用于癌癥治療的組合物的制作方法

專利名稱：用于癌癥治療的組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及抑制過度增殖的細胞的生長或增殖，或誘導過度增殖的細胞的退化。更具體地，本發明涉及刺激靶細胞中的糖原積累，以使糖原增加到對靶細胞有毒性的水平。實現增加糖原積累的方法包括例如，增加一個或多個能編碼野生型或突變型的參與糖原合成或輸入的蛋白的基因的表達或活性(例如，通過基因轉移)，和降低一個或多個能編碼野生型或突變型的參與糖原代謝、分解代謝、去除或降解的蛋白的基因的表達或活性(例如，通過反義核酸或小分子)。
背景技術：
癌癥是全球范圍內發病率和死亡率的主導原因。癌癥患者的數量和經濟成本都是巨大的。僅僅在美國，每年就有超過100萬確診的癌癥患者，癌癥的總年度花費超過了8700億美圓，這構成了約4.7％的總年度保健支出。盡管近來的早期檢測技術的進展已經導致了癌癥死亡率的總體下降，仍然沒有普遍有效的預防和治療癌癥的策略。由于多種原因，包括人口老齡化、環境污染等，預期以后幾年的癌癥病例的數目會增加。
現有的癌癥治療一般依賴于早期檢測和侵入性的治療(包括手術、化療、放療或激素療法)的組合。但是，這些治療的侵入力和普遍性的毒性對患者產生許多有害的副作用，因而嚴重損害了它們的臨床有效性和患者的生活質量。
而且，一些癌細胞或腫瘤固有地對用于癌癥治療的細胞毒性的藥物具有抗性；其它的最初能有反應，但是在治療過程中會產生抗性，這是由于選擇壓力促成了預先存在的抗性細胞群體和/或藥物誘導的突變。實際上，藥物抗性是癌癥化療失敗的主要原因。在根除實體瘤中的癌細胞時，充分認識到放療是相對無效的。這樣的失敗是不令人驚訝的，因為放療需要源自氧的自由基來破壞細胞(Gray等，Brit.J.Radiol.26683(1953))，由于缺乏合適的血液供應，腫瘤內的氧水平較低。而且，大多數化療藥物需要氧來發揮它們的功效(Giatromanolaki和Harris，Anticancer Res.214317(2001))。因此，需要能消除癌細胞且能在低氧或缺氧條件下發揮其細胞毒性作用的癌癥療法。
仍然不太清楚癌癥的起因。但是，普遍接受的是，癌癥形成或致癌作用是一個復雜過程，涉及多種遺傳的和環境的因素。在不完全明白多種致癌作用因子之間的復雜相互作用的情況下，要鑒定出能特異性地且普遍地誘導癌細胞死亡或抑制腫瘤生長的治療靶是一項艱巨的挑戰。隨著分子生物學和遺傳學的出現，近來已經鑒定出了許多可能導致癌細胞異常生長的信號傳遞途徑。例如，Ras在約30％的人類癌癥中由于突變而激活，在不同類型的腫瘤中，經常發現生長因子受體(例如，表皮生長因子，胰島素樣生長因子，Her2/Neu受體)的過量表達。這些發現已經導致了設計用于阻斷與癌癥有關的信號轉導途徑中的特定組分的化合物的發現。但是，癌細胞中的信號轉導涉及高度不同的且眾多的途徑和過程。因而，以使用化學藥物來阻斷特定的細胞途徑作為治療癌癥的方法，具有克服抗性的可能。
因此，需要治療癌癥的改進方法，其應當能有效地誘導細胞死亡，同時使對正常細胞的副作用最小化。本發明滿足了該需求，并提供了相關的優點。
發明概述本發明提供了將細胞中的糖原提高到毒性水平的方法。示例性的方法包括在細胞中表達能將細胞中的糖原的量提高到毒性水平的基因產物。在各個方面，基因產物包括能增加糖原的合成或胞內積累的蛋白，例如糖原生成酶，或能降低糖原的代謝、分解代謝、利用、降解或去除的蛋白，例如糖原分解酶。在各個其它方面，能降低糖原的代謝、分解代謝、利用或降解的基因產物包括糖原分解酶的抑制性核酸(例如，反義多核苷酸、小干擾RNA分子或核酶)。
用于實現本發明的方法的靶細胞包括例如，過度增殖的細胞，例如細胞增殖病的細胞；良性增生；和轉移性的和非轉移性的腫瘤和癌細胞。適用于靶向定位的過度增殖的細胞可以是在受試者中，且可以在任何的器官或組織中。示例性的器官和組織包括例如，腦、頭和頸、乳房、食管、嘴、胃、肺、胃腸道、肝、胰、腎、腎上腺、膀胱、結腸、直腸、前列腺、子宮、子宮頸、卵巢、睪丸、皮膚、肌肉和造血系統。
根據本發明使用的基因產物包括蛋白和抑制性核酸(例如，反義多核苷酸、小干擾RNA分子或核酶)。基因產物可以任選地由多核苷酸編碼，該多核苷酸可以包含在載體(例如，病毒或哺乳動物表達載體)中。基因產物和多核苷酸可以任選地包含在小泡(vessicle)中。多核苷酸的表達可以由在過度增殖細胞中有活性的調節元件、例如啟動子(例如，己糖激酶II、COX-2、α-胎蛋白、癌胚抗原、DE3/MUC1、前列腺特異性抗原、C-erB2/neu、端粒酶逆轉錄酶或缺氧-反應啟動子)驅動。
本發明的方法還包括在靶細胞中表達任選地由多核苷酸編碼的一種或多種其它基因產物。示例性的基因產物是能抑制細胞增殖的第二蛋白，例如細胞周期抑制劑或細胞周期蛋白抑制劑。
本發明還提供了將過度增殖細胞中的糖原提高到毒性水平的方法。示例性的方法包括將細胞與能將過度增殖細胞中的糖原的量提高到毒性水平的試劑相接觸。一方面，過度增殖細胞不是肝、肌肉或腦細胞。另一方面，試劑基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型(例如，肝、肌肉或腦糖原磷酸化酶)的活性或表達。在各種其它方面，試劑能增強糖原的合成或胞內積累或降低糖原的代謝、分解代謝、利用、降解或去除。在其它方面，試劑能增強糖原生成酶的表達或活性，或降低糖原分解酶的表達或活性。示例性的試劑包括底物類似物。其它的示例性試劑包括能降低或抑制糖原的代謝、分解代謝、利用或降解的抑制性核酸(例如，反義多核苷酸、小干擾RNA分子或核酶)。
本發明的能將糖原提高到毒性水平的方法任選地包括一種或多種與糖原毒性有關的形態學變化，例如細胞膨脹、溶酶體數目的增加、溶酶體大小的增加、或溶酶體的結構變化。將糖原提高到毒性水平還包括這樣的方法，其能造成細胞的裂解或細胞凋亡，或能抑制或減少細胞的增殖、生長或存活。
根據本發明使用的、且可以刺激或提高其表達或活性的示例性的糖原生成酶包括例如，糖原生成蛋白(Glycogenin)、糖原生成蛋白-2、糖原合酶、糖原生成蛋白相互作用蛋白(GNIP)、蛋白質磷酸酶1(PP-1)、葡萄糖轉運蛋白(GLUT)、PP-1同工型或家族成員的靶向糖原的亞基，己糖激酶同工型或家族成員和谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶。PP-1家族成員的示例性的靶向糖原的亞基包括GL(PPP1R3B，PPP1R4)，PTG(PPP1R3C，PPP1R5)，PPP1R3D(PPP1R6)或Gm/RG1(PPP1R3A，PPP1R3)。
根據本發明使用的、且可以抑制和降低其表達或活性的示例性的糖原分解酶包括例如，糖原磷酸化酶、脫支酶、磷酸化酶激酶、葡萄糖-6-磷酸酶、PPP1R1A(蛋白質磷酸酶1，調節抑制劑亞基1A)，PPP1R2(蛋白質磷酸酶1，調節亞基2)，果糖磷酸激酶，糖原合酶激酶-3同工型，GCKR葡糖激酶調節蛋白和α-葡糖苷酶。
本發明還提供了治療受試者中的細胞增殖病的方法。示例性的方法包括在一個或多個患有該病的細胞中表達能增加胞內糖原的量、足以治療細胞增殖病的基因產物。另一種示例性的方法包括使一個或多個患有該病的細胞與能增加胞內糖原的量、足以治療細胞增殖病的試劑相接觸。一方面，細胞增殖病不是肝、肌肉或腦細胞病。另一方面，試劑基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型(例如，肝、肌肉或腦糖原磷酸化酶)的活性或表達。
用于實現本發明的方法的細胞增殖病包括例如，良性增生、轉移性的和非轉移性的腫瘤和癌癥。腫瘤和癌細胞可以在受試者中，且可以在任何器官或組織中。示例性的器官和組織包括例如，腦、頭和頸、乳房、食管、嘴、胃、肺、胃腸道、肝、胰、腎、腎上腺、膀胱、結腸、直腸、前列腺、子宮、子宮頸、卵巢、睪丸、皮膚、肌肉和造血系統。腫瘤和癌癥可以是任意階段的實體或液體的，例如階段I、II、III、IV或V的腫瘤，或在緩解中。示例性的腫瘤類型包括例如，肉瘤、癌、黑素瘤、骨髓瘤、胚細胞瘤、神經膠質瘤、淋巴瘤和白血病。
本發明還提供了治療患有腫瘤的受試者的方法。示例性的方法包括在一個或多個腫瘤細胞中表達能增加胞內糖原的量、有效地治療受試者的基因產物。另一種示例性的方法包括使一個或多個腫瘤細胞與能增加胞內糖原的量、有效地治療受試者的試劑相接觸。一方面，腫瘤不是肝、肌肉或腦腫瘤。另一方面，試劑基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型(例如，肝、肌肉或腦糖原磷酸化酶)的活性或表達。
治療方法包括預防性的方法以及與另一種治療方法相組合的方法。因而，例如，當受試者患有細胞增殖病(例如腫瘤)時，受試者可以在診斷或出現腫瘤癥狀之前，在為受試者進行腫瘤治療的同時，或者在受試者完成腫瘤治療后，例如，當腫瘤緩解時進行治療。因此，基因產物或試劑可以在施用另一種療法(例如，抗腫瘤或免疫增強療法)之前、基本上與其同時或之后施用。
根據本發明的方法的施用可以提高另一種療法的有效性。例如，施用給正在進行或已經接受了抗腫瘤或免疫增強療法的受試者，可以增加胞內糖原的量，由此提高抗腫瘤或免疫增強療法的有效性。一方面，腫瘤療法不是用于肝、肌肉或腦腫瘤。另一方面，試劑基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型(例如，肝、肌肉或腦糖原磷酸化酶)的活性或表達。因而，治療方法包括施用一種或多種其它的療法。示例性的療法包括例如，施用抗腫瘤或免疫增強治療或試劑。
本發明還提供了治療受試者的方法，其能改善受試者的狀況，例如，減少細胞增殖病的一種或多種不利癥狀。例如，對于腫瘤，示例性的治療方法能減小腫瘤體積、抑制腫瘤體積的增加、抑制腫瘤的發展、刺激腫瘤細胞裂解或細胞凋亡、抑制腫瘤轉移或延長受試者的壽命。
用于實現本發明的示例性的受試者包括哺乳動物，例如人，其包括患有或有患細胞增殖病風險的受試者。受試者還包括例如，細胞增殖病療法的候選者，或正在接受或已經接受了這樣的療法的受試者。例如，對于腫瘤，示例性的治療包括抗腫瘤和免疫增強療法。
示例性的抗腫瘤療法包括例如，化學療法、免疫療法、手術切除、放射療法或過熱療法。示例性的抗腫瘤療法還包括例如，使用抗腫瘤試劑治療，例如烷化劑、抗代謝物、植物提取物、植物生物堿、亞硝基脲、激素、核苷或核苷酸類似物，更具體地，環磷酰胺、咪唑硫嘌呤、環孢菌素A、氫化潑尼松、美法侖、苯丁酸氮芥、氮芥、馬利蘭、氨甲蝶呤、6-硫基嘌呤、硫鳥嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、AZT、5-氮胞苷(5-AZC)和與5-氮胞苷有關的化合物、博來霉素、放射菌素D、光神霉素、絲裂霉素C、卡氮芥、羅氮芥、賽氮芥、鏈脲霉素、羥基脲、順氯氨鉑、米托坦、甲基芐肼、氮烯唑胺、紫杉醇、長春堿、長春新堿、阿霉素或二溴甘露醇。
示例性的免疫增強治療包括例如，施用淋巴細胞、漿細胞、巨噬細胞、樹突細胞、NK細胞或B-細胞。示例性的免疫增強治療還包括例如，使用免疫增強劑治療，例如細胞生長因子、存活因子、分化因子、細胞因子或趨化因子，更具體地，IL-2，IL-1α，IL-1β，IL-3，IL-6，IL-7，粒細胞-巨噬細胞-集落刺激因子(GMCSF)，IFN-γ，IL-12，TNF-α，TNFβ，MIP-lα，MIP-1β，RANTES，SDF-1，MCP-1，MCP-2，MCP-3，MCP-4，嗜酸性粒細胞趨化因子(eotaxin)，嗜酸性粒細胞趨化因子-2，I-309/TCA3，ATAC，HCC-1，HCC-2，HCC-3，LARC/MIP-3α，PARC，TARC，CKβ，CKβ6，CKβ7，CKβ8，CKβ9，CKβ11，CKβ12，C10，IL-8，GROα，GROβ，ENA-78，GCP-2，PBP/CTAPIIIβ-TG/NAP-2，Mig，PBSF/SDF-1或淋巴細胞趨化因子(lymphotactin)。
本發明提供了無細胞的和基于細胞的鑒定具有抗細胞增殖活性的試劑的方法。示例性的方法包括使能生成糖原的細胞與實驗試劑接觸；和在存在實驗試劑的情況下或在與實驗試劑接觸后，測定糖原毒性。糖原毒性將實驗試劑鑒定為具有抗細胞增殖活性的試劑。另一種示例性的方法包括使能表達糖原生成酶或糖原分解酶的細胞與實驗試劑接觸；和在存在實驗試劑的情況下或在與實驗試劑接觸后，測量糖原生成酶或糖原分解酶的活性或表達。糖原生成酶或糖原分解酶的升高的或降低的表達或活性分別將實驗試劑鑒定為具有抗細胞增殖活性的試劑。其它的示例性的方法包括使能表達某種基因的細胞與實驗試劑接觸，所述基因的表達由糖原生成酶或糖原分解酶的調節區控制；和在存在實驗試劑的情況下或在與實驗試劑接觸后，測量該基因的表達。該基因的增強的或降低的表達將實驗試劑鑒定為具有抗細胞增殖活性的試劑。
另一種示例性的方法包括提供實驗試劑，其能調節(提高或降低)糖原生成酶或糖原分解酶的表達或活性；使能表達糖原生成酶或糖原分解酶的細胞與實驗試劑接觸；和在存在實驗試劑的情況下或在與實驗試劑接觸后，測定糖原毒性。
糖原毒性將實驗試劑鑒定為具有抗細胞增殖活性的試劑。另一種示例性的方法包括使糖原生成酶或糖原分解酶與實驗試劑接觸；和在存在實驗試劑的情況下或在與實驗試劑接觸后，測量糖原生成酶或糖原分解酶的活性。糖原生成酶或糖原分解酶的升高的或降低的活性分別將實驗試劑鑒定為具有抗細胞增殖活性的試劑。
鑒定具有抗細胞增殖活性的試劑的方法可以用于檢測糖原毒性，可以通過如下方法檢測，例如，篩選與糖原毒性有關的形態學變化，篩選細胞生存力、篩選細胞增殖、生長或存活的抑制或減少。
鑒定試劑的方法可以采用測定基因表達或活性(例如，糖原生成酶或糖原分解酶或報道分子)的變化。示例性的糖原生成酶和糖原分解酶以及報道分子如本文所述。
鑒定試劑的方法可以在溶液中、固相中、體外地或體內地進行。
在本發明的方法中可以篩選的或用作靶的細胞是原核的或真核的。細胞可以是穩定地或瞬時地轉化了核酸序列(例如，基因)的細胞，所述核酸序列的表達由調節區(例如，糖原生成酶或糖原分解酶的調節區)控制。細胞包括過度增殖的細胞、無限增殖化細胞、和腫瘤和癌細胞。
本發明提供了試劑盒。示例性的試劑盒包括一定量的能增強糖原生成酶的表達或活性的試劑，和在標簽或包裝插頁上的關于給需要治療的受試者施用試劑的說明書。另一種示例性的試劑盒包括一定量的能降低糖原分解酶的表達或活性的試劑，和在標簽或包裝插頁上的關于給需要治療的受試者施用試劑的說明書。另一種示例性的試劑盒包括一定量的能增強胞內糖原的積累的試劑，和在標簽或包裝插頁上的關于給需要治療的受試者施用試劑的說明書。試劑盒還任選地包含例如抗腫瘤劑或免疫增強劑、藥物制劑和用于將試劑局部地、區域性地或全身地輸送給受試者的制品。


圖1A和1B顯示了感染AdGL后的降低的HeLa細胞生存力和提高的糖原沉積，其是時間和病毒載體劑量依賴性的。(A)用200MOI(淺灰條)或1000MOI(深灰條)腺病毒感染了指定時間的HeLa細胞。每個條代表表示為百分比的來自AdGL-感染的細胞的活細胞與對照AdpSh感染的細胞的百分比。(B)感染了指定的200MOI或1000MOI腺病毒的HeLa細胞。在指定時間，測定載體轉導后的胞內糖原水平。條代表感染了AdGL的細胞和感染了AdpSh(pSh)的細胞中的源自葡糖淀粉酶-還原的糖原的葡萄糖。更高的病毒載體劑量的確產生更高的糖原水平。
圖2A至2D顯示了用AdGL感染人結腸直腸癌(LoVo)和人乳房癌細胞系(MCF7)后，降低的細胞生存力和提高的糖原積累。(A)與AdpSh相比，感染了100MOI AdGL后的LoVo細胞生存力。(B)與對照AdpSh相比，提高AdGL的MOI導致LoVo細胞中的源自葡糖淀粉酶-還原的糖原的葡萄糖的積累增加。與45MOI對照AdpSh相比，當感染45MOI AdGL時，MCF7細胞顯示出(C)降低的生存力和(D)源自葡糖淀粉酶-還原的糖原的葡萄糖的積累增加。
圖3A和3B表明，與單獨使用AdGL相比，組合AdGL和細胞周期抑制劑roscovitine能增加糖原水平，并進一步降低細胞生存力。(A)與單獨使用AdGL(深灰條)或組合使用roscovitine和對照AdpSh(中灰條)相比，組合AdGL和roscovitine(黑條)隨時間過去顯著地增加了感染的HeLa細胞中的源自葡糖淀粉酶-還原的糖原的葡萄糖。(B)roscovitine顯著地降低了受AdGL-感染的細胞的細胞生存力。對于roscovitine-處理的(灰條)和未處理的細胞(白條)，將來自AdGL-感染的細胞的活細胞與對照AdpSh-感染的細胞相比較的比率表達為百分比。所有的處理都使用100MOI病毒。
圖4表明，遺傳因子可以增強GL的表達，以進一步降低癌細胞生存力。使用的4種病毒是，不含有GL的AdpSh，含有GL但是沒有增強元件的AdGL，含有GL和hsp70 5′UTR元件的AdhspGL和含有GL和WPRE元件的AdGLWPRE。所有的病毒都以100MOI使用。將來自感染了病毒的細胞的活細胞與對照AdpSh-感染的細胞的比率表達為百分比。
發明詳述本發明提供了調節胞內糖原水平的方法。通過調節糖原的胞內水平，可以使細胞交替地減少糖原或積累糖原。細胞中的糖原積累可以是毒性的，其可以導致細胞增殖、生長、存活或生存力的抑制或降低。當糖原以足以產生毒性的水平積累時，會導致細胞死亡。因而，可以靶向不希望的細胞增殖、以及異常的和病態的過度增殖的細胞(例如，細胞增殖病例如腫瘤和癌細胞)，以減少靶細胞的增殖、生長、存活或生存力。
可以通過多種機理誘導或刺激糖原在細胞中積累。例如，可以誘導或提高能直接或間接參與糖原合成、生產或積累的酶(在本文中稱作“糖原生成酶”)的表達或活性，由此增加糖原的胞內量。在另一個實例中，可以抑制或降低能直接或間接參與糖原的代謝、分解代謝、利用、降解或去除的酶(在本文中稱作“糖原分解酶”)的表達或活性，由此增加糖原的胞內量。盡管參與糖原的合成、生產或積累、或糖原的代謝、分解代謝、利用、降解或去除的幾種蛋白在技術上不是酶，因為它們不能催化底物產生反應，例如，GLUT是葡萄糖轉運蛋白，靶向糖原的亞基家族是將PP-1與糖原相連的銜接分子，為了方便，這些蛋白也稱作如本文所用的糖原生成酶和糖原分解酶，因為它們能參與調節糖原水平的各種途徑。本發明因此包括提高糖原的胞內水平的方法，而不考慮具體的生理或生化機理。
可以通過多種方法來調節參與糖原合成、生產、積累、代謝、分解代謝、利用、降解、或去除的酶的表達或活性。例如，可以將一種或多種糖原生成酶、或能編碼糖原生成酶的基因導入細胞中，以增加胞內糖原水平。在另一個實例中，可以將抑制性核酸(例如，反義物、核酶、小的干擾RNA或形成三鏈體的多核苷酸)或能編碼抑制性核酸的核酸導入細胞中，以增加胞內糖原水平。可以將靶向糖原分解酶的、或能編碼靶向糖原分解酶的反義物的抑制性核酸序列導入細胞中，以增加胞內糖原水平。向胞質內導入合適的核酸或蛋白，可以刺激或誘導胞內糖原積累，任選地達到毒性水平。
因而，根據本發明，提供了在細胞(例如，過度增殖的細胞)中調節(增加或降低)胞內糖原、任選地達到毒性水平的方法。在一個實施方案中，增加糖原的方法包括在細胞中表達基因產物，其能增加細胞中的糖原的量、任選地達到毒性水平。在各個方面，基因產物是能增加糖原的合成或胞內積累的蛋白，或能降低糖原的代謝、分解代謝、利用、降解或去除的蛋白。在特定方面，基因產物包含糖原生成酶(例如，由多核苷酸編碼)或靶向糖原分解酶的反義多核苷酸、小干擾RNA分子或核酶。
