穩定型轉谷氨酰胺酶及其制造法的制作方法

專利名稱：穩定型轉谷氨酰胺酶及其制造法的制作方法
技術領域：
本發明涉及轉谷氨酰胺酶。更詳細為涉及具有優良的氧化穩定性、溫度穩定性等 的穩定型轉谷氨酰胺酶。
背景技術：
轉谷氨酰胺酶是催化存在于肽鏈內的谷氨酰胺殘基的Y-羧基酰胺基的酰基轉 移反應的酶，蛋白質中的賴氨酸殘基氨基作為酰基受體起作用時，在蛋白質分子的分 子內或者分子間形成ε-(Y-Gin)-Lys交聯鍵。所以，如果利用轉谷氨酰胺酶的作用就能 進行蛋白質或肽的改性，因此，使用了源自鏈霉菌屬微生物酶的轉谷氨酰胺酶(參照專利 文獻1)被使用于粘結肉、香腸、豆腐、面包、面類的制造中。轉谷氨酰胺酶是以發酵過程中經Pro體轉換為成熟型的半胱氨酸為活性中心殘 基的硫醇酶，所以穩定性差，為抑制制造工序中或者制品的保存中發生失活而需要添加穩 定劑。作為用于改善轉谷氨酰胺酶保存中的穩定性的方法，已提出添加有機酸、無機酸、 多酚、硫醇、糖醇等的技術(專利文獻1)。另外，還開發出添加蛋白質(小麥蛋白質、大豆蛋 白質等)、蛋白質部分水解物而提高穩定性的方法(專利文獻2)。而且，也開發了利用海藻 糖進行穩定化的技術(專利文獻3)。專利文獻1 特開平4-207194號公報專利文獻2 專利第3651003號公報專利文獻3 特開2004-305010號公報

發明內容
到目前為止雖然已提出各種穩定化技術，但對轉谷氨酰胺酶進行穩定化的需求仍 然很高。如上所述，在食品領域中廣泛利用轉谷氨酰胺酶。所以，為了避免意外事態，要求 盡量不添加多余成分。在以上的背景下，本發明以提供具有優良的穩定性的轉谷氨酰胺酶、其制造法、及 其用途為課題。本發明人等鑒于以上的課題進行了銳意的研究。其結果，確認轉谷氨酰胺酶生產 菌的培養液中存在轉谷氨酰胺酶中間體，并成功地對其進行了回收。繼續探討的結果發現， 回收的中間體是Pro序列肽與成熟型轉谷氨酰胺酶(成熟型TGase)相結合的物質。另一 方面，對中間體的穩定性進行評價的結果，發現PH穩定性、溫度穩定性、氧化穩定性以及保 存穩定性均超出成熟型TGase。本發明是基于以上的認識下完成的，其內容如下。[1] 一種穩定型轉谷氨酰胺酶，由轉谷氨酰胺酶的Pro序列肽與成熟型轉谷氨酰 胺酶結合了的結構構成。[2]根據[1]所述的穩定型轉谷氨酰胺酶，成熟型轉谷氨酰胺酶為源自微生物。
[3]根據[2]所述的穩定型轉谷氨酰胺酶，微生物為鏈霉菌(str印tomyces)屬微 生物。[4]根據[2]所述的穩定型轉谷氨酰胺酶，微生物為茂原鏈霉菌(Str印tomyces mobaraensis)0[5]根據[1]所述的穩定型轉谷氨酰胺酶，成熟型轉谷氨酰胺酶具有序列號6所示 的氨基酸序列。[6]根據[1]所述的穩定型轉谷氨酰胺酶，Pro序列肽為源自微生物。[7]根據[6]所述的穩定型轉谷氨酰胺酶，微生物為鏈霉菌屬微生物。[8]根據[6]所述的穩定型轉谷氨酰胺酶，微生物為茂原鏈霉菌。[9]根據[1]所述的穩定型轉谷氨酰胺酶，Pro序列肽具有以下⑴ ⑶中的任 一序列(1)DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAA(序列號 1)；(2)DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAAS(序列號 2)；(3) DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAASS (序列號 3)。[10]根據[1] [9]中任一項所述的穩定型轉谷氨酰胺酶，與未結合轉谷氨酰胺 酶的Pro序列肽的成熟型轉谷氨酰胺酶相比，選自pH穩定性、溫度穩定性、氧化穩定性以及 保存穩定性中的一個以上的穩定性高。[11] 一種酶制劑，含有[1] [10]中任一項所述的穩定型轉谷氨酰胺酶。[12] 一種穩定型轉谷氨酰胺酶的制造法，包含在產生轉谷氨酰胺酶的條件下培養具有轉谷氨酰胺酶產生能力的微生物的步 驟；從培養液分離、回收結合了 Pro序列肽的成熟型轉谷氨酰胺酶的步驟。[13]根據[12]所述的穩定型轉谷氨酰胺酶的制造法，微生物為鏈霉菌屬微生物。[14]根據[12]所述的穩定型轉谷氨酰胺酶的制造法，微生物為茂原鏈霉菌。


