL去離子水中，再加入1mL lmmol/L的FeCl3溶液(含有10mmol/L的HCL)，為溶液 A ;將 0.06g 的溴化十六烷基三甲銨(Hexadecyltrimethylammonium bromide, HDTMA)溶于40mL去離子水中，為溶液B ;將溶液A緩緩加入到B溶液中，輕輕晃動，使得溶液A與溶液B混合均勻，即得到CAS藍色檢測液。
[0033]實施例1篩選出的菌株的性能試驗:
[0034]無機磷細菌液體培養基:葡萄糖10g, (NH4)2SO40.5g, NaCl 0.3g, KCl 0.3g,MgSO4.7Η200.3g, Ca3 (PO4) 25.0g, FeSO4.7Η20 0.03g, MnSO4.4Η20 0.03g，定容至 100mL,ρΗ7.0~7.5。分裝后121°C，15分鐘滅菌。
[0035]無機磷細菌固體培養基:葡萄糖10g, (NH4)2SO40.5g, NaCl 0.3g, KCl 0.3g,MgSO4.7Η200.3g, Ca3 (PO4)21g, FeSO4.7Η20 0.03g, MnSO4.4Η20 0.03g，瓊脂粉 18 ~20g,定容至100mL, ρΗ7.0~7.5。分裝后121。。，15分鐘滅菌。
[0036] CAS檢測平板:I) CAS藍色檢測液的制作:將0.07g的鉻天青(Chrome azurol S,CAS)溶于50mL去離子水中，再加入1mL lmmol/L的FeCl3溶液(含有10mmol/L的HCL)，為溶液 A ;將 0.06g 的溴化十六烷基三甲銨(Hexadecyltrimethylammonium bromide, HDTMA)溶于40mL去離子水中，為溶液B ;將溶液A沿著燒杯的壁緩緩加入到B溶液中，輕輕晃動，使得溶液A與溶液B混合均勻，即得到溶液C =CAS藍色檢測液。121°C，15分鐘滅菌。2)CAS檢測平板的制作:先配制好lmmol/L的CaCl2溶液、lmmol/L的MgSO4.7H20溶液、10%的酸水解酪蛋白溶液(121°C，15分鐘單獨滅菌);再分別取0.2mL的CaCl2溶液、0.2mL的MgSO4.7H20溶液、6mL的10%的酸水解酪蛋白溶液，用生物緩沖液1，4-哌嗪二乙磺酸[piperazine-N, N~bis (2-ethanesulfonic acid), Pipes],調 ρΗ6.8 ~7.0。去離子水定容到100mL。加入2g瓊脂粉，121°C，15分鐘滅菌。當以上的固體培養基滅完菌后，溫度降低到60°C時，以5mL CAS藍色檢測液/每10mL培養基的量沿著三角瓶壁加入，混合均勻后倒平板。注意不要產生氣泡，以免影響平板檢測實驗。
[0037]缺鐵培養基(g/L)=K2HPO40.1 ；KH2P043.0 ；MgS04.7Η20，0.2 ； (NH4)2SO4, 1.0 ;琥珀酸4.0，分裝后121°C，15分鐘滅菌。
[0038]1.固體平板上細菌嗜鐵能力的檢測
[0039]將CAS-P平板上長出的菌落接種于CAS檢測平板上，將無嗜鐵能力的菌株接種于CAS檢測平板上作為陰性對照，未接種菌種的CAS平板作為空白對照，30°C條件下培養3天，觀察菌落生長狀況及橘黃色暈圈的產生，并測定菌落和橘黃色暈圈的直徑。
[0040]結果顯示，橘黃色暈圈/菌落直徑比值為3.58 (圖2)，說明該菌株具有較強的嗜鐵能力。
[0041]2.固體平板上細菌解磷能力的檢測
[0042]將CAS-P平板上長出的菌落同時接種于無機磷固體培養基平板上，30°C條件下培養3天，觀察菌落生長狀況及解磷圈的產生，并測定菌落和解磷圈的直徑。
[0043]結果顯示，解磷圈/菌落直徑比值為2.92(圖3)，說明該菌株具有較強的解磷能力。
[0044]3.液體培養條件下細菌嗜鐵能力的檢測
[0045]將CAS-P平板上長出的菌落接種于缺鐵培養基中，30°C、150r/min條件下振蕩培養48小時，室溫靜置2小時，取上清液5mL，加入等量CAS藍色檢測液，混勻，于630nm處測定吸光值。以不接種菌株的缺鐵培養基為對照，重復3次。溶液中嗜鐵素產量通過以下公式計算:
[0046]嗜鐵素產量(％) = (Ar - As) /ArX 100%
[0047]其中，Ar為缺鐵培養基和等量CAS藍色檢測液的吸光值，As為上清液和等量CAS藍色檢測液混合液的吸光值。
[0048]結果顯示,本發明實施例1篩選出的菌株嗜鐵素產量為89.65%。
