一種抗人組織轉谷氨酰胺酶2的單克隆抗體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種抗人組織轉谷氨酰胺酶2的單克隆抗體及其應用。本發明建立了一株大鼠雜交瘤細胞株，大鼠抗人組織轉谷氨酰胺酶2（tGM2）雜交瘤細胞XK-1，CCTCC NO:C201312。該雜交瘤細胞分泌產生一種抗人組織轉谷氨酰胺酶2(tGM2)的單克隆抗體,該單克隆抗體蛋白對組織轉谷氨酰胺酶2（tGM2）有特異抑制作用，能有效抑制小鼠tGM2的酶活性，恢復基質金屬蛋白酶（MMPs）的活性，具有治療肝纖維化的作用。CCTCC NO: C2013122013.01.14
【專利說明】一種抗人組織轉谷氨酰胺酶2的單克隆抗體及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種抗人組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)的單克隆抗體，還涉及一種抗人組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)的單克隆抗體在治療小鼠肝纖維化中的應用。
【背景技術】
[0002]肝硬化是一種常見的慢性肝病，是肝嚴重纖維化的結果，將導致肝功能的逐步喪失，其病因包括肝病毒感染，酒精濫用以及其他因素。肝纖維化也為腫瘤的發生提供了環境，它不僅能激活腫瘤細胞，也能促進腫瘤的轉移。2006年全國肝炎流性病學調查結果顯示，我國人群乙型肝炎表面抗原攜帶率為7.18%，估算約有4.57億人曾感染過乙肝病毒，其中9300萬人為HBsAg攜帶者，其肝硬化和肝癌的發生率很高。肝癌目前在中國癌癥死亡率上排名第二。我國每年因慢性肝病及肝硬化造成的經濟損失估計為5000億元人民幣。在美國大約有4百萬人患有慢性肝炎，并且肝癌的死亡率排名第八。每年因慢性肝病及肝硬化造成的經濟損失估計為16億美元。然而國際上有效治療肝纖維化的方法是缺乏的。針對這一嚴峻現狀，迫切需要研究和開發一種有效的治療肝纖維化的創新方法。
[0003]肝纖維化起源于肝細胞外基質(ECM)過多的的交叉連接，這種連接就造成了肝組織剛度的增加并且不可逆轉。在多個ECM交聯酶中，組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)已被發現是一個很重要的因子，出現在包括肝硬化在內的各種組織纖維化的發病機制中。為了對抗tGM2的活性，具有烷基化功能的小分子抑制劑已經被研發。然而，它們的烷基化功效和組織接觸性較差，妨礙了這些小分子抑制劑的治療應用。我們的研究數據表明，肝纖維化是出現在免疫耐受的狀態下。在此狀態下基質金屬蛋白酶(MMPs )的表達被抑制，免疫監視系統受損，組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)的表達及酶活性增加，最終導致纖維組織過度增生和腫瘤的生長。
[0004]已有的發現給我們一個啟示:如果能制備出一種單克隆抗體，既能抑制tGM2的酶活性，又能激活抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(ADCC)，恢復基質金屬蛋白酶在纖維化組織表面的表達和活性，將會大大促進纖維化的溶解和消退。基于這個理念，我們已成功地建立了一株抗人組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)的單克隆抗體。該抗體不僅能體外抑制人tGM2的酶活性，而且在小鼠模型中能恢復基質金屬酶(MMPs)的表達，降低肝纖維化的程度，已顯示出該抗體的治療功效。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是在于提供了一種抗人組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)的單克隆抗體，該單克隆抗體由大鼠抗人組織轉谷氨酰胺酶2(tGM2)雜交瘤細胞M-Ι分泌，所針對的靶標位點位于人組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)的酶活性位點內，在小鼠和人等多種物種間高度保守。該抗體顯示出高度的特異性，并能有效地抑制組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)的酶活性。