糖原生成酶的具體的非限制性的實例包括糖原生成蛋白，糖原生成蛋白-2，糖原合酶，糖原生成蛋白相互作用蛋白(GNIP)，蛋白質磷酸酶-1(PP-1)，PP-1同工型或家族成員的靶向糖原的亞基，己糖激酶同工型或家族成員，或谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶。PP-1同工型和家族成員的靶向糖原的亞基包括GL(PPP1R3B，PPP1R4)，PTG(PPP1R3C，PPP1R5)，PPP1R3D(PPP1R6)或Gm/RG1(PPP1R3A，PPP1R3)。間接參與糖原積累的糖原生成酶的具體實例是葡萄糖轉運蛋白(GLUT)，其能將葡萄糖轉運到細胞中，用于糖原合成。示例性的糖原生成酶名稱(使用Hugo命名法)、序列和對應的Genbank登記號包括糖原生成蛋白GYG糖原生成蛋白NM_004130GYG2糖原生成蛋白2NM_003918糖原生成蛋白相互作用蛋白(GNIP)AF396651，AF396655，AF396654蛋白質磷酸酶-1PPP1CA蛋白質磷酸酶1，催化亞基，α同工型NM_002708糖原合酶GYS1糖原合酶1(肌肉)NM_002103GYS2糖原合酶2(肝)NM_021957葡萄糖轉運蛋白SLC2A1溶質載體家族2(促進的葡萄糖轉運蛋白)，成員1NM_006516GLUT1SLC2A2溶質載體家族2(促進的葡萄糖轉運蛋白)，成員2NM_000340GLUT2SLC2A3溶質載體家族2(促進的葡萄糖轉運蛋白)，成員3NM_006931GLUT3SLC2A4溶質載體家族2(促進的葡萄糖轉運蛋白)，成員4NM_001042GLUT4SLC2A6溶質載體家族2(促進的葡萄糖轉運蛋白)，成員6NM_017585GLUT9，GLUT6SLC2A7溶質載體家族2(促進的葡萄糖轉運蛋白)，成員7AL356306SLC2A8溶質載體家族2(促進的葡萄糖轉運蛋白)，成員8NM_014580GLUTX1，GLUT8SLC2A9溶質載體家族2(促進的葡萄糖轉運蛋白)，成員9NM_020041GLUT9，GLUTXSLC2A10溶質載體家族2(促進的葡萄糖轉運蛋白)，成員10NM_030777GLUT10SLC2A11溶質載體家族2(促進的葡萄糖轉運蛋白)，成員11NM_030807GLUT11，GLUT10SLC2A12溶質載體家族2(促進的葡萄糖轉運蛋白)，成員12NM_145176GLUT12，GLUT8SLC2A13溶質載體家族2(促進的葡萄糖轉運蛋白)，成員13NM_052885HMITSLC2A14溶質載體家族2(促進的葡萄糖轉運蛋白)，成員14NM_153449GLUT14己糖激酶同工型和家族成員GCK葡糖激酶(己糖激酶4，年輕人的成年型糖尿病2)NM_000162HK1己糖激酶1NM_033500HK2己糖激酶2NM_000189HK3己糖激酶3(白細胞)NM_002115谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶GFPT1谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶1NM_002056GFPT2谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶2NM_005110PP-1同工型和家族成員的靶向糖原的亞基PPP1R3B蛋白質磷酸酶1，調節(抑制劑)亞基3B NM_024607GL，FLJ14005，PPP1R4PPP1R3C蛋白質磷酸酶1，調節(抑制劑)亞基3C NM_005398PPP1R5，PTGPPP1R3D蛋白質磷酸酶1，調節亞基3D NM_006242PPP1R6PPP1R3A蛋白質磷酸酶1，調節(抑制劑)亞基3A(糖原和肌質網結合亞基，骨骼肌)NM_002711PPP1R3，Gm/RG1糖原分解酶的具體的非限制性的實例包括糖原磷酸化酶、脫支酶、磷酸化酶激酶、葡萄糖-6-磷酸酶、PPP1R1A(蛋白質磷酸酶1，調節抑制劑亞基1A)、PPP1R2(蛋白質磷酸酶1，調節亞基2)、果糖磷酸激酶、糖原合酶激酶-3同工型、GCKR葡糖激酶調節蛋白或α-葡糖苷酶。示例性的糖原分解酶名稱(使用Hugo命名法)、序列和對應的Genbank登記號包括糖原磷酸化酶PYGB磷酸化酶，糖原；腦NM_002862PYGL磷酸化酶，糖原；肝(赫斯病，糖原積貯癥VI型)NM_002863PYGM磷酸化酶，糖原；肌肉(麥卡德爾綜合征，糖原積貯癥V型)NM_005609磷酸化酶激酶PHKA1磷酸化酶激酶，α1(肌肉)NM_002637PHKA2磷酸化酶激酶，α2(肝)NM_000292PHKB磷酸化酶激酶，βNM_000293PHKG1磷酸化酶激酶，γ1(肌肉)NM_006213PHKG2磷酸化酶激酶，γ2(睪丸)NM_000294PHKGL磷酸化酶激酶，γ-樣CALM1鈣調蛋白1(磷酸化酶激酶，δ)NM_006888CALM2鈣調蛋白2(磷酸化酶激酶，δ)NM_001743CALM3鈣調蛋白3(磷酸化酶激酶，δ)NM_005184糖原合酶激酶-3GSK3A糖原合酶激酶3αNM_019884GSK3B糖原合酶激酶3βNM_002093葡萄糖-6-磷酸酶G6PC葡萄糖-6-磷酸酶，催化的(糖原積貯癥I型，馮吉爾克病)NM_000151蛋白質磷酸酶1，調節亞基PPP1R1A(蛋白質磷酸酶1，調節(抑制劑)亞基1A)，PPP1R2(蛋白質磷酸酶1，調節亞基2)，果糖磷酸激酶PFKL果糖磷酸激酶，肝NM_002626PFKM果糖磷酸激酶，肌肉NM_000289
PFKP果糖磷酸激酶，血小板NM_002627葡糖苷酶AGL淀粉-1，6-葡糖苷酶，4-α-葡聚糖基轉移酶(糖原脫支酶，糖原積貯癥III型)NM_000646GAA葡糖苷酶，α；酸(蓬珀病，糖原積貯癥II型)NM_000152GANAB葡糖苷酶，α；中性ABGANC葡糖苷酶，α；中性C AF545045MGAM麥芽糖酶-葡糖淀粉酶(α-葡糖苷酶)NM_004668GCKR葡糖激酶(己糖激酶4)調節蛋白NM_001486通過試劑或處理，也可以調節能參與糖原合成、生產、積累、代謝、分解代謝、利用、降解或去除的酶的表達或活性。這樣的試劑或處理可以直接地或間接地作用于參與糖原合成、生產、積累、代謝、分解代謝、利用、降解、或去除的蛋白。
例如，被酶較差地修飾的或未被修飾的糖原分解酶的底物類似物是這樣的試劑類型的具體實例。底物類似物可以結合酶的活性位點，并抑制或阻止天然底物的結合，由此提高糖原水平。糖和碳水化合物類似物(例如，擬寡糖(pseudooligosaccharide))是用于抑制或降低糖原分解酶的表達或活性的一類試劑的具體實例。底物類似物還包括多肽和模仿天然底物的模擬物。例如，GSK-3能磷酸化糖原合酶，這反過來又使酶失活，由此降低糖原的水平。因而，糖原合酶的類似物是能抑制GSK-3的試劑的一個具體實例。
因而，根據本發明，還提供了使用能增加胞內糖原的量的試劑調節細胞中的糖原的方法。在一個實施方案中，方法包括使細胞(例如，過度增殖的細胞)與能將糖原的量增加到毒性水平的試劑相接觸，其中所述的細胞不是肝、肌肉或腦細胞。在另一個實施方案中，方法包括使細胞與能將糖原的量增加到毒性水平的試劑接觸，前提是該試劑基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型(例如，肝、肌肉或腦糖原磷酸化酶同工型)的活性或表達。一方面，試劑能增強或刺激糖原生成酶的表達或活性。另一方面，試劑能降低或抑制糖原分解酶的表達或活性。在其它方面，過度增殖的細胞包括良性增生或轉移性的或非轉移性的癌細胞。癌細胞可以是在培養物中(體外)或體內的，例如，在受試者的腦、頭或頸、乳房、食管、嘴、胃、肺、胃腸道、肝、胰、腎、腎上腺、膀胱、結腸、直腸、前列腺、子宮、子宮頸、卵巢、睪丸、皮膚、肌肉或造血系統中。
如本文所使用的，當提及試劑或治療劑是否“抑制、減少、增加或刺激”特定酶(例如糖原磷酸化酶同工型)的表達或活性時，術語“基本的”和“基本上”是指這樣的規定，即試劑或治療劑不影響細胞中的特定酶(例如，糖原磷酸化酶)的活性，而將胞內糖原增加到毒性水平。例如，基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型的試劑在用于使胞內糖原積累到毒性水平的試劑濃度時不會抑制該酶。在肝、肌肉和腦中存在3種已知的人糖原磷酸化酶同工型。因而，“基本上抑制”這些糖原磷酸化酶同工型是指，將肝、肌肉或腦中的酶活性降低或抑制到足以使胞內糖原增加到毒性水平(例如，降低的細胞增殖、生長、存活、生存力等)。
該規定不排除能間接刺激或抑制糖原生成酶或糖原分解酶(例如，糖原磷酸化酶同工型)的試劑和治療劑，例如，抑制中間蛋白，其反過來抑制糖原磷酸化酶活性。該規定也不排除能直接靶向或結合糖原生成酶或糖原分解酶(例如糖原磷酸化酶)的試劑和治療劑，和在用于使胞內糖原增加到低于毒性水平(例如，使用的試劑的量低于殺死細胞所需的量)的濃度。因此，當使用時，該規定是指試劑和治療劑，所述試劑和治療劑包括本文所述的試劑和治療劑的具體的非限制性的實例，能靶向或結合糖原生成酶或糖原分解酶(例如糖原磷酸化酶)，且其作用是在使用的試劑或治療劑濃度將胞內糖原增加到毒性水平。
試劑包括小分子。如本文所使用的，術語“小分子”是指大小低于約5千道爾頓的分子。一般地，這樣的小分子是有機的，但是也可以是無機分子，例如元素或離子形式，例如鋰、鋅等。
能降低或抑制糖原分解酶的表達或活性的試劑的具體的非限制性的實例包括糖原磷酸化酶抑制劑，例如N-甲基-β-葡萄糖-C-羧酰胺(Watson等，Biochemistry，335745(1994))，α-D-葡萄糖(Oikonomakos等，Eur.J.Drug Metab.Pharmacokinet.19185(1994))，吡喃葡萄糖亞基-螺-乙內酰脲16(Somsak等，Curr.Pharm.Des.151177(2003))，N-乙酰基-N′-β-D-吡喃葡萄糖基脲(Acurea)和N-苯甲酰基-N′-β-D-吡喃葡萄糖基脲(Bzurea)(Oikonomakos等，Eur.J.Biochem.2691684(2002))，N-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基胺(Board M.，Biochem.J.328695(1997))，苯甲酰甲基咪唑鎓鹽(Van Schaftingen和DeHoffmann E Eur.J.Biochem.218745(1993))，CP-91149(吲哚-2-羧酰胺)(Latsis等，Biochem.J.368309(2002))，Flavopiridol(Kaiser等，Arch.Biochem.Biophys.386179(2001))，吲哚-2-羧酰胺(Hoover等，J.Med.Chem.412934(1998))，S-3-異丙基-4-(2-氯苯基)-1，4-二氫-1-乙基-2-甲基-吡啶-3，5，6-三羧酸酯(W1807)(Oikonomakos等，Protein Sci.101930(1999))，BAY R3401和BAY W1807(Bergans等，Diabetes，491419(2000)；Shiota等，Am.J.Physiol.273E868(1997))，1，4-二脫氧-1，4-亞氨基-d-阿拉伯糖醇(arabinitol)(DAB)(Fosgerau等，Arch.Biochem.Biophys.380274(2000))，5-氯-1H-吲哚-2-羧酸(1-(4-氟芐基)-2-(4-羥基哌啶-1-基)-2-氧代乙基)酰胺(CP320626)(Oikonomakos等，Structure，8575(2000))，吡哆醛(5′)二磷酸(1)-α-D-葡萄糖(Withers G.J.Biol.Chem.260841(1985))，3，4-二氯異香豆素(3，4-DC)(Rusbridge和Beynon FEBSLett.268133(1990))，咖啡因(San Juan Serrano等，Int.J.Biochem.Cell.Biol.27911(1995))，α-，β-，和γ-環糊精(Pinotsis等，Protein Sci.121914(2003))，吡喃葡萄糖亞基螺硫代乙內酰脲(Oikonomakos等，Bioorg.Med.Chem.10261(2002))，氨基胍(Sugita等，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.282E386(2002))，proglycosyn(Yamanouchi等，Arch.Biochem.Biophys.294609(1992))和2-脫氧-2-氟-α-D-吡喃葡萄糖基氟化物(Massillon等，J.Biol.Chem.27019351(1995))。
能降低或抑制糖原分解酶的表達或活性的試劑的其它的非限制性的實例包括糖原合酶激酶-3同工型(α或β)抑制劑。糖原合酶激酶3(GSK-3)的失活導致底物的脫磷酸作用，所述底物包括糖原合酶和真核的蛋白合成起始因子-2B(eIF-2B)。這導致它們的功能活化，由此增加胞內糖原。
GSK-3的小分子抑制劑包括藥物，例如hymenialdisine(例如，二溴-hymenialdisine)(Breton和Chabot-Fletcher，J.Pharmacol.Exp.Ther.282459(1997)；Meijer，等，Chem.Biol.751(2000))；靛玉紅(例如，5，5′-二溴-靛玉紅)(Damiens等，Oncogene 203786(2001)；Leclerc等，J.Biol.Chem.276251(2001))；馬來酰亞胺(例如，Ro 31-8220，SB-216763和SB-415286)(Coghlan等，Chem.Biol.7793(2000)；Cross等，J.Neurochem.7794(2001)；Hers等，FEBS Lett.460433(1999)；Lochhead等，Diabetes 50937(2001)；Smith等，Bioorg.Med.Chem.Lett.11635(2001))；和蕈毒堿的激動劑(例如，AF102B和AF150)(Forlenza等，J.Neural.Transm.1071201(2000))。其它的小分子GSK-3藥物抑制劑與ATP競爭，例如Aloisines(例如，Aloisine A和Aloisine B)(Martinez，等，J.Med.Chem.451292(2002)；Martinez等，Med.Res.Rev.22373(2002)；Mettey等，J.Med.Chem.46222(2003))。GSK-3的小分子抑制劑還包括CHIR 98014、CHIR 98021和CHIR 99023(Ring等，Diabetes，52588(2003)；Nikoulina等，Diabetes，512190(2002))。
GSK-3的小分子抑制劑還包括元素和離子，例如鋰(Klein和Melton，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 938455(1996)和Stambolic等，Curr.Biol.61664(1996))。盡管對GSK-3具有較好的特異性，仍然需要相對較高劑量的鋰(Ki是mM)來抑制細胞培養物中的GSK-3活性(Stambolic等，Curr.Biol.61664(1996))。與其它的元素離子一樣，鋰通過與Mg2+競爭發揮作用(Ryves和Harwood Biochem.Biophys.Res.Commun.280720(2001)；Carmichael等，J.Biol.Chem.27733791(2002)和Stambolic等，Curr.Biol.61664(1996))。鋅的二價形式(它模擬胰島素作用)也在15mM的濃度抑制細胞培養物中的GSK-3(Ilouz等，Biochem.Biophys.Res.Commun.295102(2002))。另一種金屬離子鈹在6mM的濃度能將GSK-3抑制到最大活性的一半(Ryves等，Biochem.Biophys.Res.Commun.290967(2002))。
GSK-3結合蛋白是GSK-3抑制劑的其它實例。例如，胰島素能通過依賴于磷酸肌醇3-激酶(PI 3-激酶)的機理滅活GSK-3。PI-激酶-誘導的PKB(也稱作Akt)的活化導致2個GSK-3同工型(GSK-3b的S9；GSK-3a的S21)的PKB磷酸化作用(Cross等，Nature 378785(1995))，這會抑制GSK-3活性。其它的刺激物通過S9/S21磷酸化作用導致GSK-3的失活，包括生長因子例如EGF和PDGF，其能刺激使GSK-3失活的激酶p90RSK(也稱作MAPKAP-K1)。
能降低或抑制糖原分解酶的表達或活性的試劑的其它的非限制性的實例包括α-葡糖苷酶抑制劑。大多數已知的天然的和合成的α-葡糖苷酶抑制劑是糖類似物，例如擬寡糖(Bischoff，H.，Eur.J.Clin.Investig.243(1994))、氮雜糖(azasugar)(Wong等，J.Org.Chem.601492(1995))和吲哚里西啶(indolizidine)生物堿(Elbein，A.D.，Ann.Rev.Biochem.，56497(1987))。阿卡波糖(一種來自游動放線菌屬(Actinoplane)物種的擬四糖)是α-葡糖苷酶的最有效的抑制劑之一(Legler G.Adv.Carb.Chem.Biochem.，48319(1990))。它的結構類似于底物的過渡態。因此，底物類似物是根據本發明使用的α-葡糖苷酶抑制劑的具體種類。
能降低或抑制α-葡糖苷酶的表達或活性的試劑的其它的非限制性實例包括Bay m1099(Wisselaar等，Clin.Chim.Acta.，18241(1989))，牛彌菜醇B環氧化物(Hermans等，J.Biol.Chem.26613507(1991))，澳粟精胺(Rhinehart，等，Biochem.Pharmacol.41223(1991))，Isofagomine(糖原磷酸化酶的肝和肌肉同工型的有效抑制劑)(Dong等，Biochem.352788(1996)；Lundgren等，Diabetes 45S2 521(1996)和Waagepetersen等，Neurochemistry International 36435(2000))，Vilidamine，井岡霉烯胺(valienamine)和有效醇胺(Takeuchi等，J.Biochem.10842(1990)；和美國專利號4,701，559)，Acarviosine-葡萄糖和異阿卡波糖(isoacarbose)(Kim等，Arch.Biochem.Biophys.371277(1999))，Salacinol，其可以從斯里蘭卡本地的植物中分離出(美國專利號6,455,573和Yoshikawa等，Bioorg.Med.Chem.101547(2002))，D(+)-海藻糖(Matsuur等，Biosci.Biotechnol.Biochem.661576(2002))，Callyspongynic acid(1)(Nakao等，J.Nat Prod.65922(2002))，1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimcin)(DNM)(Papandreou等，Mol.Pharmacol.61186(2002))，Touchi-提取物(Hiroyuki等，J.Nutr.Biochem.12351(2001))，哌嗪二酮(1)(Kwon等，J.Antibiot.53954(2000)；Sou等，Chem.Pharm.Bull.49791(2002))，2，6-二脫氧-7-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)2，6-亞氨基-D-丙三氧基-L-古洛(gulo)-庚糖醇(7-O-β-D-吡喃葡萄糖基-α-同野尻霉素，1)(Ikeda等，Carbohydr.Res.32373(2000))，乙醇胺和苯基6-脫氧-6-(嗎啉-4-基)-β-D-吡喃葡糖苷(Balbaa等，Carbohydr.Res.317100(1999))，N-甲基-1-脫氧野尻霉素(MOR-14)(Minatoguchi等，Circulation，971290(1998))，Acavisonine-西蒙精(simmondsin)(Baek等，Biosci.Biotechnol.Biochem.67532(2003))，Nestrisine(Tsujii等，Biochem.Biophys.Res.Commun.220459(1996))，Bayg 5421(Aletor等，Poult.Sci.82796(2003))，桑枝(Ramulus mori，SZ)，(Ye等，藥學學報，37108(2002))，2，4，6-三硝基苯基2-脫氧-2，2-二氟-α-葡糖苷(Braun等，J.Biol.Chem.27026778(1995))，L-組氨酸，其組胺和咪唑衍生物(Field等，Biochem.J.274885(1991))，4-O-α-D-吡喃葡萄糖基脫二氧亞胺基葡糖醇(moranoline)，及其各種N-取代的衍生物(Yoshikuni等，Chem.Pharm.Bull，37106(1989))，表澳粟精胺(Molyneux等，Arch.Biochem.Biophys.，251450(1986))，野尻霉素(Chambers等，Biochem.Biophys.Res.Commun.1071490(1982))和野尻霉素四唑(Mitchell等，Biochemistry，357341(1996))。