圖1為穩定型TGase (P-TGase)與成熟型TGase (M-TGase)的pH穩定性的對比。橫 軸為PH、縱軸為殘存活性(％)。圖2為穩定型TGase (P-TGase)與成熟型TGase (M-TGase)的溫度穩定性的對比。 橫軸為處理時間(分)、縱軸為殘存活性(％ )。圖3為穩定型TGase (P-TGase)與成熟型TGase (M-TGase)的氧化穩定性的對比。 橫軸為過氧化氫濃度(％ )、縱軸為殘存活性(％ )。圖4為穩定型TGase (P-TGase)與成熟型TGase (M-TGase)的保存穩定性的對比。 橫軸為保存期間(月)、縱軸為殘存活性(％ )。圖5為穩定型TGase (P-TGase)與成熟型TGase (M-TGase)的溫度穩定性的對比。 橫軸為處理時間(分)、縱軸為殘存活性(％ )。圖6為穩定型TGase (P-TGase)與成熟型TGase (M-TGase)的氧化穩定性的對比。 橫軸為過氧化氫濃度(％ )、縱軸為殘存活性(％ )。圖7為穩定型TGase (P-TGase)與成熟型TGase (M-TGase)的溫度穩定性的對比。
4橫軸為處理時間(分)、縱軸為殘存活性(％ )。
具體實施例方式(穩定型 TGase)本發明的穩定型轉谷氨酰胺酶(穩定型TGase)具有轉谷氨酰胺酶的Pro序列肽 與成熟型TGase結合了的結構。即，必須的構成要素為轉谷氨酰胺酶的Pro序列肽和成熟型 TGase,以這些要素相結合為特征。由于該特征，本發明的穩定型TGase呈高于成熟型TGase 的穩定性。本說明書中用語“穩定性”是作為包括了 PH穩定性、溫度穩定性、氧化穩定性、保 存穩定性的表述而被使用。所以，本發明的穩定型TGase是其選自pH穩定性、溫度穩定性、 氧化穩定性以及保存穩定性中的一個以上的穩定性優于成熟型TGase。優選方式的穩定型 TGase的pH穩定性、溫度穩定性、氧化穩定性、以及保存穩定性均優于成熟型TGase。然而，屬于分泌型蛋白質的轉谷氨酰胺酶，作為連接有信號序列(Pre序列)以及 Pro序列的PrePro型轉谷氨酰胺酶被翻譯之后，信號序列被切斷轉換為Pro型轉谷氨酰胺 酶，接著Pro序列被切斷，變為成熟型轉谷氨酰胺酶(成熟型TGase)。如后述的實施例所示， 本發明人等發現了在該一系列的過程中存在結構為被切斷的Pro序列肽結合于成熟型轉 谷氨酰胺酶的中間體，并且明確了其具有優良的穩定性。本發明的穩定型TGase典型的是 作為在上述的過程中生成的中間體而獲得，但只要是具有Pro序列肽結合于成熟型TGase 的結構、且穩定性高于成熟型TGase就對其制造法(獲取法)沒有特別的限定。所以，即使 分別準備Pro序列肽和成熟型TGase，使兩者結合的所得物，只要能確認穩定性的提高也屬 于本發明的穩定型TGase。本說明書中“Pro序列肽”是指構成Pro序列(即，存在于Pre序列和成熟型蛋白 質序列之間的序列)的肽的一部分或全部。以下作為Pro序列肽的例子示出了 3種肽。Pro序列肽的例1 由 DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAA(序列號 1)序列構成的肽Pro序列肽的例2 由 DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAAS (序列號 2)序列構成的肽Pro序列肽的例3 由 DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAASS (序列號 3)序列構成的肽對Pro序列肽的來源(起源)沒有特別的限定。