源自微生物的轉谷氨酰胺酶的制備方法

專利名稱：源自微生物的轉谷氨酰胺酶的制備方法
背景技術：
本發明涉及使用淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)(以下略作S.lividans)的宿主-載體體系，通過基因重組方法分泌生產源自放線菌的轉谷氨酰胺酶的方法。通過本發明分泌生產的轉谷氨酰胺酶被廣泛地應用于食品加工和醫藥等領域中。
通過本發明分泌生產的轉谷氨酰胺酶是催化蛋白質肽鏈內的γ-羧酰胺基的酰基轉移反應的酶。該酶作用于蛋白質時，通過ε-(γ-Glu)-Lys架橋形成反應，引起Gln脫酰胺化后轉換為Glu的反應。這種轉谷氨酰胺酶可用于果子凍等凝膠化食品、酸乳酪、干酪、或凝膠狀化妝品等的制造和改善肉類食品的肉質等(特開平1-50382)。另外，該酶可用于制造熱穩定性的微膠囊的材料、固定化酶的載體等，因此是產業上利用率高的酶。
到目前為止，已知有源自動物和微生物的轉谷氨酰胺酶(微生物轉谷氨酰胺酶以下略作“MTG”)。前者是依賴于鈣離子的酶，分布在動物的臟器、皮膚、血液等，例如豚鼠肝臟轉谷氨酰胺酶(K.Ikuraet al.Biochemistry 27，2898(1988))、人表皮角質細胞轉谷氨酰胺酶(M.A.Phillips et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，9333(1990))、人凝血因子XIII(A.Ichinose et al.Biochemistry25，6900(1990))等。
作為源自微生物的轉谷氨酰胺酶，例如在鏈輪絲菌屬(Streptoverticillium)細菌中發現的鈣非依賴性轉谷氨酰胺酶。這樣的細菌，例如有灰肉色鏈輪絲菌(Streptoverticilliumgriseocarneum)IFO 12776、肉桂鏈輪絲菌肉桂亞種(Streptoverticillium cinnamoneum sub sp.cinnamoneum)(以下略作S.cinnamoneum)IFO 12852、茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobaraense)(以下略作S.mobaraense)IFO 13819等(特開昭64-27471)。肽譜和基因結構解析的結果表明，微生物生成的這些轉谷氨酰胺酶的一級結構與源自動物的轉谷氨酰胺酶完全沒有同源性(歐洲專利公開公報0481504 A1)。
源自微生物的轉谷氨酰胺酶(MTG)由于是從上述菌類的培養物經純化制備的，所以在供給量、效率等方面都存在問題。此外，正在嘗試通過基因工程方法來制備轉谷氨酰胺酶。關于轉谷氨酰胺酶蛋白質及其基因，例如已在特開昭64-27471；Biosci.Biotech.Biochem.，58，82-87(1994)；Biosci.Biotech.Biochem.，58，88-92(1994)，特開平5-199883；Biochimie，80，313-319(1998)；Eur.J.Biochem.，257，570-576(1998)；WO 96/06931、WO 96/22366等文獻中報道過。其中，例如有利用淺青紫鏈霉菌、米曲霉菌(Aspergillusoryzae)、大腸桿菌(Escherichia coli)(以下略作E.coli)等宿主-載體體系表達生產的報道。除此之外，還有在大腸桿菌、酵母等微生物中分泌表達(特開平5-199883)的方法，以及通過大腸桿菌將MTG以非活性融合蛋白質包涵體形式表達后，再用蛋白質變性劑溶解，經去除變性劑使其復性來生產有活性的MTG的方法(特開平6-30771)的報道。然而，按照以往方法由微生物分泌表達時，存在著其表達量非常少的問題。而關于轉谷氨酰胺酶在鏈霉菌中的分泌生產，作為具體分泌蓄積量有記載的例子，雖然有利用淺青紫鏈霉菌作為宿主，通過基因重組方法導入源自茂原鏈輪絲菌的轉谷氨酰胺酶基因的報道，但其分泌量只有0.1mg/l左右(Biosci.Biotech.Biochem.，58，82-87(1994)，特開平5-199883)。
發明公開本發明的目的在于，提供在鏈霉菌屬細菌中大量分泌生產轉谷氨酰胺酶來大量制備轉谷氨酰胺酶的方法。
本發明的方法是大量制備轉谷氨酰胺酶的方法，其特征在于，利用放線菌鏈霉菌的宿主-載體體系，使用源自放線菌的轉谷氨酰胺酶基因，即，用信號肽區和前體結構區以及成熟基因結構區、以及調控該轉谷氨酰胺酶基因表達的其原有的(天然的)啟動子區構建在鏈霉菌屬細菌內可高效表達的表達型質粒，然后將該表達型質粒導入鏈霉菌屬細菌，通過培養，使帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶(轉谷氨酰胺酶原)在初期至中期階段分泌，在培養后期通過源自鏈霉菌屬細菌的蛋白酶等將前體結構部分切除，獲得成熟型(活性型)的轉谷氨酰胺酶。
附圖的簡單說明


圖1表示表達用質粒pUJ-MTG的構建順序。
實施發明的最佳方式根據本發明的方法，利用鏈霉菌屬細菌作為宿主-載體體系，制作在轉谷氨酰胺酶基因原有的啟動子下游結合含有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶(轉谷氨酰胺酶原)基因的表達構建物，然后將該表達構建物導入鏈霉菌屬細菌內進行表達，分泌到菌體外的轉谷氨酰胺酶原再用該鏈霉菌屬細菌自身生成的蛋白酶等切除前體結構部分，就可大量得到成熟型(活性型)轉谷氨酰胺酶。
已知分泌型蛋白質一般以前肽或前肽原形式翻譯后，經翻譯后修飾成為成熟型蛋白質。即，一般以前肽或前肽原形式翻譯后，切除信號肽(前導部分)后轉變為成熟肽或肽原，肽原再經蛋白酶處理，切除前體部分后轉變為成熟型肽。轉谷氨酰胺酶就是這樣一種蛋白質。在本說明書中，帶有信號肽和前體部分兩者的轉谷氨酰胺酶、即初級翻譯產物有時稱之為“前轉谷氨酰胺酶原”，而沒有信號肽但帶有前體部分的稱之為“轉谷氨酰胺酶原”。轉谷氨酰胺酶原的前體部分有時也稱之為“前體結構部分”或簡單稱之為“前體結構”，在本說明書中蛋白質的“前體結構部分/前體結構”和“前體部分”之間可互換使用。因此，“轉谷氨酰胺酶原”也稱之為“附加了前體結構部分的轉谷氨酰胺酶”。
