專利名稱：頭部創傷誘導的胞質鈣結合蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及人類急性神經元的誘導的鈣結合蛋白和鑒定及編碼該蛋白質的多聚核苷酸(ANIC-BP)。本發明還提供了表達載體，宿主細胞和抗體。此外，本發明提供了用于產生該蛋白質的方法及治療和預防與該蛋白質的表達有關的疾病。本發明還涉及抑制或者激活這種多聚核苷酸和多肽的作用。
背景技術：
中風和急性頭部創傷，多發性硬化以及脊髓傷害是迄今為止沒有任何現成療法的疾病。中風是第三大死亡原因，對患者以及社會負擔巨大。如果發生占中風大部分的局部中風的話，腦部血管堵塞是初發事件。頭創傷事故是西方世界年青人的主要疾病，很少數量的病人受由機械撞擊和動脈破裂引起的出血性中風的影響，一個共有的特征是批準的藥物很少可供使用。當前可供使用的治療方法是建立在病理生理概念之上的，該概念來源于病灶性大腦局部缺血的實驗工作。這些方法包括動脈再造管術，對炎癥過程的抑制和神經保護的藥理學策略。用動脈再灌注策略的進一步研究正在進行之中。正在完成用依賴于多形核白細胞的內皮粘連受體拮抗藥的早期臨床研究，但尚需提出策略。然而，只解決局部缺血級聯過程中單一步驟的任何策略可能僅僅產生一個不大的療效。因此，未來的療法最適當地將基于結合療法。低劑量的乙酰水楊酸和釋放改進的雙嘧達氨醇的結合在中風的次級預防中已表明具有累加效應。(Tijssen等.國際臨床學業者雜志增刊。91，14-16，1997)。目前提出的供臨床評價的另一組合是tPA加上一種有效的神經保護因子。然而，這些研究的結果還遠遠不是非常有效的。因此，急需了解更多的病理生理機制以便提供藥物目標，該目標可被用來研制新的藥物和建立更通用的治療患有急性神經損傷和疾病如多發性硬化的患者的方法。
本發明確實是集中于Ca2+鈣結合蛋白質，因為對Ca2+結合蛋白質在神經保護中的作用有大量的證據。雖然鈣結合蛋白質(CaBPs)的精確功能還不肯定，但已提出了鈣結合蛋白的作用是可緩沖細胞間Ca2+的水平(濃度)。由于鈣離子的過度負荷激活了導致蛋白水解作用和線粒體功能紊亂的生化過程，鈣結合蛋白的這一緩沖能力對興奮中毒的神經元損傷可能有保護效果(Heizmann等TINS，15，259-64，1992)。存在各種各樣的證據，支持鈣結合蛋白的這一假設的、在鈣水平的調節中和神經保護中的作用。
在中樞神經系統中表達的(小白蛋白(pavalbumin)，鈣結合蛋白-D28K，和鈣視網膜蛋白)主要Ca2+結合蛋白(CaBPs)在各種神經元群體中具有十分不尋常的和選擇性的表達模式。在確實表達CaBPs的神經元中，大部分只表達一種類型，雖然少量的神經元表達不止一種的主要鈣結合蛋白。有不斷增加的證據表明，在特殊的細胞類型中，存在或者缺乏鈣結合蛋白(CaBPs)是構成被稱為選擇易受傷性這一現象的基礎。選擇易受傷性是一種特殊類型的神經元對中樞神經系統(CNS)損傷反應而死亡的性質。例如，CA1海馬神經元是有選擇地易受球面局部缺血的損傷，小腦浦肯野氏(purkinje)細胞有選擇地易受頭部創傷，中風，胎兒酒精暴露的損傷，同時在黑質中的神經元在帕金森疾病中是有選擇地易受損傷的。已經努力地把選擇性的神經元易受傷性與各種CaBPs表達模式聯系起來，有些作者報告在選擇性地易受損傷的神經元的群體中發現了高濃度的CaBPs，而其它則報告對損傷選擇性抵抗的神經元群體中有較高濃度的CaBP。例如，據報導，高水平表達的小白蛋白(parvalbumin)的神經元選擇性地易受AMPA-誘導的毒性的損傷(Weiss等.神經學，40，1288-1292，1990)，而表達高水平的鈣結合蛋白-D28K的培養的海馬神經元據報導對谷氨酸誘導的毒性有選擇性的抵抗性(Baimbridge等.TINS，15，303-8，1992)。類似地，表達高水平的鈣視網膜蛋白的海馬神經元能抵抗有毒性劑量的興奮毒素谷氨酸，NMDA，紅藻酸和使君子氨酸((Winsky等，在《新的鈣結合蛋白質》中，277-300，1991)。
CaBPs也被發現在各種CNS疾病狀態下的表達被改變，但是，關于CaBP的表達是否與選擇性的易受傷性或對傷害的選擇性的抵抗性有關，結果也不一致。表達鈣結合蛋白-D28K的神經元據報導在阿爾茨海默(Alzheimers)病中(lacopino等，PNAS，87，4078-82，1990，Hof等，實驗神經學，111，293-301，1991)和亨廷頓舞蹈(Huntington)病中(Kiyama等.大腦研究，526，303-07，1990)是有選擇地易受損傷的，雖然在帕金森病中，在黑質中的表達鈣結合蛋白-D28K的神經元不是有選擇地易受損傷的(Yamada等.大腦研究，526，303-07，1990)。在球面局部缺血的沙土鼠模型中，一定的海馬細胞類型中小白蛋白的存在表明了與存活呈正相關(Tortosa等.神經科學.1，33-43，1993)，雖然其它的研究提出表達海馬神經元的小白蛋白在阿爾茨海默(Alzheimer)病中是有選擇地易受損傷的(Brady等.神經科學，80，1113-25，1997)。
鈣結合蛋白基因失效的小鼠表現出功能缺陷(例如共濟失調)，表明正常表達這一CaBP的神經元中的嚴重功能失調(例如，小腦浦肯野細胞)，盡管這些神經元在形態上似乎是正常的。這一發現表明CaBPs對細胞活動模式是至關重要的(Airaksinen等，PNAS，94，1488-93，1997)。此外，具有鈣結合蛋白-D28k的運動神經元的逆轉病毒侵染表明對由肌萎縮的側硬化病人的IgG誘導的毒性具有神經保護作用(Ho等，PNAS，93，6796-801)，用鈣結合蛋白-D28k進行的轉染表明可保護PC12細胞免于因血清提取，谷氨酸暴露和神經毒素MPP+而產生的毒性作用(McMahon等，分子大腦研究，526，303-07，1998)。
總之，關于鈣結合蛋白質在神經退化中的作用有大量的信息。可以肯定的是某些CaBPs提供保護，其它的CaBPs則造成選擇性的易受傷性，然而，尚不清楚的是，在不同神經元群體中，一定的CaBPs的表達是否導致一種給定的CaBP的不同功能反應。另一種觀察后的意見認為不同類型的CNS傷害的嚴重度可以影響CaBPs的明顯的神經保護功效，即在包括溫和損傷的損傷模型中，CaBP可以賦予抵抗力，但在更嚴重的CNS損傷中，不能緩沖Ca2+的增加。因此，有相當的證據表明，在CNS損傷過程中，CaBPs既可賦予抵抗力，也可賦予易受傷性，但這種復雜情況的機制和反應的調節還需要研究。
最近從小鼠來源的cDNA文庫中分離了包含功能尚未鑒定的基因(MO25)的一個基因家族(Miyamoto等.分子繁殖發育，34，1-7，1993)。該文庫是由從一種早期胚胎小鼠中分離的RNA進行構建的。對MO25預測的氨基酸序列揭示MO25基因與鈣結合蛋白具有結構上的同源性，缺乏跨膜結構域，表明該蛋白可能參與了未受精卵的胞液發育。然而，該蛋白質的真正的功能仍然是未知的。另一種類似于Mo25的基因已經從果蠅的cDNA文庫中克隆出來(Nozaki等，DNA細胞生物學，15，505-09，1996)。其推導的Mo25 cDNA的氨基酸序列與鼠MO25的同系物有69.3％的同源性。釀酒酵母中的一種同源染色體在鈣調磷酸酶B亞基基因附近的一個可讀框內編碼。最近，另一種基因從曲霉屬的hym A突變體中分離出來(Karos等，Mol.Gen Genet，260，510-521，1999)，結果顯示該基因對應于酵母，植物，蠅類，蠕蟲，魚類，鼠和人類的同源染色體。在任何描述的生物中還沒有定義Hym蛋白的細胞功能。至于只是部分地理解其功能的很多其它的蛋白質，藥物發現的過程當前正在經歷一個基本的革命，因為它包含“功能性基因組學”，即，高通量的基因組或基于基因的生物學。該方法作為鑒定基因和作為治療靶標的基因產物的一種手段，正在迅速地超過早期的基于“定位克隆”的方法。可以鑒定出表現型，即一種生物學功能或遺傳疾病，再根據其遺傳圖譜位置可把這一結果追索到其相應的基因。功能基因組學主要依賴于高通量DNA測序技術和生物信息學各種工具，從目前可供使用的很多分子生物學數據庫來鑒定具有潛在意義的基因序列。繼續需要鑒定和進一步描述基因的以及它們的作為藥物發現靶標的相關多肽/蛋白質的特征。