優選的是Pro序列肽為源自微生 物。“源自微生物Pro序列肽”除了鏈霉菌屬等的微生物產生的轉谷氨酰胺酶(例如參照特 開昭64-27471號公報)的Pro序列肽之外，還包括由該Pro序列肽(即，微生物產生的轉 谷氨酰胺酶的Pro序列的一部分或全長)同源的氨基酸序列構成的肽。在序列號4(茂原 鏈霉菌)、序列號5 (肉桂色鏈霉菌(Str印tomyces cinnamoneus))中表示微生物產生的轉 谷氨酰胺酶的Pro序列全長氨基酸序列的例子。對于本發明的穩定型TGase構成要素之一的成熟型TGase的來源(起源)也沒 有特別限定。例如，可以使用鏈霉菌屬等的微生物產生的成熟型TGase(例如參照特開昭 64-27471號公報)、哺乳動物產生的成熟型TGase (例如參照特公平1-50382號公報)、利用 重組DNA技術所得的重組(Recombinant)成熟型TGase (例如特開平5-199883號公報、特開 2004-97099號公報)等。優選成熟型TGase是源自微生物。“源自微生物的成熟型TGase”除了鏈霉菌屬等的微生物產生的天然型成熟型TGase (例如參照特開昭64-27471號公報) 之外還包含對導入了微生物產生的轉谷氨酰胺酶基因的轉化體進行培養而得到的重組成 熟型TGase。序列號6 (茂原鏈霉菌)、序列號7 (肉桂色鏈霉菌)表示源自微生物的成熟型 TGase的氨基酸序列的例子。作為Pro序列肽和/或成熟型TGase的來源的微生物優選為屬于鏈霉 菌(Sti^ptomyces)屬的微生物。作為屬于鏈霉菌屬的微生物可舉出茂原鏈霉菌 (Streptomyces mobaraensis)(舊茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobaraense)) No. 140226 株(特開 2005-73628 號公報)、淡紫灰鏈霉菌(Streptomyces lavendulae) No. 466 (參照專利第2849773號說明書、專利文獻1)、鏈霉菌(Streptomyces sp. )No. 83 (參 照專利第2849773號說明書、專利文獻1)等。另外，還可以使用通過紫外線照射、NTG(N-me thyl-N’-nitrosoguanidine)等的一般法提高了生產率、或減少了蛋白酶、淀粉酶等的雜蛋 白的生成、或抑制或缺失抗生素等生理活性物質的突變株，而且可以使用基因重組菌等。利用重組DNA技術時(即，使用基因重組菌時)，可以得到Pro序列肽的來源和成 熟型TGase的來源不同的穩定型TGase。但是優選Pro序列肽的來源和成熟型TGase的來 源相同。這種方式的穩定型TGase，典型的是通過培養轉谷氨酰胺酶生產菌(自身具有生產 性的菌或導入了轉谷氨酰胺酶基因的重組菌)而以中間體獲得。下面，對該方式的穩定型 TGase的制造法的一例進行說明。(穩定型TGase的制造法)首先，準備具有轉谷氨酰胺酶產生能力的鏈霉菌屬微生物(例如茂原鏈霉菌 No. 140226株)，在產生轉谷氨酰胺酶的條件下進行培養。只要能產生轉谷氨酰胺酶就對培 養條件沒有特別限定。培養條件的具體例示于后述的實施例。本領域技術人員可根據需要 適當地改變培養條件。培養基中可以使用淀粉、蔗糖、乳糖、甘油、葡萄糖等的碳源，胨、肉提取物、酵母提 取物、玉米漿、硝酸銨、氯化銨、硫酸銨等的氮源，磷酸一鉀、磷酸二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、炭酸 鈣等的微量金屬鹽等通常使用的培養基原料。