α-葡糖苷酶抑制劑的其它具體實例包括O-4，6-二脫氧-4-[[[1S-(1α，4α，5β，6α)]-4，5，6-三羥基-3(羥甲基)-2-環己烯-1-基]氨基]-α-D-吡喃葡萄糖基-(1-4)O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1-4)-D-葡萄糖，也稱作阿卡波糖；2(S)，3(R)，4(S)，5(S)-四羥基-N-[2-羥基-1-(羥甲基)-乙基]-5-(羥甲基)-1(S)-環六胺，也稱作伏格列波糖(A0-128)(Goke等，Digestion，56493(1995))；1，5-二脫氧-1，5-[(2-羥乙基)亞氨基]-D-山梨醇，也稱作米格列醇；1，5-二脫氧-1，5-[2-(4-乙氧甲酰基苯氧基)乙基亞氨基]-D-山梨醇，也稱作乙格列酯(emiglitate)(Lembcke等，Res.Exp.Med.191389(1991))；2，6-二脫氧-2，6-亞氨基-7-(β-D-吡喃葡萄糖基)-D-丙三氧基-L-古洛庚糖醇，也稱作MDL-25637；1，5-二脫氧-1，5-(6-脫氧-1-O-甲基-α-D-吡喃葡萄糖-6-基亞氨基)-D-山梨醇，也稱作卡格列波糖(camiglibose)；1，5，9，11，14-五羥基-3-甲基-8，13-二氧代-5，6，8，13-四氫苯并[a]并四苯-2-羧酸，也稱作普拉米西Q(pradimicin Q)；肥胖菌素(adiposine)和1，2-二脫氧-2-[2(S)，3(S)，4(R)-三羥基-5-(羥甲基)-5-環己烯-1(S)-基氨基]-L-吡喃型葡萄糖，也稱作salbostatin。吲哚里西啶生物堿，例如australine、澳粟精胺和苦馬豆素是α-葡糖苷酶抑制劑。α-葡糖苷酶抑制劑還包括經口的抗糖尿病藥(Lebovitz，H.E.Drugs，4421(1992))。N-丁基脫氧野尻霉素(N-丁基-DNJ)和DNJ的有關的N-烷基衍生物是α-葡糖苷酶I和II的抑制劑(Saunier等，J.Biol.Chem.25714155(1982)和Elbein，Ann.Rev.Biochem.56497(1987))。1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-山梨醇和衍生物(包括N-烷基、N-酰基、N-芳酰基、N-芳烷基、和O-酰基衍生物)是α-葡糖苷酶抑制劑。α-葡糖苷酶抑制劑包括L-阿拉伯糖和在植物中發現的形式，例如阿拉伯聚糖(arabinan)、阿拉伯糖基木聚糖和阿拉伯半乳聚糖。澳粟精胺是α-葡糖水解酶抑制劑的一個實例，該抑制劑是不能容易地逆轉的，且具有相對較長的作用持續時間。它還抑制溶酶體α-葡糖苷酶，這導致溶酶體糖原的積累。另一種具體的α-葡糖水解酶抑制劑是1，5-二脫氧-1，5-(6-脫氧-1-O-甲基-6-α，D-吡喃葡萄糖基)亞氨基-D-山梨醇(MDL73945)(Robinson等，Diabetes 40825(1991))。其它的α-葡糖水解酶抑制劑包括4，6-二脫氧-4-(4，5，6-三羥基-3-羥甲基環己-2-烯-1-基氨基)-α-D-吡喃型葡萄糖的吡喃葡萄糖基和寡葡糖苷基(oligoglucosidyl)衍生物。化合物O-{4，6-二脫氧-4-[1 S-(1，4，6/5)-4，5，6-三羥基-3-羥甲基環己-2-烯-1-基氨基]α-D-吡喃葡萄糖基}-(l-4)-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(l-4)-D-吡喃型葡萄糖是代表物(美國專利號4,062,950)。
下面的表1說明了示例性的具有式I結構的α-葡糖苷酶抑制劑(見，美國專利號6,143,932和6,121,489)。式I的亞類如下R1和R2獨立地為氫原子、氨基保護基、C1至C12酰基、C3至C10環烷基、C3至C6雜環、C1至C12烷基、C1至C12取代的烷基、C7至C16烷基芳基，C7至C16取代的烷基芳基，C6至C15烷基雜環，或取代的C6至C15烷基雜環；R3、R5和R7獨立地為氫原子、C1至C12烷基、C1至C12取代的烷基、苯基、取代的苯基、C7至C16烷基芳基、C7至C16取代的烷基芳基、C6至C15烷基雜環、或取代的C6至C15烷基雜環；R4、R6和R8獨立地為C1至C18取代基；R9是氫原子；當R1和R2不是氫原子或氨基保護基時，R10任選地為C1至C18取代基；AA、BB和CC獨立地為0至5；且B是0至3。與R3、R5和R7相結合的碳的立體化學獨立地為R或S或二者的混合物；當B是2或3時，每個R4和R5可以是相同的或不同的；當B是0時，每個R6和R8是不同的；且R1或R2可以與R3相連；R4可以與R5相連；R6可以與R7相連；分別地和獨立地，以形成取代的或未取代的吡咯烷環。X和Y分別為氫原子，或一起代表羰基。
表1中的IC50值代表達到50％酶被抑制的濃度，如前所述進行測定(Haslvorson和Ellias，Biochem.Biophys.Acta，3028(1958))。最有活性的抑制劑是式I化合物，其中X和Y一起形成羰基，B是0，除另有說明外，AA、BB和CC為0，R9是氫原子，R8是芐基，R6是萘-2-基甲基，R3是S-(N-(萘-2-基甲基)吲哚-3-基甲基)，R1和R2分別為氫，R10不存在，且R7
表1

能提高胞內糖原水平的試劑還包括例如，赭曲毒素A(Dwivedi和Burns，Res.Vet.Sci.3692(1984))，N-乙酰基半胱氨酸(Itinose等，Res.Commun.Chem.Pathol.Pharmacol.8387(1994))，二氯醋酸鹽(DCA)(Kato-Weinstein等，Toxicology，130141(1998)；Lingohr等，Toxicol.Sci.68508(2002))，斑蝥素(Wang等，Toxicology，14777(2000))，Methylobromofenvinphos(IPO 63化合物)(Chishti和Rotkeiwicz，Arch.Environ.Contam.Toxicol.22445(1992))，染料木黃酮(Okazaki等，(2002)Arch.Toxicol.76553)，奎寧(al-Habori等，Biochem.J.282789(1992))，Alveld毒素(Flaoyen等，Vet.Res.Commun.15443(1991))，甲硫氨酸亞砜亞胺(sulfoximine)(Havor和Delorme Glia 464(1991))，衣霉素(Chardin等，Cell Tissue Res.，256519(1989))，二甲雙胍(Detaille等，Biochem.Pharmacol.581475(1999))，5-idotubercidin(Fluckiger-Isler和Walter Biochem.J.29285(1993))，斑蝥素(Wang等，Toxicology，14777(2000))，二氮嗪(Alemzadeh等，Eur.J.Endocrinol.146871(2002))。
激素是能提高胞內糖原水平的試劑的另一個實例。具體的非限制性的實例包括表皮生長因子(Bosch等，Biochem.J.239523(1986))，氫化可的松(Black Am.J.Physiol.254G65(1988))，去甲腎上腺素，血管活性腸肽(Allaman等，Glia，30382(2000))，糖皮質激素(Laloux等，Eur.J.Biochem.136175(1983))和胰島素。
飲食添加劑是能提高胞內糖原水平的試劑的另一個實例。具體的非限制性的實例包括葡萄糖(Watson等，Biochemistry，335745(1994))，果糖(Gergely等，Biochem.J.，232133(1985))，D-塔格糖(Kruger等，Regul.Toxicol.Pharmacol.29S1-S10(1999))，與胰島素組合的寡果糖(Flamm等，Crit.Rev.Food Sci.Nutr.41353(2001))和Na+-協同轉運的氨基酸例如谷氨酰胺、丙氨酸、天冬酰胺和脯氨酸(Hue L，Gaussin V.InAmino Acid Metabolism and Therapyin Health and Nutritional Disease(Cynober，L.A.，ed)pp.179-188，CRC Press，Boca Raton，FL.(1995))。
植物和植物提取物是能提高胞內糖原水平的試劑的另一個實例。具體的非限制性的實例包括藥鼠李(Rhamnus cathartica)(Lichtensteiger等，Toxicol.Pathol.5449(1997))，苦瓜(Mormordicacharantia)和黧豆屬(Mucuna)(Rathi等，Phytother Res.16236(2002))和Graninia Kola的粉碎的種子(Braide和Grill Gegenbaurs.Morphol.Jahrb.13695(1990))。
除了本文公開的和本領域已知的示例性的抑制劑外，可以基于結構和功能知識來設計糖原分解酶抑制劑。例如，對于GSK-3，已經確定了晶體結構(Bax等，Structure(Camb)91143(2001)；Dajani等，Cell 105721(2001)；ter Haar等，Nat.Struct.Biol.8593(2001))。GSK-3的晶體結構的分析表明，該酶偏好最初的(primed)、磷酸化前的底物。GSK-3的T-環是分別在GSK-3b和GSK-3a的Y216和Y279處磷酸化的酪氨酸，但不是磷酸化的蘇氨酸。Y216/Y279磷酸化作用可能在打開底物結合位點中起作用(Dajani等，Cell 105721(2001))。因而，GSK-3的T-環酪氨酸磷酸化作用可能促進底物磷酸化作用，但不是激酶活性所嚴格需要的(Dajani等，Cell 105721(2001))。GSK-3的晶體結構還表明，S9/S21絲氨酸磷酸化的抑制作用是產生最初的擬底物(pseudosubstrate)，其能分子內地結合帶正電荷的口袋。該折疊排除了底物的磷酸化作用，因為催化槽被占據了。抑制機理是競爭性的，因此，足夠高濃度的擬底物可以競爭過最初的底物，反之亦然。因而，模擬成能適合GSK-3激酶結構域的帶正電荷的口袋的小分子抑制劑可以選擇性地抑制最初底物(例如糖原合酶)的結合。
除了晶體結構外，研究表明GSK-3對于在“引發(priming)”殘基(其位于GSK-3磷酸化作用位點的C-末端)處磷酸化前的靶蛋白具有偏好(Fiol等，J.Biol.Chem.26214042(1987))。GSK-3底物的共有序列是Ser/Thr-X-X-XSer/Thr-P，其中第一個Ser或Thr是靶殘基，X是任意的氨基酸(但經常是Pro)，且最后一個Ser-P/Thr-P是引發磷酸化作用的位點。引發磷酸化作用能將大多數GSK-3底物的底物磷酸化效率提高100-1000倍(Thomas等，FEBS Lett.458247(1999))。例如，糖原合酶(原型的最初的底物)會通過酪蛋白激酶II(CK2)發生引發磷酸化作用，然后通過GSK-3發生順序的多位點磷酸化作用(Fiol等，Arch.Biochem.Biophys.267797(1988)；Fiol等，J.Biol.Chem.2656061(1990))。一些GSK-3底物缺少引發位點。這些蛋白經常在或接近能模仿磷酸基-殘基的引發位置顯示出帶負電荷的殘基。
因為GSK-3具有許多底物，GSK-3需要許多調節水平來賦予底物特異性。因而，可以通過這些信號中的任一個來抑制GSK-3。例如，可以如下所述抑制GSK-3通過絲氨酸磷酸化作用；抑制酪氨酸磷酸化作用或刺激酪氨酸脫磷酸作用；通過引發磷酸化作用，共價修飾底物來間接抑制；和通過GSK-3與結合或折疊蛋白的相互作用，抑制或促進GSK-3-介導的底物磷酸化。
還可以基于結構和功能知識來設計α-葡糖苷酶抑制劑。例如，α-葡糖苷酶的催化機理涉及碳正離子。2-脫氧-2-氟-α-D-葡糖基氟化物或5-氟-α-D-葡糖基氟化物等化合物的不可逆的酶抑制，是由于葡萄糖環的C-2或C-5處的氟化物的誘導效應，它會使得過渡態的葡糖基陽離子不穩定，且會促進穩定的葡糖基-酶中間體的形成(Krasikov等，Biochemistry，66267(2001))。能模仿碳正離子(負電荷和/或半椅型構象)的特征的α-葡糖苷酶配體可以起抑制劑的作用。具有半椅型構象的δ葡糖酸內酯(δ-Gluconolacton)是牛肝α-葡糖苷酶的競爭性抑制劑(Firsov LM，Biokhimiya，432222(1978))。攜帶正電荷的α-葡糖苷酶抑制劑是更有效的抑制劑。例如，Tris能抑制α-葡糖苷酶活性(Krasikov等，Biochemistry，66267(2001))。因而，能模仿碳正離子的配體特征的任何組合物都可以是能抑制α-葡糖苷酶的試劑，特別是帶有正電荷的那些。
對于吲哚里西啶生物堿(澳粟精胺(castonospermine)，苦馬豆素(swainosonine))和脫氧野尻霉素一般的6-員環結構，對于葡糖苷酶抑制不是必需的。相反地，環中存在的氮和羥基相對于氮的構型是抑制活性的主要先決條件(Tropea等，Biochemistry，282027(1989))。有效抑制的表現顯然需要亞胺氮和催化酸之間的氫鍵。例如，N1-烷基-D-葡糖基胺向N1-丁基-(或十二烷基)-D-葡糖酸脒(gluconamidine)的轉變伴有約10倍的抑制作用的提高；抑制劑的幾何形狀從四面體的C1-幾何形狀變成平面的sp2脒幾何形狀。認為這是因為，質子化了的脒不能從催化酸接受質子(Legler G，Finken M，Carbohydr.Res.，292103(1996))。因此，最有活性的結構和隨后的抑制劑應當在環中具有氮，其維持相對于羥基的構型。
在本發明的方法中，其中胞內糖原的量“增加”，這是指給定的一個或多個細胞中的糖原水平更高。當提及糖原時使用的術語“積累”也是指胞內糖原水平的任何增加。當該術語在提及多個細胞時使用時，并非所有的細胞都能等同地響應和積累糖原。因而，一部分細胞可以表現出提高的糖原水平，而另一部分細胞則不表現出提高的糖原水平。
提高的胞內糖原水平可以是瞬時的或更長的持續時間，但是一般應當是足以產生毒性的量。糖原的毒性水平會導致減少的或降低的細胞增殖、生長、存活或生存力，或會產生一種或多種其它的糖原毒性特征。糖原毒性特征包括例如，形態學變化例如糖原濃縮造成的細胞膨脹，增加的溶酶體的數目和大小，溶酶體的結構變化(其特征在于顆粒的出現)以及糖原的核積累，僅舉幾個例子。因此，通過測定細胞增殖或生長速度(例如，倍增時間、細胞周期長度等)、存活時間(例如，壽命)、生存力(裂解或細胞凋亡)或組織學的分析，可以確定糖原的毒性水平。
因而，本發明提供了能將糖原增加到對細胞具有毒性的量的方法。在各個方面，通過細胞增殖、生長或存活的抑制或減少，或通過測定與糖原毒性有關的形態變化，例如細胞膨脹、溶酶體數目的增加、溶酶體大小的增加或溶酶體的結構變化，可以檢測毒性。
糖原的毒性水平還會導致降低的細胞生存力。因而，本發明提供了能將糖原增加到會造成細胞的裂解或細胞凋亡的量的方法。
具有毒性的糖原胞內水平隨細胞類型而變化，因為某些細胞類型(例如肝和肌肉)傾向于儲存更大量的糖原。結果，為了誘導糖原毒性，在正常情況具有更大量胞內糖原的細胞類型中，例如在肝和肌肉細胞中，糖原的絕對量會更大。例如，在人結直腸腺癌細胞系(HT-29，HRT-18，SW-480和Caco-2)的異步培養物中，細胞系彼此之間的糖原積累動力學類似，其特征在于在生長的指數期有較低的相對水平，隨后在穩定期有3至4倍的增加。在HT-29和HRT-18細胞系的同步培養物中，在S、G2和M期都表現出較低的糖原量，隨后在G1期開始增加，在G1期的中間達到峰值(初始值的2.5至3倍)。隨后，在G1期的后一半時間出現對稱的降低。但是，在穩定期和指數期出現的糖原對于每個細胞系具有特異性在Caco-2、HRT-18、HT-29和SW-480細胞中，最大值分別是258.5±6.9(標準差)、88.9±2.6、87.5±3和17.5±1.8μg糖原/mg蛋白(Rousset等，Cancer Res.39(2 Pt1)531(1979))。因此，糖原水平可以基于細胞類型而異，為了產生毒性，正常情況下糖原絕對水平較高的細胞一般也需要更高的糖原絕對水平。
對糖原毒性的敏感性也隨細胞類型而異。因而，在某些細胞類型中，即使略微超過正常范圍的糖原水平也足以誘導毒性，然而在其它的細胞類型中，為了誘導毒性，可能需要使糖原水平顯著超過正常范圍。在任一種情況下，使用本文公開的或本領域已知的各種實驗和形態學標準中的任一個，都可以確定糖原毒性(見，例如，Phillips等，The Liver；An Atlas and Text of Ultrastructural Pathology.New YorkRaven Press(1987)；Lembcke等，Res.Exp.Med.191389(1991)和Baudhuin等，Lab.Invest.131139(1964))。
在本發明的各種實施方案中，可以使用以前已經將其表征為刺激或增加糖原生成酶的活性、抑制或降低糖原分解酶的活性、或能調節直接地或間接地影響胞內糖原水平的蛋白的活性的試劑和治療劑，前提是該試劑或治療劑是以能將糖原水平增加到毒性水平(包括足以殺死靶細胞的水平)的量使用。也就是說，當使用的試劑和治療劑的量足以將糖原水平增加到毒性水平、或足以殺死細胞時，可以根據本發明使用本領域已知的具有糖原生成酶刺激活性、糖原分解酶抑制活性、或能調節影響胞內糖原水平的蛋白的活性的試劑和治療劑。
在本發明的其它實施方案中，可以使用被認為或固有地刺激或增加糖原生成酶的活性、抑制或降低糖原分解酶的活性、或能調節依次導致胞內糖原水平升高的另一種蛋白的活性的試劑和治療劑，前提是該試劑或治療劑在本發明之前尚未用于治療過度增殖的細胞或細胞增殖病(例如，良性增生或腫瘤或癌癥)。也就是說，根據本發明可以使用本領域已知的且識別出的、或本領域已知的且固有地能刺激或增加糖原生成酶的活性、抑制或降低糖原分解酶的活性、或能調節導致胞內糖原水平升高的蛋白的活性的任何試劑或治療劑，前提是本領域已知的該試劑和治療劑在本發明之前尚未用于治療細胞增殖病。任選地，根據本發明使用的這樣的已知的試劑和治療劑能將糖原水平增加到毒性水平，包括足以殺死靶細胞的量。
本發明包括體內方法。例如，如本文所述，細胞(例如過度增殖的細胞)可以存在受試者中，例如哺乳動物(例如，人受試者)中。該受試者任選地患有細胞增殖病，或者處于患有細胞增殖病的風險中。根據本發明，可以治療患細胞增殖病的過度增殖的細胞，以增加胞內糖原，從而誘導毒性。
如本文所使用的，當提及細胞、組織或器官時，術語“細胞增殖病”、“過度增殖”、“過度增殖病”和其表述上的變體是指任何不希望的、過度的或異常的細胞、組織或器官增殖、生長、分化或存活。過度增殖的細胞是指這樣的細胞，其增殖、生長或存活超過了對應的參考正常細胞，例如，細胞增殖病的細胞。增殖病和分化病包括疾病和生理狀況，良性的增生狀況和瘤形成，其特征在于受試者中的不希望的、過度的或異常的細胞數目、細胞生長或細胞存活。這樣的疾病的具體實例包括轉移性的和非轉移性的腫瘤和癌癥。
