利用嵌合噬菌體標準物的高靈敏基因組檢測的制作方法

專利名稱：利用嵌合噬菌體標準物的高靈敏基因組檢測的制作方法
相關申請的陳述本申請根據35USC§119(e)要求2001年12月6日申請的USSN60337,930的優先權，該申請此處被特別完全引入作為參考。
背景技術：
為了定量基因組靶物質如DNA靶物質，準確而可靠的標準物是必須的。在DNA標準物的實例中，通常，質粒DNA和PCR產物因為容易產生而被首選。通過利用質粒DNA或PCR產物的分子量分離它們，檢測質粒DNA或PCR產物的光密度可提供標準物的粗略估計的拷貝數量。但是，這種方法有一些缺點，主要由于光密度儀器(分光計)在定量質粒和PCR產物時的不穩定性，它不僅隨著實驗室與實驗室的不同而改變，也隨著同一實驗室的不同人而改變。此外，質粒DNA和PCR產物傾向于不穩定，因為發現它們對多次反復凍融和偶然的脫氧核糖核酸酶污染很敏感。
發明概述總的來說，本發明涉及利用雜交方法學靈敏地定量生物樣品中至少一種預選擇的DNA序列的方法，該方法利用感染性噬菌體顆粒用作內標物(internal standard)，該噬菌體顆粒包含可檢測的靶DNA序列，而不是那些存在于預選擇DNA序列中的或生物樣品中被定量的DNA中的，該方法使用至少包含預選擇DNA序列的感染性噬菌體顆粒作為外標物(external standard)。
在前述的方法中，預選擇DNA序列可以是病毒DNA序列的部分，其中生物樣品中的致病病毒的存在和數量期望被檢測出。優選為人類致病病毒；最優選為HBV或其它DNA病毒；然而，預選擇DNA序列可以是任何來源的，并且該樣品來自任何懷疑帶有預選擇DNA序列的生物體。該樣品可以是體液，如全血，尿液，血漿，血清，腦脊液或含有細胞的活檢樣品。該利用雜交方法的DNA檢測方法學優選可以是使用分子標志或熒光染料標記的任何其它形式探針的實時PCR(real-time PCR)。該內標物可以是感染性噬菌體，其被改造含有可檢測序列的單拷貝。外標物可以是感染性噬菌體，其被改造至少含有期望被檢測的預選擇DNA的單拷貝。對于利用分子標志的實時PCR方法，使用被設計為擴增和檢測內標物序列以及擴增和檢測在樣品和在外標物中的預選擇DNA序列的引物和分子標志。雜交方法學釋放了在改造的噬菌體中的DNA，此處指嵌合噬菌體(釋放其中的DNA)。
一種優選的，但并不局限的可以被用作內標物和外標物的噬菌體可以是M13但并不是非常局限的，通過制備嵌合噬菌體，從中保留其感染力并包含可檢測序列的單拷貝。可以使用但不局限于其它噬菌體，優選那些具有單鏈環狀DNA的噬菌體，雙鏈DNA病毒也可以使用，如λ。
用于內標物和外標物的DNA序列被改造引入到相應的噬菌體中以生產嵌合噬菌體。由于插入序列并不影響噬菌體的感染力，標準物中的靶DNA的絕對數量可以通過感染檢測容易地確定。
內標物嵌合噬菌體包含易于檢測出的DNA序列，該序列在生物樣品中不存在，因此當已知數量的內標物嵌合噬菌體在處理之前被加入到樣品中時，內標物嵌合噬菌體DNA的收獲(recovery)程度可以被用于評價其中含有的預選擇DNA的收獲率。優選地，樣品中的預選擇DNA來自病毒顆粒，如致病病毒，這樣，在與樣品中的任何病毒顆粒和加入的嵌合噬菌體顆粒一起處理的過程中，二者在樣品處理和分離DNA的過程中都接受同樣的處理條件，從而，內標物DNA的收獲率精確地反映了存在于原始樣品中的任何預選擇DNA的收獲率。雖然本發明中嵌合噬菌體的使用優選用于在生物樣品中檢測病毒DNA，但是它不僅限于此，它可被用于檢測生物樣品中其它DNA，如細菌，寄生物，或甚至是樣品中的宿主衍生的DNA。
在優選的實施方案中，內標物嵌合噬菌體包含人CCR5 DNA序列的一部分的一個拷貝。這種內標物可以被用于人DNA不存在于從樣品中提取出的DNA中的任何檢測中。如果存在人DNA，那么可以使用一種不存在于人類基因組或通過DNA雜交方法在人DNA樣品中可以檢測出的內標物DNA序列。在一個非限制的實施方案中，使用人CCR5基因從氨基酸132延伸至224的相應部分(SEQ ID NO5)。該PCR引物可以檢測SEQID NO6和SEQ ID NO7。一種能夠檢測上述CCR5序列(如在SEQ ID NO8中所顯示的序列)的分子標志被使用。在另一個實例中，內標物嵌合噬菌體包含人CD4 DNA序列的一部分，使用相應的探針和分子標志。