發明概要本發明涉及ANIC-BP，具體地說涉及ANIC-BP多肽和ANIC-BP多聚核苷酸，重組材料以及它們的產生方法。對這些多肽和多聚核苷酸的興趣在于其與一定疾病的治療方法有關，這些疾病包括但不限于中風和急性頭部創傷，多發性硬化和脊髓損傷，在下文稱作＂本發明的疾病＂。另一方面，本發明涉及利用本發明所提供的材料鑒定興奮劑和拮抗劑(如，抑制劑)和用被鑒定的化合物治療與ANIC-BP不平衡相關的疾病。另一方面，本發明還涉及檢測與不適當的ANIC-BP活性或者水平相關的疾病的診斷分析。發明描述一方面，本發明涉及ANIC-BP多肽，這樣的多肽包括(a)一種由包含SEQ ID NO1序列的多聚核苷酸編碼的分離多肽；(b)一種分離多肽，該多肽包含與SEQ ID NO2的多肽序列具有至少95％，96％，97％，98％或者99％同源性的多肽序列；(c)一種包含SEQ ID NO2的多肽序列的分離多肽；(d)一種與SEQ ID NO2的多肽序列具有至少95％，96％，97％，98％或者99％同源性的分離多肽；(e)SEQ ID NO2的多肽序列；和(f)一種分離多肽，該多肽與SEQ ID NO2的多肽序列相比，具有或包含同源性指數為0.95，0.96，0.97，0.98或0.99的多肽序列；(g)(a)至(f)中這種多肽的片段或變異體。
本發明的多肽被認為是鈣結合蛋白多肽家族的成員。因此它們具有意義是因為它們能作為一個新奇的藥物靶子。
ANIC-BP的生物學性質在下文稱作＂ANIC-BP的生物學活性＂或者＂ANIC-BP活性＂。優選地，本發明的多肽顯示至少一種ANIC-BP的生物活性。
本發明多肽也包括前面提到的多肽的變異體，包括所有的等位形式和剪接變異體。這種多肽通過可以是保守的或非保守的、或任意結合的插入，缺失和替換與參照多肽有所不同。特別優選的變異是那些其中幾個氨基酸，例如，從50到30，從30到20，從20至10，從10至5，從5至3，從3至2，從2至1種或者1個氨基酸被插入，替換或缺失或其任意結合的變異體。
本發明多肽的優選片段包括一種包含具有至少30個，50個或者100個SEQ ID NO2氨基酸序列中的連續氨基酸的氨基酸序列的分離多肽，或者包括一種包含具有至少30個，50個或者100個從SEQ ID NO2的氨基酸序列中截短或缺失的、連續氨基酸的氨基酸序列的分離多肽。優選片段是介導ANIC-BP的生物活性的生物活性的片段，包括那些具有相似活性或活性提高，或降低的不理想的活性的片段。優選片段還包括那些在動物中，尤其是在人體中具有抗原作用或致免疫性的片段。
通過肽的合成，本發明的多肽片段可以被用來產生相應的全長多肽；因此，這些變異體可以被用作產生本發明的全長多肽的中間體。本發明的多肽可以以＂成熟＂蛋白質的形式或者可以是更大的蛋白質的一部分，如前體物或者融合蛋白質。包含附加的氨基酸序列常常是很有利的，該附加的氨基酸序列包含分泌或引導序列，前序列，或者是有助于提純的序列，例如多個組氨酸殘基，或者是為了增加在重組生產期間的穩定性的附加序列。
本發明的多肽能以任何合適的方式進行制備，例如，從自然存在的來源中分離，從包含表達系統(見下文)的遺傳工程宿主細胞中分離，或通過化學合成，例如用自動肽合成儀合成，或者這些方法的結合。制備這些多肽的方法是本領域的技術人員所熟知的。
另一方面，本發明涉及ANIC-BP多聚核苷酸。這樣的多聚核苷酸包括(a)一種分離的多聚核苷酸，該多聚核苷酸包含與SEQ ID NO1的多聚核苷酸序列具有至少95％，96％，97％，98％或者99％同源性的多聚核苷酸序列；(b)一種包含SEQ ID NO1的多聚核苷酸的分離多聚核苷酸；(c)一種與SEQ ID NO1的多聚核苷酸具有至少95％，96％，97％，98％或者99％同源性的分離多聚核苷酸；(d)SEQ ID NO1的分離多聚核苷酸；(e)一種分離的多聚核苷酸，該多聚核苷酸包含編碼與SEQ ID NO2的多肽序列具有至少95％，96％，97％，98％或者99％同源性的多肽序列的多聚核苷酸序列；和(f)一種分離的多聚核苷酸，該多聚核苷酸包含編碼SEQ ID NO2的多肽的多聚核苷酸；
(g)一種分離的多聚核苷酸，該多聚核苷酸具有編碼與SEQ ID NO2的多肽序列具有至少95％，96％，97％，98％或者99％同源性的多肽序列的多聚核苷酸序列；和(h)編碼SEQ ID NO2多肽的分離多聚核苷酸序列；(i)一種分離的多聚核苷酸，該多聚核苷酸與SEQ ID NO2的多聚核苷酸序列相比，具有或包含同源性指數為0.95，0.96，0.97，0.98或0.99的多聚核苷酸序列；(j)一種具有或包含多聚核苷酸序列的分離多聚核苷酸，該多聚核苷酸序列編碼的多肽序列與SEQ ID NO2的多肽序列相比具有0.95，0.96，0.97，0.98或0.99的同源性指數；以及上面提到的多聚核苷酸的片段或變異體的多聚核苷酸、或者是與上面提到的多聚核苷酸的全長互補的多聚核苷酸。
本發明的優選聚核苷酸片斷包括一種含有具有至少15，30，50或100個來源于SEQ ID NO1序列的連續核苷酸的核苷酸序列的分離多聚核苷酸，或一種含有至少30，50或100個來源于SEQ ID NO1序列的截短的或缺失的連續核苷酸的序列的分離多聚核苷酸。
本發明多聚核苷酸的優選變異體包括拼接變異體，等位變異體和多態性，包括具有一種或更多種單核苷酸多態性(SNPs)的多聚核苷酸。
本發明的多聚核苷酸還包括編碼多肽變異體的多聚核苷酸，該多肽變異體含有SEQ ID NO2的氨基酸序列和其中幾個氨基酸殘基，例如從50到30，從30到20，從20至10，從10至5，從5至3，從3至2，從2至1種或者1個氨基酸可以被替換，缺失，或插入或以任何組合的形式。
另一方面，本發明提供了為本發明DNA序列的RNA轉錄物的多聚核苷酸。因此，提供一種RNA多聚核苷酸(a)包含一種編碼SEQ ID NO2多肽序列的DNA序列的RNA轉錄物；(b)是編碼SEQ ID NO2多肽序列的DNA序列的RNA轉錄物；(c)包含一種SEQ ID NO1的DNA序列的RNA轉錄物；或(d)是SEQ ID NO1的DNA序列的RNA轉錄物；和與其互補的RNA多聚核苷酸。
SEQ ID NO1的多聚核苷酸序列顯示與Hym A(Nozaki等，DNA細胞生物學，15，505-09，1996)和Mo25(Karos等.普通分子遺傳學(Mo1.Gen.Genet)，260，510-521，1999)的同源性。SEQ ID NO1的多聚核苷酸序列是編碼SEQ ID NO2多肽的cDNA序列。編碼SEQ ID NO2多肽的多聚核苷酸序列與編碼多肽的SEQ ID NO1序列可能是完全相同的，或者可能是除SEQ ID NO1之外的序列，該序列由于遺傳密碼的豐余性(簡并性)也編碼SEQ ID NO2的多肽。該SEQ ID NO2的多肽與鈣結合蛋白家族的其它蛋白有關，具有與Hym A蛋白和Mo25蛋白的同源性和/或結構相似性。
本發明的優選多肽和多聚核苷酸預期特別具有與其同源多肽和多聚核苷酸相似的生物學功能/性質。此外，本發明的優選多肽和多聚核苷酸至少具有ANIC-BP活性。
利用標準的克隆和篩選技術，從來源于人的中樞神經系統的mRNA細胞的cDNA文庫可以獲得本發明的多聚核苷酸，(參見例如，Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約(1989))。從自然來源中如基因組DNA文庫也可獲得、或者利用熟知的或市售的技術能夠合成本發明的多聚核苷酸。
當本發明的多聚核苷酸被用于本發明的多肽的重組生產時，多聚核苷酸本身可以包括成熟多肽的編碼序列，或帶有其它編碼序列的閱讀框中的成熟多肽的編碼序列，如編碼引導或分泌序列，前蛋白，原蛋白或前原蛋白序列或其它的融合肽部分的編碼序列。例如，可以編碼有利于提純融合多肽的標記序列。在本發明這一方面的一定的優選實施方案中，標記序列是一種六個組氨酸肽，如同pQE載體中提供的(Qiagen公司)和Gentzt等描述的(美國國家科學院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)(1989)86821-824)，或者是HA標記物。多聚核苷酸也可以包含非編碼的5′端和3′端序列，如轉錄的，非翻譯的序列，拼接的和聚腺苷酸化的信號序列，核糖體結合位點和穩定mRNA的序列。