因而，本發明還提供了治療受試者中的細胞增殖病(例如，良性增生或腫瘤或癌癥)的方法。在一個實施方案中，治療細胞增殖病(其不是肝、肌肉或腦細胞病)的方法包括在一個或多個患有該病的細胞中表達能增加胞內糖原的量、足以治療細胞增殖病的基因產物。在另一個實施方案中，治療細胞增殖病(其不是肝、肌肉或腦細胞病)的方法包括使一個或多個患有該病的細胞與能增加胞內糖原的量、足以治療細胞增殖病的試劑相接觸。在具體的方面，細胞增殖病包括轉移性的或非轉移性的癌癥。在其它方面，癌細胞存在于頭或頸、乳房、食管、嘴、胃、肺、胃腸道、胰、腎、腎上腺、膀胱、結腸、直腸、前列腺、子宮、子宮頸、卵巢、睪丸、皮膚或造血系統。
在另一個實施方案中，治療細胞增殖病的方法包括在一個或多個患有該病的細胞中，表達能增加胞內糖原的量、足以治療細胞增殖病的基因產物。在另一個實施方案中，治療細胞增殖病的方法包括使一個或多個患有該病的細胞與能增加胞內糖原的量的試劑接觸，前提是該試劑基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型的活性或表達，其足以治療細胞增殖病。在具體的方面，細胞增殖病包括轉移性的或非轉移性的癌癥。在其它方面，癌細胞存在于腦、頭或頸、乳房、食管、嘴、胃、肺、胃腸道、肝、胰、腎、腎上腺、膀胱、結腸、直腸、前列腺、子宮、子宮頸、卵巢、睪丸、皮膚或肌肉或造血系統。
還提供了治療患有腫瘤、或處于患腫瘤的風險中的受試者的方法。在一個實施方案中，腫瘤不是肝、肌肉或腦腫瘤，且方法包括在一個或多個腫瘤細胞中表達能增加胞內糖原的量、有效地治療受試者的基因產物。在另一個實施方案中，腫瘤不是肝、肌肉或腦腫瘤，且方法包括使一個或多個腫瘤細胞與能增加胞內糖原的量、有效地治療受試者的試劑相接觸。在其它的實施方案中，方法包括在一個或多個腫瘤細胞中表達能增加胞內糖原的量、有效地治療受試者的基因產物。在另一個實施方案中，方法包括使一個或多個腫瘤細胞與能增加胞內糖原的量的試劑接觸，前提是該試劑基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型的活性或表達，能有效地治療該受試者。
還提供了治療正在接受腫瘤療法或已經接受了腫瘤療法的受試者的方法。在一個實施方案中，腫瘤不是肝、肌肉或腦腫瘤，且方法包括給受試者施用能增加細胞中的胞內糖原的量、足以治療該受試者的試劑。在另一個實施方案中，方法包括給受試者施用能增加胞內糖原的量的試劑，前提是該試劑基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型的活性或表達、足以治療該受試者。
如本文所使用的，術語“治療”和其表述變體是指對個體患者施用本發明的規程、方案或方法，其中希望在患者中得到特定的生理效果或結果。由于不是每位治療的患者都能對特定的治療規程產生響應，治療不要求在任何特定的患者或患者群體中都能達到希望的效果。換而言之，某個特定的患者或患者群體可能不對治療產生響應。
術語“腫瘤”、“癌癥”和“瘤形成”在本文中可互換地使用，是指任何細胞或組織來源的細胞或細胞群體，其生長、增殖或存活超過了正常的對應細胞的生長、增殖或存活。這樣的疾病包括，例如，癌、肉瘤、黑素瘤、神經的(胚細胞瘤、神經膠質瘤)和網狀內皮的、淋巴的或造血的腫瘤性轉化病(例如，骨髓瘤、淋巴瘤或白血病)。腫瘤包括轉移性的和非轉移性的類型，且包括任何階段I、II、III、IV或V腫瘤，或緩解中的腫瘤。
腫瘤可以來自許多原發腫瘤類型，包括但不限于乳房、肺、甲狀腺、頭和頸、腦、腎上腺、甲狀腺、淋巴、胃腸的(嘴、食管、胃、小腸、結腸、直腸)、生殖泌尿道(子宮、卵巢、子宮頸、膀胱、睪丸、陰莖、前列腺)、腎、胰、肝、骨、肌肉、皮膚，且可轉移至第二位點。
“實體瘤”是指瘤形成或轉移，其一般聚集在一起形成塊。具體的實例包括內臟腫瘤例如黑素瘤、乳房、胰、子宮和卵巢癌、睪丸癌，包括精原細胞瘤，胃或結腸癌，肝細胞瘤，腎上腺的、腎的和膀胱的癌，肺、頭和頸癌和腦腫瘤/癌癥。
癌是指上皮的或內分泌組織的惡性腫瘤，包括呼吸系統癌、胃腸系統癌、生殖泌尿系統癌、睪丸癌、乳腺癌、前列腺癌、內分泌系統癌和黑素瘤。該術語還包括癌肉瘤，例如，其包括癌的和肉瘤的組織組成的惡性腫瘤。腺癌包括腺組織的癌，或者其中腫瘤形成腺樣的結構。黑素瘤是指黑素細胞和源自色素細胞源的其它細胞的惡性腫瘤，其可能產生于皮膚、眼睛(包括視網膜)或身體的其它區域。其它的癌可以形成于子宮/子宮頸、肺、頭/頸、結腸、胰、睪丸、腎上腺、腎、食管、胃、肝和卵巢。
肉瘤是指間充質細胞源的惡性腫瘤。示例性的肉瘤包括例如，淋巴肉瘤、脂質肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤和纖維肉瘤。
神經瘤形成包括神經膠質瘤、成膠質細胞瘤、腦膜瘤、成神經細胞瘤、成視網膜細胞瘤、星形細胞瘤、少突神經膠質細胞瘤。
“液體腫瘤”是指網狀內皮的或造血系統的瘤形成，例如淋巴瘤、骨髓瘤或白血病，或在性質上是擴散的瘤形成。白血病的具體實例包括急性的和慢性的淋巴母細胞瘤、成髓細胞瘤和多發性骨髓瘤。一般地，這樣的疾病源自較差地分化的急性白血病，例如，成紅細胞白血病和急性成巨核細胞白血病。具體的骨髓病包括但不限于急性前髓白血病(APML)、急性髓性白血病(AML)和慢性髓性白血病(CML)；淋巴樣惡性腫瘤包括但不限于急性成淋巴細胞性白血病(ALL)，其包括B-譜學系ALL和T-譜學系ALL、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、前淋巴細胞性白血病(PLL)、毛細胞性白血病(HLL)和瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥(WM)。具體的惡性淋巴瘤包括非-何杰金淋巴瘤和變體、外周T細胞淋巴瘤、成人T細胞性白血病/淋巴瘤(ATL)、皮膚T-細胞淋巴瘤(CTCL)、大顆粒淋巴細胞性白血病(LGF)、何杰金病和Reed-Sternberg氏病。
本發明的方法包括，在受試者的狀況中提供可檢測的或可測量的改善、即治療益處的方法。治療益處是狀況中的任何客觀的或主觀的、瞬時的或暫時的或長期的改善，或者疾病的嚴重性或不利癥狀的減輕。因而，當遞增地或部分地減輕了一種或多種有關的不利癥狀或并發癥的嚴重性、持續時間或頻率時，或者抑制或逆轉了狀況的一種或多種生理的、生化的或細胞的表現或特征時，就實現了令人滿意的臨床目的。因此，治療益處或改善(同義地使用“改進”)無需完全破壞所有的靶增殖細胞(例如，腫瘤)或消除與細胞增殖病有關的所有不利癥狀或并發癥。例如，部分地破壞腫瘤細胞塊，或甚至通過抑制腫瘤的發展或惡化而使腫瘤穩定化，可以降低死亡率和延長壽命，即使僅僅數天、數周或數月，盡管還存在一部分或大部分腫瘤。
治療利益的具體的非限制性的實例包括減小腫瘤體積(大小或細胞塊)，抑制腫瘤體積的增加，減慢或抑制腫瘤發展或轉移，刺激、誘導或增加腫瘤細胞裂解或細胞凋亡。如本文所公開的，本發明的方法的作用可以是增加腫瘤細胞塊，由于糖原毒性誘導的細胞膨脹。因此，腫瘤的細胞膨脹消退后、或細胞裂解或細胞凋亡發生后，腫瘤細胞塊會減小。對含有腫瘤的樣品(例如，血液或組織樣品)進行活組織檢查，可以確認腫瘤細胞是否表現出糖原毒性的特征，或是否減小了腫瘤細胞的數目或抑制了腫瘤細胞的增殖、生長或存活。或者，對于實體瘤，侵入性的和非侵入性的成像方法可以確定腫瘤的大小或體積。
可以減少的或降低的與腫瘤、瘤形成和癌癥有關的其它的不利癥狀和并發癥包括例如，惡心、厭食、嗜睡、疼痛和不適。因而，部分地或徹底地減少不利癥狀的嚴重性、持續時間或頻率、改善受試者的主觀感覺(例如提高的體力、食欲、心理良好)都是治療利益的具體的非限制性的實例。
還認為能導致另一種治療方案、規程或方法的應用的減少的治療也是有效的。例如，對于腫瘤，如果其實踐能導致治療腫瘤所需的抗腫瘤或免疫增強療法(例如化療藥物、放射療法或免疫療法)的更低頻率或更低劑量，則認為本發明的方法具有治療益處。
因而，根據本發明，提供了能增強抗腫瘤療法的有效性的方法。在一個實施方案中，方法包括給正在接受或已經接受了抗腫瘤或免疫增強療法(不是針對肝、肌肉或腦腫瘤)的受試者施用能增加胞內糖原的量的試劑和抗腫瘤或免疫增強療法。在另一個實施方案中，方法包括給正在接受或已經接受了抗腫瘤或免疫增強療法的受試者施用能增加胞內糖原的量的試劑，和抗腫瘤或免疫增強療法，前提是該試劑基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型的活性或表達。該試劑可以在施用抗腫瘤或免疫增強療法之前、基本上同時或之后施用。
能實現治療利益或改善的治療的劑量或“有效量”或“足夠量”，可以客觀地或主管地改進狀況的一個、幾個或所有的不利癥狀或并發癥，達到可測量的或可檢測的程度，盡管預防或抑制疾病、狀況或不利癥狀的進展或惡化是令人滿意的結果。因而，在細胞增殖病的情況下，該量足以為受試者提供治療利益，或者改善疾病的癥狀。根據要治療的疾病的狀態或治療的任何副作用的指示，可以成比例地增加或降低劑量。
當然，一般地與任何治療方案一樣，受試者會對治療表現出不同的響應。因此，合適的量至少部分地取決于治療的疾病(例如，良性增生或腫瘤和腫瘤類型或階段)、期望的治療效果以及個體受試者(例如，受試者中的生物利用率、性別、年齡等)和受試者基于遺傳的和后生的變異性對藥物的響應(例如，藥物基因組學(pharmacogenomics))。
術語“受試者”和“患者”在本文中可互換地使用，是指動物、一般地為哺乳動物，例如非人的靈長類(大猩猩，黑猩猩，猩猩，獼猴，長臂猿)、家養動物(狗和貓)、農業和牧場動物(馬、母牛、山羊、綿羊、豬)、實驗室的和實驗的動物(小鼠、大鼠、兔子、豚鼠)和人。受試者包括用于體內功效研究的疾病模型(例如，腫瘤或癌癥的動物模型)的動物(例如，小鼠和非人的靈長類)。人受試者包括成年人和兒童，例如，新生兒和年長的兒童，年齡為1至5、5至10、10至18之間的和更大的，例如，年齡為60至65、65至70、70至100的。
受試者包括患有細胞增殖病或處于患有細胞增殖病的風險中的人。受試者還包括抗腫瘤或免疫增強療法的候選者，正在接受抗腫瘤或免疫增強療法的受試者，和已經接受了抗腫瘤或免疫增強療法的受試者。
風險受試者包括具有細胞增殖病的家族史、遺傳誘因的那些，或已經遭受了前面的細胞增殖病(例如，良性增生、腫瘤或癌癥)的痛苦的那些。風險受試者還包括向致癌物或誘變劑的環境暴露，例如吸煙者，或者在工廠或工作場所中的那些。這樣的受試者沒有被確診，或者沒有表現出細胞增殖病的癥狀。因而，對與腫瘤有關的基因、基因缺失或基因突變進行遺傳篩選，可以鑒定出在發展細胞增殖病(例如癌癥)的風險中的受試者。例如，在發展乳腺癌風險中的受試者缺乏Brcal。例如在發展結腸癌風險中的受試者具有缺失的或突變的腫瘤抑制基因，例如腺瘤性結腸息肉病(APC)。在對細胞增殖病具有特定的遺傳誘因風險中的受試者是本領域已知的(見，例如，Genetic Basisof Human Cancer第2版.Bert Vogelstein(編輯)，Kenneth W.Kinzler(編輯)(2002)McGraw-Hill Professional；The Molecular Basis ofHuman Cancer.WB Coleman和GJ Tsongalis(2001)Humana Press和The Molecular Basis of Cancer.Mendelsohn等，WB Saunders(1995)).
因此，可以預防地治療風險受試者，以抑制或減小發展細胞增殖病的可能性，或者在已經治愈了細胞增殖病之后，抑制或減少復發相同的或不同的細胞增殖病的可能性。這樣的治療的結果可以是在治療的風險受試者中部分地或徹底地防止細胞增殖病或其不利癥狀。
在本發明中有用的核酸包含能編碼任何蛋白的序列，所述的蛋白能增加糖原的合成或胞內量，或直接地或間接地有助于糖原積累。因此，這樣的序列包含能編碼本文所述的任意的和所有的糖原生成酶的序列、和任意的和所有的糖原分解酶的抑制性核酸。
在本發明中有用的其它核酸序列包含能編碼蛋白的序列，所述蛋白直接地或間接地調節參與胞內糖原積累的任意蛋白的表達或活性。具體的實例包括能增加糖原生成酶的表達或活性的蛋白，和能降低糖原分解酶的表達或活性的蛋白。因此，這樣的序列包含能調節糖原生成酶和糖原分解酶的轉錄或翻譯的蛋白。這種蛋白的一個具體實例是Notch-1/Hes-1，其能抑制糖原分解酶α-葡糖苷酶(α-glucosisdase)基因的表達(Yan等，J Biol Chem.，27729760(2002))。因此，根據本發明也可以使用能編碼這樣的蛋白、或靶向這樣的蛋白進行抑制的核酸。
術語“核酸”、“多核苷酸”是指至少2個或多個核糖-或脫氧-核糖核酸堿基對(核苷酸)，它們通過磷酸酯鍵或等同鍵相連。核酸包括多核苷酸和多核苷。核酸包括單鏈的、雙鏈的或三鏈的環狀或線性的分子。核酸分子可以獨立地或混合的屬于任意的含有核苷酸的分子，例如但不限于RNA、DNA、cDNA、基因組核酸、非基因組核酸、天然的和非天然的核酸和合成的核酸。
核酸可以是任意的長度。在本發明中有用的核酸長度一般為約20個核苷酸至20Kb、10個核苷酸至10Kb、1至5Kb或更小、1000至約500個核苷酸或更小。核酸還可以更短，例如，長度為100至約500個核苷酸，或約12至25、25至50、50至100、100至250、或約250至500個核苷酸。更短的多核苷酸通常稱作單鏈或雙鏈DNA的“寡核苷酸”或“探針”。但是，這樣的寡核苷酸的長度沒有上限。
多核苷酸包括L-或D-形式和其混合物，還可以修飾它，以在施用給受試者時抗降解。具體的實例包括對存在于受試者的多種組織或體液中的內切核酸酶和外切核酸酶具有抗性的5′和3′鍵。
核酸包括反義物。如本文所使用的，術語“反義物”是指能結合特定的DNA或RNA序列的多核苷酸或肽核酸。反義物包括單鏈的、雙鏈的、三鏈的或更多鏈的RNA和DNA多核苷酸和肽核酸(PNA)，其能結合RNA轉錄物或DNA。具體的實例包括能結合有義RNA的RNA和DNA反義物。例如，單鏈的核酸可以靶向參與細胞中的糖原的代謝、分解代謝、去除或降解的蛋白轉錄物(例如，mRNA)。反義分子一般與有義鏈100％互補，但是可以是“部分地”互補的，其中僅僅一些核苷酸結合有義分子(低于100％互補，例如，95％、90％、80％、70％，有時更少)。
形成三鏈體的反義物可以結合雙鏈DNA，從而抑制基因的轉錄。源自基因的轉錄起始位點的寡核苷酸，例如在離起始位點-10和+10的位點之間，是具體的實例。
用于抑制基因表達的短干擾RNA(稱作siRNA或RNAi)是本領域已知的(見，例如，Kennerdell等，Cell 951017(1998)；Fire等，Nature，391806(1998)；WO 02/44321；WO 01/68836；WO 00/44895，WO 99/32619，WO 01/75164，WO 01/92513，WO 01/29058，WO01/89304，WO 02/16620和WO 02/29858)。通過能編碼形成“發夾”結構的RNA的核酸，或通過表達來自編碼核酸的每個末端的RNA，制作能雜交的2個RNA分子，可以誘導RNAi沉默。
核酶是能催化RNA的特異性切割的酶促RNA分子，其可以用于抑制編碼的蛋白的表達。核酶能與互補的靶RNA形成序列特異性的雜交體，靶RNA然后被切割。具體的實例包括設計的錘頭基序核酶分子，其可以特異性地和有效地催化序列的內切核酸降解切割，所述的序列能編碼例如參與糖原的代謝、分解代謝、去除或降解的蛋白。
通過掃描靶分子的切割位點，包括例如GUA、GUU和GUC，可以最初地鑒定出潛在的RNA靶內的核酶切割位點。一旦鑒定出來，就評價與含有切割位點的靶區域相對應的約15至20個核糖核苷酸的RNA序列的二級結構特征，其可能賦予寡核苷酸不可操作性。施用核糖核酸酶保護測定，通過測試與互補的寡核苷酸雜交的可接近性，還可以評價備選的靶序列的適用性。
反義物、核酶、RNAi和形成三鏈體的核酸在本文中統一稱作“抑制性核酸”或“抑制性多核苷酸”。這樣的抑制性核酸可以抑制參與胞內糖原的代謝、分解代謝、去除或降解的蛋白、例如糖原分解酶的表達。這樣的抑制性核酸可以抑制蛋白的表達或活性，所述蛋白依次抑制有助于糖原的合成或積累的蛋白的表達或活性。通過抑制這樣的蛋白的表達或活性，可以緩解參與糖原的合成或積累的蛋白的抑制，并積累胞內糖原。
抑制性多核苷酸不需要表達控制元件來在體內發揮作用。這樣的分子可以通過被動擴散被細胞吸收或進入細胞。還可以使用載體(例如病毒載體)將這樣的分子導入細胞中。抑制性多核苷酸可以由核酸編碼，以便轉錄它。而且，這樣的能編碼抑制性多核苷酸的核酸可以可操作地連接到表達控制元件上，以維持或增強編碼的反義物在細胞中或體內的表達。
基于在數據庫中可以得到的基因序列，可以設計抑制性核酸。例如，如本文所述，示例性的糖原分解酶的Genbank序列是本領域已知的，且可以用于設計抑制性核酸。
具體的抑制性核酸也是本領域已知的。糖原分解酶的反義物的具體實例包括磷酸化酶激酶α2表達調節(美國專利號6,458,591)；磷酸化酶激酶α1表達調節(美國專利號6,426,188)；磷酸化酶激酶β表達的抑制(美國專利號6,368,856)；糖原合酶激酶3β表達調節(美國專利號6,323,029)；糖原合酶激酶3α表達的抑制(美國專利號6,316,259)和肝糖原磷酸化酶表達的調節(美國專利號6,043,091)。
siRNA抑制的具體實例包括GSK3α和GSK3β(Yu等，Mol Ther.7228(2003))。通過轉染發夾siRNA載體抑制GSK-3α或GSK-3β，可以提高GSK-3靶β-連環蛋白的表達，并抑制可導致更顯著的β-連環蛋白表達的2種激酶，表明了GSK-3α和GSK-3β的基于載體的siRNA抑制。
核酸還包括核苷酸和核苷取代、添加和缺失，以及衍生的形式和融合/嵌合序列(例如，能編碼重組多肽)。例如，由于遺傳密碼的簡并性，核酸包括關于能編碼糖原生成酶的氨基酸序列的核酸簡并的序列和子序列。其它的實例是與能編碼糖原生成酶的氨基酸序列的序列互補的核酸。
核酸缺失(子序列和片段)可以具有約10至25、25至50或50至100個核苷酸。這樣的核酸可以用于表達多肽子序列，用于遺傳操縱(作為PCR擴增的引物和模板)，和作為探針，以檢測細胞、培養基、生物樣品(例如，組織、器官、血液或血清)或受試者中的能編碼蛋白的序列的存在或量(例如，通過雜交)。
術語“雜交”和其表述變體是指核酸序列之間的結合。雜交序列一般與能編碼參考序列的氨基酸序列的核酸具有約50％同源性。雜交序列之間的雜交區可以延伸超過至少約10-15個核苷酸、15-20個核苷酸、20-30個核苷酸、30-50個核苷酸、50-100個核苷酸或約100至200個核苷酸或更多。
使用各種標準克隆和化學合成技術，可以生產出核酸。這樣的技術包括但不限于核酸擴增，例如用引物(例如簡并引物混合物)進行基因組DNA或cDNA靶的聚合酶鏈反應(PCR)，所述引物能與抗體編碼序列退火。通過化學合成(例如，固相亞磷酰胺合成)或基因轉錄，也可以生產核酸。然后生產的序列可以體外地翻譯，或者將其克隆進質粒中，并擴增，然后在細胞(例如，微生物，例如酵母或細菌，真核生物，例如動物或哺乳動物細胞或植物)中表達。
為了表達或操縱，可以將核酸整合進表達盒和載體中。當核酸可操作地連接到表達控制元件時，包含核酸的表達盒和載體可以表達。如本文所使用的，術語“可操作地連接”是指提及的元件之間的物理的或功能的關系，其允許它們以它們的想要的方式運行。因而，表達控制元件“可操作地連接”到核酸是指，控制元件調節核酸轉錄，和適當時的轉錄物的翻譯。
要可操作地連接的元件不需要物理的連接。最小的元件可以連接到能編碼糖原生成酶的核酸。能控制可操作地連接的編碼蛋白(其“反式”地結合最小的元件)的核酸的表達的第二元件可以影響糖原生成酶的表達。因為第二元件調節糖原生成酶的表達，所以第二元件是可操作地連接到能編碼糖原生成酶的核酸的，盡管它不是物理地連接的。
術語“表達控制元件”是指能影響可操作地連接的核酸的表達的核酸。啟動子和增強子是表達控制元件的具體的非限制性的實例。“啟動子序列”是DNA調節區，其能啟動下游(3′方向)序列的轉錄。啟動子序列包含能促進轉錄起始的核苷酸。增強子也調節基因表達，但是可以在遠離基因(它與其可操作地連接)的轉錄起始位點處發揮作用。增強子在基因的5′或3′端、和在基因內(例如，在內含子或編碼序列中)發揮作用。其它的表達控制元件包括前導序列和融合配偶體序列，用于生成多基因的內部核糖體結合位點(IRES)元件，或多順反子的，信使，內含子的剪接信號，維持基因的正確讀框以允許mRNA的框內翻譯的元件、提供合適的目標轉錄物的多腺苷酸化作用的多腺苷酸化信號，和終止密碼子。