在本說明書中，所謂“切除”前體部分的蛋白質是指通過切斷肽鍵切除構成前體部分的至少一個以上的氨基酸的蛋白質，其中包括該蛋白質N末端區與天然成熟型蛋白質的N末端區完全一致的蛋白質，也包括只要具有該蛋白質活性，與天然蛋白質相比N末端多出一個以上源自前體部分的氨基酸的蛋白質和與天然成熟型蛋白質相比氨基酸序列短的蛋白質。在本說明書中，“成熟型轉谷氨酰胺酶”和“活性型轉谷氨酰胺酶”表示相同的含義。
本發明使用的基因構建物一般在適當的位置具有包括啟動子、編碼前轉谷氨酰胺酶原的核酸片段、以及目的蛋白基因在鏈霉菌屬細菌中表達所必需的調控序列等的適當序列。可用于構建該構建物的載體沒有特別限制，只要在鏈霉菌屬細菌中能夠發揮作用即可，可以是質粒等在染色體外自主增殖的載體，也可以是整合到細菌染色體的載體。優選源自鏈霉菌屬細菌的質粒。這樣的質粒，例如pIJ702(J.Gen.Microbiol.，129，2703-2714(1983))及其改良后的質粒等。
在本發明的方法中，在鏈霉菌屬細菌中表達轉谷氨酰胺酶基因時使用的啟動子是放線菌的轉谷氨酰胺酶基因原有的啟動子。然而，在某些情況下無法確定啟動子區，這是由于與大腸桿菌相比放線菌中的啟動子的共有序列還不明確的緣故。在這樣的情況下，可以利用包括完全覆蓋轉谷氨酰胺酶的結構基因以及調控其表達所需啟動子區的5′上游區的基因片段。
本發明可利用的轉谷氨酰胺酶基因沒有特別限定，優選使用源自肉桂鏈輪絲菌IFO 12852、灰肉色鏈輪絲菌IFO 12776、茂原鏈輪絲菌IFO 13819、利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)[WO 96/06931]等放線菌的分泌型轉谷氨酰胺酶基因。其中，特別優選的是源自肉桂鏈輪絲菌或茂原鏈輪絲菌的轉谷氨酰胺酶基因，并與這些轉谷氨酰胺酶基因原有的(天然的)啟動子一起使用。
序列表序列號1給出了本發明人等測定的含有源自肉桂鏈輪絲菌IFO 12852的轉谷氨酰胺酶基因部分5′上游區的全長堿基序列，序列號2給出了該堿基序列編碼的氨基酸序列。據推測，氨基酸序列中從第1位到第32位的序列是前導部分序列，第33位到第86位的序列為前體部分序列，第87位到第416位的序列為成熟型轉谷氨酰胺酶序列。
另外，序列號3給出了含有源自茂原鏈輪絲菌IFO 13819的轉谷氨酰胺酶基因部分5′上游區的全長堿基序列，序列號4給出了該序列編碼的氨基酸序列。氨基酸序列中從第1位到第31位的序列是前導部分序列，第32位到第76位的序列為前體部分的序列，第77位到第407位的序列為成熟型轉谷氨酰胺酶序列。
本發明使用的基因構建物導入鏈霉菌屬細菌的方法沒有特別限定，可以利用通常使用的方法，例如原生質體法(Gene，39，281-286(1985)；特開平3-251182)、電穿孔法(Bio/Technology，7，1067-1070(1989))等方法。得到的轉化體可以按照通常使用的方法和條件進行培養。例如，培養上述微生物的培養基可以使用含有碳源、氮源和無機離子的普通培養基。進而為了獲得高增殖率，可添加維生素、氨基酸等有機微量營養素，聚胨、酵母提取物等天然材料。作為碳源，可以適當地使用可溶性淀粉、葡萄糖或蔗糖等碳水化合物，有機酸，醇類以及其他碳源。培養控制在好氧條件下，pH5.0～8.5、溫度15℃～37℃等適當的范圍內進行，培養1天～2周左右。
作為氮源，可以使用氨氣、氨水、銨鹽和其他氮源。作為無機離子，根據需要可以適當使用鎂離子、磷酸根離子、鉀離子、鐵離子以及其他離子。通過在上述條件下培養轉化體，使前轉谷氨酰胺酶原在菌體內大量生成，并以轉谷氨酰胺酶原形式分泌到菌體外，然后通過鏈霉菌屬細菌本身在該培養條件下分泌生成的蛋白酶在培養基中進行切割，結果使得成熟型(活性型)轉谷氨酰胺酶大量蓄積在培養液中。
通過本發明分泌生產的轉谷氨酰胺酶根據其各種特性，可以按照業內人士熟知的方法從培養后的培養基中分離純化。例如，通過離心分離除去菌體后，再通過硫酸銨或乙醇沉淀、離子交換色譜、親合色譜、高速液相色譜、等電聚焦電泳、凝膠過濾等適宜的已知方法，或通過組合這些方法進行分離純化。
實施例實施例1.源自肉桂鏈輪絲菌IFO 12852的轉谷氨酰胺酶基因的獲得源自肉桂鏈輪絲菌CBS683.68的轉谷氨酰胺酶基因的序列已經測定(Biochimie.，80，313-319(1998))。參考該序列，合成序列號5和6所示的引物，通過PCR法從按照齋藤、三浦的方法(Biochim.Biophys.Acta.，72，619(1963))制備的肉桂鏈輪絲菌IFO12852的染色體DNA中擴增成熟轉谷氨酰胺酶序列的編碼區域。在PCR反應中使用Pyrobest DNA聚合酶(寶酒造社制)，反應條件遵循該說明書提供的方案。(序列號5)5’-TCCGATGACCGGGAAACTCCTCCCGCCGAG-3’(序列號6)5’-CGGCCAGCCTTGCTCCACCTTGGCGGGGGC-3’<序列表說明>序列號5用于擴增源自肉桂鏈輪絲菌的轉谷氨酰胺酶基因的PCR引物序列號6用于擴增源自肉桂鏈輪絲菌的轉谷氨酰胺酶基因的PCR引物然后，約960bp的DNA擴增片段用Random Primer DNA LabelingKit Ver.2(寶酒造社制)和[α-32P]dCTP，按照說明書附帶的方案進行反應，制備DNA探針。用制備的探針和肉桂鏈輪絲菌IFO 12852的染色體DNA，按照《分子克隆》第二版(J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，冷泉港實驗室出版，p9.31(1989))記載的方法進行Southern blot雜交，可以確認用限制酶BamHI切出的約3.5kb的片段中存在著轉谷氨酰胺酶基因。用EASYTRAP Ver.2(寶酒造社制)由瓊脂糖凝膠電泳回收BamHI消化肉桂鏈輪絲菌IFO 12852的染色體DNA得到的約3.5kb的片段，將該片斷插入到pUC18的BamHI位點后，導入大腸桿菌JM109(寶酒造社制)的感受態細胞，制作文庫。使用先前制備的轉谷氨酰胺酶的DNA探針，按照《分子克隆》第二版(J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，冷泉港實驗室出版，p1.90(1989))記載的一般程序進行菌落雜交，進行文庫的篩選，獲得攜有轉谷氨酰胺酶基因片段的克隆質粒的菌株，從該菌株回收質粒，取名為pB3.5。