在一個非限定的實例中，本發明實踐使用的用于在來自人類個體的全血樣品中定量HBV病毒的試劑；通過此方法用來定量的DNA從全血樣品的血漿中分離出來，并基本不含人DNA。內標物是一種感染性的嵌合M13噬菌體，其通過改造含有人CCR5 DNA序列一部分的單拷貝，例如但不限于如上所述；外標物是一種感染性的嵌合M13噬菌體，具通過改造含有HBV DNA序列一部分的單拷貝。前述兩種嵌合噬菌體標準物的DNA的數量的確定通過測定噬菌斑形成單位(PFU)完成；這些穩定的標準物可以冷凍貯藏。如上所述，在該非限制性實施例中使用被設計來擴增和檢測內標物序列以及被設計來擴增和檢測些在樣品中和在外標物中預選擇DNA的引物和分子標志。
例如如果預定量一種病毒，包含與樣品中相同的可檢測的預選擇DNA序列的外標物可以是通過與樣品中的病毒相同的DNA定量方法可檢測的病毒基因組的一部分。這樣，PCR引物和分子標志在樣品中擴增并識別的該序列的單拷貝可以通過改造引入到噬菌體基因組中。在非限定的實施例中，被用作HBV外標物的噬菌體顆粒(如M13噬菌體顆粒)可以包含HBVS基因的編碼氨基酸127至164的DNA的單拷貝，該DNA序列描述于SEQ ID NO1中。在外標物中和在樣品中擴增和檢測該序列的PCR引物和分子標志是容易制備的。在該實例中，制備與SEQ ID NO2和SEQ ID NO3雜交的引物。一種有用的用來檢測該序列的分子標志識別描述于SEQ ID NO4的序列。
如上所述，內標物可以是一種感染性噬菌體，通過改造含有任何非預選擇DNA序列，且不偶然存在于樣品中的DNA序列。
含有內標物和外標物序列的工程噬菌體顆粒提供了在進行高靈敏檢測中容易使用的高穩定性試劑。由于噬菌體的存活力不受插入序列的影響，因而對于噬菌體PFU的檢測提供了在標準物中存在的DNA序列數目的準確的定量，因而這些試劑的標準化是簡單的。
為了實現本發明的方法，在檢測人全血中的HBV的非限定的實施例中，離心全血樣品，取100微升等分的血漿，加入已知數量的內標物含CCR5基因片段的嵌合噬菌體，提取該DNA。在處理后的樣品中對HBV和CCR5片段進行實時PCR，連同使用含有部分HBV序列的嵌合噬菌體的HBV外標物通過與用于樣品中的相同的引物和分子標志檢測出。樣品中CCR5的收獲率和檢測出的HBV的數量被用來計算原始樣品中實際的HBV數量。
本發明也涉及含有插入的內標物序列和外標物序列的噬菌體顆粒，尤其是這種插入對于病毒的生存力沒有有害的影響，從而正確定量出病毒樣品中特定DNA的拷貝數。因此，樣品中PFU的數量與存在于噬菌體標準物中的內標物序列和外標物序列相等。在非限制的實例中，SEQ IDNO1插入到位置6247的M13噬菌體包括在此，還包括SEQ ID NO5插入到位置6247的M13噬菌體。這些僅僅是本發明典型的工程噬菌體。
本發明的這些和其它方面將通過以下附圖的簡要說明和發明詳述來說明。
附圖簡述

圖1描述了用本發明的方法準確定量生物樣品中的HBV基因組的實例，其中在DNA提取和對HBV進行實時PCR之前，將噬菌體-CCR5內標物加入到該樣品中，并與利用噬菌體-HBV的外標物產生的標準曲線比較。
圖2顯示一種檢測一部分HBV基因組的分子標志(A)，示意圖(B)顯示標志與靶序列的雜交，導致熒光團與標志末端的淬滅劑分離和隨之產生的熒光。
圖3A-C顯示PCR擴增含有標志的靶序列的DNA的示意圖，以及由加入樣品中的不斷增長的數量的噬菌體-HBV產生的標準曲線(圖3B-C)。
圖4A-B顯示在本發明的HBV檢測中使用的引物和標志的基因組定位。在編碼氨基酸127-164的序列的5’和3’末端陰影序列是PCR引物，更暗的位于中央的序列是標志的識別序列。
圖5顯示用于CCR5檢測的引物和標志的位置。在CCR5基因部分的5’和3’末端的陰影序列是PCR引物，更暗的位于中央的序列是標志的識別序列。