另外，為了抑制發泡可根據需要進行消泡劑 的添加。培養溫度通常為25°C 35°C。另外，使用各種發酵容器進行培養即可，通常進行2 天 6天的通氣攪拌。可根據所使用菌株的種類、發酵培養基進行，可不必依照該條件。例 如，對培養基原料進行送料(”一于)V )，或者含高濃度的培養基原料時，通常培養時 間會變得更長。另外，可根據需要進行培養基的PH控制。通過過濾或者離心分離，從培養結束后的發酵混合物去除菌體等。作為過濾優選 添加硅藻土的加壓過濾，并且優選在室溫以下的條件下實施。根據需要冷卻所得濾液，即轉 谷氨酰胺酶粗酶液。其中，如Eur，· J，Biochem.，257，570-576 (1998)所記載，已知轉谷氨 酰胺酶是作為前體而被生產，為了變換成穩定型TGase而可以向發酵混合物添加蛋白酶或 肽酶等的酶，進行一定時間的處理。另外，已知轉谷氨酰胺酶的一部分也以不具有酶活性的 氧化型存在，所以優選添加半胱氨酸、谷胱甘肽、或者含這些的物質，使其變換為活性型。其 中，這些活化操作并非限定于純化工序的階段進行，但優選在純化的早期階段進行。根據需要濃縮粗酶液。對濃縮方法沒有特別限定，優選利用能夠同時進行濃縮和 純化的超濾。通常可將濃縮進行至10倍 100倍左右。其中，只要能濃縮到可以進行接下 來的工序的濃度就對濃縮的程度沒有特別要求。其中，作為超濾膜，考慮到TGase的分子量(約38000)，優選使用具有其以下的膜，例如使用具有分子量13000的平均孔徑的旭化成工 業制ACP-13000等。不過，即使使用具有分子量50000的孔徑的膜也基本不會漏掉酶，所以 能夠通過根據需要選擇膜而提高純化度。脫鹽濃縮中有時生成沉淀，但可以通過添加適當 的緩沖液或者鹽類溶液等而使其溶解。另外，對濃縮時的溫度沒有特別的限定，優選10°C 30°C。雖然溫度越高越能有效地實施濃縮，但其反面是有可能發生失活。濃縮液中含有目標穩定型TGase(結合了 Pro序列肽的成熟型TGase)和成熟型 TGase0所以從濃縮液回收目標穩定型TGase。下面，對穩定型TGase的回收法的一例進行 說明。首先，為了去除雜蛋白質等，通過使用了乙醇、聚乙二醇等的前處理而將濃縮液部分 純化。將經該前處理回收的沉淀溶解于適當的緩沖液之后，提供于透析。透析后，添加硫酸 銨、氯化鈉等的鹽類進行鹽析。由此沉淀成熟型TGase。回收上清之后，利用鹽析、柱層析、 離心分離等分離、純化上清中的穩定型TGase。根據需要進行脫鹽、濃縮等。(含有穩定型TGase的酶制劑)可以使用穩定型TGase構成酶制劑。本發明的酶制劑的形狀沒有特別的限定，例 如為粉末狀、顆粒狀、液體狀、膠囊狀等。本發明的酶制劑含有穩定型TGase作為必須的有 效成分。其他的成分為任意。作為本發明的酶制劑可以含有的成分可例示食品用賦形劑、 各種蛋白質、各種蛋白質的分解物、各種提取物類、各種鹽類、各種抗氧化劑、半胱氨酸、谷 胱甘肽、谷氨酸鈉、肌苷酸鈉、鳥苷酸鈉、貝殼煅燒鈣、二氧化硅。其中，食品用賦形劑的例子 有糊精、支化糊精、環糊精、葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、麥芽糖醇、甘露醇、山梨糖醇、多糖 類、淀粉(馬鈴薯淀粉、玉米淀粉)、難消化性糊精、橡膠類、乳化劑(蔗糖脂肪酸酯、卵磷脂 等)、膠質、油脂。蛋白質的例子為大豆蛋白質、小麥蛋白質、玉米蛋白質、乳蛋白質、動物來 源蛋白質等。提取物類的例子有肉提取物、植物提取物、酵母提取物等。鹽類的例子有氯化 鹽、磷酸鹽、聚磷酸鹽、焦磷酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、碳酸鹽等。抗氧化劑的例子為L-抗壞 血酸鹽、亞硫酸氫鈉等。實施例1.