在測定pB3.5的克隆片段的堿基序列時，可以確認肉桂鏈輪絲菌IFO 12852的轉谷氨酰胺酶基因與肉桂鏈輪絲菌CBS683.68的轉谷氨酰胺酶基因具有大致相同的堿基序列。另外，轉谷氨酰胺酶基因的插入方向為pUC18的多克隆位點中由EcoRI至HindIII的方向。使用Di-Terminator Cycle Sequencing kit(PE Applied Biosystems公司制)和DNA測序儀373(PE Applied Biosystems公司制)測定堿基序列。
序列號1和2分別給出了測定的堿基序列和該堿基序列編碼的氨基酸序列。據推測，氨基酸序列中第1位到第32位的序列是前導部分的序列，第33位到第86位的序列為前體部分的序列，第87位到第416位的序列為成熟型轉谷氨酰胺酶的序列。實施例2.轉谷氨酰胺酶基因表達用質粒的構建1)質粒載體(pIJ702)的獲得pIJ702的制備按照[J.Bacteriol.，162，406-412(1984)；J.Bacteriol.，169，1929-1937(1985)]的方法進行。具體來說，淺青紫鏈霉菌66用pIJ702轉化后獲得的淺青紫鏈霉菌3131(ATCC 35287)(J.Gen.Microbiol.，129，2703-2714(1983))在以下的條件，于30℃培養2天。[YEME培養基+0.5％甘氨酸+50μg/ml硫鏈絲菌肽]0.3％ 酵母提取物0.5％ 蛋白胨0.3％ 麥芽提取物0.1％ 氯化鎂1.0％ 葡萄糖34.0％ 蔗糖0.5％ 甘氨酸0.10％ 50mg/ml硫鏈絲菌肽溶液(Sigma二甲基亞砜溶液)(pH7.0)將在上述條件下培養的培養基200ml離心分離(12,000g，4℃，10分鐘)，用50mM Tris-HCl(pH8.0)-5mM EDTA-50mM NaCl洗滌后，將得到的菌體懸浮于10ml的50mM Tris-HCl(pH8.0)-10mMEDTA-25％蔗糖(以下略作“TE-蔗糖”)溶液中。然后加入含有30mg/ml溶菌酶(Sigma)的TE-蔗糖2ml和0.25M EDTA 4ml，于37℃溫育30分鐘后，加入20％ SDS 2ml，再加入5M NaCl 5ml，緩慢攪拌后，于0℃溫育過夜。然后，向離心分離(100,000g，4℃，40分鐘)得到的上清中加入30％聚乙二醇6000并使之終濃度為10％，于0℃溫育4.5小時。然后離心分離(900g，4℃，5分鐘)，將沉淀溶解于10mM Tris-HCl(pH8.0)-1mM EDTA-50mM NaCl中。然后加入將16.8g氯化銫和濃度為10mg/ml的溴乙錠溶解于10mM Tris-HCl(pH8.0)-1mM EDTA(以下略作“TE”)中制備得到的溶液1.2ml，通過離心分離(1,300g，室溫，15分鐘)去除殘余物后，再進行離心分離(230,000g，20℃，12小時)。離心后在紫外線照射下，分離提取質粒DNA層，用TE飽和的丁醇反復進行3次萃取操作，除去溴乙錠。再用TE于4℃透析過夜后，用TE飽和的酚萃取一次、用氯仿·異戊醇萃取2次，回收水層。然后加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH5.2)溶液和2倍體積的乙醇，于-80℃靜置30分鐘，通過離心分離(12,000g，4℃，15分鐘)回收沉淀，用70％乙醇洗滌后，進行干燥，溶解于200μl TE中。得到大約10μg的質粒DNA。2)構建表達用質粒首先制作在放線菌(Streptomyces)和大腸桿菌兩者中都可復制的穿梭載體。用SacI和PstI酶切放線菌多拷貝質粒pIJ702(約5.8kb)，制備除去了mel(酪氨酸激酶基因)啟動子區的大小為5.1kb的片段。然后用HindIII和PstI酶切整合了蛋白酶抑制劑SSI(Streptomyces subtilisin inhibitor)和抗菌肽(apidaecin)基因融合體的pOSΔB-Ap1(約7.9kb)(Appl.Environ.Microbiol.，60，3566-3572(1994))，制備約2kb的片段。再用EcoRI酶切大腸桿菌的多拷貝型質粒pUC18(寶酒造社制)，用T4 DNA聚合酶(寶酒造社制)進行平末端化后，進行自身連接，選擇沒有被EcoRI切斷的質粒，再制備用SacI和HindIII酶切的2.7kb的片段。
接下來將pIJ702的SacI-PstI 5.1kb片段和pOSΔB-Ap1的HindIII-PstI 2kb片段以及pUC18的SacI-HindIII 2.7kb片段3者連接，構建穿梭載體-pUJS(約9.8kb)。
再用HindIII和EcoRI酶切pUJS，回收8.6kb大片段。用HindIII和EcoRI酶切整合了(1)中克隆的肉桂鏈輪絲菌IFO 12852轉谷氨酰胺酶基因的pB3.5(約6.2kb)，回收3.5kb的HindIII-EcoRI片段。構建將該3.5kb的HindIII-EcoRI片段插入到pUJS的HindIII和EcoRI位點的pUJ-MTG(約12.1kb)。
以上的構建順序如
圖1所示。
用pUJ-MTG轉化得到的轉化體大腸桿菌AJ13669保藏于通商產業省工業技術院生命工程工業技術研究所(日本國305-8566茨城縣筑波市東1丁目1-3)，保藏日期為1999年10月14日，保藏號為FERMP-17602；根據布達佩斯條約，該菌種于2000年8月28日轉為國際保藏，保藏號為FERM BP-7287。實施例3.淺青紫鏈霉菌TK24的轉化淺青紫鏈霉菌TK24是源自淺青紫鏈霉菌66的菌株，帶有鏈霉素抗性(鏈霉菌的基因操作(Genetic manipulation ofStreptomyces)，實驗室指南D.A.Hopwood et al.，p266，1985，Thejohn Innes Foundation Norwich)。本菌株是由D.A.Hopwood(JohnInnes Institute，Colney Lane，Norwich NR4 7UH，U.K.)提供的，可以從D.A.Hopwood實驗室獲得。
