丁炔醇Ⅰ酯酶的制作方法

專利名稱：丁炔醇Ⅰ酯酶的制作方法
技術領域：
本發明涉及來自穎殼假單胞菌(Pseudomones glumae)的具有酯酶活性，特別是具有丁炔醇I酯酶活性的新蛋白，涉及編碼此蛋白的核苷酸序列，表達盒，載體和重組微生物；本發明還涉及制備上述蛋白質的方法和此蛋白在有機酯的酶促酯水解或轉酯反應，特別是對映體選擇性(enantioselective)酶促酯水解或轉酯反應中的用途。
酯酶和脂肪酶是水解酶，它們能夠用于工業生產過程中以合成旋光性的有機化合物，它們的特點是具有高底物特異性。它們通過與絲氨酸蛋白酶相似的作用機理，能夠將酰基轉移到親核基團，例如羰基上或水解斷裂酯鍵。酯酶，脂肪酶和絲氨酸蛋白酶具有共同的催化三聯體，一個由絲氨酸，組氨酸和天冬氨酸構成的序列基序，其中羰基碳原子受到活性絲氨酸的親核攻擊，在另兩個氨基酸參與下導致電荷分配。酯酶和脂肪酶還可以將酰基轉移到其他親核基團，如硫醚的硫基或活化胺上。
脂肪酶水解長鏈甘油酯，其特征在于表面活化作用，即只有在脂質底物存在時活性位點才可接近。脂肪酶在非水的有機溶劑中是穩定的，并被應用于許多工業生產過程中進行動力學外消旋體拆分，即一個對映體的轉化要遠遠快于另一個對映體的轉化。然后，根據不同的理化性質可以從反應溶液中得到所述對映體。
Nakamura(Nakamura，K.等，四面體；不對稱(TetrahedronAsymmetry)9，(1999)，4429-4439)描述了利用商品化的脂肪酶(Amano AK，AH和PS；Amano醫藥有限公司)在疏水溶劑中經轉酯作用進行的1-炔-3-醇的外消旋體拆分。在這個反應中，對映體選擇性隨酰基供體的鏈長增加而增大，而空間大的殘基(氯乙酸酯，苯甲酸乙烯酯)對反應具有不利影響。Yang(Yang，H等，J.Org.Chem.64，(1999)，1709-1712)描述了以來自Candida antarctica的脂肪酶B作為催化劑，經轉酯作用從乙烯基酯對映體選擇性地制備旋光性酸。在這一情況中，乙酯會導致明顯較低的反應速率和選擇性。應用從Burkholderiaplantarii(Pseudomonas plantarii或穎殼假單胞菌)DSM 6535分離出來的一種脂肪酶，借助甲氧基乙酸乙酯可以對外消旋胺進行對映體選擇性的酰化(Balkenhohl，F.等，J.prakt.Chem.339，(1997)，381-384)。
酯酶以對映體選擇性方式催化酯鍵的形成和斷裂(正反應和逆反應)。在轉酯作用中優選利用乙烯基酯來得到旋光性醇，這是因為轉化之后由于互變異構作用醇轉變成醛或酮，酯中的醇官能團不再存在，所以可以避免逆反應的發生。與脂肪酶不同，酯酶不具有表面活化的性質，而且其轉化相對短鏈的有機化合物，人們已經從多種生物體中分離出不同底物特異性的酯酶。
這樣，Pseudocardia thermophila FERM-BP-6275的酯酶被用于水解旋光性的苯并二氫吡喃乙酸酯(EP-A-0 892 044)。
酸熱芽孢桿菌(Bacillus acidocaldarius)中的一種酯酶能夠以低的對映體選擇性從窄范圍的底物出發水解酯(Manco，G.等，生物化學雜志(Biochem.J.)，332，(1998)，203-212)。
可以利用曲霉菌的酰基轉移酶1在有機非極性溶劑中經轉酯作用從乙烯基酯得到二級醇，優選轉化具有較小側鏈的二級醇(Faraldos，J.等，Synlett4，(1997)，367-370)。已經對熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)DSM 50 106的膜結合內酯特異性酯酶(Khalameyzer，v.等，應用和環境微生物(Appl.And Environ.Microbiol)，65(2)，(1999)，477-482)，和大腸桿菌(E.coli)malQ突變株的乙酰酯酶(Peist，R.等，細菌學雜志(J.Bacteriol.)，179，(1997)，7679-7686)進行了克隆。然而，對這兩種酯酶的對映體選擇性和底物特異性還沒有更詳細的研究。紅球菌屬(Rhodococcus)種NCBM 11216能夠表達4種酯酶，RRl到RR4，它們具有不同的特異性。對于利用萘酚和酸合成酯，RRl和RR2優選具有短碳鏈的酸，RR3和RR4則特異性地轉化具有相對較長碳鏈和空間相對較大殘基的酸(Gudelj，M.等，J.Mol.Cat.B，Enzymatic 5，(1998)，261-266)。
然而，目前尚沒有底物范圍大、對映體選擇性高、并且能夠應用于工業生產過程的酯酶可用于制備小的有機分子，如具有短碳鏈的旋光性醇，酸或酯。本發明的目的是提供具有至少一種如上所述性質的酯酶。
我們已經驚奇地發現，可以通過提供具有丁炔醇I酯酶活性的蛋白質及其具有丁炔醇I酯酶活性的功能等價物來完成這個目的，其中所述蛋白質中包括至少一個根據SEQ ID NO3，4，5或6的部分氨基酸序列a) FIETLGLERPVLVGHSLGGAIALAVGLDYPER(SEQ ID NO3)，b) IALIAPLTHTETEP(SEQ ID NO4)，c) GGGMMGLRPEAFYAASSDLV(SEQ ID NO5)d) AIDAIFAPEPV(SEQ ID NO6)(每一個蛋白質序列均以氨基酸單字母密碼的形式給出，所有情形中第一個氨基酸都相應于各序列的氨基末端)。
具體地，本發明的這一目的通過提供包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或者由SEQ ID NO1的核苷酸序列編碼的丁炔醇I酯酶及所述蛋白質的功能等價物來完成。
為簡單起見，上文所提及的這些蛋白質在以下都稱作丁炔醇I酯酶。
針對本發明的目的，本文具體公開的多肽或蛋白質的“功能等價物”或類似物是這樣的多肽或蛋白質，它們同本文具體公開的多肽或蛋白質不同，但是仍具有所需要的生物學活性，特別是酶活性。
本發明中“功能等價物”特別是指這樣的突變體，在上述序列的至少一個位點上它具有與具體提及的此位點的氨基酸不同的氨基酸，但是它仍具有至少一種本發明的生物學活性。因此，“功能等價物”包括可通過一個或多個氨基酸的插入，替代，缺失和/或倒位得到的突變體，上述的修飾可以在序列上任一位點發生，只要這些修飾所導致的突變體具有本發明的性質譜即可。尤其是，當突變體和未經修飾的多肽之間在反應模式上具有性質上的一致性，即，例如轉化相同底物的速率存在差異時，也存在功能等價。
“功能等價物”自然也包括可從其它生物體獲得的多肽，和自然發生的變異體。例如，可以通過序列比較找到同源序列區域，然后可以根據本發明的特殊要求確立等價酶。
“功能等價物”同樣包括具有，例如，所需要的生物學活性的本發明多肽的片斷，優選單結構域或序列基序。
＂功能等價物＂還可以是融合蛋白，它們包含上述一個多肽序列或來源于其的功能等價物以及至少一段功能不同的別的異源序列，兩個序列之間為功能性的N-或C-端連接(即，融合蛋白各部分間的相互功能消減可以忽略不計)。這樣的異源序列的非限制性實例有，例如信號肽，酶，免疫球蛋白，表面抗原，受體或受體配體。