[0006]本發明還有一個目的是在于提供了一種大鼠抗人組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)雜交瘤細胞該雜交瘤細胞可分泌抗人組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)的單克隆抗體，該細胞已于2013年I月14日送至中國典型培養物保藏中心進行保藏，分類命名:大鼠抗人組織轉谷氨酰胺酶2(tGM2)雜交瘤細胞XK-1，保藏編號:CCTCC NO:C201312，地址:中國武漢武漢大學。
[0007]本發明最后一個目的是在于提供了一種用抗人轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)的單克隆抗體在制備治療小鼠肝纖維化藥物中的應用。
[0008]為了實現上述目的，本發明采用以下技術措施:
[0009]一、靶標抗原決定簇的設計和多肽的合成:
[0010]利用文獻檢索和蛋白質氨基酸序列分析， 申請人:在轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)的酶活性區域發現了一段高度保守的氨基酸序列，其序列為SEQ ID N0:1所示。該序列在小鼠、大鼠和人類之間高度保守。 申請人:按此序列進行了多肽的合成(由美國NeoB1lab公司合成)。多肽與載體蛋白匙孔血藍蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,簡稱KLH)進行偶聯(由美國NeoB1lab公司合成)，作為免疫原去免疫大鼠。
[0011]二、抗人組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)單克隆抗體的制備:
[0012]A、SD大鼠的免疫
[0013]用KLH-多肽偶聯蛋白作為抗原免疫3只年齡為12周的SD大鼠。250ug抗原溶解于無菌的磷酸緩沖液里，并且在50°C水浴鍋里加熱30分鐘，然后與福氏完全佐劑混和，制成均勻的油乳狀物，并將抗原油乳狀物注射于大鼠的腹腔。3周之后，用同樣的方法將抗原與福氏不完全佐劑混勻，并注射于大鼠的腹腔。再過3周，用同樣的方法將抗原與福氏不完全佐劑混勻，并注射于大鼠的腹腔。在最后一次免疫之后2周，通過眼球周邊采血和酶聯標記方法來確定KLH-多肽偶聯蛋白的免疫成功。
[0014]B、細胞融合
[0015]在確定免疫成功之后一個月，作加強免疫。將200ug KLH-多肽偶聯蛋白抗原經尾靜脈注射于陽性大鼠。2天后，另取非免疫大鼠，制備滋養層細胞。4天后，處死被免疫的大鼠，用無菌剪刀與鑷子取出脾臟，用PH7.4，0.1mol / L磷酸緩沖液洗去血液，用無菌的針頭在無菌培養皿中將脾臟扎成多孔，淋巴細胞被釋放于無血清的DMEM培養液里，最后用無血清的DMEM培養液制成細胞懸浮液，即為免疫大鼠脾淋巴細胞親本，備用。取2X 17個IR983F大鼠骨髓瘤細胞(購自上海都宜生物科技公司)與18個免疫大鼠脾淋巴細胞于50ml離心管中，混勻于無血清的DMEM培養液中，300g離心5分鐘，吸去上清液，重復2次。最后輕彈管底，使沉淀的細胞松動，于37度水浴中保溫，并于I分鐘內輕輕滴加Iml 50%PEG融合劑(Sigma公司)，同時輕輕彈動細胞60?90秒，然后于I分鐘內滴加2ml無血清DMEM培養液，隨后于2分鐘內加入20毫升無血清的DMEM的培養液。離心300g，5min,吸去上清液，然后再用含20%小牛血清的HAT-DMEM培養液稀釋至100ml，制成細胞懸浮液，以每孔10ul均勻分加于10塊96孔細胞培養板中。然后于37度，C02培養箱中培養12-15天。期間，更換HAT細胞培養液4次。培養后期，若培養孔中培養液出現淡黃色，在觀察確認有細胞克隆存在之后，可取出一部分培養液進行抗體檢測。