完全相同的，或者與SEQ ID NO1多聚核苷酸序列有充分的同源性的多聚核苷酸可被用作cDNA和基因組DNA的雜交探針，或用為核酸擴增反應的引物(例如，PCR)。這些探針和引物可以用來分離本發明的全長cDNA和編碼多肽的基因組克隆，并且分離其它基因的cDNA和基因組克隆(包括編碼從人類來源的共生同源基因產物(paralogs)和除人以外的其它物種來源的直向同源基因產物(orthologs)和共生同源基因產物(paralogs)的基因)，該其它基因與SEQ ID NO1有很高的序列相似性，典型地至少有95％的同源性。優選的探針和引物一般包括至少15個核苷酸，優選地至少30個核苷酸，如果不是至少100個核苷酸的話，可能具有至少50個核苷酸。特別優選的探針將在30個和50個核苷酸之間。特別優選的的引物將在20和25核苷酸之間。
編碼本發明多肽的一種多聚核苷酸，包括除人以外的物種來源的同系物，可以由包含下列步驟的方法獲得在嚴緊的雜交條件下，用一種具有SEQ ID NO1的序列或其片段，優選地具有至少15個核苷酸的片段的標記探針篩選文庫；和分離包含所說的多聚核苷酸序列的全長cDNA和基因組克隆。這種雜交技術是技術人員熟知的。優選的嚴緊雜交條件包括在42℃下在包含以下成分的溶液中過夜培養50％的甲酰胺，5倍的SSC(150mM的氯化鈉，15mM的檸檬酸三鈉)，50mM的磷酸鈉(pH7.6)，5倍的Denhard’t溶液，10％的葡聚糖硫酸鹽，和20微克/毫升的變性的、剪切的鮭精DNA；緊接著在0.1×SSC中、于大約65℃下洗滌濾膜。這樣，本發明也包括所分離的多聚核苷酸，優選地是具有至少100個核苷酸的核苷酸序列，在嚴緊的雜交條件下，用具有SEQ ID NO1的序列或其片段，優選地具有至少15核苷酸的片段的標記探針篩選文庫可獲得這些多聚核苷酸。
熟練的技術人員將意識到，在許多情況之下，一種分離的cDNA序列將是不完全的，因為編碼多肽的區域并不一直延伸至5′端。這是逆轉錄酶，一種本質上具有較低的“持續合成能力”(在聚合反應過程中，酶保持附著在模板上的能力測定)的酶，在第一條鏈的cDNA合成期間不能完成mRNA模板的一個DNA拷貝的結果。
有可供使用和本領域的技術人員熟知的幾個方法獲得全長的cDNA，或者延伸的短cDNA，例如根據cDNA末端快速擴增的方法(RACE)獲得的那些方法(例如，參見Frohman等，美國國家科學院院刊85，8998-9002，1988)。例如，以馬拉松(Marathon)(商標)技術(Clontech實驗室公司)為例的該技術最近的改進明顯地簡化了對較長的cDNA的搜索。在馬拉松(商標)技術中，由從選擇的組織中提取的mRNA和連接到兩端的“接頭”序列制備cDNA。然后用基因特異的和接頭特異的寡聚核苷酸引物組合進行核酸擴增以擴增“丟失的”cDNA 5′端。然后用“嵌套”引物，即在擴增產物內設計用于退火的引物(典型地，在接頭序列的3′進一步退火的接頭特異引物，和在已知基因序列的5′進一步退火的基因特異引物)重復PCR反應。然后通過DNA序列測定和全長的cDNA可分析該反應的產物，該全長的cDNA的構建可通過把產物直接地連接到現有的cDNA以產生一完整的序列或者用為5′引物設計的新的序列信息進行單獨的全長PCR。
由本領域中熟知的方法，從包含表達系統的遺傳工程宿主細胞中可以制備本發明的重組多肽。因此，另一方面，本發明涉及含有本發明的多聚核苷酸或多種多聚核苷酸的表達系統，涉及經遺傳工程改構的含有這些表達系統的宿主細胞，和涉及通過重組技術產生本發明的多肽。也可以使用無細胞翻譯系統，用來源于本發明的DNA構建體的RNA產生這樣的蛋白質。
為了重組生產，宿主細胞可通過遺傳工程方法插入用于本發明的多聚核苷酸的表達系統或其部分。用在許多標準的實驗室手冊中描述的方法，可把多聚核苷酸導入宿主細胞，如Davis等，分子生物學的基本方法(1986)，以及Sambrook等(出處同上)。把多聚核苷酸導入宿主細胞的優選的方法包括，例如，磷酸鈣轉染，DEAE-葡聚糖介導的轉染，轉位，微注射，陽離子脂介導的轉染，電穿孔，轉導，刮削輸入(scrape loading)，基因槍導入或者感染。
適當的宿主的代表例子包括細菌細胞，如鏈球菌，金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，鏈霉菌和枯草桿菌細胞；真菌細胞，如酵母細胞和曲霉屬細胞；昆蟲細胞，如果蠅S2細胞和夜蛾Sf9細胞；動物細胞如CHO，COS，海拉細胞，C127，3T3，BHK，HEK 293和Bowes黑瘤細胞；和植物細胞。
可以利用各種各樣的表達系統，例如，染色體的，附加型的和病毒來源的系統，例如，從細菌質粒來源的載體，從噬菌體，從轉座子，從酵母附加體，從插入因子，從酵母染色體因子，從病毒如桿狀病毒，乳多空病毒，如SV40，牛痘病毒，腺病毒，禽痘病毒，假狂犬病毒和逆轉病毒，以及由其組合來源的載體，如來源于質粒和噬菌體遺傳因子的載體，如粘粒和噬菌粒。表達系統可以包含調節和產生表達的控制區域。一般地，可以使用任何能夠維持，繁殖或者表達多聚核苷酸、以在宿主中產生多肽的系統或者載體。通過任何多種多樣的熟知的和常規操作技術，例如，象Sambrook等(出處同上)陳述的那些技術，可把合適的多聚核苷酸序列可以插入到表達系統中。合適的分泌信號可以滲入到所需的多肽中，以使翻譯的蛋白質分泌到內質網腔，周質空間或胞外環境中。這些信號可以是該多肽內生的，或者它們可以是異源的信號。
如果本發明的多肽準備表達用于篩選分析，一般優選的是在細胞的表面產生該多肽。在這種情況下，可以在篩選分析使用之前收獲這些細胞。如果多肽是分泌到培養基中，可以去除培養基以便回收和提純多肽。如果這些多肽是產生在細胞內的，回收多肽之前必須對細胞進行裂解。
通過熟知的方法從重組細胞培養物中可以回收和純化本發明的多肽，這些方法包括硫酸胺或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石層析和凝集素層析。最優選的是，使用高效液相色譜提純多肽。在細胞內合成，分離和/或提純多肽的過程中，當多肽被變性時，可以用一些熟知的重新折疊蛋白的技術產生有活性的構象。
通過檢測相關基因的突變，本發明的多聚核苷酸可以用作診斷的試劑。對在cDNA和基因組序列中的具有SEQ ID NO1的多聚核苷酸特征的突變形式基因(該基因與功能失調有關)的檢測，可以提供診斷工具，該診斷工具能增加對，或限定疾病的診斷，或對疾病的易感性診斷，該疾病是因為該基因過低的表達，或過高的表達，或改變的時空表達引起的。
通過多種本領域熟知的技術，可以在DNA水平上檢測攜帶基因突變的個體。
供診斷的核酸可以從一個受實驗者的細胞中獲得，如從血，尿，唾液，活組織檢查或尸體解剖材料中獲得。基因組DNA可直接用于檢測，或者在分析之前，通過PCR，優選地用RT-PCR，或其他的擴增技術進行酶促擴增。RNA或cDNA也可以類似的方式使用。與正常的基因型相比，通過擴增產物大小的變化可以檢測缺失和插入。通過把擴增的DNA與標記的ANIC-BP核苷酸序列雜交，能夠鑒定點突變。通過RNA酶消化或熔點溫度的區別可以從錯配的雙螺旋中區別開完美匹配的序列。通過加有或沒有變性劑的凝膠上DNA片段電泳遷移率的改變，或者通過直接的DNA序列測定(例如，參見，Myers等，科學(1985)2301242)也可以檢測DNA序列的差異。通過核酸酶保護實驗，如RNA酶和S1核酸酶保護或化學切割方法(參見Cotton等，美國國家科學院院刊(1985)854397-4401)也可以揭示特定位置的序列變化。
可以構建一組陣列的包含ANIC-BP多聚核苷酸序列或者其片段的寡聚核苷酸探針，來進行有效的篩選，如遺傳突變的篩選。這些陣列優選地是高密度的陣列或柵格。陣列技術方法是熟知的，而且具有一般的適用性，可以用來解決分子遺傳學上各種各樣的問題，包括基因表達，遺傳連鎖，和遺傳變異性，參見，例如，M.Chee等，科學，274，610-613(1996)和其中引用的其它參考文獻。
多肽或者mRNA表達水平不正常的減少或增加的檢測也可用于診斷或測定一個受實驗者對本發明的疾病的敏感性。利用任何本領域熟知的定量分析多聚核苷酸方法，例如，象核酸擴增，如PCR，RT-PCR，RNA酶保護，Northern印跡和其它的雜交方法，在RNA水平可以測定減少的或者增加的表達。
能夠用來測定來源于宿主的樣品中的蛋白質水平，如本發明的多肽的分析技術是本領域的技術人員熟知的。這些分析方法包括放射免疫分析，競爭結合分析，Western印跡分析，和酶聯免疫吸附測定(ELISA)分析。