根據本發明，“功能等價物”包括本發明具體公開的多肽或蛋白質的同系物。它們與本發明具體公開的一個序列具有至少60％的同源性，優選具有至少75％的同源性，尤其是具有至少85％的同源性，如舉例來說，具有90％，95％或99％的同源性，這是通過Pearson和Lipman的算法(Proc.Natl.Acad，Sci.(美國)85(8)，1998，2444-2448.)計算的同源性。
本發明的蛋白質或多肽的同系物可以通過誘變，如通過點突變或蛋白質截短產生，這里所用的術語“同系物”涉及蛋白質的變體形式，它可以作為蛋白活性的拮抗劑或激動劑。
可以通過篩選突變體，如截短突變體的組合文庫鑒定本發明蛋白質的同系物。可以例如通過核酸水平上的組合誘變，如，通過合成寡核苷酸混合物的酶促連接，產生一個多樣化的蛋白質變體文庫。有大量方法可以用于從簡并寡核苷酸序列制備潛在同系物文庫。簡并基因序列的化學合成可以在自動DNA合成儀上進行，然后可以將合成的基因連接到適當的表達載體中。利用一組簡并基因可以在一個混合物中提供編碼一組期望的可能蛋白質序列的所有序列。合成簡并寡核苷酸的方法是本領域技術人員所熟知的方法(參見如Narang，S.A.(1983)四面體393；Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem. 53323；Itakura等，(1984)科學(science)1981056；Ike等，(1983)核酸研究(Nucleic Acid Res.11477)。
另外，可以利用蛋白質密碼子的片斷文庫產生一個多樣化的蛋白質片斷群，用于篩選及隨后挑選出本發明蛋白質的同系物。在一個實施方案中，編碼序列片斷的文庫可以通過如下方法產生在每個分子只能產生大約一個切口的條件下，用核酸酶處理編碼序列的雙鏈PCR片斷，使雙鏈DNA變性，使DNA復性形成雙鏈DNA，其中可能包括了由帶不同切口的產物形成的正義/反義對，然后用S1核酸酶處理，從新形成的雙鏈體中去除單鏈部分，并將得到的片斷文庫連接到表達載體中。利用此方法可以得到編碼不同長度的本發明蛋白質的N-末端，C-末端和中間片斷的表達文庫。
對于從由點突變或截短產生的組合文庫中篩選出基因產物，以及從cDNA文庫中篩選出具有所選特性的基因產物，有幾種技術是眾所周知的現有技術。可以對這些技術進行適應性修改以便從組合誘變產生的基因文庫中快速篩選出本發明的同系物。用于通過高通量分析篩選大量基因文庫的最常用技術包括，將基因文庫克隆到可復制的表達載體中，利用得到的載體文庫轉化適當的細胞，并在一定條件下表達組合基因，在所述表達條件下檢測所需的活性能夠有助于分離出如下載體，此載體編碼其產物已經被檢測出來的基因。循環綜合誘變(recursive ensemble mutagenesis)(REM)是一種能夠增加文庫中功能性突變體頻率的技術，此技術可以與篩選試驗結合用于鑒定同系物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS897811-7815；Delgrave等，(1993)蛋白質工程(Protein Engineering)6(3)327-331)。
本發明優選的功能等價物是在至少一個位點上與SEQ ID NO2不同的一段序列，其中所述序列中的所述改變優選對酯酶活性僅造成不顯著的改變，即活性變化不超過約±90％，尤其是±50％或不超過±30％。可以利用參照底物，如，丁酸丁炔醇酯在標化條件下(例如，20mM底物，10mM磷酸緩沖液，pH7.4，T＝20℃)測定此變化。
本發明特別涉及那些功能等價物，它們包含至少一個由SEQ ID NO2所示序列中至少10個連續氨基酸組成的部分序列，并且對參照底物具有上述活性。
這類部分序列的非限制性實例來源于上述根據SEQ ID NO3，4，5和6的部分序列。
因此，進而本發明酯酶的優選功能等價物包括，如，至少一個來源于SEQ ID NO3，4，5或6的部分序列，同本文具體陳述的部分序列進行比較，其具有一個或多個氨基酸替代，缺失，倒位或插入，并且其酯酶活性同原蛋白質(SEQ ID NO2)的酯酶活性相差不超過約±90％或±50％，優選不超過±30％。
本發明丁炔醇I酯酶優選具有大約40到42kDa，尤其是大約41.3kDa的分子量，所述分子量是利用SDS凝膠電泳進行測定的。它們尤其可以從保藏號為DSM 13176的穎殼假單胞菌(Pseudomonas glumae)Lu 2023中得到。得到其它的菌株變種是容易的，例如可以利用穎殼假單胞菌(Pseudomonas glumae)Lu8093作為起始菌株，通過篩選，如在苯基乙酸乙酯為唯一碳源的基本培養基平板上進行培養而得到。
本發明還包括編碼丁炔醇I酯酶的多核苷酸，并包括SEQ ID NO1所示的核酸序列或其衍生序列。
本發明特別涉及編碼一種上述多肽或蛋白質的核酸序列(單鏈和雙鏈DNA和RNA序列，例如，cDNA和mRNA)，及其能夠通過如利用人工核苷酸類似物得到的功能等價物。
本發明既涉及編碼本發明多肽或蛋白質或其生物活性部分的分離的核酸分子，也涉及能用作如雜交探針或引物鑒定或擴增本發明的編碼核酸的核酸片斷。
另外，本發明的核酸分子可以包含來自基因編碼區3′和/或5′末端的非翻譯序列。
“分離的”核酸分子是指該核酸分子與其天然來源中存在的其它核酸分子分離，而且如果此分子是經重組技術產生的，則它還可以基本上不含有其它細胞物質或培養基，或者如果此分子是經化學合成的，則它還可以基本上不含有化學前體或其它化學藥品。
本發明的核酸分子可以通過利用分子生物學的標準技術和本發明提供的序列信息進行分離。例如，可以利用本文具體公開的一個完整序列或其部分作為雜交探針并且使用標準的雜交技術(技術描述參見Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA laboratory Manual)，第二版，冷泉港實驗室，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989)從適當的cDNA文庫中分離出cDNA。此外，對含有一個本文所公開序列或其部分的核酸分子來說，還可以利用根據此序列構建的寡核苷酸引物通過聚合酶鏈反應來分離。可以將由此擴增得到的核酸克隆到適當的載體中，并通過DNA序列分析進行表征。本發明的寡核苷酸也可以通過標準的合成方法，如，利用自動DNA合成儀進行合成。
本發明還包括與本文具體公開的核苷酸序列或其部分互補的核酸分子。
利用本發明的核苷酸序列可以制備能用于鑒定和/或克隆其它細胞類型和生物體中的同源序列的探針和引物。這樣的探針和引物通常包含一個核苷酸序列區域，在嚴緊條件下所述區域能夠與本發明的一個核酸序列的有義鏈或者相對應的反義鏈上的至少約12個連續核苷酸，優選至少約25個，如40、50或75個連續核苷酸雜交。
本發明的其它核酸序列是從如SEQ ID NO1所示序列衍生得到的，它們經過一個或多個核苷酸的添加，替代，插入或缺失而與SEQ ID NO1不同，但是它們仍舊能編碼具有所需性質譜的多肽，所述性質譜是指例如，特別是限于上述的酶活力變化范圍之內的本發明的酯酶活性。
本發明還包括與具體提及的序列比較而言，根據特定來源或宿主生物的密碼子使用而包含所謂的沉默突變或者經過修飾的核酸序列，及其自然發生的變體如剪接變體或等位基因變體。本發明還涉及由保守核苷酸替代(即，有關氨基酸被具有相同電荷，大小，極性和/或溶解性的氨基酸替代)可得到的序列。