表達控制元件包括“組成型”元件，在不存在信號或刺激時，其中發生可操作地連接的核酸的轉錄。對信號或刺激作出響應、導致表達的表達控制元件(其增強或降低可操作地連接的核酸的表達)是“可調節的”。能對信號或刺激作出響應、增強可操作地連接的核酸的表達的可調節的元件稱作“誘導型元件”。能對信號或刺激作出響應、降低可操作地連接的核酸的表達的可調節的元件稱作“阻抑型元件”(即，該信號降低表達；當信號消除或沒有時，增強表達)。
表達控制元件包括在特定的組織或細胞類型中有活性的元件，稱作“組織特異性的表達控制元件”。組織特異性的表達控制元件一般是在特定的細胞或組織類型中有活性的，因為它們能被轉錄激活物蛋白或其它的轉錄調節劑所識別，與其它的細胞或組織類型相比，這些轉錄激活物在特定的細胞或組織類型是有活性的。
組織特異性的表達控制元件包括在過度增殖的細胞、例如細胞增殖病(包括腫瘤和癌癥)中有活性的啟動子和增強子。這樣的啟動子的具體的非限制性的實例是己糖激酶II，COX-2，α-胎蛋白，癌胚抗原，DE3/MUC1，前列腺特異性抗原，C-erB2/neu，端粒酶逆轉錄酶和缺氧反應啟動子。
對于細菌表達，組成型的啟動子包括T7，以及誘導型啟動子例如噬菌體λ的pL，plac，ptrp，ptac(ptrp-lac雜交體啟動子)。在昆蟲細胞系統中，可以使用組成型的或誘導型的啟動子(例如，ecdysone)。在酵母中，組成型的啟動子包括，例如，ADH或LEU2和誘導型的啟動子例如GAL(見，例如，Ausubel等，InCurrent Protocols in MolecularBiology，卷2，Ch.13，ed.，Greene Publish.Assoc.& WileyInterscience，1988；Grant等，InMethods in Enzymology，153516-544(1987)，eds.Wu & Grossman，1987，Acad.Press，N.Y.；Glover，DNA Cloning，卷II，Ch.3，IRL Press，Wash.，D.C.，1986；Bitter，InMethods in Enzymology，152673-684(1987)，eds.Berger &Kimmel，Acad.Press，N.Y.；和Strathern等，The Molecular Biologyof the Yeast Saccharomyceseds.Cold Spring Harbor Press，卷I和II(1982))。
對于哺乳動物表達，可以使用病毒的或其它來源的組成型的啟動子。例如，可以使用SV40，或病毒長末端重復序列(LTR)等，或源自哺乳動物細胞的基因組的(例如，金屬硫蛋白IIA啟動子；熱休克啟動子，類固醇/甲狀腺激素/視黃酸反應元件)或源自哺乳動物病毒的(例如，腺病毒晚期啟動子；誘導型小鼠乳癌病毒LTR)誘導型啟動子。
因此，除了別的以外，本發明的方法包括將核酸或蛋白導入靶細胞，例如，細胞增殖病的細胞。這樣的細胞稱作轉化的細胞。當提及細胞或生物時使用的術語“轉化的”是指，將外源分子、例如蛋白或核酸(例如，轉基因)整合進細胞后，該細胞中的遺傳變化。因而，“轉化的細胞”是這樣的細胞，其中或在其后代中已經手工地(例如通過重組DNA技術)導入了外源分子。核酸或蛋白可以在轉化的細胞和其后代中穩定地或瞬時地表達。可以繁殖轉化的細胞，并表達導入的蛋白，或轉錄核酸或表達編碼的蛋白。后代細胞可以與親本細胞不同，因為在復制過程中可能發生突變。
轉化的細胞包括但不限于原核細胞和真核細胞，例如細菌、真菌、植物、昆蟲和動物(例如，哺乳動物，包括人)細胞。在一個具體的方面，細胞是能生產糖原或對糖原毒性敏感的細胞。在另一個具體的方面，細胞是這樣的細胞，其包含糖原生成酶、糖原分解酶或參與增加或降低胞內糖原的其它蛋白的表達控制元件，其可操作地連接至報道分子。細胞可以存在于培養物、許多細胞中的一部分、或離體的組織或器官中，或在受試者中(體內)。
一般地，細胞轉化采用“載體”，它是指質粒、病毒(例如病毒載體)、或本領域已知的其它的載體，其可以通過插入或整合核酸來操縱。為了遺傳操縱，可以使用“克隆載體”，為了轉錄或翻譯插入的多核苷酸，可以使用“表達載體”。這樣的載體可以用于導入核酸，包括能編碼糖原生成酶的核酸和能編碼抑制性核酸(其可操作地連接至表達控制元件)的核酸，和在細胞中或在受試者體內表達編碼的蛋白或抑制性核酸(例如，在溶液中或在固相中)。
載體一般含有用于在細胞中繁殖的復制起點。可以包含存在于載體中的控制元件(包括如本文所述的表達控制元件)，在合適時以促進轉錄和翻譯。
載體可以包含選擇標記。“選擇標記”是這樣的基因，它有利于選擇含有該基因的細胞。“陽性選擇”是指一個過程，其中含有選擇標記的細胞在暴露于陽性選擇后仍能存活。抗藥性是陽性選擇標記的一個實例；含有標記的細胞在含有選擇藥物的培養基中能存活，而缺少該標記的細胞則會死亡。選擇標記包括抗藥性基因例如neo，其能賦予對G418的抗性；hygr，其能賦予對潮霉素的抗性和puro，其能賦予對嘌呤霉素的抗性。其它的陽性選擇標記基因包括有利于鑒定或篩選含有標記的細胞的基因。這些基因其中包括熒光蛋白(GFP和GFP-樣發色團，螢光素酶)的基因，lacZ基因，堿性磷酸酶基因和表面標記例如CD8。“陰性選擇”是指一個過程，其中含有陰性選擇標記的細胞在暴露于合適的陰性選擇試劑后被殺死。例如，含有單純皰疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)基因(Wigler等，Cell 11223(1977))的細胞對藥物丙氧鳥苷(GANC)是敏感的。類似地，gpt基因賦予了細胞對6-硫代黃嘌呤(6-thioxanthine)的敏感性。
包含的病毒載體是基于逆轉錄病毒、腺伴隨病毒(AAV)、腺病毒、呼腸孤病毒、慢病毒、輪狀病毒基因組、猿猴病毒40(SV40)或牛乳頭瘤病毒的病毒(Cone等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816349(1984)；Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory，Gluzmaned.，1982；Sarver等，Mol.Cell.Biol.1486(1981))。腺病毒能有效地感染緩慢復制的和/或終末分化的細胞，且可以用于靶向緩慢復制的和/或終末分化的細胞。用于表達的其它病毒載體包括細小病毒、諾沃克病毒、冠狀病毒、副粘病毒和彈狀病毒、披膜病毒(例如，辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒(semliki forest virus))和水泡性口膜炎病毒(VSV)。
哺乳動物表達載體包括用于體內和離體表達的那些，例如AAV(美國專利號5,604,090)。以前已經證實，AAV載體能在人中表達，其水平足以實現治療利益(Kay等，Nat.Genet.24257(2000)；Nakai等，Blood 914600(1998))。腺病毒載體(美國專利號5,700,470；5,731,172和5,928,944)、單純皰疹病毒載體(美國專利號5,501,979)、逆轉錄病毒(例如，慢病毒載體用于感染分裂的以及非分裂的細胞和泡沫病毒)載體(美國專利號5,624,820；5,693,508；5,665,577；6,013,516和5,674,703和WIPO公開WO 92/05266和WO 92/14829)和乳頭瘤病毒載體(例如，人和牛乳頭瘤病毒)都已經用于基因療法(美國專利號5,719,054)中。載體還包括基于巨細胞病毒(CMV)的載體(美國專利號5,561,063)。已經開發了能有效地將基因輸送進腸道細胞中的載體(美國專利號5,821,235；5,786,340和6,110,456)。
通過將蛋白包含在能結合到靶細胞配體或受體的表面上，可以使用含有病毒或哺乳動物載體的病毒微粒或小泡來靶向特定的細胞類型(例如，不希望的增殖細胞)。或者，可以將細胞類型特異性的啟動子和/或增強子包含在載體中，以在靶細胞中表達核酸。因而，可以使病毒載體本身、或病毒表面上的蛋白能靶向細胞，以實現體外、離體或體內轉化。
通過本領域已知的方法，例如滲透壓休克(例如，磷酸鈣)、電穿孔、微注射、細胞融合等，也可以將組合物(例如，蛋白和核酸)導入靶細胞中。使用其它的技術，也可以實現核酸和多肽的體外、離體和體內導入。例如，聚合物，例如聚酯、聚氨基酸、水凝膠、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素、硫酸魚精蛋白或丙交酯/乙交酯共聚物、聚交酯/乙交酯共聚物、或乙烯乙酸乙烯酯共聚物。通過凝聚技術或通過界面聚合作用，例如通過分別使用羥甲基纖維素或明膠-微膠囊、或聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，可以將核酸包封在微膠囊中，或在膠體系統中。膠體分散系統包括大分子復合物、納米膠囊(nano-capsule)、微球體、珠和基于脂質的系統，包括水包油乳狀液、膠束、混合的膠束和脂質體。
用于將不同的組合物導入細胞的脂質體是本領域已知的，包括例如磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、脂轉染試劑和DOTAP(見，例如，美國專利號4,844,904；5,000,959；4,863,740和4,975,282和GIBCO-BRL，Gaithersburg，Md)。用于基因療法的基于哌嗪的兩親的(amphilic)陽離子脂質也是已知的(見，例如，美國專利號5,861,397)。陽離子脂質系統也是已知的(見，例如，美國專利號5,459,127)。
聚合物、微膠囊和膠體分散系統(例如脂質體)在本文中統一稱作“小泡”。因此，包括了體外、體內和離體地輸送進細胞或組織中的病毒的和非病毒的載體方法。
術語“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文中可互換地使用，指通過酰胺鍵或等同鍵共價連接的2個或多個氨基酸或殘基。多肽的長度沒有限制，氨基酸可以連接到非天然的和非酰胺的化學鍵上，包括例如，與戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯、雙功能的馬來酰亞胺或N，N′-二環己基碳化二亞胺(DCC)形成的那些。非酰胺鍵包括例如，酮亞甲基、氨基亞甲基、烯、醚、硫代醚等(見，例如，Spatola inChemistry andBiochemistry of Amino Acids，Peptides and Proteins，卷7，pp 267-357(1983)，“Peptide and Backbone Modifications，”Marcel Decker，NY)。
當用作組合物的修飾語時，術語“分離的”是指該組合物是通過手工制備的，或從其天然存在的體內環境指分離出來的。通常，這樣分離的組合物基本上不含有一種或多種它們一般與其天然伴隨的物質，例如，一種或多種蛋白、核酸、脂質、碳水混合物、細胞膜。術語“分離的”不排除替代的物理形式，例如多肽多聚體、翻譯后的修飾(例如，磷酸化、糖基化)或衍生的形式。
當不含有大多數或全部一般與其天然伴隨的物質時，“分離的”組合物也可以是“基本上純的”。因而，分離的分子也是基本上純的，不包含存在于眾多其它序列中的多肽或多核苷酸，例如抗體庫的抗體，或基因組或cDNA庫中的核酸。“基本上純的”分子可以與一個或多個其它分子組合。因而，術語“基本上純的”不排除組合物的組合。
基本的純度可以是至少約60％或更大的分子質量。純度還可以是約70％或80％或更大，且可以是更大，例如，90％或更大。可以通過任何合適的方法檢測純度，包括例如紫外光譜學、層析(例如，HPLC、氣相)、凝膠電泳(例如，銀染色或考馬斯染色)和序列分析(核酸和肽)。
根據本發明使用的核酸、蛋白、試劑和其它組合物包括如本文所述的修飾形式，前提是修飾形式保留未修飾過的或參考的核酸、蛋白、試劑或組合物的至少一部分功能或活性。例如，能編碼參與糖原合成的修飾蛋白(例如，糖原生成酶)的核酸可以保留足夠的活性，以刺激或增加胞內糖原(修飾過的蛋白可以單獨使用，或者與另一種參與糖原合成的蛋白組合使用)，但是相對于參與糖原合成的參考的未修飾過的蛋白，具有升高的或降低的活性。
因而，本發明還使用蛋白、核酸、試劑和其它組合物，其含有示例性的蛋白、核酸、試劑和組合物的修飾。如本文所使用的，當提及組合物(例如蛋白、核酸、試劑或其它組合物)時，術語“修飾”和其表述變體是指源自參考組合物的修飾過的組合物。與參考的未修飾過的蛋白、核酸、試劑或組合物相比，這樣的修飾過的蛋白、核酸、試劑和其它組合物可以具有更高的或更低的活性。
多肽修飾包括氨基酸取代、添加和缺失，其也稱作“變體”。多肽修飾也包括用一個或多個D-氨基酸取代L-氨基酸(和其混合物)、結構和功能類似物，例如，含有合成的或非天然的氨基酸或氨基酸類似物的肽模擬物(peptidomimetics)，和衍生形式。
多肽修飾還包括融合(嵌合)多肽序列，其是含有一個或多個分子的氨基酸序列，所述分子通常不存在于參考天然(野生型)序列中，共價地附著到該序列上，例如，一個或多個氨基酸。修飾包括環結構，例如分子的氨基和羧基端之間的末端與末端的酰胺鍵，或分子內的或分子間的二硫鍵。可以體外或體內修飾多肽(包含抗體)，例如，翻譯后地修飾，以包含例如糖殘基、磷酸基、遍在蛋白質、脂肪酸或脂質。
“保守取代”是將一個氨基酸替換為生物學上、化學上或結構上類似的殘基。生物學上類似是指，該取代與生物學活性(例如酶活性)相容。結構上類似是指，該氨基酸的側鏈具有類似的長度，例如丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸，或具有類似的大小。化學上類似是指，該殘基具有相同的電荷，或二者都是親水的或疏水的。具體的實例包括一個疏水殘基的取代，例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一個，或一個極性殘基取代另一個，例如精氨酸取代賴氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬酰胺，絲氨酸取代蘇氨酸等。
術語“相同”或“同一性”是指，提及的2個或多個實體是相同的。因而，當2個蛋白序列相同時，它們具有相同的氨基酸序列。“同一性區域”是指提及的相同的2個或多個實體的一部分。因而，當2個蛋白序列在一個或多個序列區相同時，它們在該區具有氨基酸同一性。術語“基本的同一性”是指，分子是結構上相同的，或具有參考分子的一個或多個功能(例如，生物學功能)中的至少部分功能。具有基本的同一性的多肽包括，與參考多肽具有50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或更高的同一性的氨基酸序列，前提是修飾的多肽具有至少部分的活性，例如有助于糖原合成或積累。
如本文所使用的，術語“子序列”或“片段”是指全長分子的一部分。蛋白子序列比全長對比序列少一個或多個氨基酸(例如一個或多個內部的或在氨基或羧基端的末端氨基酸缺失)。核酸子序列比全長對比核酸序列少至少一個核苷酸。因此，子序列可以是任意的長度，最高達全長分子。
修飾的形式還包括衍生序列，例如，氨基酸，其中游離的氨基形成鹽酸胺、對甲苯磺酰基、芐氧羰基；游離的羧基形成鹽、甲基和乙基酯；游離的羥基形成O-酰基或O-烷基衍生物，以及天然存在的氨基酸衍生物，例如，4-羥脯氨酸取代脯氨酸、5-羥賴氨酸取代賴氨酸、高絲氨酸取代絲氨酸、鳥氨酸取代賴氨酸等。使用本領域熟知的眾多方法中的任一種，可以產生修飾(例如，基于PCR的定位缺失和插入誘變、化學修飾和誘變、交聯等)。
使用本領域已知的方法，可以通過細胞表達或體外翻譯使用能編碼多肽的核酸的重組DNA技術或化學合成多肽鏈制備多肽序列。多肽序列也可以通過化學合成儀(見，例如，Applied Biosystems，FosterCity，CA)生產。
本發明可以與任意的其它治療方案或治療規程結合實施。本發明的組合物和方法也可以與能提供理想效果的任意的其它試劑或治療劑相組合。示例性的試劑和治療劑具有抗腫瘤活性或免疫增強活性。
因此，本發明提供了這樣的方法，其中本發明的方法與任意的治療方案或治療規程組合使用，例如本文所述的或本領域已知的抗細胞增殖方案。在一個實施方案中，方法包括施用抗腫瘤或免疫增強治療劑或試劑。抗腫瘤或免疫增強治療劑或試劑可以在施用能增加胞內糖原的核酸或試劑或治療劑之前、基本上與其同時或之后施用。
如本文所使用的，“抗腫瘤”、“抗癌”或“抗瘤形成”的試劑、治療、療法、活性或效果是指能抑制、降低、減緩、減少或預防增生、腫瘤、癌或瘤形成的生長、轉移、增殖或存活的試劑、療法、治療方案、規程或方法。抗腫瘤的試劑、療法或治療可以如下進行破壞、抑制或延遲細胞周期進程或細胞增殖；刺激或增強細胞凋亡、裂解或細胞死亡；抑制核酸或蛋白合成或代謝；抑制細胞分裂；或降低、減少或抑制細胞存活，或生產或利用細胞存活因子、生長因子或信號傳遞途徑(胞外的或胞內的)。
抗腫瘤療法的實例包括化學療法、免疫療法、放射療法(離子化或化學的)、局部的或區域的熱(過熱療法)療法和手術切除。
抗細胞增殖和抗腫瘤試劑的具體的非限制性種類包括烷化試劑、抗代謝物、植物提取物、植物生物堿、亞硝基脲、激素、核苷和核苷酸類似物。微生物毒素的具體的非限制性的實例包括細菌霍亂毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、白喉毒素和植物毒素蓖麻蛋白。藥物的具體實例包括環磷酰胺、咪唑硫嘌呤、環孢菌素A、氫化潑尼松、美法侖、苯丁酸氮芥、氮芥、馬利蘭、氨甲蝶呤、6-巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、AZT、5-氮胞苷(5-AZC)和與5-氮胞苷有關的化合物、博來霉素、放射菌素D、光神霉素、絲裂霉素C、卡氮芥、羅氮芥、賽氮芥、鏈脲霉素、羥基脲、順氯氨鉑、米托坦、甲基芐肼、氮烯唑胺、紫杉醇、長春堿、長春新堿、阿霉素和二溴甘露醇。
放射療法包括給受試者內部地或外部地輸送。例如，可以給受試者外部地施用α、β、γ和X-射線，無需受試者內在化或物理地接觸放射性同位素。X-射線劑量范圍的具體實例是，從日劑量50至200倫琴持續較長的時間(3至5/周)至單次劑量2000至6000倫琴。劑量變化較大，且取決于暴露時間、同位素的半衰期、發射的放射類型、細胞類型和治療的位置以及疾病的發展階段。放射性核素的具體的非限制性的實例包括例如47Sc，67Cu，72Se，88Y，90Sr，90Y，97Ru，99Tc，105Rh，111In，125I，131I，149Tb，153Sm，186Re，188Re，194Os，203Pb，211At，212Bi，213Bi，212Pb，223Ra，225Ac，227Ac和228Th。
如這里使用的，當提及試劑、療法或治療時使用的術語“免疫增強”是指，該試劑、療法或治療能增強、刺激、誘導或促進體液或細胞介導的免疫反應。這樣的療法可以增強一般的免疫反應，或者增強對特定靶的免疫反應，例如，細胞增殖病，例如腫瘤或癌癥。
免疫增強劑的具體的非限制性的實例包括生長因子、存活因子、分化因子、細胞因子和趨化因子。其它的實例是單克隆抗體、多克隆抗體和其混合物。能通過腫瘤相關抗原(TAA)結合腫瘤細胞的抗體是免疫增強治療的一個具體實例。術語“腫瘤相關抗原”或“TAA”是指由腫瘤細胞表達的抗原。
可以被靶向的TAA及相應抗體的具體實例包括例如，M195抗體，其能結合白血病細胞CD33抗原(美國專利號6,599,505)；單克隆抗體DS6，其能結合卵巢癌CA6腫瘤相關抗原(美國專利號6,596,503)；人IBD12單克隆抗體，其能結合上皮細胞表面H抗原(美國專利號4,814，275)和BR96抗體，其能結合結腸、乳房、卵巢和肺癌表達的Lex碳水化合物表位。可以使用的其它的抗腫瘤抗體包括例如，Herceptin(抗Her-2neu抗體)，Rituxan，Zevalin，Bevacizumab(Avastin)，Bexxar，Campath，Oncolym，17-1A(Edrecolomab)，3F8(抗成神經細胞瘤抗體)，MDX-CTLA4，IMC-C225(Cetuximab)和Mylotarg。