[0016]C、雜交瘤細胞的篩選:
[0017]用酶聯免疫標記的方法篩選抗體表達為陽性的雜交瘤細胞克隆。將合成的多肽抗原(非KLH偶聯的多肽)溶解于0.05M碳酸緩沖液(PH9.6)，濃度為10ug/ml，包被于96孔聚苯乙烯板，4°C過夜。用磷酸緩沖液(PBS )洗滌3次之后，用0.5%BSA溶液封閉96孔板，37 °C，I小時。待測雜交瘤培養上清加入96孔板，37°C，培育I小時，然后用磷酸緩沖液(PBS)洗滌3次，再加入過氧化物酶(HRP)偶聯的抗大鼠IgG的二抗(GE Healthcare公司)，37°C，培育30分鐘。用磷酸緩沖液(PBS) +0.1%吐溫(Tween-20)洗滌4次，用四甲基聯苯胺(TMB)顯色，經酶標儀定量測定，以確定產生抗多肽單抗的陽性孔。
[0018]經檢測確定為產生抗tGM2多肽抗體的陽性孔細胞，先轉移至24孔培養板培養擴增，用酶聯免疫標記的方法再次確認陽性的雜交瘤細胞克隆，然后轉移細胞至T25培養瓶中培養擴增。將陽性的雜交瘤細胞克隆凍存，同時挑選5個抗體表達水平最高的克隆進行再克隆，并經全面鑒定與分析，最后才能獲得抗tGM2多肽的單克隆雜交瘤細胞系，由此獲得了一株抗人tGM2的單克隆雜交瘤細胞，該細胞已于2013年I月14日送至中國典型培養物保藏中心進行保藏，分類命名:大鼠抗人組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)雜交瘤細胞》(-1，保藏編號=CCTCC N0:C201312，地址:中國武漢武漢大學。
[0019]該雜交瘤細胞與一般的雜交瘤細胞相似，屬于懸浮培養細胞，可在RPMI 1640，10%FBS培養基中培養，細胞周期約為17小時。雜交瘤細胞向培養基中分泌抗tGM2的單克隆抗體，抗體濃度可達到25pg/ml。
[0020]D、抗人組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)單克隆抗體的純化制備:
[0021]抗人tGM2的單克隆抗體可通過誘發腹水瘤進行生產，其過程如下:向健康的SD大鼠腹腔注射Iml降植烷(Pristane)，飼養2周后，向大鼠腹腔接種5 X 16個雜交瘤細胞，飼養9?11天后即可明顯產生腹水，待腹水量達到最大限度時，用毛細管抽取腹水，一般可得50ml左右。腹水經1000rpm/min離心1min,棄去上層脂肪層，收集中層腹水,_80°C保存備用。
[0022]抗人tGM2的單克隆抗體的分離純化:收集的腹水經生理鹽水4倍稀釋后，加入等體積的飽和硫酸銨溶液(PH=7.4)混合均勻，4°C沉淀I小時。然后8000rpm/min離心30分鐘。收集沉淀，并重新溶解于等體積的生理鹽水中，再加入飽和硫酸銨溶液(PH=7.4)，使其體積占總體積的45%,4°C沉淀I小時。經8000rpm/min離心30分鐘后,將沉淀重新溶解于適量的生理鹽水中，_20°C保存備用。
[0023]利用Amersham Pharmacia B1tech 公司的 protein G 親和層析柱(5ml, HiTrapprotein G HP)進行親和層析。上樣前，用20mM, pH=7.6的磷酸緩沖液平衡protein G親和層析柱。吸取2ml經飽和硫酸銨鹽析的樣品，緩慢上樣。待樣品完全進入層析柱后，用20mM，pH=7.6的磷酸緩沖液洗脫雜蛋白，流速為0.5ml/min。雜蛋白洗脫完之后，用10mM, pH=3.2的檸檬酸緩沖液洗脫抗體蛋白，流速為lml/min，每管收集1ml。每只收集管中預先加有100ul，pH=9.0的IM Tris-HCL緩沖液，用來中和洗脫液至pH=7.0。經UV_280nm檢測收集到的第二洗脫峰即為要純化的抗體蛋白。然后，經超濾，濃縮即得高濃度的抗tGM2的單克隆抗體。抗體純度經SDS-PAGE電泳鑒定，純度大于96%。