本發明也涉及從本文具體公開的核酸出發經序列多態性衍生得到的分子。這些遺傳多態性可由種群內部個體之間的自然變異引起，這些自然變異通常會導致基因中1％到5％的核苷酸序列發生變異。
本發明還包括能夠與上述的編碼序列雜交或與之互補的核酸序列，可以通過篩選染色體或cDNA文庫得到這些多核苷酸，而且適當的情況下，可以通過PCR技術利用適當的引物對這些多核苷酸進行擴增，然后以適宜的探針對其進行分離。另一個可能方法是以本發明的多核苷酸或載體轉化適當的微生物，增殖微生物并由此擴增多核苷酸，然后對其進行分離。另外可以經過化學途徑合成本發明的多核苷酸。
能夠“雜交”到多核苷酸上這一性質是指多核苷酸或寡核苷酸在嚴緊條件下結合到幾乎完全互補的序列上的能力，而不互補的多核苷酸對之間在此條件下沒有非特異性的結合。為此，這些序列應具有70-100％，優選90-100％的互補性。互補序列能夠特異性地相互結合的性質可以被用于如Northern或Southern印跡技術中或PCR或RT-PCR技術中進行引物結合。為此通常使用長度為30個或更多個堿基對的寡核苷酸。嚴緊條件是指，例如在Northern印跡技術中采用溫度為50-70℃，優選60-65℃的洗滌溶液，例如含有0.1％SDS(20×SSC3M NaCl，0.3M檸檬酸鈉，pH7.0)的0.1×SSC緩沖液洗脫非特異性雜交的cDNA探針或寡核苷酸。在此情況下，如上所述，只有高度互補的核酸才能保持相互結合。嚴緊條件的設立是本領域技術人員所熟知的，參見如Ausubel等，分子生物學的現行方法(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。
本發明還涉及表達盒，其包括至少一個可操作地連接到調節核酸序列上的本發明多核苷酸。優選的是將啟動子序列定位在本發明多核苷酸的5’上游，這樣該啟動子序列將有助于調控丁炔醇I酯酶的表達。尤其優選的是，將終止序列以及，如果適當的話，其它通用的調節元件定位在本發明多核苷酸的3’下游，而且使它們均可操作地與編碼丁炔醇I酯酶的序列連接。可操作地連接是指啟動子，編碼序列，終止子以及，如果適當的話，其它的調節元件依次排列，以致每一個調節元件都能夠如所預期的那樣在編碼序列表達之前，之中和之后行使其功能。其它的能可操作連接的序列的實例有引導序列以及翻譯擴增子，增強子，聚腺苷酸化信號等等。其它有用的調節元件包括選擇標記，報道基因，擴增信號，復制起點等。
除了人工調節序列，天然的調節序列仍可以位于實際結構基因之前。通過遺傳修飾，在適當的情況下，可以關閉上述的天然調節和增強或減弱基因的表達。然而，表達盒的構建也可以更簡單，即在結構基因之前不插入附加的調節信號，并且保留天然啟動子及其調節作用。相反，可以使天然的調節序列發生突變，以便其調節作用不再存在，基因表達得到增強或減弱。在表達盒中可以存在一個或多個拷貝的這些核酸序列。
有用的啟動子的實例有cos，tac，trp，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，lacIq，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，λ-PR或λ-PL啟動子(它們可以有利地用于革蘭氏陰性細菌)；以及革蘭氏陽性細菌啟動子amy和SPO2，酵母啟動子ADC1，Mfa，AC，P-60，CYC1，GAPDH，或植物啟動子CaMV/35S，SSU，OCS，lib4，usp，STLS1，B33，nos或者遍在蛋白啟動子或云扁豆蛋白啟動子。尤其優選利用誘導型啟動子，例如，光以及特別是溫度誘導型啟動子如PrP1啟動子。
原則上，所有天然啟動子以及它們的調節序列都可以使用。另外，還可以有利地使用人工合成的啟動子。
所述調節序列應有助于核酸序列的特異表達和蛋白質表達。根據宿主生物體的不同，這可能意味著，例如，基因只能在誘導之后進行表達或過表達，或是基因立即進行表達或過表達。
在此上下文中，調節序列或因子可以正面地影響并由此增強或減弱表達。這樣，通過使用強轉錄信號如啟動子和/或增強子，可以有利地在轉錄水平上增強調節元件的作用。然而，除此之外，也可以如通過提高mRNA的穩定性來增加翻譯。
本發明的表達盒是通過將適當的啟動子和能夠編碼丁炔醇I酯酶的適當多核苷酸以及終止子或聚腺苷酸化信號融合得到的。為此可以使用常規的重組和克隆技術，見如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1989)以及T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，基因融合實驗(Experimentswith Gene Fusions)，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1984)，Ausubel，F.M.等，分子生物學的現行方法，Greene Publishing Assoc.and WileyInterscience(1987)。
本發明還涉及用于轉化真核和原核宿主的重組載體，其中該載體攜帶有本發明的多核苷酸或者本發明的表達盒。所述載體使得丁炔醇I酯酶可以在適當的宿主生物體中表達。這些載體是本領域技術人員非常熟悉的并可以在如“克隆載體”(clong vectors)(Pouwels P.H.等，編.，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)一書中查到。除了質粒之外，載體也指本領域技術人員已知的所有其它載體，例如噬菌體，病毒如SV40，CMV，桿狀病毒和腺病毒，轉座子，IS元件，噬菌粒，粘粒，線狀或環狀DNA。這些載體能在宿主中以自主方式復制或以染色體方式復制。
借助本發明的載體，可以產生這樣的重組微生物，它們被例如至少一個本發明的載體所轉化并且可用于生產重組酯酶。有利的是，將如上描述的本發明重組表達盒作為表達載體的一部分引入適當的宿主系統并使其表達。為了在特定表達系統中表達上述核酸，本發明優選使用本領域技術人員所熟知的常見克隆和轉染方法。適宜的系統可參見如分子生物學的現行方法，F.Ausubel等，編，Wiley Interscience，紐約1997。
適合接受本發明載體轉化的宿主生物原則上包括能夠有助于本發明多核苷酸及其等位基因變體，功能等價物或衍生物進行表達的所有生物。宿主生物是指，例如，細菌，真菌，酵母，植物或動物細胞。優選的生物有細菌例如埃希氏菌屬(Escherichia)中的細菌如大腸桿菌(Escherichia coli)，鏈霉菌(Streptomyces)，芽孢桿菌(Bacillus)或假單胞菌(Pseudomonas)；真核微生物如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，曲霉菌(Aspergillus)；來自動物或植物的高等真核細胞如Sf9或CHO細胞。通過包含在載體或表達盒中的標記基因可挑選出成功轉化的生物體。標記基因的實例有引起抗生素抗性的基因，以及所編碼的酶能夠催化染色反應使轉化細胞著色的基因。然后，可以利用自動化細胞分揀篩選出所述細胞。經載體成功轉化并攜帶有適當的抗生素抗性基因的生物體可以在含有適當抗生素的培養基或底物上進行篩選。位于細胞表面的標記蛋白可以借助親和色譜用于篩選。