穩定型TGase的純化使用含2%的可溶性淀粉、5%的蔗糖、2%的聚胨、0. 2%的酵母提取物、0. 的硫 酸鎂、0.2%的磷酸二鉀、0. 05%的Adecanol的培養基，將作為轉谷氨酰胺酶生產菌的茂原 鏈霉菌(Sti^ptomycesmobaraensis)No. 140226 ^ (參照特開 2OO5-73628 號公報)在 30°C 下進行2天的振蕩培養，得到了 4000mL的粗酶液。其中，只要不是特別說明，％是指重量％ (以下的各實施例中亦然)。接著，以超濾膜(旭化成社制ACP1010)將粗酶液脫鹽、濃縮，得到200mL的濃縮 液。向濃縮液以最終成為1/10濃度的方式添加、混合McIlvaine緩沖液(pH6. 0)之后，以 冷乙醇50%進行了分餾。將回收的沉淀溶解于含0. IM氯化鈉的1/10濃度的Mcllvaine緩 沖液(pH6.0)之后，提供于透析。接著，以達到飽和濃度的方式向透析液添加氯化鈉，在低 溫下靜置3天后，回收了上清。沉淀為成熟型TGase (M-TGase)的結晶，經利用飽和食鹽溶液 的重結晶化而獲得M-TGase純化酶。M-TGase純化酶的比活性(u/Abs280nm)為19. 1。其 中，序列號6表示M-TGase的氨基酸序列。另一方面，以達到飽和濃度的方式向回收的上清添加硫酸銨，回收了沉淀。將回收 的沉淀溶解于20mM的磷酸緩沖液(KPB ；pH7. 2)中之后，以該緩沖液進行了透析。接著，以
7成為1. 7M的方式向透析液添加硫酸銨，提供于以含1. 7M硫酸銨的20mM磷酸緩沖液(KPB ； pH7. 2)進行了平衡化的Phenyl-S印harose 6Fast Flow0以硫酸銨濃度1. 7M進行洗凈后， 以硫酸銨濃度1. OM進行了洗脫。本洗脫餾分中洗脫出了目標穩定型TGase (P-TGase)。如此 得到的P-TGase的比活性(u/Abs280nm)為7.9。對添加了 SDS (十二烷基硫酸鈉)的情況 和未添加的情況的凝膠過濾(S印hacryl S-100)洗脫圖譜進行比較，結果判明了 P-TGase 具有在成熟型TGase上結合有Pro序列肽的結構。轉谷氨酰胺酶的活性的測定是根據特開昭64-27471號公報所記載的方法進行 的。S卩，以芐氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸和羥基胺為底物在不存在Ca2+下進行反應，將生成的 異羥肟酸在三氯乙酸共存條件下形成鐵配合物，測定525nm的吸收，由標準曲線求出異羥 肟酸的量，計算轉谷氨酰胺酶活性。下面，詳細說明測定法。首先，準備以下的試劑A以及 B0試劑A 0. 2M TRIS-鹽酸緩沖液(ρΗ6. 0)、0. IM羥基胺、0. OlM還原型谷胱甘肽、
0. 03M芐氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸試劑B :3N 鹽酸、12%三氯乙酸、5% FeCl3 ·6Η20(溶解于 0. 1N-HC1)的 1 1 1 的混合液向酶液0. 05mL添加0. 5mL的試劑A混合后，37°C下反應10分鐘。添加試劑B停 止反應并形成Fe配合物之后測定525nm的吸光度。作為對照，使用預先熱失活的酶液同樣 進行反應而測定其吸光度，求出與酶液的吸光度差。另行代替酶液使用L-谷氨酸-γ-單 異羥肟酸制作標準曲線，由上述吸光度差求出所生成的異羥肟酸的量。以1分鐘生成1 μ 摩爾的異羥肟酸的酶活性作為1單位。只要沒有特別說明，以下的各試驗中也通過該測定 法測定了轉谷氨酰胺酶的活性。2. Pro序列肽的純化向1.中得到的P-TGase溶液1. 8mL添加、溶解5. Omg的碳酸鈉之后，混合10% (w/ ν)的SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液0. 