[0024]三、抗人組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)的單克隆抗體在制備治療小鼠肝纖維化藥物中的應用，其應用過程是:
[0025]A、小鼠肝纖維化模型的建立:
[0026]通過反復注射th1acetamide (TAA) (0.2mg/g體重,一周兩次,共注射8周)建立小鼠肝硬化模型。圖1，雙熒光免疫染色顯示，tGM2在小鼠正常肝臟里幾乎沒有表達，然而，在纖維化肝里，tGM2的表達明顯增加，并顯示出與纖維化的I型膠原橋梁相并存。更重要的是，小鼠肝硬化模型中tGM2在纖維化肝組織中的分布與在人肝硬化肝內的分布情況很相似(見圖1)。
[0027]B、抗人轉谷氨酰胺酶2的單克隆抗體在小鼠肝纖維化模型上的治療效果:
[0028]小鼠被重復注射TAA (0.2mg/g體重，2次/周，共8周)。8周之后，小鼠明顯地失去體重，肝纖維化癥狀出現。肝纖維化小鼠被分成兩組。第一組為實驗組(21只小鼠)，將被注射抗人tGM2的抗體，抗體的劑量分別是每只小鼠0.005暈克,0.02暈克或者0.1暈克，每種劑量注射7只小鼠。第二組為對照組(7只小鼠)，將被注射正常的大鼠IgG，劑量為0.1毫克。第三組為空白組(7只小鼠)，小鼠沒有經過TAA和抗體的注射。在最后一次TAA注射后兩天，經過腹腔注射抗tGM2的抗體或正常的大鼠IgG。5天之后，再注射一輪抗體。再過5天，小鼠被殺，治療效果被評估。
[0029]圖2A顯示了天狼星紅(Sirius Red)染色的結果，與對照組比較，肝纖維化結締在抗tGM2抗體治療組(0.1毫克)顯著減少。圖2B顯示，纖維化標志分子α-平滑肌肌動蛋白(α -SM)的表達也隨著抗tGM2抗體劑量的增加而減少。圖2C顯示，在對照組受抑制的MMP9的表達得到部分恢復,然而在實驗組抗tGM2的抗體的注射大大地增強MMP9的表達水平。這與小鼠肝纖維化的消退相一致。動物實驗表明，抗人組織轉谷氨酰胺酶的抗體蛋白作為藥物能有效抑制組織轉谷氨酰胺酶的酶活性，大大促進肝纖維化的消融，為治療人肝纖維化、肝硬化提供了新的途徑。
[0030]四、與現有技術相比，本發明具有以下優點:
[0031]目前國內治療肝纖維化的常用藥物包括秋水仙堿、干擾素、熊去氧膽酸等。秋水仙堿通過抑制微管蛋白聚合，干擾細胞的膠原分泌，刺激膠原酶的活性，增加膠原的降解，來減輕肝纖維化程度，但往往引起惡心、嘔吐、食欲降低、腹瀉、便秘和腹脹，有強的毒副作用。干擾素能抑制肝星狀細胞的激活、增殖，具有抗肝纖維化的作用，但會引起發熱，大藥量可致可逆性血細胞減少，以白細胞和血小板減少為主，紅細胞減少，藥量大毒副作用強。熊去氧膽酸在長時間用藥后肝纖維化改善程度不高。在國外，具有烷基化功能的抑制肝纖維化的小分子抑制劑已經被研發。然而，它們的烷基化功效和組織接觸性較差，妨礙了這些小分子抑制劑的治療應用。目前，臨床上需要更加理想更加安全、有效的的抗肝纖維化的新藥。人組織轉谷氨酰胺酶2(tGM2)在人肝纖維化的過程中，起了重要作用。抗人組織轉谷氨酰胺酶2的單克隆抗體，能特異地抑制人組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)的酶活性，作為大分子藥物，較常規藥物顯示出許多優異性:(1)首先是該單克隆抗體的靶向性，像導彈似的，能定向地擊中靶目標，特異性地結合人纖維化肝組織表面的轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)，抑制該酶的活性，阻止肝進一步纖維化，同時，該抗體對其他正常的人體組織器官有很少的結合，因而毒副作用小；(2)該抗體親和力強，小劑量的抗體就能發揮其療效，減少對人體組織器官的毒副作用；(3)通過抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(ADCC)，該抗體能將基質金屬蛋白酶(MMPs)聚集到纖維化肝的表面，直接溶解纖維化的細胞外介質，恢復肝的彈性和功能；