因此，另一方面，本發明涉及一種診斷試劑盒，它包括
(a)一種本發明的多聚核苷酸，優選地為SEQ ID NO1的核苷酸序列，或者是它的片段或RNA轉錄物；(b)一種與(a)的多聚核苷酸序列互補的核苷酸序列；(c)一種本發明的多肽，優選地為SEQ ID NO2的多肽或其片段；(d)一種本發明的多肽的抗體，優選地為SEQ ID NO2的多肽的抗體。
可以理解的是，在任何這樣的試劑盒中，(a)，(b)，(c)或(d)可以包括一個實質上的組成部分。這種試劑盒在診斷疾病或對疾病的敏感性時，尤其是本發明的一些疾病中將具有用途。
本發明的多聚核苷酸序列對染色體定位研究是有價值的，該序列特異性地瞄準單個人體染色體上面的特定位置，并且能與其雜交。把一些相關序列作圖到本發明的染色體上，在研究那些序列與基因相聯系的疾病的相關性方面是重要的第一步。一旦一種序列作圖到染色體的精確位置上，該序列在染色體上的物理位置能夠與遺傳圖譜數據相互聯系起來。例如，在人類的V.McKusick，孟得爾遺傳中發現了這樣的數據(通過JohnsHopkins大學Welch醫學圖書館網上可查到)。然后通過連鎖分析(物理位置上鄰近的基因的共遺傳)鑒定已作圖到相同的染色體區域的基因與疾病的相互關系。使用輻射雜合體(RH)作圖(Walter，M.Spillett，D.，Thomas，P.，Weissenbach，J.，以及Goodfellow，P.，(1994)用于構建整個基因組的輻射雜合體作圖的方法，自然遺傳學，7，22-28)可以確定基因組序列(基因片段，等等)的準確的人類染色體定位。從美國遺傳研究所(Huntsville，美國阿拉巴馬洲)可以得到一些輻射雜合體作圖面板，例如GeneBridge4輻射雜合體作圖面板(人類分子遺傳學，1996，3月；5(3)339-46，人類基因組的輻射雜合體作圖。Gyapay G，Schmitt K，Fizames C，Jones H，Vega-Czarny N，Spillett D，MuseletD，Prud Homme JF，Dib C，Auffray C，Morissette J，Weissenbach J，Goodfellow PN)。利用這一面板為了確定基因的染色體位置，利用由RHDNAs的目的基因設計的引物，進行93次PCR。每種這些DNA含有保持在倉鼠背景下(人/倉鼠雜合體細胞系)的隨機的人類基因組片段。這些PCR產生93個結果，表明目的基因的PCR產物的存在或者缺乏。把這些結果與利用已知位置的基因組序列來源的PCR產物的結果進行比較。該比較可以在http//www.genome.wi.mit.edu上進行。
本發明的多聚核苷酸序列對組織表達研究也是有價值的工具。這些研究可以測定本發明的多聚核苷酸的表達類型，通過檢測編碼這些多肽的mRNA，該測定指明組織中編碼的多肽的表達類型。這些使用的技術是本領域的技術人員熟知的，包括在柵格上排列的克隆雜交技術，如cDNA微陣列雜交(Schena等，科學，270，467-470，1995以及Shalon等，基因組研究(Genome Res)，6，639-645，1996)和核苷酸擴增技術如PCR。一種優選的方法是利用由Perkin Elmer公司提供的TAQMAN(商標)技術。這些研究結果可以表明生物體中的多肽的正常功能。此外，通過與另一種形式的相同基因編碼的mRNA的表達模式(例如，在編碼潛在的或一種調節的突變的多肽方面有改變的基因)比較研究mRNAs的正常表達模式，可以深刻地理解本發明的多肽的作用，或者它們在疾病中不合適的表達所起的作用。這種不合適的表達可以是時空性的，或者只是定量性質的。本發明的多肽在人腦中表達。
本發明的另一方面涉及抗體。本發明的多肽或者它們的片段，或者表達它們的細胞，可以用作免疫原來產生對本發明多肽具有免疫特異性的多種抗體。術語“免疫特異性的”是指與對現有技術中的其它相關多肽的親和性相比，所述抗體對本發明的多肽本質上有更大的親和性。
利用常規的實驗流程，通過向一種動物，優選地為非人類的動物施用多肽或攜帶抗原決定族的片段或細胞，可以獲得針對本發明的多肽產生的抗體。為了制備單克隆抗體，可以使用任何能提供由連續不斷的細胞系培養產生的抗體的技術。例子包括雜交瘤技術(Kohler，G，Milstein，C，自然(1975)256495-497)，trioma技術，人類B-細胞雜交瘤技術(Kozbor等，當代免疫學(Immunology Today)(1983)472)和EBV-雜交瘤技術(Cole等，單克隆抗體以及癌療法，77-96，Alan R.Liss公司，1985)。
用于單鏈抗體產生的技術，如在美國專利4,946,778中描述的那些技術，也可適用于產生針對本發明多肽的單鏈抗體。也可使用轉基因鼠或其它生物，包括其它哺乳動物來表達人源化抗體。
以上描述的抗體可被用來分離或鑒定表達多肽的克隆，或者通過親和層析提純多肽。也可用本發明多肽的抗體治療本發明中的疾病。
本發明的多肽和多聚核苷酸也可以用作為疫苗。因此，另一方面，本發明涉及在哺乳動物中誘導免疫反應的方法，該方法包括用本發明的多肽接種哺乳動物，足以產生抗體和/或者T細胞免疫的反應，包括，例如產生細胞因子的T細胞或者細胞毒性T細胞，以便使所述動物免于疾病，不管那種疾病是否已經建立在個體之內。哺乳動物中的免疫反應也可通過這樣一種方法誘導，該方法包括通過在活體內指導多肽表達和編碼多肽的載體提供本發明的多肽，以誘導這樣的免疫反應來產生抗體保護所說的動物不受本發明的疾病的侵染。給動物施用該載體的方法是在粒子顆粒上涂一層膜、使之加速進入所需的細胞中，或者是其它方法。這樣的核酸載體可以包括DNA，RNA，修飾的核酸，或者DNA/RNA雜合體。為了用作疫苗，通常地多肽或核酸載體以疫苗的配方劑型提供(組合物)。該配方還可以包含一個合適的載體。由于多肽可以在胃中分解，優選地是不經過腸道施藥(例如，皮下注射，肌內注射，靜脈注射或皮內注射)。適合于非腸道施用的配方劑型包括水溶液和非水溶液的無菌注射液，該注射液可包含提供與受體血液等滲的劑型的抗氧化劑，緩沖液，制菌劑以及溶質；以及水溶液和非水溶液的無菌懸浮液，該懸浮液包括懸浮劑和增稠劑。這些配方劑型盛裝在一個單位劑量或多種單位劑量的容器中，例如，密封的安瓿和小瓶并且可在冷凍干燥的條件下儲藏，只需要在使用之前直接添加無菌的液體載體。疫苗配方也包括增強配方免疫原性的佐劑系統，如水包油系統和其它的本領域中熟知的系統。劑量將取決于疫苗的比活性，并且可以通過日常的實驗方法迅速地予以測定。
本發明的多肽有一種或多種生物學功能，該生物學功能在一種或多種疾病狀態方面，特別是上文論及的本發明的疾病方面具有相關性。因此，鑒定刺激或者抑制多肽的功能或者水平的化合物是有用的。因此，另一方面，本發明提供篩選化合物的、以確定刺激或者抑制多肽的功能或者水平的方法。這些方法鑒定可用作治療和預防上文論及的本發明的這些疾病的興奮劑和拮抗劑。從各種各樣來源可以鑒定化合物，例如，細胞，無細胞的制備物，化合物文庫，收集的化合物，和天然產物混合物。通過這樣鑒定的興奮劑或拮抗劑可以是天然的或修飾的底物，配體，受體，酶，等等，如，可以是多肽，其結構的或功能的模擬物(參見Coligan等，免疫學現代流程1(2)第5章(1991))或者一個小的分子。
篩選方法可以借助于直接或者間接地與候選化合物相結合的標記，簡單地測量候選化合物與多肽，或細胞或攜帶多肽的膜，或其融合蛋白的結合能力。或者，篩選方法可以包括測量或檢測(定性地和定量地)候選化合物與標記的競爭物(例如，興奮劑或拮抗劑)對多肽的競爭結合。此外，利用對攜帶多肽的細胞合適的檢測系統，這些篩選方法可以檢驗候選化合物是否導致由于多肽的激活或者抑制而產生的信號。一般地，在已知的興奮劑存在的情況下分析激活作用的抑制劑，并且通過在候選化合物存在時觀察興奮劑對激活作用的影響。此外，篩選方法可以簡單地包括以下步驟把候選化合物與包含本發明多肽的溶液相混合，形成混合物，和在混合物中測量ANIC-BP活性，并且把混合物的ANIC-BP活性與不包含任何候選化合物的對照混合物相比較。
本發明的多肽可以被用于常規的低容量篩選方法中，也可以高通量的篩選(HTS)形式使用。這些高通量的篩選(HTS)形式不僅包括已公認的96孔微板的使用，最近，還包括384個孔的微量滴定板的使用，而且還包括一些新出現的方法，如Schullek等描述的納孔(毫微孔)方法(AnalBiochem，246，20-29，(1997)).