免疫增強劑和治療劑的其它實例包括免疫細胞，例如淋巴細胞、漿細胞、巨噬細胞、樹突細胞、NK細胞和B-細胞，它們表達針對細胞增殖病的抗體，或者可能產生針對細胞增殖病的免疫反應。能增強或刺激免疫原性的細胞因子包括IL-2、IL-1α、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-7、粒細胞-巨噬細胞-集落刺激因子(GMCSF)、IFN-γ、IL-12、TNF-α和TNFβ，它們也是免疫增強劑的非限制性實例。包括MIP-1α、MIP-1β、RANTES、SDF-1、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、嗜酸性粒細胞趨化因子、嗜酸性粒細胞趨化因子-2、I-309/TCA3、ATAC、HCC-1、HCC-2、HCC-3、PARC、TARC、LARC/MIP-3α、CKβ、CKβ6、CKβ7、CKβ8、CKβ9、CKβ11、CKβ12、C10、IL-8、ENA-78、GROα、GROβ、GCP-2、PBP/CTAPIIIβ-TG/NAP-2、Mig、PBSF/SDF-1和淋巴細胞趨化因子在內的趨化因子是免疫增強劑的其它的非限制性的實例。
本發明還提供了試劑盒，其包含試劑、核酸、蛋白和藥物制劑，它們包裝在合適的包裝材料中，任選地與關于使用試劑盒組分的說明書(例如，關于實現本發明的方法的說明書)組合。在一個實施方案中，試劑盒包含一定量的能增強糖原生成酶的表達或活性的試劑，和在標簽或包裝插頁上的關于給需要治療的受試者施用試劑的說明書。在另一個實施方案中，試劑盒包含一定量的能降低糖原分解酶的表達或活性的試劑，和在標簽或包裝插頁上的關于給需要治療的受試者施用試劑的說明書。在另一個實施方案中，試劑盒包含一定量的能增強胞內糖原的積累的試劑，和在標簽或包裝插頁上的關于給需要治療的受試者施用試劑的說明書。在其它方面，試劑盒還包含抗腫瘤劑或免疫增強劑，例如，烷化劑、抗代謝物、植物生物堿、植物提取物、抗生素、亞硝基脲、激素、核苷類似物、核苷酸類似物或抗體。在其它方面，試劑盒包含例如用于將試劑局部地、區域性地或全身地輸送給受試者的制品。
如本文所使用的，術語“包裝材料”是指容納試劑盒組分的物理結構。包裝材料可以無菌地維持組分，且可以由通常用于該目的的材料(例如，紙、波紋纖維、玻璃、塑料、箔、安瓿等)制成。標簽或包裝插頁可以包含實現本發明的方法的合適的書面說明書，例如，治療細胞增殖病，用于鑒定具有抗細胞增殖活性的試劑的測定等。因而，在其它的實施方案中，試劑盒包含標簽或包裝插頁，其包含用于在溶液中、體外、體內或離體地實現本發明的方法的說明書。
因此，說明書還可以包括關于實現本文所述的任何方法的說明。例如，本發明的藥物組合物可以與關于給受試者施用以治療細胞增殖病(例如腫瘤或癌癥)的說明書一起包含在容器、包裝或分配器中。說明書還可以包含令人滿意的臨床終點或可能發生的任何不利癥狀、儲存信息、有效期、或管理機構(例如Food and Drug Administration)要求的用于人受試者的任何信息。
說明書可以是在“印刷物”上，例如在試劑盒內的紙或紙版上，在固定到試劑盒或包裝材料上、或系在裝有試劑盒組分的小瓶或試管上的標簽上。說明書可以包含聲音或視頻磁帶，且另外地包含在計算機可讀介質上，例如磁盤(軟盤或硬盤)、光學CD例如CD-或DVD-ROM/RAM、磁帶、電存儲介質例如RAM和ROM和它們的混合物，例如磁/光存儲介質。
本發明的試劑盒還可以包含緩沖劑、防腐劑、或蛋白/核酸穩定劑。試劑盒還可以包含用于測定活性的對照組分，例如，對照樣品或標準物。試劑盒的每個組分可以包裝在單個的容器或混合物中，且所有的各個容器可以在一個或多個包裝中。
蛋白、核酸、試劑和其它的組合物和本發明的方法還可以使用藥物制劑。這樣的藥物制劑用于體內或離體地施用給受試者。
藥物制劑包含“藥學上可接受的”和“生理上可接受的”載體、稀釋劑或賦形劑。如本文所使用的，術語“藥學上可接受的”和“生理上可接受的”包括與藥物施用相容的溶劑(水性的或非水性的)、溶液、乳狀液、分散介質、涂層、等滲劑和吸收促進或延遲劑。這樣的制劑可以包含在液體中；在乳狀液、懸浮液、糖漿或酏劑或固體形式中；在片劑(涂覆的或未涂覆的)、膠囊(硬的或軟的)、粉末、顆粒、晶體或微珠(microbead)中。補充的化合物(例如，防腐劑、抗細菌劑、抗病毒劑和抗真菌劑)也可以包含在組合物中。
可以使藥物制劑與局部的、區域的或全身的施用途徑相容。因而，藥物制劑包含適用于通過特定途徑施用的載體、稀釋劑或賦形劑。本發明的組合物的施用途徑的具體的非限制性的實例是腸胃外的，例如，靜脈內的、皮內的、肌內的、皮下的、經口的、經皮的(局部的)、跨粘膜的、顱內的、眼內的、直腸的施用，和適用于施用方案或要治療的狀況的任何其它劑型。
用于腸胃外的、皮內的或皮下應用的溶液或懸浮液可以包含無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇、或其它的合成溶劑；抗細菌劑，例如芐醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸；緩沖劑，例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，和用于調節張力的試劑，例如氯化鈉或葡萄糖。可以用酸或堿調節pH，例如鹽酸或氫氧化鈉。
用于注射的藥物制劑包含無菌水性溶液(這是水溶性的)或分散體和用于臨時制備無菌注射溶液或分散體的無菌粉末。對于靜脈內施用，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸緩沖鹽水(PBS)。載體可以使溶劑或分散介質，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)和其合適的混合物。可以維持流動性，例如，通過使用涂層例如卵磷脂，在分散體的情況下，通過維持需要的顆粒大小，和使用表面活性劑。抗細菌劑和抗真菌劑包括例如，對羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸和硫柳汞。組合物中可以包含等滲劑，例如，糖類，多元醇例如甘露醇、山梨醇，氯化鈉。通過包含能延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁或明膠，可以延長可注射組合物的吸收。
通過將需要量的活性組合物整合在合適的溶劑(含有一種或上述成分的組合)中，可以制備出無菌注射制劑。通常，通過將活性組合物整合進含有基礎分散介質和任何其它成分的無菌載體中，制備出分散體。在用無菌粉末制備無菌注射溶液的情況下，制備方法包括，例如，真空干燥和凍干，這會產生活性成分和任意的其它理想成分(來自先前制備的它們的溶液)的粉末。
對于跨粘膜的或經皮的施用，制劑中使用了適用于要透過的屏障的滲透劑。這樣的滲透劑是本領域已知的，對于跨粘膜施用，包括例如去污劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。通過使用鼻噴霧、吸入裝置(例如，吸氣器)或栓劑，可以實現跨粘膜施用。對于經皮給藥，將活性混合物配制進軟膏、油膏、凝膠、乳膏或貼劑中。
可以用載體制備藥物制劑，所述載體能避免從體內快速消除，例如控釋制劑或延時材料，例如單硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯。使用制品也可以輸送制劑，例如植入物和微囊化的輸送系統，以實現局部的、區域的或全身的持續輸送或控釋。
可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚乙醇酸(polyglycolic acid)、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。這樣的制劑的制備方法是本領域的技術人員已知的。材料還可以從AlzaCorporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.公司商業購得。脂質體懸浮液(包含脂質體，其使用抗體或病毒外殼蛋白靶向細胞或組織)也可以用作藥學上可接受的載體。它們可以根據已知的方法制備，例如如美國專利號4,522,811所述。
適用于給藥的其它藥物制劑是本領域已知的(見，例如，Gennaro(ed.)，RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第20版，Lippincott，Williams & Wilkins(2000)；Ansel等，PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems，第7版，Lippincott Williams& Wilkins Publishers(1999)；Kibbe(ed.)，Handbook of PharmaceuticalExcipients American Pharmaceutical Association，第3版.(2000)；和Remington′s Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms，Technonic Publishing Co.，Inc.，Lancaster，Pa.，(1993))。
根據本發明使用的包含核酸、蛋白、試劑、治療劑和藥物制劑的組合物可以包裝在劑量單位形式中，以方便施用和劑量的統一。本文使用的“劑量單位形式”是指適合用作單位劑量治療劑的物理上分離的單位；每個單位含有一定量的組合物和載體、賦形劑、稀釋劑或介質結合，經過計算它們能產生理想的治療效果。單位劑量形式取決于許多因素，包括但不一定限于采用的特定組合物、要達到的效果、要治療的受試者的藥物動力學和藥物基因組學。
本發明提供了鑒定和篩選具有抗細胞增殖活性和可以用于治療細胞增殖病(例如，癌癥和腫瘤)的試劑和治療劑的無細胞的(例如，在溶液中，在固相中)和基于細胞的(例如，體外或體內)方法。該方法可以在溶液中進行，使用原核或真核細胞在體外進行，和在體內進行，例如使用疾病動物模型。可以單獨使用鑒定出的能增加糖原水平、例如達到毒性水平的試劑和治療劑，或者與基因轉移組合使用，以降低參與糖原的代謝、分解代謝、降解或去除的蛋白(例如，糖原生成酶)的表達或活性，或者增加或刺激參與糖原的合成或積累的蛋白(例如，糖原分解酶或葡萄糖轉運蛋白)的表達或活性。
在一個實施方案中，鑒定具有抗細胞增殖活性的試劑的方法包括使能生產糖原的細胞與實驗試劑接觸；和在存在實驗試劑的情況下或在與實驗試劑接觸后，測定糖原毒性。糖原毒性將實驗試劑鑒定為具有抗細胞增殖活性的試劑。在另一個實施方案中，鑒定具有抗細胞增殖活性的試劑的方法包括使能生產糖原的細胞與實驗試劑接觸；和在存在實驗試劑的情況下或在與實驗試劑接觸后，測定細胞生存力。減小的或降低的細胞生存力將實驗試劑鑒定為具有抗細胞增殖活性的試劑。
使用未轉化的能生產糖原的或能表現出糖原毒性的細胞，可以實現本發明的基于細胞的篩選測定。這樣的細胞一般能表達一種或多種糖原生成酶或糖原分解酶，可以測定其表達或活性，以鑒定具有抗細胞增殖活性的試劑。
因而，在另一個實施方案中，鑒定具有抗細胞增殖活性的試劑的方法包括使能表達糖原生成酶或糖原分解酶的細胞與實驗試劑接觸；和在存在實驗試劑的情況下或在與實驗試劑接觸后，測量糖原生成酶或糖原分解酶的活性或表達。糖原生成酶或糖原分解酶的升高的或降低的表達或活性分別將實驗試劑鑒定為具有抗細胞增殖活性的試劑。在各個方面，測量了一種或多種糖原生成酶，例如糖原生成蛋白，糖原生成蛋白-2，糖原合酶，糖原生成蛋白相互作用蛋白(GNIP)，蛋白質磷酸酶1(PP-1)，葡萄糖轉運蛋白(GLUT)，PP-1同工型或家族成員的靶向糖原的亞基(例如，GL(PPP1R3B，PPP1R4)，PTG(PPP1R3C，PPP1R5)，PPP1R3D(PPP1R6)或Gm/RG1(PPP1R3A，PPP1R3))，己糖激酶同工型或家族成員，谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶，或一個或多個糖原分解酶，例如糖原磷酸化酶，脫支酶，磷酸化酶激酶，葡萄糖-6-磷酸酶，PPP1R1A(蛋白質磷酸酶1，調節抑制劑亞基1A)，PPP1R2(蛋白質磷酸酶1，調節亞基2)，果糖磷酸激酶，糖原合酶激酶-3同工型，GCKR葡糖激酶調節蛋白或α-葡糖苷酶。
或者，在篩選方法中可以使用轉化的細胞(例如，用核酸序列轉化)。例如，細胞可以是穩定地或瞬時地轉化了基因的，該基因的表達由糖原生成酶或糖原分解酶的調節區調節，該基因的表達變化可以指示該試劑是否具有抗細胞增殖活性。具體的實例是用報告基因轉化的細胞，該報告基因是指能編碼可以檢測的蛋白的基因，例如半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉移酶、葡萄糖氧化酶、螢光素酶或綠色熒光蛋白。表達可以由選自下述的啟動子調節糖原生成蛋白，糖原生成蛋白-2，糖原合酶，糖原生成蛋白相互作用蛋白(GNIP)，蛋白質磷酸酶1(PP-1)，葡萄糖轉運蛋白(GLUT)，PP-1家族的靶向糖原的亞基，己糖激酶家族成員，谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶，糖原磷酸化酶，脫支酶，磷酸化酶激酶，葡萄糖-6-磷酸酶，PPP1R1A(蛋白質磷酸酶1，調節抑制劑亞基1A)，PPP1R2(蛋白質磷酸酶1，調節亞基2)，果糖磷酸激酶，糖原合酶激酶-3同工型，GCKR葡糖激酶調節蛋白或α-葡糖苷酶。
因而，在另一個實施方案中，鑒定具有抗細胞增殖活性的試劑的方法包括使能表達基因的細胞與實驗試劑接觸，所述基因的表達由糖原生成酶或糖原分解酶的調節區調節；和在存在實驗試劑的情況下或在與實驗試劑接觸后；測量該基因的表達，其中該基因的增強的或降低的表達將實驗試劑鑒定為具有抗細胞增殖活性的試劑。
用于實現篩選方法的細胞類型的具體的非限制性的實例包括來自對細胞增殖病敏感的任何組織或器官的細胞。例如，細胞包括過度增殖的、無限增殖化的腫瘤和癌細胞系，和源自腦、頭或頸、乳房、食管、嘴、胃、肺、胃腸道、肝、胰、腎、腎上腺、膀胱、結腸、直腸、前列腺、子宮、子宮頸、卵巢、睪丸、皮膚、肌肉或造血系統的原代分離物。
在其它的實施方案中，鑒定具有抗細胞增殖活性的試劑的方法包括提供能增強糖原生成酶的表達或活性的實驗試劑；使能表達糖原生成酶的細胞與實驗試劑接觸；和在存在實驗試劑的情況下或在與實驗試劑接觸后，測定糖原毒性。糖原毒性將實驗試劑鑒定為具有抗細胞增殖活性的試劑。
在其它的實施方案中，鑒定具有抗細胞增殖活性的試劑的方法包括提供能結合糖原生成酶或糖原分解酶的實驗試劑；使能表達糖原生成酶或糖原分解酶的細胞與實驗試劑接觸；和在存在實驗試劑的情況下或在與實驗試劑接觸后，測定糖原毒性。糖原毒性將實驗試劑鑒定為具有抗細胞增殖活性的試劑。
在輔助的實施方案中，鑒定具有抗細胞增殖活性的試劑的方法包括提供能降低糖原分解酶的表達或活性的實驗試劑；使能表達糖原分解酶的細胞與實驗試劑接觸；和在存在實驗試劑的情況下或在與實驗試劑接觸后，測定糖原毒性。糖原毒性將實驗試劑鑒定為具有抗細胞增殖活性的試劑。
在其它的實施方案中，鑒定具有抗細胞增殖活性的試劑的方法包括使糖原生成酶或糖原分解酶與實驗試劑接觸；和在存在實驗試劑的情況下或在與實驗試劑接觸后，測量糖原生成酶或糖原分解酶的活性。糖原生成酶或糖原分解酶的升高的或降低的活性分別將實驗試劑鑒定為具有抗細胞增殖活性的試劑。在各個方面，接觸是在無細胞的系統中(例如，在溶液中或在固相中)，或在基于細胞的系統中(例如，體外或體內)進行的。
當提及試劑或治療劑時使用的術語“接觸”是指，該試劑和其它提及的實體之間的直接的或間接的相互作用。直接相互作用的一個具體實例是結合。間接相互作用的一個具體實例是試劑作用于中間分子，其又作用于提及的實體。因而，例如，使糖原生成酶或糖原分解酶與實驗試劑接觸包括使試劑結合酶，或者使試劑作用于中間體，其又作用于該酶。
術語“測量”和“測定”和其表述變體在本文中可互換地使用，是指定性的或定量的確定，或定性的且定量的確定。當提及糖原水平、糖原或細胞毒性或酶(例如，糖原生成酶或糖原分解酶)的表達或活性等使用該術語時，預期測定糖原水平、毒性或酶的表達或活性等的所有方法，包括本文所述的和本領域已知的各種方法。例如，可以如下所述測定糖原毒性篩選一種或多種與糖原毒性有關的形態學變化；篩選細胞生存力；篩選細胞增殖、生長或存活的抑制或減少。
實驗試劑和治療劑可以用于任意的原核或真核細胞，其中的糖原可以測量，或其生長、增殖或生存力可以檢測。例如，無限增殖化的、過度增殖的或腫瘤或癌細胞可以在一定的條件下在培養基中生長一定的時間，該時間足以允許接觸和測量或檢測糖原積累、糖原毒性或減少的細胞生長、增殖、存活或生存力。
通過本領域已知的多種方法，可以檢測糖原積累。示例性的方法如實施例1所述，其涉及葡糖淀粉酶介導的糖原向葡萄糖的水解，然后進行比色定量。將該值表達為μg還原的葡萄糖/百萬細胞。已經開發了能測量葡萄糖向糖原的整合的高通量篩選測定(Berger J，Hayes NS.Anal Biochem.1998 Aug 1；261(2)159)，且可以用于測量糖原積累，以鑒定能增強或刺激胞內糖原積累的試劑和治療劑。http://neo.pharm.hiroshimau.ac.jp/ccab/2nd/mini_review/mr32/yano.html組織學分析也可以用于檢測糖原。例如，使用McMannus氏過碘酸希夫(PAS)染色，可以在組織切片中觀察到糖原。該染色是組織化學反應，因為過碘酸能氧化形成醛的碳碳鍵，所述的醛與能產生洋紅色的品紅-亞硫酸試液反應。或者，使用例如電子顯微鏡，能結合糖原的單克隆抗體和免疫金顆粒組合可以檢測糖原(Baba，O.KokubyoGakkai Zasshi.60264(1993))。
可以直接地或間接地確定糖原含量。例如，將放射標記的葡萄糖、例如[13C或14C]-葡萄糖整合進糖原，然后進行射線照相定量。確定糖原的一個替代方法是，使用葡糖淀粉酶水解成葡萄糖單體，并通過比色測量還原的葡萄糖，例如，用葡萄糖Trinder比色試劑(Sigma，St.Louis，MO)(Kepler和Decker..InMethods of Enzymatic Analysis，Eds.H.U.Bergenmeyer和K.Gawehn，Academic Press，New York，41127-1131(1974))。另一種糖原測定是用蒽酮試劑(Lab Express，Inc.Fairfield，New Jersey)比色檢測酸還原的葡萄糖(Seifter等，Arch.Biochem.25191(1950))。這些測定也可以用于高通量篩選能增加或刺激胞內糖原積累的試劑和治療劑。
也可以體內檢測糖原水平。例如，傅里葉變換紅外光譜學已經用于確定人組織中的糖原水平(Yano K.，Evaluation Of Glycogen LevelsIn Human Carcinoma Tissues By Fourier Transform InfraredSpectroscopy.“Trends in Analytical Life Sciences”卷1(CCAB97)CyberCongress on Analytical BioSciences held on Internet Aug.21，1997)。NMR光譜學是連續地體內研究肌肉糖原代謝的非侵入性的方法(Roden和Shulman，Annu Rev Med.50277(1999))。
在本領域已知的許多基于比色、發光、輻射測量或熒光測定的方法中，可以測量細胞毒性。用于確定細胞生存力的比色技術包括例如，錐蟲藍排斥(見，例如，實施例1和2)。簡而言之，用錐蟲藍對細胞染色，并使用血細胞計數器計數。活細胞排斥染料，而死亡的和垂死的細胞則攝入藍色染料，并且在光學顯微鏡下能容易地區別開。中性紅能被活細胞吸收，并濃縮在細胞的溶酶體中；通過定量中性紅染色的細胞的數量，可以使用光學顯微鏡確定活細胞。四氮唑鹽(例如MTT，XTT，WST-1)可以在比色測定方法中用于定量細胞生存力(Roche Diagnostics Corp.Indianapolis，IN)。在線粒體(其僅僅在代謝完整的細胞中有活性)的呼吸鏈中，“琥珀酸鹽-四氮唑還原酶”系統能將四氮唑鹽切割成甲。