2mL，37°C下處理30分鐘。將2. OmL的處理液提供于以 含0. 1 % SDS的20mM KPB (pH7. 2)進行平衡化的S印hacryl S-100 (柱體積160mL)。監測吸 光度280nm，回收流動相量123mL附近觀察到的峰。使用Amicon Ultra(Ultracel_5K)，在 4°C的條件下對回收的溶液進行了離心濃縮。得到的濃縮液(樣品)提供于N末端氨基酸 測序以及質量分析。從N末端氨基酸分析的結果明確了肽的N末端為DNGAGEETKS。另一方 面，質量分析的結果觀測到了 m/z (1)3623. 938、(2)3640.903、(3)3710. 780、(4)3727.845、 (5) 3813. 735的5個峰。認為(1)和(3)分別為(2)和(4)的脫酰胺體。從N末端氨基酸 測序的結果和質量分析的結果，將其他的3峰的氨基酸序列鑒定為，(l)DNGAGEETKSYAETYR LTADDVANINALNESAPAA(序列號 1)、(2) DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAAS (序列號 2)、(3)DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAASS(序列號 3)。而且，這些序列相當于 Pro 序列全長(序列號4)的一部分。3. P-TGase的穩定性試驗1對比了 P-TGase和Μ-TGase的pH穩定性。pH2 4時使用檸檬酸-鹽酸緩沖液、 pH4 11時使用伯瑞坦-羅比森(Britton-Robinson)緩沖液調制各酶稀釋液，進行50°C、1 小時的處理之后，測定了轉谷氨酰胺酶活性。其結果，相對于P-TGase在pH4時也具有93% 的殘存活性，同條件下的M-TGase的殘存活性為2% (圖1)。這樣，P-TGase在酸性區域中顯示出高穩定性。另一方面，也對比了 P-TGase和Μ-TGase的溫度穩定性。用0. 2MTRIS-鹽酸緩沖 液(pH6.0)調制了各酶稀釋液，各溫度下熱處理之后，測定了轉谷氨酰胺酶活性。其結果， 50°C下處理80分鐘時的殘存活性是相對于M-Tgase為33%，P-Tgase為64% (圖2)。這 樣，P-TGase顯示出高于Μ-TGase的熱穩定性。4. P-TGase的穩定性試驗2為了評價溶液中的對氧化的穩定性(氧化失活的難度)，實施了抑制試驗(對過氧 化氫)。將過氧化氫水(試劑、30% (w/v))以適宜的0.2M TRIS-鹽酸緩沖液(pH6. 0)稀 釋后添加到酶溶液，37°C下處理30分鐘之后，測定了轉谷氨酰胺酶活性。處理濃度0. 03% (w/v)時的殘存活性是相對于M-TGase為3%, P-TGase % 54% (圖3)。這樣，P-TGase在 溶液中顯示出高氧化穩定性。5. P-TGase的穩定性試驗3評價了粉末狀態下的穩定性。通過凍結干燥分別對P-TGase和M-TGase進行了 粉末化。對M-TGase粉末混合糊精，以使每重量當中的轉谷氨酰胺酶活性與P-TGase粉末 相同。保存溫度為44°C。2個月后的殘存活性是相對于M-TGase為79% ,P-TGase為85% (圖4)。這樣，在粉末狀態時P-TGase顯示出高穩定性。6. P-TGase的純化(淡紫灰鏈霉菌No. 466)使用含2%的可溶性淀粉、5 %的蔗糖、2 %的聚胨、0. 2 %的酵母提取物、0. 1 %的 硫酸鎂、0.2%的磷酸二鉀、0. 05%的Adecanol的培養基，將作為轉谷氨酰胺酶生產菌的 淡紫灰鏈霉菌(Sti^ptomyceslavendulae)No. 466(參照專利第2849773號公報、特開平 4-207194號公報)，在30°C下進行3天的振蕩培養，得到了粗酶液1500mL。