融合蛋白質，如由Fc部分和在上文描述的ANIC-BP多肽制備的那些融合蛋白質也可以用于高通量的篩選分析，以鑒定本發明的多肽的拮抗劑(參見D.Bennett等，分子識別雜志，852-58(1995)；和K.Johanson等，生物化學雜志，270(16)9459-9471(1995))。篩選方法多聚核苷酸，多肽和本發明多肽的抗體也可以用于具體的篩選方法，來檢測附加的化合物對細胞中mRNA和多肽的產生的效應。例如，用在本領域中熟知的標準方法，利用單克隆和多克隆抗體，可以構建ELISA分析，以便測量分泌的或者細胞相關水平的多肽。這可以用來發現一些介質，該介質可能抑制或者提高(也分別稱為拮抗劑或興奮劑)從合適地操縱的細胞或者組織產生的多肽。
通過在本領域中熟知的標準的受體結合技術，如果有的話，可以用本發明的多肽來鑒定膜結合的或者可溶解的受體。這些技術包括，但不限于，配體結合和交聯分析，其中多肽被標記上放射性同位素(例如125I)，被化學修飾(例如，生物素化的)，或融合到適宜于檢測或提純的多肽序列上，和與一定來源的可能受體(細胞，細胞膜，細胞上清液，組織提取液，體液)培養。其它方法包括生物物理技術如胞質基因共振和光譜學。如果有任何的話，這些篩選方法也可以用來鑒定多肽的興奮劑和拮抗劑，這些興奮劑和拮抗劑與多肽結合到其受體上競爭。進行這樣的分析的標準方法在本領域中是熟知的技術。
本發明多肽的拮抗劑的例子包括抗體，或者，在某些情況下，包括寡聚核苷酸或蛋白質，該蛋白質與配體、底物、受體、酶等緊密相關，如同有的情況，是關于多肽的，例如，配體、底物、受體、酶等的一個片段；或者是結合到本發明多肽上，但不引發反應的一個小分子，因此可抑制該多肽的活性。
篩選方法也可以包括利用轉基因技術和ANIC-BP基因。構建轉基因動物的技術已充分建立。例如，ANIC-BP基因通過微型注射可以導入受精卵母細胞的雄性原核中，通過逆轉病毒轉移至移植前的胚或移植的后胚中，或者通過遺傳上修飾的注射，如電穿孔，把胚胎干細胞注射到宿主的胚泡中。特別有用的轉基因動物是所謂的“knock-in”動物，在該動物中，一個動物基因在該動物基因組內被人類等同的基因所取代。knock-in轉基因動物在藥物發現過程中對作用靶標的證實是有用的，化合物對人體的靶標作用是特異性的。其它有用的轉基因動物是所謂的＂基因失效(knock-out)＂動物，在該動物中，本發明多肽的動物直向同源基因的表達和細胞中內源DNA序列編碼基因表達被部分地或者完全廢止失效。基因失效可瞄準特定的細胞或組織，由于該技術的局限性的，基因失效可能只在一定的細胞或者組織之中發生，或者在所有的或基本上所有的動物細胞中發生。轉基因動物技術也提供一個完整的動物表達克隆系統，其中導入的基因被表達，產生大量的本發明的多肽。
用于上述方法的篩選試劑盒構成本發明的另一方面，這樣的篩選試劑盒包括(a)一種本發明的多肽；(b)一種表達本發明的多肽的重組細胞；(c)一種表達本發明的多肽的細胞膜；或(d)一種本發明的多肽的抗體；其中，多肽優選地是SEQ ID NO2的多肽。
可充分理解的是，在任何這樣的試劑盒中，(a)，(b)，(c)，或(d)可包含一種實質上的組成部分。術語解釋提供下列定義以便理解在上文中經常使用的某種術語。
本文所使用的＂抗體＂包括多克隆抗體和單克隆抗體，嵌合的，單鏈，和人源化的抗體，以及Fab片段，包括Fab或者另一種免疫球蛋白表達文庫的產物。
＂分離的＂是指從自然狀態中，“通過人的手”改變的，即，如果它存在于自然界，從它的原來的環境中已經被改變或者被撤走，或者兼有這兩種情況。例如，在一個活著的生物體中天然存在的多聚核苷酸或者多肽不是＂分離的＂，但是從其天然狀態共存的材料中分離出來的相同的多聚核苷酸或者多肽是＂分離＂的，正如此處使用的術語一樣。而且，通過轉化，遺傳操作或通過任何其它的重組方法導入到生物體的多聚核苷酸或者多肽是＂分離＂的，即使它還存在于所說的生物體中，該有機體可以是存活著的或者非存活的。
＂多聚核苷酸＂一般地是指任何多聚核糖核苷酸(RNA)或多聚脫氧核糖核苷酸(DNA)，它們可以是沒有修飾的或者是修飾的RNA或DNA。＂多聚核苷酸＂包括，但沒有限制，單鏈的和雙鏈的DNA，單鏈和雙鏈區域的混合物的DNA，單鏈的和雙鏈的RNA，單鏈和雙鏈區域的混合物的RNA，以及包含DNA和RNA的雜合分子，該DNA和RNA可以是單鏈的，更典型地是雙鏈的、或者是單鏈和雙鏈區域的混合物。此外，＂多聚核苷酸＂是指包含RNA或DNA或RNA和DNA兩者的三鏈區域。術語＂多聚核苷酸＂也包括含有一種或多種的修飾堿基的DNA或RNA，和為穩定性或其它原因帶有修飾的主鏈(骨架)的DNA或RNA。“修飾的”堿基包括，例如，三苯甲基化的堿基和稀有堿基，如次黃嘌呤核苷。對DNA和RNA可進行多種多樣的修飾，因此，＂多聚核苷酸＂包括化學上地，酶促地，代謝上的修飾形式的、如同自然界發現的多聚核苷酸，以及具有病毒和細胞特征的DNA和RNA的化學形式。＂多聚核苷酸＂也包括相對較短的多聚核苷酸，經常稱作寡聚核苷酸。
＂多肽＂是指包含兩種或者多種通過肽鍵或修飾的肽鍵、即同位的肽鍵彼此相連的氨基酸的任何多肽。＂多肽＂還涉及短鏈，一般地稱作肽，寡肽或寡聚體，和長鏈，一般地稱作蛋白質。多肽可以含有除20種基因-編碼的氨基酸以外的氨基酸。“多肽”包括通過自然過程修飾的，如翻譯后加工或者本領域熟知的化學修飾技術修飾的氨基酸序列。這些修飾作用在基本的教科書和更詳細的專著，以及大量的研究文獻中有充分的描述。修飾作用可以在多肽中的任何地方發生，包括肽的主鏈，氨基酸側鏈和氨基或羧基末端。將充分理解的是，同一類型的修飾可以相同或不同程度存在于的給定的多肽的幾個位置。還有，一種給定的多肽可以包含多種類型的修飾。多肽因遍在蛋白化作用可以分支，并且它們可以是環狀的，有或者沒有分支。環狀的，分支的或者分支環狀的多肽可能因翻譯后的自然加工或者通過合成的方法產生。修飾作用包括乙酰化作用，酰化作用，ADP-核糖基化作用，酰胺化作用，生物素化作用，黃素的共價連接，血紅素部分的共價連接，一個核苷酸或核苷酸衍生物的共價連接，脂類或脂類衍生物的共價連接，磷脂酰肌醇的共價連接，交聯作用，環化作用，二硫鍵形成，脫甲基作用，共價交聯的形成，胱氨酸的形成，焦谷氨酸的形成，甲酰基化作用，γ-羧化作用，糖基化作用，GP1錨狀物形成，羥基化作用，碘化作用，甲基化作用，豆蔻酰化作用，氧化作用，蛋白質的水解加工，磷酸化作用，異戊烯化作用，消旋作用，硒代化作用，硫酸脂化作用，轉移RNA介導的氨基酸向蛋白質的添加，如精氨酰化作用和遍在蛋白化作用(參見，例如，蛋白質-結構和分子特性，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，紐約，1993；Wold，F.，翻譯后蛋白質的修飾觀點和展望，1-12，蛋白質的翻譯后共價修飾，B.C.Johnson，編輯，學術出版社，紐約，1983；Seifter等，＂蛋白質的修飾和非蛋白質共因子的分析＂，酶學方法學，182，626-646，1990，以及Rattan等，“蛋白質合成翻譯后修飾和衰老”，紐約學術科學年報(Ann NY Acad Sci)，663，48-62，1992)。
多肽序列的＂片段＂是指比參考序列更短，但保持與參考序列基本上相同的生物功能或者活性的多肽序列。多聚核苷酸的＂片段＂是指比SEQ IDNO1的參考序列短的多聚核苷酸序列。
＂變異體＂是指不同于參考多聚核苷酸或者多肽，但保持其基本特性的多聚核苷酸或者多肽。多聚核苷酸的典型的變異體在核苷酸序列方面不同于參考多聚核苷酸。變異體的核苷酸序列的變化可能或者不能改變參考多聚核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。正如下面所討論的，核苷酸的改變可以導致參考序列編碼的多肽中氨基酸的替換，添加，缺失，融合和截短。多肽的典型變異體在氨基酸序列方面不同于參考多肽。一般地，這些改變是有限的，因此，參考多肽和變異體的序列總體上是密切類似的，在很多區域是相同。變異體和參考多肽在氨基酸序列方面通過任何組合形式中的一種或多種的替換，插入，缺失而表現不同。替換的或插入的氨基酸殘基可以是或者不是遺傳密碼編碼的。典型的保守替換包括甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。多聚核苷酸或者多肽的變異體可以是如等位基因天然存在的，或者也可以是尚不知道的天然存在的變異體。非天然存在的多聚核苷酸和多肽的變異體可通過突變技術或通過直接合成產生。作為變異體還包括具有一種或多種的翻譯后的修飾，例如，糖基化作用，磷酸化作用，甲基化作用，ADP核糖基化作用，等等。實施方案包括N-端氨基酸的甲基化作用，絲氨酸和蘇氨酸的磷酸化作用，以及C-端的甘氨酸的修飾。
＂等位基因＂是指存在于基因組中一個給定基因座的基因的兩種或更多種替換形式中的一個。
＂多態性＂是指一個種群中，在基因組中一個給定位置上的核苷酸序列(和編碼的多肽序列，如果有關的話)的變異。
＂單核苷酸多態性＂(SNP)指在一個種群中，基因組中單核苷酸位置上的核苷酸變異性的發生。在一個基因之內或在基因組的基因間區域內可以存在一個單核苷酸多態性(SNP)。利用等位基因特異的擴增(ASA)能夠分析SNP。該過程至少需要3種引物。普通的引物被用于對被分析的多態性的逆互補。該普通引物可以是來自多態性堿基的介于50到1500個堿基對之間。其它兩種(或多種)引物彼此相同，除最后的3′堿基擺動以便與兩個(或多個)構成多態性的等位基因中的一個匹配之外。然后對樣品DNA，進行兩種(或多種)PCR反應，每種反應用普通引物和其中等位基因特異引物。