因此，本發明還涉及攜帶有本發明載體的微生物，并涉及能夠內源性地表達丁炔醇I酯酶的穎殼假單胞菌(Pseudomonas glumae)突變體Lu2023，該微生物保藏于德意志微生物保藏中心(DSM)，保藏號DSM13176。
本發明的丁炔醇I酯酶尤其能夠催化至少一個如下反應a)對映體選擇性地水解具有旋光性的式I的酯R1-COO-R2(I)，
其中R1是直鏈的或支鏈的，未取代的或單取代的或多取代的C1-C10烷基，C2-C10鏈烯基，C2-C10炔基，R2是直鏈的或支鏈的，未取代的或單取代的或多取代的C1-C10烷基，C2-C10鏈烯基，C2-C10炔基，C7-C15芳烷基或單環的或多環的，未取代的或單取代的或多取代的芳族基團，R1和/或R2包含至少一個不對稱碳，其中尤其優選R1中與酯鍵碳結合的碳或者R2中與酯鍵氧結合的碳是不對稱碳；和b) 利用具有旋光性的式II的醇對式I所示的酯進行對映體選擇性的酯轉換R2-OH (II)，其中R2具有以上其中一種含義，并在適當的情況下，還具有至少一個不對稱碳，其中尤其優選攜帶OH基團的碳是不對稱碳。
本發明還涉及利用丁炔醇I酯酶進行對映體選擇性的酯水解的方法，該方法中將丁炔醇I酯酶與具有旋光性的式I的酯的立體異構體混合物進行接觸，然后可從反應介質中得到由于立體選擇性地水解兩種立體異構體中任一種所產生的旋光性化合物和/或未水解的酯對映異構體。然而，也可以利用丁炔醇I酯酶水解不具有旋光活性的那些式I的酯。
本發明還涉及對映體選擇性的轉酯方法，其中在丁炔醇I酯酶存在下，將具有旋光性的式II的醇的立體異構體混合物與式I所示的酯接觸，然后可以從反應介質中得到未反應的醇立體異構體，或者在丁炔醇I酯酶存在下，將旋光性的式I的酯的立體異構體混合物與式II所示的醇接觸，然后可以從反應介質中得到包含在酯中的旋光性醇的立體異構體。在轉酯反應中優選使用乙烯基酯作為旋光性醇的酰化劑。其有利之處在于，轉化之后，由于互變異構現象，不再存在可用于逆反應的乙烯基酯中的醇官能團。丁炔醇I酯酶也能夠催化酯和醇都不具有旋光活性的轉酯反應。
酯水解中，優選的底物是由乙醇，丙醇，丁醇形成的酯，尤其優選的是與羧酸如，乙酸，丙酸，丁酸，戊酸，己酸，庚酸，辛酸，乳酸，2-乙基己酸，3-甲基丁酸，甲氧基乙酸，2-甲基丙酸，2-丁烯酸，3-氯丙酸和2-甲基戊酸形成的丁炔酯(丁炔醇的酯，1-甲基丙-2炔醇的酯)。尤其優選丁酸丁炔酯和甲基丁酸丁炔酯。
在轉酯反應中優選的醇是乙醇，丙醇和丁醇，尤其優選的是丁炔醇。
在轉酯反應中優選的酯是乙烯酯，例如，乙酸乙烯酯，丙酸乙烯酯和丁酸乙烯酯。
上述方法所采用的反應介質是有機溶劑，例如，烷烴，醚，甲苯，二氧雜六環，甲基異丁基酮，甲基叔丁基醚(MTBE)等。在酯水解反應中，也可以使用由所用的緩沖溶液和有機溶劑如，MTBE和庚烷或甲苯形成的混合物。
本發明還涉及利用丁炔醇I酯酶通過上述方法制備的旋光性醇，羧酸或酯。
外消旋物的拆分，即對映體選擇性和反應速率能夠受到酸部分的大小和疏水性的影響。反應優選在室溫，pH值6到9，尤其優選pH值7.0到7.4的條件下進行。酯酶的應用形式可以是分離或純化的酶，表達酯酶的微生物的細胞，所述微生物的培養物上清液，細胞裂解物或提取物，或者固定化的酯酶。可以通過本領域技術人員已知的化學或物理分離方法從反應溶液中分離出反應產物。可以通過膜過濾從反應混合物中分離得到丁炔醇I酯酶。
可以借助聚丙烯酰胺，藻酸，角叉菜聚糖對酯酶進行固定化，也可以通過已知的方法使酯酶共價結合或吸附到適當的載體上，優選通過在硅藻土上凍干或硫酸銨沉淀對丁炔醇I酯酶進行固定。
如上所述，丁炔醇I酯酶可以從穎殼假單胞菌(Pseudomonas glumae)Lu 2023中獲得。然而，也可以通過已知的肽合成方法進行制備。
此外，丁炔醇I酯酶還可以從真核或原核生物中獲得，只要所述生物能夠表達丁炔醇I酯酶即可，舉例來說如，帶有本發明載體的微生物。
因此，本發明還涉及制備丁炔醇I酯酶的方法，該方法包括對能夠產生丁炔醇I酯酶的微生物或用本發明載體轉化的微生物進行培養，適當時誘導丁炔醇I酯酶的表達，然后從培養物中分離出丁炔醇I酯酶。可以利用已知的方法對微生物進行培養和發酵，例如，可以在TB或LB培養基中，20至40℃以及pH 6到9的條件下增殖細菌。適當的培養條件的描述詳見如T.Maniatis，E.F.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1989)。
培養之后，裂解細胞，通過蛋白分離方法從裂解物中分離出丁炔醇I酯酶。可以按照需要使細胞裂解，這可以通過高頻超聲波，或通過高壓如置于弗氏壓碎器中，通過滲透作用，通過去污劑、裂解酶或有機溶劑的作用，通過勻漿器，優選玻璃珠磨來進行，也可以聯合使用所述這些方法中的一種或多種來進行。離心以后，蛋白質和其它可溶性分子保留在上清液中。利用氯化錳沉淀DNA可以產生一種明顯不太粘稠的溶液。通過利用如，硫酸銨或磷酸鉀進行鹽析，可以選擇性地沉淀蛋白質。沉淀也可以通過pH或溫度的變化，或者使用有機溶劑如甲醇，乙醇或丙酮來實現。鹽沉淀之后，可以通過透析的方法去除所述的鹽。
可以利用已知的色譜方法對丁炔醇I酯酶作進一步純化，如分子篩色譜法(凝膠過濾)，Q-Sepharose色譜法，離子交換色譜法和疏水色譜法，也可以使用其它常規方法如超過濾，結晶和天然凝膠電泳。
利用下列非限制性實施例并參照附圖對本發明進行更詳細說明，其中附

圖1描述了對本發明的丁炔醇I酯酶的部分氨基酸序列與來自熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)的內酯特異性酯酶的部分序列進行的序列比對。Query本發明的克隆LU2898的部分序列。Sbjct熒光假單胞菌酶(登錄號087637)的部分序列。
實施例1篩選能夠表達丁炔醇I酯酶的穎殼假單胞菌突變體篩選的起始點是能產生脂肪酶的菌株穎殼假單胞菌(Pseudomonas(Burkholderia)glumae)Lu8093。所述菌株產生的脂肪酶使得能夠進行大量有意義的反應(Balkenhonl，F.等，J.prak t.Chem.339，(1997)，381-384)。然而，乳酸酯，甲基丁酸酯和苯乙酸酯不是此脂肪酶作用的底物，也不能被此菌株通過任何其它的途徑進行水解。
然而，它們的水解產物可以用作碳源，為此，人們尋找到能夠水解所述的酯，并且能夠以其水解產物作為碳源進行生長的Lu8093突變體。所以帶有新的酯酶活性的突變體應該能夠通過在所述酯類上的生長來顯示自己。
篩選條件將Lu8093在培養基上培養16h，離心收獲細胞。用鹽水沖洗細胞兩次，將106個細胞鋪在含有0.5或1.0g/l苯乙酸乙酯為唯一碳源的基本培養基平板上。然而，剛開始沒有生長，4到6天之后，才可以看到單個菌落。隨后幾天，菌落數進一步增加。
從由此方法獲得的酯酶陽性突變體中挑選出突變體Lu2023。令人驚奇的是，新的酯酶活性也適用于選擇性水解相對較小的有機分子。舉例來說，其表現出對丁炔醇酯的選擇性水解。
實施例2穎殼假單胞菌Lu 2023的發酵為獲得丁炔醇I酯酶，將穎殼假單胞菌Lu 2023以14升的規模培養然后收獲活性生物質。
在實驗室中，將穎殼假單胞菌Lu 2023在含有M12無機鹽培養基和1g/lEPA的瓊脂平板上劃線接種，并在28℃培養36到48小時。這些平板可以在4℃貯藏四周。