圖6A-B顯示本發明HBV檢測的靈敏性和動態范圍的兩個實例。
圖7A-F描述了在4℃(圖7A-B)、室溫(圖7C-D)和37℃(圖7E-F)貯藏3-4周后，含有HBV多核苷酸的噬菌體的穩定性。
圖8A-D顯示對樣品中的HBV序列(圖8A-B)和CCR5(圖8C-D)序列的同時(多元)檢測，并且在同一試管中HBV和CCR5的擴增互不干涉。
發明詳述在描述本方法之前，應該理解本發明并不僅限于所描述的特定方法和實驗條件，因為這種方法和條件可以改變。也應當理解，這里使用的術語僅用來描述特定的實施方案，并不用于限制，因為本發明的范圍僅由附加的權利要求所限定。
正如在說明書和附加的權利要求中所用的，單一形式的“一個”和“這個”包括復數，除非上下文中有清楚的指示。因而例如，涉及“一種方法”包括一種或多種方法，和/或這里描述類型的步驟，和/或對于閱讀了本公開的本領域技術人員來說變得明顯的方法等。
除非另有定義，這里使用的所有的技術和科學術語與本發明所屬領域的普通技術人員理解的意義相同。雖然任何與這里描述相似或相同的方法和材料可以用于本發明實踐或檢驗，但優選的方法和材料在這里描述。這里涉及的所有出版物被引入作為參考，用來描述與引用的出版物相關的方法和/或材料。
本發明的檢測提供了準確和靈敏定量樣品中預選擇DNA序列的水平的方法。該檢測方法優選適于檢測生物樣品中病毒顆粒的數量，但并不僅限于此，檢測使用的標準物是活的含有適當DNA序列的噬菌體顆粒對于內標物，插入的DNA的收獲率被評價，并且從而校正得到的檢測水平，利用含有與插入DNA完全不同的DNA序列的噬菌體，以使內標物的檢測能力不受樣品或檢測中的任何成分的影響。用于產生標準曲線或單點校準器(Single-point calibrator)的外標物，是一種至少包含與樣品中檢測的相同的DNA序列的活噬菌體顆粒，因此用定量在樣品中預選擇DNA的試劑可以用作外標物。使用一種基于雜交的DNA檢測方法，加入到檢測中的標準物噬菌體中的DNA在第一次融解循環中從噬菌體中釋放。
由于一些原因，利用活的含有外標或內標DNA序列的噬菌體的本發明基因組檢測提供了一種高度準確和靈敏性的檢測。首先，噬菌體顆粒容易產生(將近109PFU/ul)。其次，通過測定與有限稀釋PCR檢測相匹配的PFU，該噬菌體和在噬菌體中的DNA因而容易被定量。第三，保存和轉移噬菌體顆粒是容易的，因為它們能抵抗脫氧核糖核酸酶的處理和溫度的變化。最后，它很容易達到精確，因為不必提取DNA:PCR條件使標準物的DNA從它們的噬菌體顆粒包裝中釋放出來。在M13的實例中，一旦被加熱到95℃時，在模板的初始片段變性期間，單鏈環形的DNA自動地釋放到PCR反應混合物中。本發明的工程噬菌體顆粒在此處是指嵌合噬菌體，以反映在噬菌體基因組中非噬菌體DNA的存在。
正如在下面實施例中所示，本發明的檢測適合具有6-log動態范圍的HBV的檢測，并且可以檢測到從小到10個至10,000,000個HBV拷貝。相比之下，Roche HBV Monitor檢測具有200個拷貝的靈敏度，操作范圍3log并從而可檢測200至200,000個拷貝；Bayer的HBV bDNA檢測操作范圍4log，靈敏度為0.7Meq(×106)，從而可以檢測0.7至5000Meq(×106)。
嵌合噬菌體按照如下標準重組DNA技術制備。簡單地說，靶序列通過PCR擴增并用T4(Gibco)連接酶過夜連接插入到SmaI或XmaI位點。由于將DNA片段插入到SmaI或XmaI位點會中斷α-肽序列，因而β-半乳糖苷酶活性喪失，它通過白色的噬斑取代了藍色的噬斑反映出來。通過挑選多個白色噬斑，之后進行一系列序列鑒定，我們從而可以選擇那些帶有符合需要的靶序列的M13噬菌體。M13噬菌體序列長為7250個bp，并且它的全序列和限制性核酸內切酶信息可以在Internet上找到，網址為www.lifetech.com。這里的靶序列是不變的，并且在多克隆位點插入到SmaI或XmaI位點。