按照[特開平3-25118；Hunter，I.S.，“DNA克隆”實用方法2，Glover，D.M.(編著)，IRL出版(1985)；鏈霉菌的基因操作，實驗室指南D.A.Hopwood et al.，p104，1985，The john InnesFoundation Norwich]的方法，將淺青紫鏈霉菌TK24原生質體化，然后進行轉化。具體來說，將淺青紫鏈霉菌TK24于YEME培養基+0.5％甘氨酸中30℃培養2天。將200ml培養液進行離心分離(1,300g，室溫，10分鐘)，得到的菌體懸浮于72ml的0.35M蔗糖溶液中。
然后將該懸浮液進行離心分離(1,300g，室溫，10分鐘)，再將菌體懸浮于含有1mg/ml的溶菌酶(Sigma)的P緩沖液60ml中，于30℃溫育2.5小時，用脫脂棉過濾，去除殘余物。對得到的濾液進行離心分離(1,300g，室溫，10分鐘)，用P緩沖液25ml反復洗滌2次后，將沉淀懸浮于1ml P緩沖液中，作為原生質體懸浮液。[P緩沖液]TES[N-Tris(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸] 5.73g蔗糖 103g氯化鎂2.03g硫酸鉀0.5g氯化鈣3.68g微量元素溶液 2ml/L(pH7.4)另外，配制1％磷酸二氫鉀溶液，在臨用前每100ml P緩沖液中加入1ml。[微量元素溶液]1L溶液中含有以下物質氯化鋅 40mg氯化鐵200mg氯化銅 10mg氯化錳 10mg硼酸四鈉鹽 10mg鉬酸銨 10mg接著按照下述步驟，用轉谷氨酰胺酶基因表達質粒pUJ-MEG(約12.1kb)轉化淺青紫鏈霉菌TK24的原生質體懸浮液。
將下述物質緩慢混合，于室溫靜置2分鐘。
DNA溶液(0.2μg/μl) 20μl淺青紫鏈霉菌TK24的原生質體懸浮液 100μl0.35M蔗糖溶液 20μl含有20％聚乙二醇1000的P緩沖液 1.5ml進行離心分離(1,700g，室溫，10分鐘)，收集沉積物，用P緩沖液反復洗滌2次，懸浮于1ml P緩沖液中后，將該懸浮液涂布于下述R-2瓊脂培養基上，每份為200μl。[瓊脂培養基]1)R-2/A硫酸鉀 0.5g/l氯化鎂 20.2g/l氯化鈣 5.9g/l葡萄糖 20.0g/l脯氨酸 6.0g/l酪蛋白氨基酸0.2g/l微量元素溶液 4ml瓊脂 44.0g/l2)R-2/BTES11.5g/l酵母提取物 10.0g/l蔗糖203g/l(pH7.4)3)1％KH2PO4分別配制1)2)3)，在制作平板培養基時將R-2/A和R-2/B混合，再與1％ KH2PO4溶液混合，混合比例為最終體積200m中混合有1ml的1％ KH2PO4溶液。
涂布了轉化體的R-2瓊脂培養基于30℃溫育18小時后，加入含有200μg/ml的硫鏈絲菌肽的P緩沖液1ml，將瓊脂的整個表面覆蓋，再于30℃溫育7天，得到菌落。從得到的菌落提取質粒，確認有目的質粒的導入。實施例4.轉谷氨酰胺酶基因的表達和分泌生產將轉化體pUJ-MEG/淺青紫鏈霉菌TK24在含有10μg/ml硫鏈絲菌肽的Tripton-Soya Broth(DIFCO公司制)液體培養基4ml中30℃培養3天，再將該培養液1ml接種到100ml上述液體培養基(500ml體積的坂口燒瓶)中，于30℃培養2周。每隔一定時間取培養液樣品，進行SDS-PAGE，之后用特開平6-046855記載的抗轉谷氨酰胺酶抗體，于《分子克隆》第2版(J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，冷泉港實驗室出版，p18.60(1989)記載的條件進行蛋白印跡(Westernblot)。結果表明，培養7～10天時可以確認有附加前體結構部分的轉谷氨酰胺酶(轉谷氨酰胺酶原)的分泌生產(約40-50mg/l)，進一步繼續培養時，與轉谷氨酰胺酶原經加工后的成熟轉谷氨酰胺酶分子量幾乎相同的轉谷氨酰胺酶的生成量增大，培養2周時蓄積了約40～50mg/l的成熟型轉谷氨酰胺酶。
用附加前體結構部分的轉谷氨酰胺酶(轉谷氨酰胺酶原)分泌生產量多的時期的培養上清，進行SDS-PAGE，之后半干印跡(semi-dryblotting)到PVDF膜上(“用于基因克隆的蛋白質結構解析”(Analysisof Protein Structure for Gene Cloning)，東京化學同人(1993))。轉移后，用考馬斯亮藍對PVDF膜進行染色、脫色并風干。切下轉谷氨酰胺酶原部分，用蛋白質測序儀(型號476A，Perkin-Elmer公司制)對N末端氨基酸序列進行解析。解析結果可以確認轉谷氨酰胺酶原的N末端氨基酸序列中10個氨基酸序列(Gly-Asp-Gly-Glu-Glu-Lys-Gly-Ser-Tyr-Ala-)(序列號7)。該氨基酸序列與Biochimie.，80，313-319(1998)給出的前體區序列不同，而與實施例1測定的氨基酸序列(序列號2)一致。
由本發明可在鏈霉菌屬細菌中生成轉谷氨酰胺酶，并從培養液中大量得到轉谷氨酰胺酶。通過本發明的方法在培養液中蓄積的轉谷氨酰胺酶，由于是通過鏈霉菌屬細菌自身生成的蛋白酶切割的成熟型轉谷氨酰胺酶，所以可以簡便而且可大規模地從培養基中回收成熟型轉谷氨酰胺酶。
序列表<110>味之素株式會社(Ajinomoto Co.，Inc.)<120>源自微生物的轉谷氨酰胺酶的制備方法<130>Y1H0984<140><141><150>JP 11-295649<151>1999-10-18<160>7<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1461<212>DNA<213>肉桂鏈輪絲菌(Streptoverticillium cinnamoneum)<220><221>CDS<222>(151)..