接著，利用超濾膜(旭化成社制ACP1010)濃縮粗酶液，得到了 300mL的濃縮液。 以80%飽和濃度硫酸銨鹽析濃縮液，回收了沉淀。將回收的沉淀溶解于20mM的磷酸緩沖液 (KPB ;pH7. 2)，并且在相同的緩沖液中進行了透析。從透析樣品去除不溶物，同樣將上清提 供于以20mM磷酸緩沖液(KPB ;pH7. 2)進行平衡化的Blue-S印harose 6Fast Flow。回收 以該緩沖液進行洗凈的餾分，用含1. 7M硫酸銨的20mM磷酸緩沖液(KPB ；pH6. 8)進行了透 析。將透析樣品提供于同樣以含1. 7M硫酸銨的20mM磷酸緩沖液(KPB ；pH6. 8)進行了平衡 化的 Phenyl-Sepharose 6Fast Flow.以同樣的緩沖液洗凈后，以硫酸銨濃度1. 7M OM的線性梯度進行洗 脫，結果在洗脫液硫酸銨濃度1. OM附近洗脫出了 P-TGase。并且，在洗脫液硫酸銨濃度0. 8M 附近洗脫出了 M-TGase。7. P-TGase (淡紫灰鏈霉菌No. 466)的穩定性試驗1還對P-TGase和Μ-TGase的溫度穩定性進行了對比。用0. 2M TRIS-鹽酸緩沖液 (pH6. 0)調制各酶稀釋液，各溫度下熱處理之后，測定了轉谷氨酰胺酶活性。其結果，50°C下 處理20分時的殘存活性是相對于M-TGase為12% ,P-TGase為29% (圖5)。這樣，源自淡 紫灰鏈霉菌No. 466株的P-TGase顯示出高于源自同株M-TGase的熱穩定性。8. P-TGase (淡紫灰鏈霉菌No. 466)的穩定性試驗2為評價溶液中的對氧化的穩定性(氧化失活難度)，實施了抑制試驗(對過氧化 氫)。將過氧化氫水(試劑、30% (w/v))以適宜的0.2M TRIS-鹽酸緩沖液(pH6. 0)稀釋后向酶溶液添加，37°C下處理15分鐘之后，測定了轉谷氨酰胺酶活性。處理濃度0.006% (w/ ν)時的殘存活性是相對于M-TGase為35%,P-TGase為62% (圖6)。這樣，源自淡紫灰鏈 霉菌No. 466株的P-TGase在溶液中顯示出高氧化穩定性。9. Pro型轉谷氨酰胺酶的調制使用含2%的可溶性淀粉、5%的蔗糖、2%的聚胨、0.2%的酵母提取物、0. 的 硫酸鎂、0.2%的磷酸二鉀、0. 05%的Adecanol的培養基，將作為轉谷氨酰胺酶生產菌的茂 原鏈霉菌(Sti^ptomycesmobaraensis)No. 140226 株(特開 2005-73628)，在 30°C 下進行 了 2天的振蕩培養，得到了粗酶液1500mL。將粗酶液利用超濾膜(旭化成社制ACP1010) 進行濃縮，獲得了 150mL的濃縮液。將濃縮液以基于文獻信息(Eur. J. Biochem. 257， 570-576(1998))的方法進行純化，得到了 Pro型轉谷氨酰胺酶。10. P-TGase的調制(利用蛋白酶處理的由Pro型轉谷氨酰胺酶的轉變)將Pro型轉谷氨酰胺酶溶液用含150mM氯化鈉的50mM Hepes緩沖液(pH7. 4)進 行透析而得到了透析樣品(Abs. 280nm = 1. 8)。向透析樣品以處理液終濃度成為0. 08u/mL 的方式添加Dispase II (ROCHE制)之后，30°C下進行60分鐘的處理調制了 P-TGase。反應 的停止是通過用含5mM EDTA的0. 2M TRIS-鹽酸緩沖液(pH6. 0)稀釋到下述“11. ”的使用 濃度為止而進行的。另一方面，下述“11. ”中使用的M-TGase也是使用了與P-TGase同樣 地進行了 DispaseII處理的樣品。11. P-TGase (蛋白酶處理品)的穩定性試驗還對P-TGase和Μ-TGase的溫度穩定性進行了對比。用0. 