本文所使用的＂剪接變異體＂指最初從相同的基因組DNA序列轉錄的RNA分子中產生的cDNA分子，但它經歷了可供選擇的RNA剪接方式。當最初的RNA轉錄物一般為了去掉內含子而經歷剪接，產生不止一種mRNA分子，每種mRNA分子編碼不同的氨基酸序列時，即出現了另一種RNA剪接。術語剪接變異體也指上面cDNA分子編碼的蛋白質。
＂同一性＂反映兩個或多個多肽序列，或者兩個或多個多聚核苷酸序列之間的相互關系，這種相互關系是通過比較序列而確定的。一般來說，同一性分別指兩種多聚核苷酸序列或兩種多肽序列在其被比較的序列長度上的準確的核苷酸對核苷酸或氨基酸對氨基酸的對應性。
＂％同一性＂-對沒有準確對應性的序列，可以測定＂％同一性＂。一般來說，要比較的兩種序列進行排列對比，產生最大的序列之間的相關性。這可以包括在一個或兩個序列中插入的“缺口”，以增加排列對比的程度。在每種被比較的整個長度序列上可以測定＂％同一性＂(所謂的完全排成一行)，這特別合適于相同的或者長度十分相似的序列，或者在較短的，限定的長度序列上測定＂％同一性＂(所謂的局部排成一行)，這更合適于長度不相等的的序列。
＂相似性＂是進一步的，更復雜地測定兩個多肽序列之間的相互關系。一般來說，＂相似性＂是指比較兩個多肽鏈的氨基酸，在殘基對殘基的基礎上，不僅考慮每種比較(對同一性)序列的一對殘基之間的準確對應性，也考慮在沒有準確對應性的地方，是否在進化的基礎上，一種殘基可能替換其它的殘基。這種可能性有相關聯的“得分”，然后從其中可以確定兩種序列的＂％相似性＂。
比較兩種或多種序列同一性和相似性的方法是本領域所熟知的。例如，在一整套威斯康星序列分析軟件中可供使用的程序，9.1版本(Devereux Jeta等，核酸研究，12，387-395，1984，由遺傳學計算機小組(集團)提供，Madison，威斯康星，美國)，和例如BESTFIT和GAP程序，可用來測定兩種多聚核苷酸之間的％同一性和兩種多肽序列之間的％同一性和％相似性。BESTFIT使用Smith和Waterman的“局部同源性＂算法(分子生物學雜志，147，195-197，1981，應用數學進展，2，482-489，1981)并且尋找兩種序列之間的相似性的最佳單一區域。BESTFIT更適宜于比較長度不相似的兩種多聚核苷酸或者兩種多肽序列，該程序假定較短的序列代表較長序列的一部分。GAP是把兩種序列排成行對比，根據Neddleman和Wunsch的算法(分子生物學雜志，48，443-453，1970)，尋找＂最大限度的相似性＂。GAP更適合于比較長度大致相同的序列，并預期在遍及整個長度的序列上進行排列對比。優選地，用于每個程序中的參數＂缺口權重＂和＂長度權重＂對于多聚核苷酸序列和對于多肽序列分別是50和3，以及12和4。優選地，當所比較的兩種序列最適地的排成隊列時，對％同一性和相似性進行測定。
其它的測定序列之間的同一性和/或相似性的程序在本領域中也是熟知的，例如BLAST程序家族(Altschul S F等，分子生物學雜志，215，403-410，1990，Altschul S F等，核酸研究，25389-3402，1997，由國家生物工程信息中心(NCBI)提供，Bethesda，馬里蘭，美國和通過NCBI的主頁www.ncbi.nlm.nih.gov也可進入)和FASTA(Pearson W R，酶學中的方法，183，63-99，1990；Pearson W R和Lipman D J，美國國家科學院院刊，85，2444-2448，1988，可以提供作為威斯康星序列分析軟件包的一部分)。
優選地，BLOSUM62氨基酸替換矩陣(Henikoff S和Henikoff J G，美國國家科學院院刊，89，10915-10919，1992)被用于多肽序列比較，包括在比較之前，核苷酸序列首先地被翻譯為氨基酸序列的地方。
優選地，程序BESTFIT被用來測定疑問多聚核苷酸或者多肽序列與參考多聚核苷酸或多肽序列的％同一性，疑問和參考序列進行了最佳排列比較，且如上文中描述的，該程序的參數設定了違約值(default value)。
＂同一性指數＂是序列相關性的度量，它可以用來比較候選序列(多聚核苷酸或者多肽)和參考序列。例如，與參考多聚核苷酸序列相比，具有0.95同一性指數的候選多聚核苷酸序列，除了候選多聚核苷酸序列可以包括每100個參考序列的多聚核苷酸中平均多達5個核苷酸差異之外，與參考序列相比是相同的。這些差異選自下組至少一種核苷酸的缺失，替換，包括轉換和顛換，或插入。這些差異可發生在參考多聚核苷酸序列的5′或3′端位置，或者是介于這些末端位置的任何地方，單獨散布在參考序列的核苷酸之中，或者在參考序列之內的一種或多種鄰接的集團中。換句話說，正如上文所描述的，與參考多聚核苷酸序列相比，要獲得有0.95的同一性指數的多聚核苷酸序列，在參考序列的每100個核苷酸中平均多達5個核苷酸可以被缺失，替換，或者插入，或者它們的任何組合。在細節上已作必要的修正，同樣的情形也實用于同一性指數的其它值，例如0.96，0.97，0.98，0.99。
同樣地，對于多肽，例如，與參考多肽序列相比，具有0.95的同一性指數的候選多肽序列，除了可以包括每100個參考序列的氨基酸中平均多達5個氨基酸差異之外，與參考序列相比是相同的。這些差異選自下組至少一種氨基酸缺失，替換，包括保守的非保守的替換，或者插入。這些差異可發生在參考多肽序列的氨基端或羧基端的位置，或者是介于這些末端位置的任何地方，單獨散布在參考序列的氨基酸之中，或者在參考序列之內的一種或多種鄰接的集團中。換句話說，正如上文所描述的，與參考多多肽序列相比，要獲得0.95的同一性指數的多態序列，在參考序列的每100個氨基酸中平均多達5個氨基酸可以被缺失，替換，或者插入，或者它們的任何組合。在細節上已作必要的修正，同樣的情形也實用于同一性指數的其它值，例如0.96，0.97，0.98，0.99。
核苷酸或氨基酸差異的數量和同一性指數之間的相互關系可以以下列方程表示na≤xa-(xa·I)其中na是核苷酸或氨基酸差異的數量，xa分別是SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的核苷酸或者氨基酸的總數量。
I是同一性指數，·是乘法的符號，和其中，xa和I的任何非整數的積在從xa減去之前四舍五入為最近的整數。
＂同系物＂是用于本領域來表明具有與參考序列高度的序列相關性的多聚核苷酸或者多肽序列的一個普通術語。這樣的相關性可以通過測定如上文解釋的兩種序列之間的同一性和/或相似性的程度作定量分析。屬于這一普通術語的還有術語＂直向同源物＂，以及＂共生同源物＂。＂直向同源物＂指與另一物種中的多聚核苷酸或者多肽的功能對等的多聚核苷酸或者多肽。＂共生同源物＂指同一物種之內功能相似的多聚核苷酸或者多肽。
＂融合蛋白質＂指由兩個不相關的，融合的基因或其片段編碼的蛋白質。在專利US 5541087，US 5726044，EP 574395，EP 493418，以及EP 0232 262中公開了一些實施例。對Fc-ANIC-BP來說，使用免疫球蛋白Fc區域作為融合蛋白的一部分對完成Fc-ANIC-BP的功能表達是有利的，當用于治療時以提高這樣一種融合蛋白質的藥物動力學性質，以及產生二聚體的Fc-ANIC-BP。Fc-ANIC-BP DNA構建體在5′到3′方向，包含分泌盒，即從哺乳動物細胞激發起輸出的信號序列，編碼作為融合伙伴的免疫球蛋白的Fc區域片段的DNA，和編碼Fc-ANIC-BP的DNA。在某些用途方面，非常理想的是通過突變功能性Fc的側面，而不觸動該融合蛋白的其它部分，或者在表達之后完全缺失掉Fc部分，能夠改變內在的功能性質(補體結合，Fc-受體結合)。
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圖1在小腦半球損傷側面的對側中、顯示差異調節條帶的代表性mRNA的差別顯示凝膠。箭頭指差異表達的條帶。圖2大鼠Mo25小腦的270個堿基對基因片段在TBI(創傷的腦部損傷)之后分別在5，10，15，20，25和30個循環的RT-PCR。注意第2泳道在20，25，和30個循環的強烈表達。
L2TBI大鼠非損傷側面的cDNA；R2TBI大鼠損傷側面的cDNA。圖3經TBI之后，用放射性32P標記大鼠Mo25小腦mRNA的270個堿基對基因片段的斑點印跡分析。
檢查了六只單獨的大鼠，3個創傷的腦部損傷處理的和3個模擬手術動物。圖4用放射性32P標記的大鼠Mo25的270個堿基對基因片段在8個大鼠組織上雜交的多個組織的Northern印跡(Clontech實驗室公司，PaloAlto，美國加州)。圖5大鼠腦橫切片的原位雜交。利用對SICCBP和Mo25特異的正義和反義探針。用反義探針監測到的照亮有髓神經束(胼胝體，視束，嗅束中間體，小腦前連合)的強烈信號。圖6大鼠腦部損傷7天之后，ANIC-BP的實時TaqMan PCR表達。比較模擬手術的大鼠大腦和實驗之后死亡7天的腦組織中的非損傷的皮層側面，損傷的皮層側面和小腦。誤差條是標準的平均誤差(S.E.M.)。
更多的實施例實施例1創傷的腦部損傷模型用側面流體方法在大鼠中研究對創傷的腦部損傷(TBI)反應過程中的上或下調節基因的鑒定。在雄性Sprague-Dawley大鼠中用側面流體撞擊方法誘導集中于右側膜皮層的溫和創傷的腦部損傷。創傷的腦部損傷5天之后，大鼠死亡，并用差別顯示分析解剖的腦組織。用RT-PCR證實創傷腦部的小腦中的蛋白質的上調節。
對照大鼠進行麻醉，并且縮回顳肌，但不實行開顱手術。存活5天后，麻醉并殺死所有的大鼠，解剖大鼠的大腦，并于液氮中冷凍。