除了上述的靶序列，任何與檢測基因組序列相同的DNA序列可以被插入到M13噬菌體中。然而為了避免在測試樣品中檢測到污染的基因組DNA，通常可以將cDNA序列插入到M13噬菌體中，由于一個大的內含子存在于不同的外顯子之間從中不會擴增到基團組DNA。因此，在本發明的這種實施方案的一個實例中，人CD4基因的引物和標志根據此處的教導制備而成。而且，許多單鏈和雙鏈DNA噬菌體可以被用作同樣形式的定量性標準物。在單鏈DNA的實例中，M13無疑是最方便和可靠的選擇，已有許多關于這種載體和它生物學的知識。至于雙鏈噬菌體，λ系列因為上述同樣的原因是一種優選。通過測定PFU，所有的這些重組噬菌體都非常容易生產、純化和定量。
實施例為了向本領域普通技術人員提供完全的公開和說明怎樣制備和使用本發明的方法和合成物，公開以下實施例，但是并不是有意限定發明者認為的其發明的范圍。雖然已經努力確保關于所使用數量的準確性(如數量，溫度等)，但是應該考慮到一些實驗誤差和偏差。除非已經指出，否則，部分是指按重量計的部分，分子量是指平均分子量，溫度是用攝氏度表示，壓力是指等于或接近大氣壓。
M13噬菌體DNA標準物制備如下用適當的檢測引物和產生平端產物的Pfu多聚酶產生目的擴增子。該產物在1％的瓊脂糖凝膠中純化，并根據制造商的說明書連接到M13mp 18RF DNA(Gibco)上。連接產物用于轉化DHα5F’感受態細胞(Gibco)。由于缺少β-半乳糖苷酶活性，含有插入片段的噬菌體產生的噬斑用藍/白選擇進行識別。通過在一個30循環的PCR中(90℃進行30秒，55℃進行30秒，72℃進行1分鐘)，用引物M13-pUC-F(5’CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’)(SEQ ID NO9)和M13/pUC-b(5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’)(SEQ ID NO10)，篩選陽性噬斑。這些是插入區域側翼的M13噬菌體的通用引物。因此它們可用于篩選噬菌體是否有任何插入。正確大小的片段進一步通過序列分析進行篩選。噬菌體被滴定，且系列稀釋在無核糖核酸酶的水中進行。由于10分鐘95℃的變性步驟足夠使噬菌體DNA暴露，因此噬菌體被直接放入PCR反應中。
使用最小2.5×106至2.5×101的6次復制，對每個實時PCR檢測產生一個外標物曲線。由于噬菌體為單鏈，在實時PCR檢測中，一個顆粒相當于0.5個雙鏈DNA的拷貝。噬菌體標準物在室溫和4℃下穩定，雖然它的貯藏維持在-20℃。
本發明的方法示于圖1，為準確定量生物樣品中的HBV基因組，其中將噬菌體-CCR5內標物在DNA提取和對HBV進行實時PCR之前加入到樣品中，并與利用噬菌體-HBV的外標物產生的標準曲線比較。圖2顯示-種檢測HBV基因組的一部分的分子標志(A)，示意圖(B)顯示了標志與靶序列的雜交，導致熒光團與標志末端的淬滅劑分離和隨之產生的熒光。圖3顯示PCR擴增含有標志的靶序列的DNA的示意圖，以及由加入樣品中的不斷增長的數量的噬菌體-HBV產生的標準曲線。圖4顯示在本發明的一個HBV檢測中使用的引物和標志的基因組位置。在編碼氨基酸127-164的序列的5’和3’末端的陰影序列是PCR引物，更暗的位于中央的序列是標志的識別序列。圖5表示用于CCR5檢測的引物和標志的位置。在CCR5基因部分的5’和3’末端的陰影序列是PCR引物，更暗的位于中央的序列是標志的識別序列。
圖6顯示本發明HBV檢測的靈敏性和動態范圍的兩個實例。圖7描述了在4℃，室溫和37℃貯藏3-4周后，含有HBV多核苷酸的噬菌體的穩定性。圖8表示對樣品中的HBV序列和CCR5序列的同時(多元的)檢測，并且在同一試管中HBV和CCR5的擴增互不干涉。結果顯示，含有HBV基因或CCR5基因的M13噬菌體的產生是非常有效的，并且感染噬菌體的效價高達每微升培養上清液109。進一步，本發明的方法在含有HBV基因或CCR5基因的感染性M13噬菌體的噬斑形成單位與通過有限稀釋定量PCR測定的拷貝數之間獲得了非常高的相關性。
序列表<110>Zhang，LinqiHo，David A.