確定細胞生存力的熒光技術包括例如，碘化丙啶、熒光DNA嵌入劑。碘化丙啶被活細胞排斥，但是能對死細胞的核染色。然后可以使用碘化丙啶標記的細胞的流式細胞儀來定量活的和死的細胞。AlamarBlue測定(Alamar Biosciences Inc Sacramento CA)采用氧化還原指示劑，它能改變代謝活性引起的顏色或熒光，并用于定量哺乳動物細胞的生存力或增殖。可以用分光光度法(熒光)測量Alamar Blue。乳酸脫氫酶(LDH)的釋放指示細胞的結構損傷和死亡，且可以通過分光光度酶測定來測量。溴脫氧尿苷(BrdU)能整合在新合成的DNA中，且可以用熒光染料標記的抗體檢測。熒光染料Hoechst 33258能標記DNA，且可以用于定量細胞的增殖(例如，流式細胞儀)。定量整合的熒光染料羧基熒光素二醋酸琥珀酰亞氨基酯(CFSE或CFDA-SE)可以提供細胞分裂分析(例如，流式細胞儀)。該技術可以體外或體內地使用。7-氨基放射菌素D(7-AAD)是熒光嵌入劑，其與DNA結合后會發生光譜移位，且可以提供細胞分裂分析(例如，流式細胞儀)。
確定細胞增殖的輻射測量技術包括例如，[3H]-胸苷，其能整合進活細胞的新合成的DNA中，并經常用于確定細胞的增殖。通過閃爍計數可以定量死細胞的鉻(51Cr)-釋放，以定量細胞生存力。
檢測細胞生存力的發光技術包括例如，CellTiter-Glo發光細胞生存力測定(Promega Madison WI)。該技術能定量存在的ATP的量，以確定活細胞的數目。
市場上可買到的用于檢測細胞生存力和細胞增殖的試劑盒包括例如，細胞增殖Biotrak ELISA(Amersham Biosciences Piscataway，NJ)；Guava ViaCountTMAssay，其能基于熒光試劑的攝入差異提供快速的細胞計數和生存力確定(Guava Technologies，Hayward，CA)；CyQUANT細胞增殖測定試劑盒(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)；和CytoLux測定試劑盒(PerkinElmer Life Sciences Inc.，Boston，MA)。DELFLA測定試劑盒(PerkinElmer Life Sciences Inc.，Boston，MA)可以使用時間分辨的熒光方法檢測細胞增殖和毒性。BRET2(生物發光共振能量轉移)是高級的、非破壞性的測定技術，用于監控活細胞中的蛋白-蛋白相互作用和胞內信號傳遞事件(PerkinElmer LifeSciences Inc.，Boston，MA)。BRET2是基于生物發光供體蛋白向熒光受體蛋白的共振能量轉移的，使用Renilla螢光素酶(Rluc)作為供體，綠色熒光蛋白(GFP2)的突變體作為受體分子。BRET2類似于熒光共振能量轉移(FRET)，但是不需要激發光源和與其相關的問題(例如自身熒光造成的高背景)。細胞死亡檢測ELISA是用于體外定量確定細胞死亡后的與胞質組蛋白有關的DNA片段(單-和寡-核小體)的光度酶免疫測定(Roche Diagnostics Corp.，Indianapolis，IN)。LDH細胞毒性檢測試劑盒能測量從損傷的細胞釋放出的乳酸脫氫酶(LDH)(Takara.Mirus.Bio，Madison，WI)。QuantosTM細胞增殖測定是基于熒光的測定，其測量來自裂解的細胞的DNA-染料復合物的熒光(Stratagene，La Jolla，CA)。CellTiter-Glo細胞生存力測定是用于測量細胞生存力的發光測定(Promega，Madison WI)。
實驗試劑和治療劑是可以購得的，或可以使用本領域已知的組合文庫方法中的眾多方法中的任一個來生產，包括生物學文庫；空間上可接近的平行的固相或溶液相文庫；需要去卷曲的合成文庫方法；“一個珠子一種化合物”文庫方法；和使用親合層析選擇的合成文庫方法。生物學文庫方法限于肽文庫，而其它的方法可以用于肽、非肽的寡聚物或化合物的小分子文庫。
分子文庫的合成方法是本領域已知的(見，例如，DeWitt等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.906909(1993)；Erb等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9111422(1994)；Zuckermann等，J.Med.Chem.372678(1994)；Cho等，Science 2611303(1993)；Carrell等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059(1994)；Carell等，Angew.Chem.Int Ed.Engl.332061(1994)和Gallop等，J Med.Chem.371233(1994))。化合物文庫可以存在于溶液(例如，Houghten，Biotechniques 13412(1992))或珠子(Lam，Nature 35482(1991))、芯片(Fodor Nature364555(1993))、細菌(美國專利號5,223,409)、孢子(美國專利號5,233,409)、質粒(Cull等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891865(1992))或噬菌體(Scott和Smith，Science 249386(1990)；Devli Science 249404(1990)；Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.876378(1990)；Felici，J.Mol.Biol.222301(1991)和美國專利號5,233,409)。
作為鑒定能增加細胞中的糖原的試劑或治療劑的體外測定的一個實例，細胞可以在組織培養微量滴定板中生長。這些微量滴定板可以是適用于測量糖原積累或細胞毒性的任何形式。為了進行該測定，可以在適合細胞系生長的條件下，以合適的細胞密度，將細胞系(例如，癌細胞系)接種到板上。可以將實驗試劑以各種濃度和各種劑型手工地或自動地應用于細胞，例如使用機器人裝置。或者，可以對細胞進行實驗處理，例如改變溫度、pH、充氧作用(例如，缺氧)、鹽或離子濃度等。細胞糖原積累或細胞毒性的確定取決于采用的具體測定，如本文所述的或本領域已知的。例如，發光計可以用于確定基于發光的實驗的結果，熒光計或流式細胞儀可以用于定量基于熒光的測定，閃爍計數器可以用于檢測基于輻射測量的測定的結果，等。
除非另有定義，本文使用的所有技術和科技術語都具有與本發明技術領域內的普通技術人員的通常理解一樣的含義。盡管與本文所述相似的或等同的方法和材料可以用于實踐或驗證本發明，本文還是公開了合適的方法和材料。
本文引用的所有出版物、專利、Genbank登記號和其它參考文獻都整體引作參考。在有沖突的情況下，以本說明書為準，包括定義。
如本文所使用的，單數形式的“一個(a)”、“一個(an)”和“該(the)”包括復數形式，除非上下文中清楚地另有說明。因而，例如，“一個基因或核酸”的表述包括多個基因或核酸，“一個細胞”的表述包括全部或部分細胞或許多細胞，等。
已經描述了本發明的許多實施方案。然而，應當明白，可以進行許多改變而不背離本發明的精神和范圍。因此，下面的實施例意在解釋而非限制權利要求書所述的發明范圍。
實施例實施例1該實施例描述了各種示例性的材料和方法。
重組腺病毒載體合成的寡核苷酸設計用于擴增人GLcDNA的可讀框(SEQ ID NO3-GenBank登記號XM_015545，位置10堿基對至1183堿基對)(SEQ ID NO1-有義引物GACCAATTGTCGCGCTTGCCA CAACC；SEQ ID NO2-反義引物CTGCTCGAGCGCGCCAGCCA CCACT)。使用聚合酶鏈反應(PCR)，從人胎兒肝Marathon cDNA文庫(Clontech，Inc.)擴增了1192個堿基對的片段。將該片段再克隆進pBluescript(Stratagene，Inc.)的EcoRV位點，生成pSSBS-GL。用三重覆蓋率，對該質粒測序。將含有人GLcDNA的pSSBS-GL的HincII片段亞克隆進Adeno-X表達系統(Clontech，Inc.)的pShuttle的PmeI位點，生成pShuttle-hsGL。
通過PCR(SEQ ID NO4-有義引物GGCAATTGAACGGCTAGCCTGAGGAGCTGC；SEQ ID NO5-反義引物CCACTAGTGCGGTTCCCTGCTCTCTGTCG)，擴增了熱休克蛋白70的5′非翻譯區中的翻譯增強子元件(SEQ ID NO6-來自Genbank登記號AC020768，與M11717對應，位置276堿基對至488堿基對)，并將213個堿基對的片段亞克隆進pNEB193載體(New England Biolabs，Inc.)的SmaI位點。用三重覆蓋率，對得到的克隆進行測序。將257個堿基對的XbaI/SpeI片段平端克隆進pShuttle-GL中的GLcDNA的唯一的NheI位點5′，生成pShuttle-hspGL。
通過PCR(SEQ ID NO7-有義引物TCGGGATCCAATCAACCTCTGGATTACA；SEQ ID NO8-反義引物TGCTCTAGACAAGCAACACGGACC)，擴增了土撥鼠乙型肝炎病毒中的轉錄增強子元件(WPRE)(SEQ ID NO 9Genbank登記號J02442，位置1093堿基對至1714堿基對)，并將641個堿基對的片段亞克隆進pGEM-T載體系統(Promega，Inc.)中。用三重覆蓋率，對得到的克隆進行測序。將含有WPRE元件的NotI/XbaI限制片段克隆進GLcDNA的3′，生成pShuttle-GLWPRE。
使用Clontech的Adeno-X表達系統來生成用于該研究的腺病毒載體。根據生產商的說明，將空的pShuttle載體、pShuttle-GL、pShuttle-hspGL和pShuttle-GLWPRE轉移進Adeno-X腺病毒基因組中，分別生成重組腺病毒載體AdpSh、AdGL、AdhspGL和AdGLWPRE。根據Clontech的Adeno-X表達系統的說明書，用腺病毒載體DNA轉染HEK 293細胞，生產粗腺病毒原液。根據生產商的說明書，使用Adenopure腺病毒純化試劑盒(Puresyn，Inc.)純化出腺病毒顆粒。
細胞培養從美國典型培養物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)得到了HeLa(人子宮頸上皮腺癌)、MCF7(人乳房上皮腺癌)和LoVo(人結腸直腸上皮腺癌)細胞系。在添加了5％熱滅活的胎牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺、青霉素(100U/ml)-鏈霉素(100μg/mg)和2.2g/L NaHCO3的高-葡萄糖Dulbecco氏最小必需培養基(DMEM，Gibco#12800-017)中培養HeLa和MCF7細胞。在添加了5％熱滅活的FBS、2mM谷氨酰胺、青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100μg/mg)和2.2g/L NaHCO3的Kaighn氏改進的Ham氏F-12培養基(F-12K，ATCC)中培養LoVo細胞。
將培養的細胞系接種到6或12孔組織培養板上。當它們達到70-85％匯合時，用各種量的重組GL腺病毒或對照腺病毒感染細胞。將腺病毒加到每個孔中的300μl培養基中，在37℃、5％CO2溫育2小時。溫育后，加入1.5ml培養基，在37℃、5％CO2溫育。每天更換培養基。在感染后的各個時間點，使用錐蟲藍計數活細胞，并收集剩余的細胞，冷凍用于后續的糖原測量。
錐蟲藍生存力細胞計數使用錐蟲藍(0.4％、Gibco)對死細胞和垂死的細胞進行染色。使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco#25200-056)，從組織培養板取下細胞，重新懸浮到1ml磷酸緩沖鹽水(PBS)中。使用Neubauer血細胞計數器，進行手工細胞計數。
糖原測定根據Keppler和Decker(Keppler和Decker，1984 inMethods of Enzymatic Analysis第3版.(Bergmeyer，H.U.Bergmeyer，J.，和Grab，M.Eds.)，卷6，pp.11-18，VCH，New York.)，并進行一些改進，進行酶促的糖原向葡萄糖的水解。簡而言之，對冷凍的細胞沉淀進行3輪的凍融，以破碎細胞膜。將細胞沉淀重新懸浮到200μl250mU葡糖淀粉酶(在0.2M醋酸鈉緩沖液中，pH4.8)中。
在搖動下，將裂解物在45℃溫育2小時。通過在2500rpm離心10分鐘，澄清裂解物。將上清液(5μl)和葡萄糖標準物轉移到96孔板上，用10μl 0.25N氫氧化鈉中和。然后用葡萄糖Trinder比色劑(Sigma，315-500)確定葡萄糖。使用分子裝置VERSAmax微量培養板讀數器，在505nm測量顏色反應的強度。
roscovitine研究roscovitine(Calbiochem #557362)，[2-(R)-(1-乙基-2-羥乙基氨基)-6-芐基氨基-9-異丙基嘌呤]，是依賴于細胞周期蛋白的激酶Cdk2和Cdc2的有效的選擇抑制劑。在二甲基亞砜(DMSO)中制備了roscovitine原液，并儲存在-20℃備用。將藥物稀釋在培養基中，并以35μM的終濃度使用。在所有情況下，未處理的細胞的表現與單獨用DMSO處理的細胞相同。在用腺病毒轉導后24小時，將roscovitine加入細胞培養物中，并溫育48至72小時。然后收集細胞，進行錐蟲藍生存力計數和糖原測量。
實施例2該實施例描述的數據表明，將能編碼增加胞內糖原的蛋白的基因轉移到細胞中，可以將糖原增加到對該細胞有毒性的水平。
將能編碼靶向糖原的亞基家族的成員(其能將PP-1靶向糖原顆粒)的核酸克隆進了重組腺病毒載體中，以在靶人癌細胞系中表達。將能編碼野生型人GL蛋白的cDNA克隆進如實施例1所述的腺病毒載體中。將能表達GLcDNA的重組腺病毒載體命名為AdGL。由于腺病毒自身在高劑量時可以是對細胞有毒性的，所以生產了與AdGL相同、但是缺少GLcDNA的對照載體，并命名為AdpSh。
使用從重組病毒載體生產的高滴度腺病毒顆粒來感染如實施例1所述的各種人癌細胞系。簡而言之，將人子宮頸上皮腺癌細胞系(HeLa)培養至約70％匯合，然后用AdGL或對照AdpSh感染。24小時后，觀察AdGL-感染的細胞與AdpSh-處理的細胞相比的形態學變化。另外，AdGL-感染的細胞的尺寸更大，且觀察到了細胞更加變圓。
使用錐蟲藍排斥實驗，估計了病毒感染后的細胞生存力。使用Neubauer血細胞計數器，對用錐蟲藍染色的細胞和活細胞進行計數。活細胞排斥染料，而死的和垂死的細胞則攝入藍色染料，并且在光學顯微鏡下能容易地區別開。
感染后72小時，與對照AdpSh-處理的細胞相比，在AdGL-處理的細胞中觀察到了明顯的錐蟲藍攝入。因而，GL的超表達在HeLa細胞系中誘導了死亡。
用AdGL感染HeLa細胞后，觀察到的細胞生存力的減小和糖原的增加是時間和病毒劑量依賴性的。HeLa細胞感染了200感染復數(MOI)或1000MOI的AdGL或AdpSh腺病毒(圖1)。將來自AdGL-感染的細胞的能排斥錐蟲藍的活細胞的數目與對照AdpSh-感染的細胞的比率表達為百分比(圖1，圖A)。結果表明，AdGL-感染的細胞的生存力隨時間過去降低。
病毒劑量的增加也降低了AdGL-感染的細胞的生存力。在感染了AdGL的細胞中，在200至1000的增加的感染復數(MOI)，觀察到了源自葡糖淀粉酶-還原的糖原的葡萄糖的劑量依賴性的增加(圖1，圖B)。相反地，在任一個感染復數，感染了對照AdpSh的細胞產生了最小的非特異性的源自葡糖淀粉酶-還原的糖原的葡萄糖積累(圖1，圖B)。
結果表明，糖原積累的增加與細胞生存力的降低有關。這些發現證實了GL的超表達所誘導的糖原積累會導致細胞死亡。
為了證實該策略對過度增殖的癌細胞的總體可用性，使用AdGL腺病毒感染了2種其它的如實施例1所述的細胞系。GL在人乳房上皮腺癌(MCF7)和人結腸直腸上皮腺癌(LoVo)中的超表達導致了與HeLa細胞系類似的細胞生存力的降低和源自葡糖淀粉酶-還原的糖原的葡萄糖的增加(圖2)。這些數據證實了能表達GL的腺病毒所誘導的糖原積累一般能殺死癌細胞。
實施例3該實施例描述的數據顯示在細胞中轉移與能抑制細胞生長的藥物組合的編碼增加胞內糖原的蛋白的基因，將增加糖原積累和細胞死亡。
roscovitine是依賴于細胞周期蛋白的激酶Cdk2和Cdc2的有效的選擇性抑制劑，且是細胞抑制性的。為了研究該藥物與AdGL組合使用時，是否會增加糖原的積累和相應地降低細胞生存力，用AdGL或AdpSh腺病毒(500MOI)感染了HeLa細胞，隨后加入35μM roscovitine(圖3)。
AdGL和roscovitine的組合顯著地增加了在感染的HeLa細胞中的糖原的量。相反地，在有或沒有roscovitine的情況下，未感染的對照細胞沒有表現出顯著的糖原積累的增加(圖3，圖A)。對于roscovitine-處理的和未處理的細胞，將來自AdGL-感染的細胞的排斥錐蟲藍的活細胞的數目與對照AdpSh-感染的細胞的比率表達為百分比(圖3，圖B)。
因此，數據證實了，能抑制、減少或阻止癌細胞生長的化合物可以與能表達糖原生成酶的載體(例如，腺病毒GL)組合使用，以將糖原增加到對癌細胞有毒性的水平。而且，相對于在靶細胞中單獨表達糖原生成酶，增加了得到的糖原的量。
實施例4該實施例描述的數據表明，可以對基因轉移載體進行修飾，以增加基因的表達水平。
為了增加GLcDNA的表達水平，將2個核酸增強元件與AdGL載體對比了它們的降低細胞生存力的能力(圖4)。第一個元件能提高mRNA翻譯的效率，最初是在人熱休克蛋白-70(hsp70)基因的5′非翻譯區(5′UTR)鑒定出來的(Vivinus等，Eur J Biochem.2681908(2001))。將該元件整合進AdGL載體，從而生成了如實施例1所述的AdhspGL。命名為WPRE的第二個元件是在土撥鼠肝炎病毒中鑒定出來的，是順式作用的RNA轉錄后調節元件(Donello等，J Virol.725085(1998))。將WPRE整合進AdGL載體中，從而生成了如實施例1所述的AdGLWPRE。
如前所述，用每種病毒載體(500MOI)單獨地感染了HeLa細胞。將來自病毒感染的細胞的排斥錐蟲藍的活細胞的數目與對照AdpSh-感染的細胞的比率表達為百分比。hsp70 5′UTR元件不能顯著降低感染的HeLa細胞的生存力。與單獨的AdGL相比，WPRE元件的整合導致細胞生存力降低了約1.5倍。因而，對基因轉移載體的遺傳修飾可以提高目標基因、例如GL的表達，由此增加糖原積累，并依次降低細胞生存力。
實施例5該實施例描述了幾個示例性的鑒定抑制試劑的α-葡糖苷酶活性測定。
簡而言之，將10μl實驗試劑溶液和990μl底物溶液(10mM麥芽糖)加到裝有α-葡糖苷酶固定化的瓊脂糖(10mg-濕凝膠)的末端加帽的小柱中。通過加入1.0ml含有10mM麥芽糖的模型腸液啟動測定。在37℃溫育30分鐘后，通過葡萄糖CII-實驗(Wako Pure ChemicalCo.，日本)定量釋放出的葡萄糖。基于有或沒有實驗試劑的情況下的濾液中的葡萄糖量的差異，計算抑制活性。將在測定條件下能抑制50％的α-葡糖苷酶活性的實驗試劑的量定義為IC50(Matsumoto等，Analytical Sciences，181315(2002))。