(1398)<400>1cggcggcagc cctccttgcc gccggcgcag cgacgcagga cggcgcggcc aaggccctga 60gcggcagctc gtcgcaaacc cctccatcgc gtcgtgctct cacatgccct cgtttcacga 120ggcttcacca caagggagtt attgatttcc atg cac aaa cgt cgg aga ctt ctc 174Met His Lys Arg Arg Arg Leu Leu1 5gcc ttc gcc act gtg ggt gcg gtc ata tgc acc gca gga ttc aca cct 222Ala Phe Ala Thr Val Gly Ala Val Ile Cys Thr Ala Gly Phe Thr Pro10 15 20tcg gtc agc cag gcc gcc agc agt ggc gat ggg gaa gag aag ggg tcc 270Ser Val Ser Gln Ala Ala Ser Ser Gly Asp Gly Glu Glu Lys Gly Ser25 30 35 40tac gcc gaa acg cac ggc ctg acg gcg gat gac gtc gag agc atc aac 318Tyr Ala Glu Thr His Gly Leu Thr Ala Asp Asp Val Glu Ser Ile Asn45 50 55gca ctg aac gaa aga gct ctg act ctg ggc caa cct ggc aag cct ccg 366Ala Leu Asn Glu Arg Ala Leu Thr Leu Gly Gln Pro Gly Lys Pro Pro60 65 70aag gaa tta cct ccg agc gcc agc gcg ccc tcc cgg gcc ccc tcc gat 414Lys Glu Leu Pro Pro Ser Ala Ser Ala Pro Ser Arg Ala Pro Ser Asp75 80 85gac cgg gaa act cct ccc gcc gag ccg ctc gac agg atg cct gag gcg 462Asp Arg Glu Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Glu Ala
90 95 100tac cgg gcc tac gga ggc agg gcc act acg gtc gtc aac aac tac ata 510Tyr Arg Ala Tyr Gly Gly Arg Ala Thr Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile105 110 115 120cgc aag tgg cag cag gtc tac agt cac cgc gac gga aag aaa cag caa 558Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Lys Lys Gln Gln125 130 135atg acc gaa gag cag cga gaa aag ctg tcc tac ggt tgc gtt ggc gtc 606Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Lys Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val140 145 150acc tgg gtc aac tcg ggc ccc tac ccg acg aac aga ttg gcg ttc gcg 654Thr Trp Val Asn Ser Gly Pro Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala155 160 165tcc ttc gac gag aac aag tac aag aac gac ctg aag aac acc agc ccc 702Ser Phe Asp Glu Asn Lys Tyr Lys Asn Asp Leu Lys Asn Thr Ser Pro170 175 180cga ccc gat gaa acg cgg gcg gag ttc gag ggt cgc atc gcc aag ggc 750Arg Pro Asp Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Ile Ala Lys Gly185 190 195 200agt ttc gac gag ggg aag ggt ttc aag cgg gcg cgt gat gtg gcg tcc 798Ser Phe Asp Glu Gly Lys Gly Phe Lys Arg Ala Arg Asp Val Ala Ser205 210 215gtc atg aac aag gcc ctg gaa aat gcc cac gac gag ggg act tac atc 846Val Met Asn Lys Ala Leu Glu Ash Ala His Asp Glu Gly Thr Tyr Ile220 225 230aac aac ctc aag acg gag ctc acg aac aac aat gac gct ctg ctc cgc 894Asn Asn Leu Lys Thr Glu Leu Thr Asn Asn Asn Asp Ala Leu Leu Arg235 240 245gag gac agc cgc tcg aac ttc tac tcg gcg ctg agg aac aca ccg tcc 942Glu Asp Ser Arg Ser Asn Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser250 255 260ttc aag gaa agg gac ggc ggc aac tac gac ccg tcc aag atg aag gcg 990Phe Lys Glu Arg Asp Gly Gly Asn Tyr Asp Pro Ser Lys Met Lys Ala265 270 275 280gtg atc tac tcg aag