(4)作為大分子藥物,單克隆抗體的制備工藝已成熟,工藝便捷，生產成本可以很低，極具產業化價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0032]圖1為一種小鼠肝硬化模型的雙熒光法免疫染色示意圖。
[0033]雙熒光法免疫染色顯示，纖維化標志分子膠原蛋白I和組織轉谷氨酰胺酶2(tGM2)共存于小鼠肝纖維化部位。
[0034]圖2為一種抗人組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)單克隆抗體在小鼠肝纖維化模型上的治療效果示意圖。
[0035]抗人組織轉谷氨酰胺酶2的單克隆抗體，通過恢復基質金屬蛋白酶MMP9的活性，消減了小鼠肝纖維化。(A)天狼星紅(Sirius Red)染色的結果顯示，肝纖維化結締在抗人tGM2單克隆抗體的治療下顯著減少；(B)纖維化標志分子α -平滑肌肌動蛋白(a _SMA)的表達隨著抗體劑量的增加而減少；(C)抗人tGM2抗體的治療顯著增強MMP9的表達水平。
[0036]圖3為一種抗人組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)單克隆抗體對tGM2的酶活性抑制示意圖。
[0037]以人組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)的酶活性部位為靶標的大鼠單克隆抗體，在體外能有效地抑制其轉氨酶的活性。(A)抗人組織轉谷氨酰胺酶2的單克隆抗體有效地抑制了tGM2所催化的生物素化的多肽底物與多聚賴氨酸的交聯；(B)顯示了人tGM2的功能結構示意圖和酶活性位點，以及來自于酶活性位點的多肽抗原位點。
[0038]圖4為一種人組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)在肝硬化病人的肝樣本上的表達示意圖。
[0039]染色結果顯示，人組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)在肝硬化病人的肝纖維化部位有顯著性的過量表達。(A)免疫熒光染色顯示，人tGM2與纖維化標志分子α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)共存于人肝纖維化部位；(B)天狼星紅(Sirius Red)染色的結果；(C)顯示肝硬化組織中人組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)，α -平滑肌肌動蛋白(a -SMA)和膠原蛋白I的mRNA表達水平有顯著增加。
[0040]圖5為一種纖維化肝的免疫抑制和基質金屬蛋白酶缺失的示意圖
[0041]小鼠肝纖維化模型的研究結果顯示，在肝纖維化部位，基質金屬蛋白酶(MMPs)的表達受到到抑制，并出現免疫耐受。(A)在TAA處理后，正常肝的谷丙轉氨酶(ATL)水平增加6倍，但纖維化肝的ATL水平沒有顯著變化；(B)在急性損傷的條件下，與纖維化肝相比，正常肝受到的損傷程度更嚴重；(C)與正常肝相比，纖維化肝的膠原蛋白I mRNA的表達水平增高了 4倍；(D)在急性損傷后，正常肝的基質金屬蛋白酶MMP9的表達水平顯著增加，而在纖維化肝MMP9的表達水平沒有顯著變化；(E)和(F)在急性損傷后，正常肝的TNF- α和IL-1 β的表達水平都顯著增加，而在纖維化肝TNF-α和IL_1 β的表達水平沒有顯著變化。