第2組TBI處理的老鼠用于組織化學和免疫組織化學染色。在TBI(創傷的腦部損傷)后一周，麻醉這些老鼠，并灌注鹽水，再灌注3％的多聚甲醛。腦組織在一個冷凍切片機上切成30微米的冠狀切片。實施例2免疫組織化學小腦切片用鈣結合蛋白質的單克隆抗體標記。免疫復合物用親和素-生物素/DAB方法觀測。作為正對照，鈣結合蛋白質-D(28KD)被用作小腦浦肯野氏細胞的可靠的標記。實施例3原位雜交根據本領域技術人員熟知的標準方法設計選自序列No.1(正義，反義)的寡聚脫氧核苷酸。根據本領域中熟知的方法，這些探針用于老鼠腦組織切片的原位雜交。在柯達BioMax膠片上曝光5天后觀察放射自顯影。實施例4從創傷的腦部損傷的大鼠中提取RNAmRNA差式顯示被研發作為鑒定和分析任何真核細胞中mRNA水平上改變的基因表達的方法(Liang和Pardee，科學257，967，1992)。在本發明中，我們利用這一方法來研究對創傷的腦部損傷反應中的上調和下調基因，以便對CNS傷害的分子影響獲得更好的了解(den Daas等，美國神經科學學會會議，華盛頓D.C.，美國，1998)。創傷的腦部損傷的動物模型稱為側面流體撞擊模型，并且實施如下在雄性Sprague-Dawley大鼠中用側面流體撞擊方法誘導集中于大腦右側膜皮層的溫和創傷的腦部損傷。對照大鼠被麻醉，并且縮回顳肌，但不實行開顱手術。經存活5天后，麻醉并殺死所有的大鼠，解剖大鼠的大腦，并于液氮中冷凍。研磨勻漿整個腦部組織，提取總RNA(Sambrook等，1989).差式顯示通過RNA差式顯示分析獲得的RNA。用具有兩種另外核苷酸的、以所有可能組合方式的寡聚-dT引物(下游引物；13節)對mRNAs進行逆轉錄，從而把反應固定在聚腺苷酸尾的前端。用相同的3′端引物和第二個具有十個堿基的隨機的5′引物進行cDNA的擴增。擴增產物在非變性的10％的聚丙烯酰胺凝膠(Amersham Pharmacia Biotech，德國)上分析。DNA通過銀染色觀察。染色之后，凝膠在室溫下干燥一小時(圖1)。從凝膠上切下差式表達的條帶。把DNA洗脫下來，再擴增并亞克隆到pCR2.1載體上(Invitrogen，美國)。亞克隆片段通過Sanger法(SangerF.，等，PNAS，美國74，5463-5467)進行序列分析，并且把其序列與基因組數據庫相比較。用逆轉錄PCR(RT-PCR)驗證獲得的基因片段。為了證實差式表達的大鼠Mo25，用特異的19節和21節引物，利用大力神試管(Titan one tube)RT-PCR系統(Boehringer曼海姆，德國)通過RT-PCR分析序列。一微克的從對照和TBI處理的動物中提取的總RNA用于RT-PCR。用大鼠Mo25的探針進行點雜交技術和人的Mo25探針進行Northern印跡分析可以驗證更多的基因。逆轉錄PCR(RT-PCR)為了證實差式表達的中風誘導的鈣結合蛋白質，用特異的19節和21節引物，利用大力神試管RT-PCR系統(Boehringer曼海姆，德國)通過RT-PCR分析序列。一微克的從對照和TBI處理的動物中提取的總RNA用于RT-PCR。實時PCR用實時TaqMan PCR技術在ABI棱晶7700序列檢測系統(PE，應用生物系統，德國)中檢查頭部創傷之后ANIC-BP在大鼠大腦中的分布。利用這一技術，可以高靈敏度地測定mRNA的絕對濃度。設計了具有25和29個堿基對長度的引物以及一種32節的TaqMan探針(報告染料FAM/猝滅劑染料TAMRA)。Ca2+結合由SDS-PAGE分離的蛋白質被印跡到硝酸纖維素膜上，并用Maruyama等(J.Biochem.95511-519，1984)描述的方法分析放射性標記的Ca2+的結合。經溫育之后，洗去多余的同位素，把膜曝光于柯達XOMAT.TM膠片上一段合適的時間。在結合蛋白的位置上顯影出一個條帶。通過使用對結合蛋白特異的抗體和通過Western印跡的方法施用抗體證實結合蛋白的存在，該方法是本領域熟知的技術。
序列表<110>Merck Patent GmbH<120>急性神經元鈣結合蛋白<130>ANICBPJDDWS<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1026<212>DNA<213>人類<220><221>CDS<222>(1)..(1026)<400>1atg ccg ttc ccg ttt ggg aag tct cac aaa tct cca gca gac att gtg 48Met Pro Phe Pro Phe Gly Lys Ser His Lys Ser Pro Ala Asp Ile Val1 5 10 15aag aat ctg aag gag agc atg gct gtt ctg gaa aag caa gac att tct 96Lys Asn Leu Lys Glu Ser Met Ala Val Leu Glu Lys Gln Asp Ile Ser20 25 30gat aaa aaa gca gaa aag gct aca gaa gaa gtt tcc aaa aat ctg gtt 144Asp Lys Lys Ala Glu Lys Ala Thr Glu Glu Val Ser Lys Asn Leu Val35 40 45gcc atg aaa gaa att ctg tat ggc aca aat gaa aaa gag cct cag aca 192Ala Met Lys Glu Ile Leu Tyr Gly Thr Asn Glu Lys Glu Pro Gln Thr50 55 60gaa gca gta gct caa ctt gct caa gaa ctc tat aat agt ggg ctc ctt 240Glu Ala Val Ala Gln Leu Ala Gln Glu Leu Tyr Asn Ser Gly Leu Leu65 70 75 80agc acc ctg gta gct gat tta cag ctc att gac ttt gag ggc aaa aaa 288Ser Thr Leu Val Ala Asp Leu Gln Leu Ile Asp Phe Glu Gly Lys Lys85 90 95gac gtg gct caa att ttc aac aat att ctc aga aga caa att ggt acg 336Asp Val Ala Gln Ile Phe Asn Asn Ile Leu Arg Arg Gln Ile Gly Thr100 105 110aga act cct act gtt gaa tac atc tgc acc caa cag aat att ttg ttc 384Arg Thr Pro Thr Val Glu Tyr Ile Cys Thr Gln Gln Asn Ile Leu Phe115 120 125atg tta ttg aaa ggg tat gaa tct cca gaa ata gct cta aat tgt gga 432Met Leu Leu Lys Gly Tyr Glu Ser Pro Glu Ile Ala Leu Asn Cys Gly130 135 140ata atg tta aga gaa tgc atc aga cat gaa cca ctt gca aaa atc att 480Ile Met Leu Arg Glu Cys Ile Arg His Glu Pro Leu Ala Lys Ile Ile145 150 155 160ttg tgg tcg gaa cag ttt tat gat ttc ttc aga tat gtc gaa atg tca 528Leu Trp Ser Glu Gln Phe Tyr Asp Phe Phe Arg Tyr Val Glu Met Ser165 170 175aca ttt gac ata gct tca gat gca ttt gcc aca ttc aag gat tta ctt 576Thr Phe Asp Ile Ala Ser Asp Ala Phe Ala Thr Phe Lys Asp Leu Leu180 185 190aca aga cat aaa ttg ctc agt gca gaa ttt ttg gaa cag cat tat gat 624Thr Arg His Lys Leu Leu Ser Ala Glu Phe Leu Glu Gln His Tyr Asp195 200 205aga ttt ttc agt gaa tat gag aag tta ctt cat tca gaa aat tat gtg 672Arg Phe Phe Ser Glu Tyr Glu Lys Leu Leu His Ser Glu Asn Tyr Val210 215 220aca aaa aga cag tca ctg aag ctt ctc ggt gaa cta cta cta gat aga 720Thr Lys Arg Gln Ser Leu Lys Leu Leu Gly Glu Leu Leu Leu Asp Arg225 230 235 240cac aac ttc aca att atg aca aaa tac atc agt aaa cct gag aac ctc 768His Asn Phe Thr Ile Met Thr Lys Tyr Ile Ser Lys Pro Glu Asn Leu245 250 