cac ttc tgg agc ggg cag gac cag cgg ggc tcc 1038Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Gln Arg Gly Ser285 290 295tcc gac aag agg aag tac ggc gac ccg gaa gcc ttc cgc ccc gac cag 1086Ser Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Glu Ala Phe Arg Pro Asp Gln300 305 310ggt acc ggc ctg gtc gac atg tcg aag gac aga agc att ccg cgc agt 1134Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Lys Asp Arg Ser Ile Pro Arg Ser315 320 325ccg gcc aag ccc ggc gaa ggt tgg gtc aat ttc gac tac ggt tgg ttc 1182Pro Ala Lys Pro Gly Glu Gly Trp Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe330 335 340ggg gct caa aca gaa gcg gat gcc gac aaa acc aca tgg acc cac ggc 1230Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Thr Trp Thr His Gly345 350 355 360gac cac tac cac gcg ccc aat agc gac ctg ggc ccc atg cac gta cac 1278Asp His Tyr His Ala Pro Asn Ser Asp Leu Gly Pro Met His Val His365 370 375gag agc aag ttc cgg aag tgg tct gcc ggg tac gcg gac ttc gac cgc 1326Glu Ser Lys Phe Arg Lys Trp Ser Ala Gly Tyr Ala Asp Phe Asp Arg380 385 390gga gcc tac gtg atc acg ttc ata ccc aag agc tgg aac acc gcc ccc 1374Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro395 400 405gcc aag gtg gag caa ggc tgg ccg tgacaggctg gtactacgac ctctgctgat 1428Ala Lys Val Glu Gln Gly Trp Pro410 415ttctgcccgg tcagtccacg cctctcgacg cga 1461<210>2<211>416<212>PRT<213>肉桂鏈輪絲菌(Streptoverticillium cinnamoneum)<400>2Met His Lys Arg Arg Arg Leu Leu Ala Phe Ala Thr Val Gly Ala Val1 5 10 15Ile Cys Thr Ala Gly Phe Thr Pro Ser Val Ser Gln Ala Ala Ser Ser20 25 30Gly Asp Gly Glu Glu Lys Gly Ser Tyr Ala Glu Thr His Gly Leu Thr35 40 45Ala Asp Asp Val Glu Ser Ile Asn Ala Leu Asn Glu Arg Ala Leu Thr50 55 60Leu Gly Gln Pro Gly Lys Pro Pro Lys Glu Leu Pro Pro Ser Ala Ser65 70 75 80Ala Pro Ser Arg Ala Pro Ser Asp Asp Arg Glu Thr Pro Pro Ala Glu85 90 95Pro Leu Asp Arg Met Pro Glu Ala Tyr Arg Ala Tyr Gly Gly Arg Ala100 105 110Thr Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser115 120 125His Arg Asp Gly Lys Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Lys
130 135 140Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Pro Tyr145 150 155 160Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asn Lys Tyr Lys165 170 175Asn Asp Leu Lys Asn Thr Ser Pro Arg Pro Asp Glu Thr Arg Ala Glu180 185 190Phe Glu Gly Arg Ile Ala Lys Gly Ser Phe Asp Glu Gly Lys Gly Phe195 200 205Lys Arg Ala Arg Asp Val Ala Ser Val Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn210 215 220Ala His Asp Glu Gly Thr Tyr Ile Asn Asn Leu Lys Thr Glu Leu Thr225 230 235 240Asn Asn Asn Asp Ala Leu Leu Arg Glu Asp Ser Arg Ser Asn Phe Tyr245 250 255Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asp