【具體實施方式】
[0042]實施例1:多肽設計和合成
[0043]利用文獻檢索和蛋白質氨基酸序列分析軟件， 申請人:在組織轉谷氨酰胺酶2(tGM2)的酶活性區域發現了一段高度保守的氨基酸序列，其序列為SEQ ID N0.1所示。該序列在小鼠，大鼠和人類之間高度保守。 申請人:按此序列進行了多肽的合成(由美國NeoB1lab公司合成)。部分多肽與載體蛋白匙孔血藍蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,簡稱KLH)偶聯(由美國NeoB1lab公司合成)，作為免疫原去免疫大鼠。
[0044]實施例2:抗人組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)單克隆抗體的制備
[0045]A、SD大鼠的免疫
[0046]用KLH-多肽偶聯蛋白作為抗原免疫3只年齡為12周的SD大鼠。250ug抗原溶解于無菌的磷酸緩沖液里，并且在50°C水浴鍋里加熱30分鐘，然后與福氏完全佐劑混和，制成均勻的油乳狀物，并將抗原油乳狀物注射于大鼠的腹腔。3周之后，用同樣的方法將抗原與福氏不完全佐劑混勻，并注射于大鼠的腹腔。再過3周，用同樣的方法將抗原與福氏不完全佐劑混勻，并注射于大鼠的腹腔。在最后一次免疫之后2周，通過眼球周邊采血和酶聯標記方法來確定KLH-多肽偶聯蛋白的免疫成功。
[0047]B、細胞融合
[0048]在確定免疫成功之后一個月，作加強免疫。將200ug KLH-多肽偶聯蛋白抗原經尾靜脈注射于陽性大鼠。2天后，另取非免疫大鼠，制備滋養層細胞。4天后，處死被免疫的大鼠，用無菌剪刀與鑷子取出脾臟，用PH7.4，0.1mol / L磷酸緩沖液洗去血液，用無菌的針頭在無菌培養皿中將脾臟扎成多孔，淋巴細胞被釋放于無血清的DMEM培養液里，最后用無血清的DMEM培養液制成細胞懸浮液，即為免疫大鼠脾淋巴細胞親本，備用。取2X107個IR983F大鼠骨髓瘤細胞(購自上海都宜生物科技公司)與18個免疫大鼠脾淋巴細胞于50ml離心管中，混勻于無血清的DMEM培養液中，300g離心5分鐘，吸去上清液，重復2次。最后輕彈管底，使沉淀的細胞松動，于37度水浴中保溫，并于I分鐘內輕輕滴加Iml 50%PEG融合劑(Sigma公司)，同時輕輕彈動細胞60?90秒，然后于I分鐘內滴加2ml無血清DMEM培養液，隨后于2分鐘內加入20毫升無血清的DMEM的培養液。離心300g，5min,吸去上清液，然后再用含20%小牛血清的HAT-DMEM培養液稀釋至100ml，制成細胞懸浮液，以每孔10ul均勻分加于10塊96孔細胞培養板中。然后于37度，CO2培養箱中培養12-15天。期間，更換HAT細胞培養液4次。培養后期，若培養孔中培養液出現淡黃色，在觀察確認有細胞克隆存在之后，可取出一部分培養液進行抗體檢測。
[0049]C、雜交瘤細胞的篩選:
[0050]用酶聯免疫標記的方法篩選抗體表達為陽性的雜交瘤細胞克隆。將合成的多肽抗原(非KLH偶聯的多肽)溶解于0.05M碳酸緩沖液(PH9.6)，濃度為10ug/ml，包被于96孔聚苯乙烯板，4°C過夜。用磷酸緩沖液(PBS )洗滌3次之后，用0.5%BSA溶液封閉96孔板，37 °C，I小時。待測雜交瘤培養上清加入96孔板，37°C，培育I小時，然后用磷酸緩沖液(PBS)洗滌3次，再加入過氧化物酶(HRP)偶聯的抗大鼠IgG的二抗(GE Healthcare公司)，37°C，培育30分鐘。用磷酸緩沖液(PBS) +0.1%吐溫(Tween-20)洗滌4次，用四甲基聯苯胺(TMB)顯色，經酶標儀定量測定，以確定產生抗多肽單抗的陽性孔。