菌株發酵是在Infors xxy 14-1發酵罐中進行的，對于預培養，在250ml的培養基中用鉑接種環接種2至3環，并在200rpm，28℃下培養24小時。主培養按照下列條件進行溫度28℃空氣供給7升/分鐘攪拌600rpm發酵運行時間約24h內在pH和pO2測量用于預培養和主培養的培養基15g/l Springer酵母自溶物65％1.6 g/l硫酸錳×7水0.02 g/l氯化鈣×2水
3.5 g/l磷酸二氫鉀3.5 g/l磷酸氫二鉀5g/l磷酸氫二銨6ml Pluriol P2000消泡劑將上述組分溶解于去離子水中，所得溶液用25％強氨溶液調節pH到6.5，分別對5m/l的微量元素溶液和2g/l的葡萄糖進行無菌過濾。
滅菌之后補全培養基，向發酵罐中加入0.5g/l的苯乙酸乙酯。加入Pluriol P2000以抑制發酵中泡沫的出現。當發酵罐中的pO2重新增加到85％時，停止發酵。在低于15℃的溫度下，以大約9000到10000g對發酵罐中的物質進行離心，然后丟棄澄清的流出物。將所得細胞物質在-16℃下冰凍。
實施例3從穎殼假單胞菌Lu 2023中純化丁炔醇I酯酶將穎殼假單胞菌(Lu 2023)細胞(100ml，濕重50g)置于玻璃珠研磨器(100ml玻璃珠，直徑0.5mm)中，在4℃，3000rpm下進行裂解。離心(10 000rpm，30min)及沖洗玻璃珠之后，上清液(300ml)用氯化錳(pH7到7.5；終濃度50mM)進行沉淀。再次進行離心之后，將上清液的pH值調節到7.8并加入濃度50mM的EDTA。以Q-Sepharose(300ml)色譜法對這一體積進行純化。樣品上樣之后，以50mM Tris/HCl洗滌柱子。收集感興趣的組分并通過超濾作用(100kDa)進行濃縮。利用分子篩色譜(直徑5cm，高90cm。材料S-300)將丁炔醇I酯酶與非特異性的酯酶分離。得到的活性組分是渾濁的，再次對其進行濃縮。很明顯，該酯酶與膜相結合。所以首先利用蛋白酶(胰蛋白酶，重量比1∶50到1∶100)消化此膜組分。這一操作使除了SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中的幾條帶之外的其余所有蛋白質從膜組分中消失。活性仍得以保持。利用天然凝膠電泳(0.04％ SDS)使上述各條帶彼此分離，并通過活性測定試驗鑒定上述天然凝膠中的酯酶。從凝膠中洗脫出所述酯酶，其在變性的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳上呈現出一條純凈的帶。
通過印跡法將由此方法純化的蛋白質轉移到PVDF膜上并對其進行序列分析，或者，經過胰蛋白酶進行裂解之后，利用反相HPLC分離肽并進行序列分析。由于蛋白的氨基末端被封閉，只得到胰蛋白酶裂解產生的肽。這些不同的氨基酸序列表現出與來自魯氏不動桿菌(Acinetobacteriwoffii)和惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的己二烯二酸環異構酶(EC 5.5.1.1)以及來自熒光假單胞菌的內酯酯酶具有很少的同源性。具有AIDAIFAPEGV序列的肽顯示出與果膠酯酶(EC 3.1.1.11)同源。
附圖1描述了對本發明的部分氨基酸序列與來自熒光假單胞菌的內酯特異性酯酶的部分序列進行的序列比對。
實施例4丁炔醇I酯酶的固定化應用不同的方法進行固定化。
1.在硅藻土存在下通過丙酮沉淀使丁炔醇I酯酶基本上失活。將25mg的蛋白質與3.5g的硅藻土(Merck)混合，再加入1.4升丙酮(-20℃)反應10分鐘。然后經G3玻璃吸濾器分離負荷支持物，過濾殘余物以冷丙酮進行洗滌并干燥。
2.丁炔醇I酯酶不與Accurel(Akzo)結合。
3.可以利用凍干法將丁炔醇I酯酶(2.3單位/g，EPA試驗)固定到硅藻土上。為此，將酶溶液與硅藻土混合并在-80℃下冰凍。隨后，將得到的固態物質進行凍干。
4.通過硫酸銨沉淀對丁炔醇I酯酶(454毫單位/g，EPA試驗)進行固定化。為此，在硅藻土存在下以80％的飽和硫酸銨沉淀酶。
實施例5利用來自穎殼假單胞菌Lu 2023的丁炔醇I酯酶進行外消旋體拆分操作程序(標準混合物)在磷酸緩沖液(200ml，10mM，pH 7.4)中，攪拌下使100單位的丁炔醇I酯酶與20mmol的丁酸丁炔醇酯(丁酸1-甲基丙-2-炔基酯)進行反應。對pH進行連續監測并通過添加氫氧化鈉溶液使pH值保持在大約7.4。在如附表1中所指示的時間取樣，并利用甲基叔丁基醚(MTBE)萃取兩次，通過GC(Chiraldex GTA)對得到的有機相進行分析。通過膜過濾將丁炔醇I酯酶從反應混合物中分離出來。
隨著濃度的增加，較不優選的酯對映體越來越多地被轉化出來。大約45分鐘之后，這一現象引起反應混合物中S-丁炔醇的ee的下降。在大約30至40分鐘之后，產物的ee達到最大值84％(83-97.9％)。底物的ee在90分鐘的反應過程之后增高到99％以上。對映體過剩(ee)被定義為優選被轉化的對映體的量的百分數減去較不被優選轉化的對映體的量的百分數。多數情況下，這與旋光純度相符。在30分鐘前pH值呈線性下降。從大約100分鐘以后，pH的變化可忽略不計。
經過萃取后，水相中的殘留酯酶活性仍大約在50％左右。
表1
附表1表明利用丁炔醇I酯酶轉化丁酸丁炔醇酯時對映體過剩隨時間的變化。根據Cahn，Prelog和Ingold的R/S約定，R和S構型定義了手性分子的兩個對映體。轉化率是指反應混合物中被轉化的酯的比例。
實施例6丁炔醇I酯酶的特異性與酯中酸部分的大小和疏水性/電荷的關系標準方法在磷酸緩沖液(200ml，10mM，pH7.4)中，通過攪拌，使100單位的丁炔醇I酯酶與20mmol的丁炔醇酯進行反應。對pH進行連續監測并通過連續滴定使pH值保持在7.0。利用甲基叔丁基醚對所取樣品萃取兩次，通過GC(Chiraldex GTA)對所得有機相進行分析。
結果外消旋體拆分的質量和反應速率取決于酸部分的大小和疏水性。丁炔醇I酯酶的最佳底物是丁酸丁炔醇酯和甲基丁酸丁炔醇酯。脂肪酶對這些底物沒有活性。對于長鏈的酯如正癸酸丁炔醇酯也是如此。
表2
表2表明利用丁炔醇I酯酶轉化酯時對映體過剩對被轉化酯的酸部份的依賴性。
實施例7利用丁炔醇I酯酶在有機介質中進行轉酯反應將10mmol的外消旋丁炔醇與5mmol的丁酸乙烯酯溶解于50ml的甲基叔丁基醚(MTBE)中，并與固定在硅藻土上的9單位的丁炔醇I酯酶(3.3g)進行混合，在室溫下搖動混合物24h。過濾之后，除去溶劑并利用GC對產物混合物進行表征。
轉化率47％時，得到(R)-丁炔醇(18％ee)和(S)-丁炔醇的丁酸酯(45％ee)。
在甲基異丁基酮中，轉化率43％時得到16％ee的(R)-丁炔醇和52％ee的丁酸(S)-丁炔醇酯。
表3表明利用丁炔醇I酯酶轉化酯時對映體過剩對被轉化酯的酸部分的依賴性。
表3
1)三個最佳的S-丁基醇ee值的平均值序列表<110>巴斯福股份有限公司(BASF Aktiengesellschaft)<120>丁炔醇I酯酶<130>M/42107 Butinol I Esterase<140>
<141>
<160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1530<212>DNA<213>穎殼假單孢菌(Pseudomonas glumae)LU 2023<220>