[0049]4.液體培養條件下細菌解磷能力的檢測
[0050]將CAS-P平板上長出的菌落接種于裝有10mL以Ca3(PO4)2為唯一磷源的無機磷細菌液體培養基(PH7.0)的250mL三角瓶中，30°C，160r/min條件下振蕩培養，接種后每天取5.0mL培養液，4000r/min離心10分鐘，并經0.45 μ m微孔濾膜過濾，采用鑰藍比色法測定培養液中可溶性磷含量，并測定PH值。以不接種菌株的PVK液體培養基為空白對照，重復3次。
[0051]結果顯示，接種上述菌株的培養液中，可溶性磷含量為58-456 μ g/mL,第5天最高(456 μ g/mL)，之后，可溶性磷含量下降；培養液中pH值的變化趨勢與可溶性磷含量成反t匕，隨著可溶性磷含量的增加，培養液的PH值降低，第5天，pH值降到最低，之后，隨著可溶性磷含量的減少，培養液的PH值回升(圖4)。
[0052]由此可見，采用本發明篩選方法獲得的菌株同時具有嗜鐵和解磷能力。
【權利要求】
1.一種嗜鐵解磷細菌的分離篩選方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)采集作物根圍土壤，去雜，接種于滅菌水中，接種量為0.5-1.5g/100mL水，25-35°C條件下培養2-3小時，靜置，分離上清液，備用； (2)制備CAS-P檢測平板，將CaCl2溶液、MgSO4.7H20溶液、質量濃度為8-12%的酸水解酪蛋白溶液混合均勻，向其中加入Ca3 (PO4) 2，調節pH為6.8-7.0，用水定容，每10mL定容溶液中含有CaCl2溶液0.1-0.3mL, MgSO4.7H20溶液0.1-0.3mL,酸水解酪蛋白溶液4_8mL，Ca3(PO4)20.3-0.8g ;加入瓊脂粉，瓊脂粉的加入量為l_3g/100mL定容溶液，滅菌，滅菌后待溫度降至50-60°C時，再加入CAS藍色檢測液，CAS藍色檢測液的加入量為3-8mL/100mL定容溶液，混勻后倒平板，即得； (3)將步驟(1)的上清液接種于CAS-P檢測平板上，接種量為100-200UL/平板，.25-35°C條件下培養3-5天，在該檢測平板上生長的菌株即為嗜鐵解磷細菌。
2.如權利要求1所述的一種嗜鐵解磷細菌的分離篩選方法，其特征在于，步驟(1)中，培養時，以150-200r/min進行振蕩培養。
3.如權利要求1所述的一種嗜鐵解磷細菌的分離篩選方法，其特征在于，步驟(1)中，接種量為1.0g/100mL水。
4.如權利要求1所述的一種嗜鐵解磷細菌的分離篩選方法，其特征在于，步驟(2)中，所述CaCl2溶液和MgSO4.7H20溶液的濃度均為lmmol/L。
5.如權利要求1所述的一種嗜鐵解磷細菌的分離篩選方法，其特征在于，步驟(2)中，所述CAS藍色檢測 液的制備方法為:將0.07g的鉻天青溶于50mL去離子水中，再加入1mLImmoI/L的FeCl3溶液，為溶液A ;將0.06g的溴化十六烷基三甲銨溶于40mL去離子水中，為溶液B ;將溶液A加入到B溶液中，混合均勻，即得到CAS藍色檢測液。
6.如權利要求1所述的一種嗜鐵解磷細菌的分離篩選方法，其特征在于，步驟(2)中，調節PH所用的試劑為生物緩沖液1，4-哌嗪二乙磺酸。
7.如權利要求1所述的一種嗜鐵解磷細菌的分離篩選方法，其特征在于，步驟(2)中，所述定容用的水為去離子水、純化水或蒸餾水。
8.如權利要求1所述的一種嗜鐵解磷細菌的分離篩選方法，其特征在于，步驟(2)中，所述滅菌的溫度為121°C，滅菌時間為15分鐘。
9.如權利要求1所述的一種嗜鐵解磷細菌的分離篩選方法，步驟(2)中，所述CAS-P檢測平板的制備方法為:將lmmol/L的CaCl2溶液0.2mL、lmmol/L的MgSO4.7Η20溶液0.2mL、質量濃度為10%的酸水解酪蛋白溶液6mL混合均勻，向其中加入Ca3(PO4)20.5g，調節pH為.6.8-7.0，用去離子水定容至10mL,加入2g瓊脂粉，滅菌，滅菌后待溫度降至50_60°C時，再加入3-8mL CAS藍色檢測液，混勻后倒平板，即得。
【文檔編號】C12N1/20GK104178440SQ201410432410
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月28日 優先權日:2014年8月28日
【發明者】余賢美, 艾呈祥, 付麗, 安淼, 王海榮, 劉嘉芬 申請人:山東省果樹研究所