[0051]經檢測確定為產生抗tGM2多肽抗體的陽性孔細胞，先轉移至24孔培養板培養擴增，用酶聯免疫標記的方法再次確認陽性的雜交瘤細胞克隆，然后轉移細胞至T25培養瓶中培養擴增。將陽性的雜交瘤細胞克隆凍存，同時挑選5個抗體表達水平最高的克隆進行再克隆，并經全面鑒定與分析，獲得一株抗tGM2多肽的單克隆雜交瘤細胞系。該細胞已于2013年I月14日送至中國典型培養物保藏中心進行保藏，分類命名:大鼠抗人組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)雜交瘤細胞XK-1，保藏編號:CCTCC NO:C201312，地址:中國武漢武漢大學。
[0052]D、抗人tGM2多肽的單克隆抗體的純化制備:
[0053]抗人tGM2的單克隆抗體可通過誘發腹水瘤進行生產，其過程如下:向健康的SD大鼠腹腔注射Iml降植烷(Pristane)，飼養2周后，向大鼠腹腔接種5xl06個雜交瘤細胞，飼養9?11天后即可明顯產生腹水，待腹水量達到最大限度時，用毛細管抽取腹水，一般可得50ml左右。腹水經1000rpm/min離心1min,棄去上層脂肪層，收集中層腹水,_80°C保存備用。
[0054]抗人tGM2的單克隆抗體的分離純化:收集的腹水經生理鹽水4倍稀釋后，加入等體積的飽和硫酸銨溶液(PH=7.4)混合均勻，4°C沉淀I小時。然后8000rpm/min離心30分鐘。收集沉淀，并重新溶解于等體積的生理鹽水中，再加入飽和硫酸銨溶液(PH=7.4)，使其體積占總體積的45%,4°C沉淀I小時。經8000rpm/min離心30分鐘后,將沉淀重新溶解于適量的生理鹽水中，_20°C保存備用。
[0055]利用Amersham Pharmacia B1tech 公司的 protein G 親和層析柱(5ml, HiTrapprotein G HP)進行親和層析。上樣前，用20mM, pH=7.6的磷酸緩沖液平衡protein G親和層析柱。吸取2ml經飽和硫酸銨鹽析的樣品，緩慢上樣。待樣品完全進入層析柱后，用20mM，pH=7.6的磷酸緩沖液洗脫雜蛋白，流速為0.5ml/min。雜蛋白洗脫完之后，用10mM, pH=3.2的檸檬酸緩沖液洗脫抗體蛋白，流速為lml/min,每管收集1ml。每只收集管中預先加有100ul，pH=9.0的IM Tris-HCL緩沖液，用來中和洗脫液至pH=7.0。經UV_280nm檢測收集到的第二洗脫峰即為要純化的抗體蛋白。然后，經超濾，濃縮即得高濃度的抗tGM2的單克隆抗體。抗體純度經SDS-PAGE電泳鑒定，純度大于96%。Western Blot實驗結果僅僅顯示出一條80KD陽性帶，說明該抗體能特異地與tGM2結合。該抗體為大鼠IgG2b亞型，抗體最高稀釋可達0.5ug/mL.
[0056]實施例3:抗人tGM2單克隆抗體的功能活性的鑒定
[0057]為了檢測單克隆抗體抑制tGM2的活性， 申請人:建立了一個酶促反應體系。在這個系統里，來源于人I型膠原蛋白的一段多肽先被B1tin修飾化(B1tin-LSQQIENI)，然后在tGM2的催化下被交聯到多聚賴氨酸(poly-lysine)上(圖3).交聯反應的程度是通過avidin-HRP介導的酶促反應來監測。圖3顯示，隨著抗tGM2的抗體濃度的增加，tGM2的轉氨活性被大大抑制。
[0058]實施例4:人組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)在肝硬化病人的肝樣本上的表達
[0059]利用免疫熒光染色方法， 申請人:對十二例肝硬化病人的肝樣本作了檢驗。圖4A,-平滑肌肌動蛋白的染色(綠色)揭示出:不管病因如何(HCV，HBV，PBC，or HCC感染)，大多數肝硬化樣本明顯地存在著典型的結節性纖維化橋梁(nodular fibrotic bridges)。tGM2染色(紅色)揭示:tGM2蛋白廣泛地表達在纖維化橋梁里和其周圍，顯示出tGM2與纖維化的緊密相關。惡性的假小葉的周圍也存在著tGM2陽性的纖維橋梁。圖4B，天狼星紅(Sirius Red)染色揭示出肝樣本上的纖維結節，即肝臟疤痕。利用qRT-PCR的方法我們也檢測了硬化肝的tGM2的mRNA的表達水平。圖4C顯示:1型膠原蛋白和-平滑肌肌動蛋白(兩種典型的纖維化指標)的mRNA水平分別增加了 5倍多和2倍多。tGM2的mRNA也顯著地增加了 2倍。最后，我們檢測了細胞外間質tGM2的酶活性，發現硬化肝的tGM2的轉氨酶活性顯著增加。