<221>CDS<222>(1)..(1530)<400>1atg atc gtc caa ctg atc gcc atc gtg gtc gcc ctc tac gcc gtg ctg 48Met Ile Val Gln Leu Ile Ala Ile Val Val Ala Leu Tyr Ala Val Leu1 5 10 15ttc gcg ttc acg ctg ttc acc gcg cat cag gtg cgc cgc cgc ttt ccg 96Phe Ala Phe Thr Leu Phe Thr Ala His Gln Val Arg Arg Arg Phe Pro20 25 30ccc gag ggc aag ttc gtc gag atc gac ggc gac cgc ctg cat tat gtc 144Pro Glu Gly Lys Phe Val Glu Ile Asp Gly Asp Arg Leu His Tyr Val35 40 45gac tac ggc agc ggg ccg ccg atc gtg atg gtg cat ggc ctg tgc ggg 192Asp Tyr Gly Ser Gly Pro Pro Ile Val Met Val His Gly Leu Cys Gly50 55 60cag ctg ctg aac ttc gcc tac ctc gat ctg gcg cgg ctc gcg cag tcg 240Gln Leu Leu Asn Phe Ala Tyr Leu Asp Leu Ala Arg Leu Ala Gln Ser65 70 75 80cat cgc gtg atc ctc gtc gat cgg gcc ggc tcg gga cgc tcg acg cgc288His Arg Val Ile Leu Val Asp Arg Ala Gly Ser Gly Arg Ser Thr Arg85 90 95ggc ccc gcc tcg cgc gcg aac gtc tat gcg cag gcg cgc ggc atc gcc336Gly Pro Ala Ser Arg Ala Asn Val Tyr Ala Gln Ala Arg Gly Ile Ala100 105 110cgc ttc atc gag acg ctc ggc ctg gag cgg ccg gtg ctg gtg ggc cat384Arg Phe Ile Glu Thr Leu Gly Leu Glu Arg Pro Val Leu Val Gly His115 120 125tcg ctc ggc ggc gcg atc gcg ctc gcg gtc ggc ctg gac tac ccc gag432Ser Leu Gly Gly Ala Ile Ala Leu Ala Val Gly Leu Asp Tyr Pro Glu130 135 140cgc gtg agc cgc atc gcg ctg atc gcg ccg ctc acg cac acc gag acc480Arg Val Ser Arg Ile Ala Leu Ile Ala Pro Leu Thr His Thr Glu Thr145 150 155 160gag ccg ccc aag gcg ttc cgc ggg ctc gcg ctg cgc ccg gcg gcg ctg528Glu Pro Pro Lys Ala Phe Arg Gly Leu Ala Leu Arg Pro Ala Ala Leu165 170 175cgc cgc ttc gcg tcg ctg acg atg ggc atc ccg atc atg att ctg caa576Arg Arg Phe Ala Ser Leu Thr Met Gly Ile Pro Ile Met Ile Leu Gln180 185 190agc cgc aag gcg atc gac gcg atc ttc gcg ccg gag ccg gtg ccg cgc624Ser Arg Lys Ala Ile Asp Ala Ile Phe Ala Pro Glu Pro Val Pro Arg195 200 205gat ttc ccg ctg aag ggc ggc ggc atg atg ggg ctg cgg ccc gag gcg672Asp Phe Pro Leu Lys Gly Gly Gly Met Met Gly Leu Arg Pro Glu Ala210 215 220ttc tac gcg gcg tcg tcg gac ctg gtc gcc gcg ccc gag gac ctg ccc720Phe Tyr Ala Ala Ser Ser Asp Leu Val Ala Ala Pro Glu Asp Leu Pro225 230 235 240gac atg gag cgc cgc tac ccg acg ctg ggc gtg ccg gtc agc atg ctg768Asp Met Glu Arg Arg Tyr Pro Thr Leu Gly Val Pro Val Ser Met Leu245 250 255tac ggg cgc cag gac gcg atc ctc gat ttc cac aag cat ggc gag ggg816Tyr Gly Arg Gln Asp Ala Ile Leu Asp Phe His Lys His Gly Glu Gly260 265 270ctc aag cgc aag ctc gac ggc gtc gag ctg agc gcc gtc gag ggc ggg864Leu Lys Arg Lys Leu Asp Gly Val Glu Leu Ser Ala Val Glu Gly Gly275 280 285cac atg ctg ccc gtg acg cag ccg gcc gcc acc acc gac tgg ctc ctc912His Met Leu Pro Val Thr Gln Pro Ala Ala Thr Thr Asp Trp Leu Leu290 295 300gcg gtg gcc gcg gcg gcg aac gcg gcg gcg cag cac gat gcg gcg cgg960Ala Val Ala Ala Ala Ala Asn Ala Ala Ala Gln His Asp Ala Ala Arg305 310 315 320ccg gat ccg gca ccg tcc gag gtc acg cag gcc ggc gcg ctg cag cat1008Pro Asp Pro Ala Pro Ser Glu Val Thr Gln Ala Gly Ala Leu Gln His325 330 335ctg aag gtc ggc gac aac gtg ctg atc ggc aag aag ccc acc ggc acg1056Leu Lys Val Gly Asp Asn Val Leu Ile Gly Lys Lys Pro Thr Gly Thr340 