Gly Gly Asn260 265270Tyr Asp Pro Ser Lys Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp275 280285Ser Gly Gln Asp Gln Arg Gly Ser Ser Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp290 295 300Pro Glu Ala Phe Arg Pro Asp Gln Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser305 310 315 320Lys Asp Arg Ser Ile Pro Arg Ser Pro Ala Lys Pro Gly Glu Gly Trp325 330 335Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala340 345 350Asp Lys Thr Thr Trp Thr His Gly Asp His Tyr His Ala Pro Asn Ser355 360 365Asp Leu Gly Pro Met His Val His Glu Ser Lys Phe Arg Lys Trp Ser370 375380Ala Gly Tyr Ala Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile385 390 395 400Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Ala Lys Val Glu Gln Gly Trp Pro405 410 415<210>3<211>1809<212>DNA<213>茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobaraense)<220><221>CDS<222>(578)..(1798)<400>3gtcgacgcgg gccgggaggg ggtgcggcgg cgcccttcgg ctgtgtggac gaagcgtcgg 60gtcggagggg cggccggata tcgtccttgg ggcggggtgg ccggaattgc cgccatggtg 120ttgccgggga atcgacccga agacatgatc acttctcgta tccacccgat cacgtatccg 180ggagtcgaga agtgttacgc cgtgcccctg tccgcgtcct cacccctgtc gccgtgacag 240cgacccgcgt tcttccactc gcacggacgg ccccacagga cctttcggcc cgggctcgcc 300ccgccgcctc ggtgacggcc tccgaataac gcggccgccg gggcctcggc cggttgaccg 360atccgggtca cgcgccccgc cgggcgggcg gccacgtccg gtctcgcccc gcccgacatc 420ggctgcgact gccttcgctc gcacttcttc ccgcctcccg gccgcgtttt tccgccgccg 480aaggtgcggc gacgcgtacc gaatccccct tcatcgcgac gtgcttccgc acggccgcgt 540tcaacgatgt tccacgacaa aggagttgca ggtttcc atg cgc ata cgc cgg aga 595Met Arg Ile Arg Arg Arg1 5gct ctc gtc ttc gcc act atg agt gcg gtg tta tgc acc gcc gga ttc 643Ala Leu Val Phe Ala Thr Met Ser Ala Val Leu Cys Thr Ala Gly Phe10 15 20atg ccg tcg gcc ggc gag gcc gcc gcc gac aat ggc gcg ggg gaa gag 691Met Pro Ser Ala Gly Glu Ala Ala Ala Asp Asn Gly Ala Gly Glu Glu25 30 35acg aag tcc tac gcc gaa acc tac cgc ctc acg gcg gat gac gtc gcg 739Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Thr Tyr Arg Leu Thr Ala Asp Asp Val Ala40 45 50aac atc aac gcg ctc aac gaa agc gct ccg gcc gct tcg agc gcc ggc 787Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ser Ala Gly55 60 65 70ccg tcg ttc cgg gcc ccc gac tcc gac gac agg gtc acc cct ccc gcc 835Pro Ser Phe Arg Ala Pro Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala75 80 85gag ccg ctc gac agg atg ccc gac ccg tac cgt ccc tcg tac ggc agg 883Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg90 95 100gcc gag acg gtc gtc aac aac tac ata cgc aag tgg cag cag gtc tac 931Ala Glu Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr105 110 115agc