[0060]實施例5:小鼠肝纖維化模型的建立
[0061]通過反復注射th1acetamide (TAA) (0.2mg/g體重,一周兩次,共注射8周)建立小鼠肝硬化模型。圖1，雙熒光免疫染色顯示，tGM2在小鼠正常肝臟里幾乎沒有表達，然而，在纖維化肝里，tGM2的表達明顯增加，并顯示出與纖維化的I型膠原橋梁相并存。更重要的是，小鼠肝硬化模型中tGM2在纖維化肝組織中的分布與在人肝硬化肝內的分布情況很相似(見圖1)。
[0062]實施例6:纖維化肝臟的免疫抑制和基質金屬蛋白酶的缺失
[0063]由于急性損傷而造成的肝纖維化可以通過基質金屬蛋白酶(MMPs)自發地清除。然而，由于慢性肝炎造成的肝硬化疤痕卻不能得到及時溶解。這是因為纖維化肝的肝星狀細胞中許多基質金屬蛋白酶(MMPs)的基因被沉默化了，蛋白酶不再表達(Qin andHan, 2010)。既然在纖維化的肝星狀細胞里MMPs的活性被永久地抑制，那么用于溶解纖維化的MMPs就可能來源于白細胞或骨髓衍生的淋巴細胞。大多數MMPs基因的表達是受促炎性細胞因子(TNF-aand IL-Ιβ)誘導的。事實上，從血漿ALT水平和肝出血癥狀表明，纖維化肝是抗TAA損傷挑戰的(見圖5A和5B)，而正常肝在經過TAA損傷挑戰后會進入壞死。急性損傷的正常肝表達了大量的基質金屬蛋白酶MMP9，而發生硬化的肝卻沒有顯示MMP9的表達(見圖OT).主要的促炎性細胞因子，TNF-α和IL-1 β，僅僅在急性損傷的肝中表達水平增高，但在纖維化的肝臟中卻沒有增加(見圖5Ε和5F)。因此， 申請人:認為發生肝硬化的肝組織中存在著免疫抑制，而且這種免疫抑制保護了纖維化組織免受免疫系統的進攻，消除了基質金屬蛋白酶的表達，并促進了腫瘤的發生和轉移。
[0064]實施例7:抗人tGM2單克隆抗體在小鼠肝纖維化模型上的治療效果
[0065]小鼠被重復注射TAA (0.2mg/g體重，2次/周，共8周)。8周之后，小鼠明顯地失去體重，肝纖維化癥狀出現。肝纖維化小鼠被分成兩組。第一組為實驗組(21只小鼠)，將被注射抗人tGM2的單克隆抗體，抗體的劑量分別是0.005暈克,0.02暈克和0.1暈克,每種劑量注射7只小鼠。第二組為對照組(7只小鼠)，將被注射正常的大鼠IgG，劑量為0.1毫克。第三組為空白組(7只小鼠)，小鼠沒有經過TAA和抗體的注射。在最后一次TAA注射后2天，經過腹腔注射抗人tGM2的單克隆抗體或正常的大鼠IgG。5天之后，再注射一輪抗體。再過5天，小鼠被殺，治療效果被評估。
[0066]圖2A顯示了天狼星紅(Sirius Red)染色的結果，與對照組比較，肝纖維化結締在抗人tGM2單克隆抗體治療組(0.1毫克)顯著減少。圖2B顯示，纖維化標志分子α-平滑肌肌動蛋白(α -SM)的表達也隨著抗人tGM2抗體劑量的增加而減少。圖2C顯示，在對照組，受抑制的MMP9的表達得到部分恢復，然而在實驗組，抗人tGM2抗體的注射大大地增強MMP9的表達水平。這與小鼠肝纖維化的消退相一致。
【權利要求】
1.一種雜交瘤細胞，其特征在于:大鼠抗人組織轉谷氨酰胺酶2 (tGM2)雜交瘤細胞XK-1, CCTCC NO: C201312。
2.權利要求1所述的雜交瘤細胞分泌的抗體。
3.權利要求2所述抗體在制備治療小鼠肝纖維化藥物中的應用。
【文檔編號】C12R1/91GK104278013SQ201310393799
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年9月2日 優先權日:2013年9月2日
【發明者】張紅軍, 韓原平 申請人:武漢諧康生物科技有限公司