345 350ctg gtg gcc gac aac ctg ctg ccg ggc aag acc ctg tgg ctg ctg tcg1104Leu Val Ala Asp Asn Leu Leu Pro Gly Lys Thr Leu Trp Leu Leu Ser355 360 365acc ggc acg ggt ctc gcg ccg ttc atg tcg atc atc cgc gat ccg gac1152Thr Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe Met Ser Ile Ile Arg Asp Pro Asp370 375 380atc tac gaa cgc tac gag aag gtg gtg ctc acg cac acc tgc cgc ctg1200Ile Tyr Glu Arg Tyr Glu Lys Val Val Leu Thr His Thr Cys Arg Leu385 390 395 400aag ggc gag ctc gcg tac atg gac ttc atc aag cac gac ctg ccg ggc1248Lys Gly Glu Leu Ala Tyr Met Asp Phe Ile Lys His Asp Leu Pro Gly405 410 415cat gag tac ctc ggc gac atc atc aag gaa aag ctg atc tac tac ccg1296His Glu Tyr Leu Gly Asp Ile Ile Lys Glu Lys Leu Ile Tyr Tyr Pro420 425 430acc gtc acg cgc gaa gcg ttc gac aac gag ggg cgg atc acc gac ctg1344Thr Val Thr Arg Glu Ala Phe Asp Asn Glu Gly Arg Ile Thr Asp Leu
435 440 445atc tcg acg ggc aag ctg ttc acc gat ctc gac gtc ccg ccg ttc tcg1392Ile Ser Thr Gly Lys Leu Phe Thr Asp Leu Asp Val Pro Pro Phe Ser450 455 460ccc gag aac gac cgc gtg atg ctg tgc ggc agc acc gcg atg ctg aag1440Pro Glu Asn Asp Arg Val Met Leu Cys Gly Ser Thr Ala Met Leu Lys465 470 475 480gac acc acc gac ctg ctc aag cag gcc ggc ctc gtc gaa ggc aag aac1488Asp Thr Thr Asp Leu Leu Lys Gln Ala Gly Leu Val Glu Gly Lys Asn485 490 495agc gcg ccg ggc cac tat gtg atc gaa cgc gca ttt gtc gac1530Ser Ala Pro Gly His Tyr Val Ile Glu Arg Ala Phe Val Asp500 505 510<210>2<211>510<212>PRT<213>穎殼假單孢菌LU 2023<400>2Met Ile Val Gln Leu Ile Ala Ile Val Val Ala Leu Tyr Ala Val Leu1 5 10 15Phe Ala Phe Thr Leu Phe Thr Ala His Gln Val Arg Arg Arg Phe Pro20 25 30Pro Glu Gly Lys Phe Val Glu Ile Asp Gly Asp Arg Leu His Tyr Val35 40 45Asp Tyr Gly Ser Gly Pro Pro Ile Val Met Val His Gly Leu Cys Gly50 55 60Gln Leu Leu Asn Phe Ala Tyr Leu Asp Leu Ala Arg Leu Ala Gln Ser65 70 75 80His Arg Val Ile Leu Val Asp Arg Ala Gly Ser Gly Arg Ser Thr Arg85 90 95Gly Pro Ala Ser Arg Ala Asn Val Tyr Ala Gln Ala Arg Gly Ile Ala100 105 110Arg Phe Ile Glu Thr Leu Gly Leu Glu Arg Pro Val Leu Val Gly His115 120 125Ser Leu Gly Gly Ala Ile Ala Leu Ala Val Gly Leu Asp Tyr Pro Glu130 135 140Arg Val Ser Arg Ile Ala Leu Ile Ala Pro Leu Thr His Thr Glu Thr145 150 155 160Glu Pro Pro Lys Ala Phe Arg Gly Leu Ala Leu Arg Pro Ala Ala Leu165 170 175Arg Arg Phe Ala Ser Leu Thr Met Gly Ile Pro Ile Met Ile Leu Gln180 185 190Ser Arg Lys Ala Ile Asp Ala Ile Phe Ala Pro Glu Pro Val Pro Arg195 200 205Asp Phe Pro Leu Lys Gly Gly Gly Met Met Gly Leu Arg Pro Glu Ala210 215 220Phe Tyr Ala Ala Ser Ser Asp Leu Val Ala Ala Pro Glu Asp Leu Pro225 230 235 240Asp Met Glu Arg Arg Tyr Pro Thr Leu Gly Val Pro Val Ser Met Leu245 250 255Tyr Gly Arg Gln Asp Ala Ile Leu Asp Phe His Lys His Gly Glu Gly260 265 270Leu Lys Arg Lys Leu Asp Gly Val Glu Leu Ser Ala Val Glu Gly Gly275 280 285His Met Leu Pro Val Thr Gln Pro Ala Ala Thr Thr Asp Trp Leu Leu290 295 300Ala Val Ala Ala Ala Ala Asn Ala Ala Ala Gln His Asp Ala Ala Arg305 310 315 320Pro Asp Pro Ala Pro Ser Glu Val Thr Gln Ala Gly Ala Leu Gln His325 330 335Leu Lys Val Gly Asp Asn Val Leu Ile Gly Lys Lys Pro Thr Gly Thr340 345 350Leu