2M TRIS-鹽酸緩沖液 (pH6. 0)調制了各酶稀釋液，各溫度下熱處理之后，測定了轉谷氨酰胺酶活性。其結果，50°C 下處理60分鐘時的殘存活性是相對于M-TGase為41%，P-TGase為76% (圖7)。這樣，通 過蛋白酶處理得到的P-TGase也顯示出高于M-TGase的熱穩定性。由此，認為經蛋白酶處 理而得到的上述“10. ”的P-TGase與上述“1. ”的P-TGase屬于相同的物質。產業上的利用可能性本發明的穩定型轉谷氨酰胺酶與成熟型轉谷氨酰胺酶相比，在pH穩定性、溫度穩 定性等方面優異。本發明的穩定型轉谷氨酰胺酶的用途例子為粘結肉、香腸、豆腐、面包、面 類的制造。本發明并不受上述的發明的實施方式以及實施例的說明的任何限定。不脫離要求 保護的范圍所記載的、本領域技術人員能夠容易想到的范圍中的各種各樣的變形方式也包 括在本發明中。本說明書中所示的論文、公開專利公報、以及專利公報等的內容是通過援用而引 用了其全部內容。
權利要求
一種穩定型轉谷氨酰胺酶，由轉谷氨酰胺酶的Pro序列肽與成熟型轉谷氨酰胺酶結合了的結構構成。
2.根據權利要求1所述的穩定型轉谷氨酰胺酶，其中，成熟型轉谷氨酰胺酶為源自微 生物。
3.根據權利要求2所述的穩定型轉谷氨酰胺酶，其中，微生物為鏈霉菌屬微生物。
4.根據權利要求2所述的穩定型轉谷氨酰胺酶，其中，微生物為茂原鏈霉菌。
5.根據權利要求1所述的穩定型轉谷氨酰胺酶，其中，成熟型轉谷氨酰胺酶具有序列 號6所示的氨基酸序列。
6.根據權利要求1所述的穩定型轉谷氨酰胺酶，其中，Pro序列肽為源自微生物。
7.根據權利要求6所述的穩定型轉谷氨酰胺酶，其中，微生物為鏈霉菌屬微生物。
8.根據權利要求6所述的穩定型轉谷氨酰胺酶，其中，微生物為茂原鏈霉菌。
9.根據權利要求1所述的穩定型轉谷氨酰胺酶，其中Pro序列肽具有以下的(1) (3) 中的任一個序列(1)DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAA(序列號1)；(2)DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAAS(序列號2)；(3)DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAASS(序列號3)。
10.根據權利要求1 9中任一項所述的穩定型轉谷氨酰胺酶，其中，與未結合轉谷氨 酰胺酶的Pro序列肽的成熟型轉谷氨酰胺酶相比，選自pH穩定性、溫度穩定性、氧化穩定性 和保存穩定性中的一個以上的穩定性高。
11.一種酶制劑，含有權利要求1 10中任一項所述的穩定型轉谷氨酰胺酶。
12.一種穩定型轉谷氨酰胺酶的制造法，包含在產生轉谷氨酰胺酶的條件下，培養具有轉谷氨酰胺酶產生能力的微生物的步驟； 從培養液分離、回收結合了 Pro序列肽的成熟型轉谷氨酰胺酶的步驟。
13.根據權利要求12所述的穩定型轉谷氨酰胺酶的制造法，其中，微生物為鏈霉菌屬 微生物。
14.根據權利要求12所述的穩定型轉谷氨酰胺酶的制造法，其中，微生物為茂原鏈霉菌。
全文摘要
本發明以提供具有優良的穩定性的轉谷氨酰胺酶及其制造法為課題。提供一種穩定型轉谷氨酰胺酶，其由轉谷氨酰胺酶的Pro序列肽與成熟型轉谷氨酰胺酶結合了的結構所構成。還提供一種穩定型轉谷氨酰胺酶的制造法，其包含在產生轉谷氨酰胺酶的條件下培養具有轉谷氨酰胺酶產生能力的微生物的步驟；從培養液分離、回收結合了Pro序列肽的成熟型轉谷氨酰胺酶的步驟。
文檔編號C12N9/10GK101945995SQ20098010464
公開日2011年1月12日 申請日期2009年1月22日 優先權日2008年2月13日
發明者岡田正通, 天野仁, 山口莊太郎, 黑野良明 申請人:天野酶株式會社