cac cgc gac ggc agg aag cag cag atg acc gag gag cag cgg gag 979Ser His Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu120 125 130tgg ctg tcc tac ggc tgc gtc ggt gtc acc tgg gtc aat tcg ggt cag 1027Trp Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln135 140 145 150tac ccg acg aac aga ctg gcc ttc gcg tcc ttc gac gag gac agg ttc 1075Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe155 160 165aag aac gag ctg aag aac ggc agg ccc cgg tcc ggc gag acg cgg gcg 1123Lys Asn Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala170 175 180gag ttc gag ggc cgc gtc gcg aag gag agc ttc gac gag gag aag ggc 1171Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly185 190 195ttc cag cgg gcg cgt gag gtg gcg tcc gtc atg aac agg gcc ctg gag 1219Phe Gln Arg Ala Arg Glu Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu200 205 210aac gcc cac gac gag agc gct tac ctc gac aac ctc aag aag gaa ctg 1267Asn Ala His Asp Glu Ser Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu215 220 225 230gcg aac ggc aac gac gcc ctg cgc aac gag gac gcc cgt tcc ccg ttc 1315Ala Asn Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe
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340 345 350His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met His Val Tyr Glu355 360 365Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg Gly370 375 380Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Asp385 390 395 400Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro405<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述用于擴增源自肉桂鏈輪絲菌的轉谷氨酰胺酶基因的PCR引物<400>5tccgatgacc gggaaactcc tcccgccgag 30<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述用于擴增源自肉桂鏈輪絲菌的轉谷氨酰胺酶基因的PCR引物<400>6cggccagcct tgctccacct tggcgggggc 30<210>7<211>10<212>PRT<213>肉桂鏈輪絲菌(Streptoverticillium cinnamoneum)<400>7Gly Asp Gly Glu Glu Lys Gly Ser Tyr Ala1 5 10
權利要求
1.一種鏈霉菌屬細菌，其特征在于，該細菌導入了含有源自放線菌的轉谷氨酰胺酶基因序列以及調控該轉谷氨酰胺酶基因表達的啟動子序列的基因構建物。
2.權利要求1所述的鏈霉菌屬細菌，其中，放線菌是肉桂鏈輪絲菌(Streptoverticillium cinnamoneum)。
3.權利要求1或2所述的鏈霉菌屬細菌，其中，該細菌是淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)。
4.一種轉谷氨酰胺酶原的制備方法，其特征在于，培養 1～3任一項所述的鏈霉菌屬細菌，使源自放線菌的轉谷氨酰胺酶原分泌到培養基中。
5.一種成熟型轉谷氨酰胺酶的制備方法，其特征在于，培養權利要求1～3任一項所述的鏈霉菌屬細菌，使源自放線菌的轉谷氨酰胺酶原分泌到培養基中，然后由源自上述鏈霉菌屬細菌的蛋白酶切去上述轉谷氨酰胺酶原的前體結構部分，并回收源自放線菌的成熟型轉谷氨酰胺酶。
6.權利要求4所述的方法，其中，轉谷氨酰胺酶原具有序列號2的第33位甘氨酸殘基到第416位脯氨酸殘基的氨基酸序列。
7.權利要求5所述的方法，其中，成熟型轉谷氨酰胺酶具有序列號2的第87位絲氨酸殘基到第416位脯氨酸殘基的氨基酸序列。
全文摘要
本發明涉及利用微生物分泌生產轉谷氨酰胺酶的方法。本發明還涉及大量制備轉谷氨酰胺酶的方法,該方法的特征在于,通過培養用含有源自放線菌的轉谷氨酰胺酶基因以及該基因原有的(天然的)啟動子的表達質粒轉化的鏈霉菌屬細菌,在培養初期至中期使轉谷氨酰胺酶原分泌,在培養后期由源自鏈霉菌屬細菌的蛋白酶等切去前體結構部分,獲得成熟型(活性型)的轉谷氨酰胺酶。
文檔編號C12N15/54GK1379812SQ00814437
公開日2002年11月13日 申請日期2000年10月13日 優先權日1999年10月18日
發明者田口精一, 百瀨春生 申請人:味之素株式會社