Val Ala Asp Asn Leu Leu Pro Gly Lys Thr Leu Trp Leu Leu Ser355 360 365Thr Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe Met Ser Ile Ile Arg Asp Pro Asp370 375 380Ile Tyr Glu Arg Tyr Glu Lys Val Val Leu Thr His Thr Cys Arg Leu385 390 395 400Lys Gly Glu Leu Ala Tyr Met Asp Phe Ile Lys His Asp Leu Pro Gly405 410 415His Glu Tyr Leu Gly Asp Ile Ile Lys Glu Lys Leu Ile Tyr Tyr Pro420 425 430Thr Val Thr Arg Glu Ala Phe Asp Asn Glu Gly Arg Ile Thr Asp Leu435 440 445Ile Ser Thr Gly Lys Leu Phe Thr Asp Leu Asp Val Pro Pro Phe Ser450 455 460Pro Glu Asn Asp Arg Val Met Leu Cys Gly Ser Thr Ala Met Leu Lys465 470 475 480Asp Thr Thr Asp Leu Leu Lys Gln Ala Gly Leu Val Glu Gly Lys Asn485 490 495Ser Ala Pro Gly His Tyr Val Ile Glu Arg Ala Phe Val Asp500 505 510<210>3<211>32<212>PRT<213>穎殼假單孢菌Lu2023<400>3Phe Ile Glu Thr Leu Gly Leu Glu Arg Pro Val Leu Val Gly His Ser1 5 10 15Leu Gly Gly Ala Ile Ala Leu Ala Val Gly Leu Asp Tyr Pro Glu Arg20 25 30<210>4<211>14<212>PRT<213>穎殼假單孢菌Lu2023<400>4Ile Ala Leu Ile Ala Pro Leu Thr His Thr Glu Thr Glu Pro1 5 10<210>5<211>20<212>PRT<213>穎殼假單孢菌Lu2023<400>5Gly Gly Gly Met Met Gly Leu Arg Pro Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Ser1 5 10 15Ser Asp Leu Val20<210>6<211>11<212>PRT<213>穎殼假單孢菌Lu2023<400>6Ala Ile Asp Ala Ile Phe Ala Pro Glu Pro Val1 5 10
權利要求
1.具有丁炔醇I酯酶活性的蛋白質及其具有丁炔醇I酯酶活性的功能等價物，其中所述蛋白質包含至少一個根據SEQ ID NO.3，4，5或6的部份氨基酸序列。
2.如權利要求1所述的蛋白質及其功能等價物，其中所述蛋白質包含根據SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
3.如權利要求1或2所述的蛋白質，其中功能等價物包含至少一段由SEQ ID NO.2，3，4，5或6所示的氨基酸序列中至少10個連續氨基酸殘基組成的部分序列。
4.如任一前述的權利要求所述的蛋白質，其包含一條分子量約為41300Da的多肽鏈。
5.如任一前述的權利要求所述的蛋白質，其中所述的蛋白質可從保藏號為DSM 13176的穎殼假單胞菌Lu 2023中獲得。
6.如任一前述的權利要求所述的蛋白質，其中所述的蛋白質能夠催化至少一種下列反應a)對映體選擇性的水解具有旋光性的式I的酯R1-COO-R2(I)，其中R1是直鏈的或支鏈的，未取代的或單取代的或多取代的C1-C10烷基，C2-C10鏈烯基，C2-C10炔基，R2是直鏈的或支鏈的，未取代的或單取代的或多取代的C1-C1 0烷基，C2-C10鏈烯基，C2-C10炔基，C7-C15芳烷基或單環的或多環的，未取代的或單取代的或多取代的芳族基團，R1和/或R2包含至少一個不對稱碳；和b)利用具有旋光性的式II的醇對式I的酯進行對映體選擇性的酯交換R2-OH (II)，其中R2具有如上一種含義，并且在適當的情況下，具有至少一個不對稱碳。
7.編碼如任一前述權利要求所述的蛋白質的多核苷酸，以及其功能等價物，與其互補的多核苷酸和可與其雜交的核酸序列。
8.如權利要求7所述的多核苷酸，其包含由SEQ ID NO.1的核酸序列中的至少30個連續核苷酸殘基組成的核苷酸序列。
9.表達盒，其包含至少一段如權利要求7或8所述的多核苷酸，并且該多核苷酸與至少一段調節核酸序列可操作地連接。
10.用于轉化真核或原核宿主的重組載體，其包含如權利要求7或8所述的多核苷酸，或者如權利要求9所述的表達盒。
11.用于制備如權利要求1至6之任一項所述的蛋白質的方法，其中，對能夠內源性生產該蛋白質的微生物或用如權利要求10所述的載體轉化的微生物進行培養，并從培養物中分離出該蛋白質。
12.如權利要求11所述的方法，其中微生物是穎殼假單胞菌Lu 2023，保藏號DSM 13176。
13.按照如權利要求11或12所述的方法可以獲得的蛋白質。
14.保藏號為DSM 13176的穎殼假單胞菌Lu 2023及其變體和突變體。
15.微生物，其包含如權利要求10所述的載體。
16.利用如權利要求1至6之任一項所述的蛋白質進行對映體選擇性酯水解的方法，其中a)使此蛋白質與具有旋光性的式I的酯的立體異構體混合物接觸；并b)從反應介質中得到由立體選擇性的水解任一種立體異構體所產生的旋光性化合物和/或未水解的酯對映異構體。
17.用于進行對映體選擇性轉酯反應的方法，其中a)在如權利要求1至6之任一項所述的蛋白質存在下，將具有旋光性的式II的醇的立體異構體混合物與式I的酯接觸，然后從反應介質中得到未反應的醇立體異構體；或者b)在如權利要求1至6之任一項所述的蛋白質存在下，將具有旋光性的式I的酯的立體異構體混合物與式II的醇接觸，然后從反應介質中得到包含在酯中的旋光性醇的立體異構體。
18.如權利要求17所述的方法，其中利用乙烯基酯作為轉酯反應中旋光性醇的酰化劑。
19.如權利要求16，17和18之任一項所述的方法，其中所用的反應介質是有機溶劑。
20.利用如權利要求1至6之任一項所述的蛋白質制備的旋光性醇，羧酸或酯。
全文摘要
本發明涉及來自穎殼假單胞菌的具有酯酶活性，特別是具有丁炔醇I酯酶活性的新蛋白，涉及編碼此蛋白的核酸序列，表達盒，載體和重組微生物；本發明還涉及制備所述蛋白質的方法和此蛋白在進行有機酯的酶促，特別是對映體選擇性的酶促酯水解或轉酯反應中的用途。
文檔編號C12N1/15GK1449447SQ01814931
公開日2003年10月15日 申請日期2001年8月30日 優先權日2000年8月31日
發明者B·豪爾, T·弗里德里希, C·尼貝林, R·施蒂默爾, W·拉德納 申請人:巴斯福股份公司