255aaa tta atg atg aac ctg ctg cga gac aaa agt cgc aac atc cag ttt 816Lys Leu Met Met Asn Leu Leu Arg Asp Lys Ser Arg Asn Ile Gln Phe260 265 270gag gcc ttt cac gtt ttt aag gtg ttt gta gcc aat cct aac aag acg 864Glu Ala Phe His Val Phe Lys Val Phe Val Ala Asn Pro Asn Lys Thr275 280 285cag ccc atc cta gac atc ctc ctc aag aac cag gcc aaa ctc ata gag 912Gln Pro Ile Leu Asp Ile Leu Leu Lys Asn Gln Ala Lys Leu Ile Glu290 295 300ttc ctc agc aag ttt cag aac gac agg acg gag gat gag cag ttt aac 960Phe Leu Ser Lys Phe Gln Asn Asp Arg Thr Glu Asp Glu Gln Phe Asn305 310 315 320gac gag aag acc tat tta gtt aaa cag atc agg gat ttg aag aga cca 1008Asp Glu Lys Thr Tyr Leu Val Lys Gln Ile Arg Asp Leu Lys Arg Pro325 330 335gct cag caa gaa gct taa 1026Ala Gln Gln Glu Ala340<210>2<211>341<212>PRT<213>人類<400>2Met Pro Phe Pro Phe Gly Lys Ser His Lys Ser Pro Ala Asp Ile Val1 5 10 15Lys Asn Leu Lys Glu Ser Met Ala Val Leu Glu Lys Gln Asp Ile Ser20 25 30Asp Lys Lys Ala Glu Lys Ala Thr Glu Glu Val Ser Lys Asn Leu Val35 40 45Ala Met Lys Glu Ile Leu Tyr Gly Thr Asn Glu Lys Glu Pro Gln Thr50 55 60Glu Ala Val Ala Gln Leu Ala Gln Glu Leu Tyr Asn Ser Gly Leu Leu65 70 75 80Ser Thr Leu Val Ala Asp Leu Gln Leu Ile Asp Phe Glu Gly Lys Lys85 90 95Asp Val Ala Gln Ile Phe Asn Asn Ile Leu Arg Arg Gln Ile Gly Thr100 105 110Arg Thr Pro Thr Val Glu Tyr Ile Cys Thr Gln Gln Asn Ile Leu Phe115 120 125Met Leu Leu Lys Gly Tyr Glu Ser Pro Glu Ile Ala Leu Asn Cys Gly130 135 140Ile Met Leu Arg Glu Cys Ile Arg His Glu Pro Leu Ala Lys Ile Ile145 150 155 160Leu Trp Ser Glu Gln Phe Tyr Asp Phe Phe Arg Tyr Val Glu Met Ser165 170 175Thr Phe Asp Ile Ala Ser Asp Ala Phe Ala Thr Phe Lys Asp Leu Leu180 185 190Thr Arg His Lys Leu Leu Ser Ala Giu Phe Leu Glu Gln His Tyr Asp195 200 205Arg Phe Phe Ser Glu Tyr Glu Lys Leu Leu His Ser Glu Asn Tyr Val210 215 220Thr Lys Arg Gln Ser Leu Lys Leu Leu Gly Glu Leu Leu Leu Asp Arg225 230 235 240His Asn Phe Thr Ile Met Thr Lys Tyr Ile Ser Lys Pro Glu Asn Leu245 250 255Lys Leu Met Met Asn Leu Leu Arg Asp Lys Ser Arg Asn Ile Gln Phe260 265 270Glu Ala Phe His Val Phe Lys Val Phe Val Ala Ash Pro Ash Lys Thr275 280 285Gln Pro Ile Leu Asp Ile Leu Leu Lys Asn Gln Ala Lys Leu Ile Glu290 295 300Phe Leu Ser Lys Phe Gln Ash Asp Arg Thr Glu Asp Glu Gln Phe Asn305 310 315 320Asp Glu Lys Thr Tyr Leu Val Lys Gln Ile Arg Asp Leu Lys Arg Pro325 330 335Ala Gln Gln Glu Ala340
權利要求
1.一種選自下組的分離的多肽(a)一種由包含SEQ ID NO1序列的多聚核苷酸編碼的分離多肽；(b)一種包含與SEQ ID NO2的多肽序列具有至少95％的等同性的多肽序列的分離多肽；(c)一種與SEQ ID NO2的多肽序列具有至少95％的等同性的分離多肽；(d)SEQ ID NO2的多肽序列，和(e)(a)至(d)中這些多肽的片段或變異體。
2.如權利要求1所要求的分離多肽，其包含SEQ ID NO2的多肽序列。
3.如權利要求1所要求的分離多肽，該多肽是SEQ ID NO2的多肽序列。
4.一種選自下組的分離的多聚核苷酸(a)一種分離的多聚核苷酸，它含有與SEQ ID NO1的多聚核苷酸序列具有至少95％的等同性的多聚核苷酸序列；(b)一種與SEQ ID NO1的多聚核苷酸具有至少95％的等同性的分離多聚核苷酸；(c)一種分離的多聚核苷酸，該多聚核苷酸包含編碼與SEQ ID NO2的多肽序列具有至少95％的等同性的多肽序列的多聚核苷酸序列；(d)一種分離的多聚核苷酸，該多聚核苷酸具有編碼與SEQ ID NO2的多肽序列具有至少95％的等同性的多肽序列的多聚核苷酸序列；(e)一種分離的具有至少100個核苷酸的核酸序列的多聚核苷酸，該分離的多聚核苷酸是在嚴緊雜交條件下，用標記的、具有SEQ ID NO1序列的或具有它的至少15個核苷酸片段的探針通過篩選文庫而獲得的；(f)一種多聚核苷酸，該多聚核苷酸是(a)至(e)中的多聚核苷酸對等的RNA；或者是與所說的分離的多聚核苷酸互補的多聚核苷酸，以及上面提到的多聚核苷酸的變異體和片段的多聚核苷酸，或者是與上面提到的多聚核苷酸在其全長范圍上互補的多聚核苷酸。
5.如權利要求4所要求的分離的多聚核苷酸、其選自下組(a)一種包含SEQ ID NO1多聚核苷酸的分離的多聚核苷酸；(b)SEQ ID NO1的分離的多聚核苷酸；(c)一種分離的多聚核苷酸，該多聚核苷酸含有編碼SEQ ID NO2的多肽的多聚核苷酸；和(d)一種分離的編碼SEQ ID NO2的多肽的多聚核苷酸。
6.一種表達系統，當所說的載體存在于相容的宿主細胞中時，該表達系統含有能夠產生權利要求1的多肽的多聚核苷酸。
7.一種含有權利要求6的表達載體的重組宿主細胞或者一種表達權利要求1的多肽的該細胞膜。
8.一種產生權利要求1的多肽的方法，該方法包括在可充分產生所說的多肽和從培養基中回收該多肽的條件下，培養如權利要求7中限定的宿主細胞的步驟。
9.一種由免疫球蛋白Fc-區和權利要求1的任何一種多肽組成的融合蛋白。
10.一種對權利要求1至3之任一權利要求的多肽具有免疫特異性的抗體。
11.一種用于篩選以便鑒定能夠刺激或者抑制權利要求1的多肽的功能或水平的化合物的方法，該方法包括選自下組的方法(a)直接或間接地通過一種與候選化合物相關的標記，定量或定性地測量或檢測候選化合物與多肽(或與表達該多肽的細胞或膜)或與它的一種融合蛋白的結合；(b)在一種標記的競爭劑存在的情況下，測量一種候選化合物與多肽(或與表達該多肽的細胞或膜)或與它的一種融合蛋白的結合；(c)利用對表達該多肽的細胞或細胞膜合適的檢測系統，檢驗候選化合物是否導致由該多肽激活作用或抑制作用產生的信號；(d)把含有權利要求1的多肽的一種溶液與候選化合物混合，以形成混合物，測定該混合物中多肽的活性，以及與不含候選化合物的對照混合物比較該混合物的活性；或(e)檢測候選化合物對編碼所述多肽的mRNA或細胞中所述多肽產生的影響效果，例如，用ELISA分析，以及(f)按照生物工程或化學標準技術生產所說的化合物。
全文摘要
本文公開了ANIC－BP多肽和多聚核苷酸以及通過重組技術產生這樣的多肽的方法,也公開了在診斷試驗中利用ANIC－BP多肽和多聚核苷酸的方法。
文檔編號C12P21/02GK1357041SQ00809310
公開日2002年7月3日 申請日期2000年6月14日 優先權日1999年6月22日
發明者I·丹達阿斯, V·費施爾, C·賽費爾德, L·溫枚爾啻尼爾 申請人:默克專利股份有限公司