<120>使用嵌合噬菌體的高靈敏性基因組檢測<130>2570-1-002<150>US 60/337,930<151>2001-12-06<160>10<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>112<212>DNA<213>噬菌體M13<400>1tcgctggatg tgtctgc9gc gttttatcat cttcctctgc atcctgctgc tatgcctcat 60cttcttgttg gttcttctgg actatcaagg tatgttgccc gtttgtcctc ta112<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2tcgctggatg tgtctgcggc gttttat 27<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3ggtatgttgc ccgtttgtcc tcta24<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>標志
<400>4cctgctgcta tgcctcatct tcttgttgg 29<210>5<211>239<212>DNA<213>人類<400>5gctgtgtttg cgtctctccc aggaatcatc tttaccagat ctcaaaaaga aggtcttcat 60tacacctgca gctctcattt tccatacagt cagtatcaat tctggaagaa tttccagaca120ttaaagatag tcatcttggg gctggtcctg ccgctgcttg tcatggtcat ctgctactcg180ggaatcctaa aaactctgct tcggtgtcga aatgagaaga agaggcacag ggctgtgag 239<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6gctgtgtttg cgtctctccc agga24<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7gaagaagagg cacagggctg tgag24<210>8<211>28<212>DNA<213>人類<400>8gctggtcctg ccgctgcttg tcatggtc28<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9cccagtcacg acgttgtaaa acg 23<210>10
<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10agcggataac aatttcacac agg 2權利要求
1.一種利用雜交方法學在生物樣品中定量至少一種預選擇DNA序列的方法，其中該方法利用一種感染性M13噬菌體顆粒作為內標物，該噬菌體顆粒包含可檢測的靶DNA序列，所述的靶DNA序列不是存在于預選擇DNA序列中的或生物樣品中被定量的DNA中的那些，該方法并利用包含預選擇DNA序列的感染性的M13噬菌體顆粒作為外標物。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述雜交方法學是使用分子標志的實時PCR擴增。
3.如權利要求1所述的方法，其中內標物是包含人CCR5基因一部分的感染性M13噬菌體。
4.如權利要求3所述的方法，其中所述的人CCR5基因部分是SEQID NO5。
5.如權利要求1所述的方法，其中預選擇DNA序列是乙型肝炎病毒的一部分。
6.如權利要求1所述的方法，其中外標物是包含乙型肝炎病毒基因組的一部分的感染性M13顆粒。
7.如權利要求5所述的方法，其中外標物是包含乙型肝炎病毒基因組的一部分的感染性M13顆粒。
8.如權利要求7所述的方法，其中所述乙型肝炎基因組部分是乙型肝炎S蛋白的一部分。
9.如權利要求8所述的方法，其中所述的部分是SEQ ID NO1。
10.如權利要求1所述的方法，其中所述樣品選自全血、尿、血漿、血清、腦脊髓液或含有細胞的活檢樣品。
11.一種包含SEQ ID NO1的感染性嵌合M13噬菌體。
12.一種包含SEQ ID NO5的感染性嵌合M13噬菌體。
全文摘要
本發明提供了使用雜交方法學靈敏地定量生物樣品中至少一種預選擇DNA序列的方法，該方法使用感染性噬菌體顆粒體作為內標物，該噬體菌體顆粒包含可檢測的靶DNA序列而不含存在于預檢測DNA序列或生物樣品中定量的DNA中的DNA序列，本方法并使用至少包含預選擇DNA序列的噬菌體顆粒作為外標物。
文檔編號C12N7/00GK1612940SQ02826841
公開日2005年5月4日 申請日期2002年12月4日 優先權日2001年12月6日
發明者張林琦, D·D·霍 申請人:阿隆戴蒙德艾滋病研究中心