鑒定能抑制α-葡糖苷酶的試劑的其它示例性測定是針對α-葡糖苷酶(酵母，I型，Sigma Chemical Co.生產)以及從豬腸粘膜制備出的麥芽糖酶和蔗糖酶(根據Borgstrom和Dahlgvist在Acta Chem.Scand.，121997(1958)中所述的方法制備)的實驗試劑。當麥芽糖和蔗糖用作底物時，將0.25mlα-葡糖苷酶溶液(通過用0.02M磷酸鹽緩沖液(pH6.8)稀釋制備)與0.5ml在相同緩沖液中的實驗試劑的溶液相混合，且用0.25ml在相同緩沖液中的0.05M麥芽糖或0.05M蔗糖作為底物。使混合物在37℃反應10分鐘。然后加入葡萄糖B-實驗試劑(3ml；它是用于葡萄糖測量的葡萄糖氧化酶試劑，Wako PureChemical Co.，日本)，使混合物在37℃溫育20分鐘。隨后在505nm測量反應溶液的吸光度。
通過向0.25ml含有0.005mg/mlα-葡糖苷酶的0.02M磷酸鹽緩沖液(pH6.8)中加入0.5ml在相同緩沖液中的實驗試劑溶液和0.25ml在相同緩沖液中的0.01M對硝基苯基-α-D-吡喃型葡糖苷酶溶液，使混合物在37℃反應15分鐘，確定了當對硝基苯基-α-D-吡喃型葡糖苷酶用作底物時，實驗試劑對α-葡糖苷酶(酵母，I型，Sigma Chemical Co.)和葡糖淀粉酶(根霉屬(Rhizopus)霉菌，Sigma Chemical Co.)的抑制活性。加入碳酸鈉溶液(3ml，0.1M)終止反應，在400nm測量吸光度。通過3至5個不同的實驗試劑濃度確定抑制速度(％)，由此計算50％抑制濃度。
權利要求
1.將細胞中的糖原增加到毒性水平的方法，包括在細胞中表達基因產物，所述基因產物能將細胞中的糖原的量增加到毒性水平。
2.權利要求1的方法，其中所述的基因產物包括能增加糖原的合成或胞內積累的蛋白。
3.權利要求1的方法，其中所述的基因產物包括能降低糖原的代謝、分解代謝、利用、降解或去除的蛋白。
4.權利要求1的方法，其中所述的糖原的量能造成與糖原毒性有關的形態學變化。
5.權利要求4的方法，其中所述的與糖原毒性有關的形態學變化包括細胞膨脹、溶酶體數目的增加、溶酶體大小的增加、或溶酶體的結構變化。
6.權利要求1的方法，其中所述的糖原的量能造成細胞的裂解或細胞凋亡。
7.權利要求1的方法，其中所述的糖原的量能抑制或減少細胞的增殖、生長或存活。
8.權利要求1的方法，其中所述的基因產物包含糖原生成酶。
9.權利要求1的方法，其中所述的糖原生成酶包含糖原生成蛋白、糖原生成蛋白-2、糖原合酶、糖原生成蛋白相互作用蛋白(GNIP)、蛋白質磷酸酶1(PP-1)、葡萄糖轉運蛋白(GLUT)、PP-1同工型或家族成員的靶向糖原的亞基、己糖激酶同工型或家族成員、或谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶。
10.權利要求9的方法，其中所述的PP-1家族成員的靶向糖原的亞基包含GL(PPP1R3B，PPP1R4)、PTG(PPP1R3C，PPP1R5)、PPP1R3D(PPP1R6)或Gm/RGl(PPP1R3A，PPP1R3)。
11.權利要求1的方法，其中所述的基因產物包含能減少糖原分解酶的表達的反義多核苷酸、小的干擾RNA分子或核酶。
12.權利要求11的方法，其中所述的糖原分解酶包含糖原磷酸化酶、脫支酶、磷酸化酶激酶、葡萄糖-6-磷酸酶、PPP1R1A(蛋白質磷酸酶1，調節抑制劑亞基1A)、PPP1R2(蛋白質磷酸酶1，調節亞基2)、果糖磷酸激酶、糖原合酶激酶-3同工型、GCKR葡糖激酶調節蛋白或α-葡糖苷酶。
13.權利要求1的方法，其中所述的細胞包含過度增殖的細胞。
14.權利要求13的方法，其中所述的過度增殖細胞包含轉移性的或非轉移性的癌細胞。
15.權利要求14的方法，其中所述的癌細胞存在于腦、頭或頸、乳房、食管、嘴、胃、肺、胃腸道、肝、胰、腎、腎上腺、膀胱、結腸、直腸、前列腺、子宮、子宮頸、卵巢、睪丸、皮膚、肌肉或造血系統中。
16.權利要求14的方法，其中所述的過度增殖細胞存在于受試者中。
17.權利要求16的方法，其中所述的受試者是哺乳動物。
18.權利要求16的方法，其中所述的受試者是人。
19.權利要求1的方法，其中所述的基因產物包含蛋白、反義多核苷酸、小的干擾RNA或核酶。
20.權利要求1的方法，其中所述的基因產物是由多核苷酸編碼的。
21.權利要求20的方法，其中所述的多核苷酸包含載體。
22.權利要求20的方法，其中所述的載體包含病毒或哺乳動物表達載體。
23.權利要求20的方法，其中所述的多核苷酸還包含小泡。
24.權利要求1的方法，其中基因產物的表達是由在過度增殖的細胞中有活性的啟動子賦予的。
25.權利要求24的方法，其中所述的啟動子包含己糖激酶II，COX-2，α-胎蛋白，癌胚抗原，DE3/MUC1，前列腺特異性抗原，C-erB2/neu，端粒酶逆轉錄酶或缺氧反應啟動子。
26.權利要求1的方法，還包括在細胞中表達能抑制細胞增殖的第二種蛋白。
27.權利要求的方法26，其中所述的第二種蛋白包含細胞周期抑制劑。
28.權利要求的方法26，其中所述的第二種蛋白包含細胞周期蛋白抑制劑。
29.將過度增殖的細胞中的糖原增加到毒性水平的方法，包括使細胞與能將過度增殖的細胞中糖原的量增加到毒性水平的試劑接觸，其中所述的過度增殖細胞不是肝、肌肉或腦細胞。
30.權利要求29的方法，其中所述的糖原的量能造成與糖原毒性有關的形態學變化。
31.權利要求29的方法，其中所述的糖原的量能造成細胞的裂解或細胞凋亡。
32.權利要求29的方法，其中所述的糖原的量能抑制或減少細胞的增殖、生長或存活。
33.權利要求29的方法，其中所述的試劑能增加糖原生成酶的表達或活性。
34.權利要求33的方法，其中所述的糖原生成酶選自糖原生成蛋白、糖原生成蛋白-2、糖原合酶、糖原生成蛋白相互作用蛋白(GNIP)、蛋白質磷酸酶1(PP-1)、葡萄糖轉運蛋白(GLUT)、PP-1同工型或家族成員的靶向糖原的亞基、己糖激酶同工型或家族成員、或谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶。
35.權利要求29的方法，其中所述的試劑能降低糖原分解酶的表達或活性。
36.權利要求29的方法，其中所述的試劑包含反義物、核酶、siRNA或形成三鏈體的核酸，其能特異性地結合糖原分解酶。
37.權利要求35的方法，其中所述的糖原分解酶選自糖原磷酸化酶、脫支酶、磷酸化酶激酶、葡萄糖-6-磷酸酶、PPP1R1A(蛋白質磷酸酶1，調節抑制劑亞基1A)，PPP1R2(蛋白質磷酸酶1，調節亞基2)，果糖磷酸激酶、糖原合酶激酶-3同工型、GCKR葡糖激酶調節蛋白或a-葡糖苷酶。
38.將過度增殖的細胞中的糖原增加到毒性水平的方法，包括使細胞與能將過度增殖的細胞中糖原的量增加到毒性水平的試劑接觸，前提是該試劑基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型的活性或表達。
39.權利要求38的方法，其中所述的糖原磷酸化酶同工型包含肝、肌肉或腦糖原磷酸化酶。
40.權利要求38的方法，其中所述的糖原的量能造成與糖原毒性有關的形態學變化。
41.權利要求38的方法，其中所述的糖原的量能造成細胞的裂解或細胞凋亡。
42.權利要求38的方法，其中所述的糖原的量能抑制或減少細胞的增殖、生長或存活。
43.權利要求38的方法，其中所述的試劑能增加糖原生成酶的表達或活性。
44.權利要求43的方法，其中所述的糖原生成酶選自糖原生成蛋白、糖原生成蛋白-2、糖原合酶、糖原生成蛋白相互作用蛋白(GNIP)、蛋白質磷酸酶1(PP-1)、葡萄糖轉運蛋白(GLUT)、PP-1同工型或家族成員的靶向糖原的亞基、己糖激酶同工型或家族成員、或谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶。
45.權利要求38的方法，其中所述的試劑能降低糖原分解酶的表達或活性。
46.權利要求38的方法，其中所述的試劑包含反義物、核酶、siRNA或形成三鏈體的核酸，其能特異性地結合糖原分解酶。
47.權利要求45的方法，其中所述的糖原分解酶選自脫支酶、磷酸化酶激酶、葡萄糖-6-磷酸酶、PPP1R1A(蛋白質磷酸酶1，調節抑制劑亞基1A)、PPP1R2(蛋白質磷酸酶1，調節亞基2)、果糖磷酸激酶、糖原合酶激酶-3同工型、GCKR葡糖激酶調節蛋白或α-葡糖苷酶。
48.權利要求38的方法，其中所述的試劑包含底物類似物。
49.權利要求38的方法，其中所述的過度增殖細胞包含轉移性的或非轉移性的癌細胞。
50.權利要求49的方法，其中所述的癌細胞存在于腦、頭或頸、乳房、食管、嘴、胃、肺、胃腸道、肝、胰、腎、腎上腺、膀胱、結腸、直腸、前列腺、子宮、子宮頸、卵巢、睪丸、皮膚或肌肉或造血系統中。
51.權利要求38的方法，其中所述的過度增殖細胞存在于受試者中。
52.權利要求51的方法，其中所述的受試者是哺乳動物。
53.權利要求51的方法，其中所述的受試者是人。
54.治療受試者中的細胞增殖病的方法，其中細胞增殖病不是肝、肌肉或腦細胞病，包括在一個或多個患有該病的細胞中表達能增加胞內糖原的量的基因產物，或包括使一個或多個患有該病的細胞與能增加胞內糖原的量的試劑相接觸，其足以治療細胞增殖病。
55.權利要求54的方法，其中所述的細胞增殖病包含轉移性的或非轉移性的癌癥。
56.權利要求55的方法，其中所述的癌細胞存在于頭或頸、乳房、食管、嘴、胃、肺、胃腸道、胰、腎、腎上腺、膀胱、結腸、直腸、前列腺、子宮、子宮頸、卵巢、睪丸、皮膚或造血系統。
57.治療受試者中的細胞增殖病的方法，包括在一個或多個患有該病的細胞中表達能增加胞內糖原的量的基因產物，或包括使一個或多個患有該病的細胞與一定量的能增加胞內糖原的量的試劑相接觸，前提是該試劑基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型的活性或表達，其足以治療細胞增殖病。
58.權利要求57的方法，其中所述的細胞增殖病包含轉移性的或非轉移性的癌癥。
59.權利要求58的方法，其中所述的癌細胞存在于腦、頭或頸、乳房、食管、嘴、胃、肺、胃腸道、肝、胰、腎、腎上腺、膀胱、結腸、直腸、前列腺、子宮、子宮頸、卵巢、睪丸、皮膚或肌肉或造血系統。
60.權利要求54和57的方法，其中所述的受試者是哺乳動物。
61.權利要求54和57的方法，其中所述的受試者是人。
62.治療患有腫瘤的受試者的方法，其中所述的腫瘤不是肝、肌肉或腦腫瘤，包括在一個或多個腫瘤細胞中表達能增加胞內糖原的量的基因產物，或包括使一個或多個腫瘤細胞與能增加胞內糖原的量的試劑相接觸，其能有效地治療受試者。
63.治療患有腫瘤的受試者的方法，包括在一個或多個腫瘤細胞中表達能增加胞內糖原的量的基因產物，或包括使一個或多個腫瘤細胞與一定量的能增加胞內糖原的量的試劑接觸，前提是該試劑基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型的活性或表達，其能有效地治療該受試者。
64.治療正在接受或已經接受了腫瘤療法的受試者的方法，其中所述的腫瘤療法不是針對肝、肌肉或腦腫瘤，包括給受試者施用一定量的能增加細胞中的胞內糖原的量的試劑，其足以治療該受試者。
65.治療正在接受或已經接受了腫瘤療法的受試者的方法，包括給受試者施用一定量的能增加胞內糖原的量的試劑，前提是該試劑基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型的活性或表達，其足以治療該受試者。
66.提高抗腫瘤療法的有效性的方法，包括給正在接受或已經接受了抗腫瘤或免疫增強療法的受試者施用一定量的能增加胞內糖原的量的試劑和抗腫瘤或免疫增強療法，其中所述的腫瘤療法不是針對肝、肌肉或腦腫瘤。
67.提高抗腫瘤療法的有效性的方法，包括給正在接受或已經接受了抗腫瘤或免疫增強療法的受試者施用一定量的能增加胞內糖原的量的試劑和抗腫瘤或免疫增強療法，前提是該試劑基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型的活性或表達。
68.權利要求66或67中的任一項的方法，其中所述的試劑是在施用抗腫瘤或免疫增強療法之前、基本上同時或之后施用的。
69.權利要求62至67中的任一項的方法，其中所述的腫瘤包含轉移性的或非轉移性的腫瘤。
70.權利要求62至67中的任一項的方法，其中所述的腫瘤包含階段I、II、III、IV或V的腫瘤。
71.權利要求62至67中的任一項的方法，其中所述的腫瘤處于緩解中。
72.權利要求62至67中的任一項的方法，其中所述的腫瘤是實體的或液體的。
73.權利要求62、64和66中的任一項的方法，其中所述的腫瘤至少部分地位于頭或頸、乳房、食管、嘴、胃、肺、胃腸道、胰、腎、腎上腺、膀胱、結腸、直腸、前列腺、子宮、子宮頸、卵巢、睪丸或皮膚。
74.權利要求63、65和67中的任一項的方法，其中所述的腫瘤至少部分地位于腦、頭或頸、乳房、食管、嘴、胃、肺、胃腸道、肝、胰、腎、腎上腺、膀胱、結腸、直腸、前列腺、子宮、子宮頸、卵巢、睪丸、皮膚或肌肉。
75.權利要求62至67中的任一項的方法，其中所述的腫瘤是造血的腫瘤。
76.權利要求62至67中的任一項的方法，其中所述的腫瘤包含肉瘤、癌、黑素瘤、骨髓瘤、胚細胞瘤、神經膠質瘤、淋巴瘤或白血病。
77.權利要求62至67中的任一項的方法，其中所述的治療能減小腫瘤體積，抑制腫瘤體積的增加，抑制腫瘤發展，刺激腫瘤細胞裂解或細胞凋亡，或抑制腫瘤轉移。
78.權利要求62至67中的任一項的方法，其中所述的治療能減少與腫瘤有關的一種或多種不利癥狀。
79.權利要求62至67中的任一項的方法，其中所述的治療能延長受試者的壽命。
80.權利要求62至67中的任一項的方法，其中所述的受試者是正在接受或已經接受了抗腫瘤或免疫增強療法的候選者。
81.權利要求62至67中的任一項的方法，還包括施用抗腫瘤或免疫增強治療或試劑。
82.權利要求81的方法，其中所述的抗腫瘤治療包含化學療法、免疫療法、手術切除、放射療法或過熱療法。
83.權利要求81的方法，其中所述的抗腫瘤試劑包含烷化劑、抗代謝物、植物提取物、植物生物堿、亞硝基脲、激素、核苷或核苷酸類似物。
84.權利要求81的方法，其中所述的抗腫瘤試劑選自環磷酰胺、咪唑硫嘌呤、環孢菌素A、氫化潑尼松、美法侖、苯丁酸氮芥、氮芥、馬利蘭、氨甲蝶呤、6-巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、AZT、5-氮胞苷(5-AZC)和與5-氮胞苷有關的化合物、博來霉素、放射菌素D、光神霉素、絲裂霉素C、卡氮芥、羅氮芥、賽氮芥、鏈脲霉素、羥基脲、順氯氨鉑、米托坦、甲基芐肼、氮烯唑胺、紫杉醇、長春堿、長春新堿、阿霉素和二溴甘露醇。
85.權利要求81的方法，其中所述的免疫增強治療包含施用淋巴細胞、漿細胞、巨噬細胞、樹突細胞、NK細胞或B-細胞。
86.權利要求81的方法，其中所述的免疫增強劑包含抗體、細胞生長因子、細胞存活因子、細胞分化因子、細胞因子或趨化因子。
87.權利要求81的方法，其中所述的免疫增強劑選自IL-2、IL-1α、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-7、粒細胞-巨噬細胞-集落刺激因子(GMCSF)、IFN-γ、IL-12、TNF-α、TNFβ、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、SDF-1、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、嗜酸性粒細胞趨化因子、嗜酸性粒細胞趨化因子-2、I-309/TCA3、ATAC、HCC-1、HCC-2、HCC-3、LARC/MIP-3α、PARC、TARC、CKβ、CKβ6、CKβ7、CKβ8、CKβ9、CKβ11、CKβ12、C10、IL-8、GROα、GROβ、ENA-78、GCP-2、PBP/CTAPIIIβ-TG/NAP-2、Mig、PBSF/SDF-1和淋巴細胞趨化因子。
88.鑒定具有抗細胞增殖活性的試劑的方法，包括a)使能生產糖原的細胞與實驗試劑接觸；和b)在存在實驗試劑的情況下或在與實驗試劑接觸后，測定糖原毒性，其中糖原毒性將實驗試劑鑒定為具有抗細胞增殖活性的試劑。
89.權利要求88的方法，其中糖原毒性是通過篩選與糖原毒性有關的形態學變化來測定的。
90.權利要求88的方法，其中糖原毒性是通過篩選細胞生存力來測定的。
91.權利要求88的方法，其中糖原毒性是通過篩選細胞增殖、生長或存活的抑制或降低來測定的。
92.權利要求88的方法，還包括c)測量細胞生存力。
93.權利要求88的方法，其中所述的細胞是原核的或真核的。
94.權利要求88的方法，其中所述的細胞穩定地或瞬時地轉化了基因，該基因的表達由糖原生成酶或糖原分解酶的調節區控制。
95.權利要求88的方法，其中所述的細胞轉化了核酸序列。
96.權利要求88的方法，其中所述的細胞是過度增殖的細胞。
97.權利要求88的方法，其中所述的細胞是無限增殖化的細胞。
98.權利要求88的方法，其中所述的細胞是癌細胞。
99.鑒定具有抗細胞增殖活性的試劑的方法，包括a)使能表達糖原生成酶或糖原分解酶的細胞與實驗試劑接觸；和b)在存在實驗試劑的情況下或在與實驗試劑接觸后，測量糖原生成酶或糖原分解酶的活性或表達，其中糖原生成酶或糖原分解酶的升高的或降低的表達或活性分別將實驗試劑鑒定為具有抗細胞增殖活性的試劑。
100.鑒定具有抗細胞增殖活性的試劑的方法，包括a)使能表達基因的細胞與實驗試劑接觸，所述基因的表達由糖原生成酶或糖原分解酶的調節區控制；和b)在存在實驗試劑的情況下或在與實驗試劑接觸后，測量該基因的表達，其中該基因的升高的或降低的表達將實驗試劑鑒定為具有抗細胞增殖活性的試劑。
101.權利要求99或100的方法，其中所述的酶包含糖原生成蛋白、糖原生成蛋白-2、糖原合酶、糖原生成蛋白相互作用蛋白(GNIP)、蛋白質磷酸酶1(PP-1)、葡萄糖轉運蛋白(GLUT)、PP-1同工型或家族成員的靶向糖原的亞基、己糖激酶同工型或家族成員、或谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶。
102.權利要求101的方法，其中所述的PP-1家族成員的靶向糖原的亞基包含GL(PPP1R3B，PPP1R4)，PTG(PPP1R3C，PPP1R5)，PPP1R3D(PPP1R6)或Gm/RG1(PPP1R3A，PPP1R3)。
103.權利要求99或100的方法，其中所述的糖原分解酶包含糖原磷酸化酶、脫支酶、磷酸化酶激酶、葡萄糖-6-磷酸酶、PPP1R1A(蛋白質磷酸酶1，調節抑制劑亞基1A)、PPP1R2(蛋白質磷酸酶1，調節亞基2)、果糖磷酸激酶、糖原合酶激酶-3同工型、GCKR葡糖激酶調節蛋白或a-葡糖苷酶。
104.權利要求100的方法，其中所述的基因能編碼半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉移酶、葡萄糖氧化酶、螢光素酶或熒光蛋白。
105.權利要求100的方法，其中所述的調節區包含選自下述的啟動子糖原生成蛋白、糖原生成蛋白-2、糖原合酶、糖原生成蛋白相互作用蛋白(GNIP)、蛋白質磷酸酶1(PP-1)、葡萄糖轉運蛋白(GLUT)、PP-1家族的靶向糖原的亞基、己糖激酶家族成員、谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶、糖原磷酸化酶、脫支酶、磷酸化酶激酶、葡萄糖-6-磷酸酶、PPP1R1A(蛋白質磷酸酶1，調節抑制劑亞基1A)、PPP1R2(蛋白質磷酸酶1，調節亞基2)、果糖磷酸激酶、糖原合酶激酶-3同工型、GCKR葡糖激酶調節蛋白或α-葡糖苷酶。
106.權利要求99或100的方法，其中所述的細胞是原核的或真核的。
107.權利要求106的方法，其中所述的細胞穩定地或瞬時地轉化了基因，該基因的表達由糖原生成酶或糖原分解酶的調節區控制。
108.權利要求106的方法，其中所述的細胞轉化了核酸序列。
109.權利要求106的方法，其中所述的細胞是過度增殖的細胞。
110.權利要求106的方法，其中所述的細胞是無限增殖化的細胞。
111.權利要求106的方法，其中所述的細胞是癌細胞。
112.權利要求99或100中的任一項的方法，其中所述的接觸是在體外的。
113.權利要求99或100中的任一項的方法，其中所述的接觸是在體內的。
114.鑒定具有抗細胞增殖活性的試劑的方法，包括a)提供能增強糖原生成酶的表達或活性的實驗試劑；b)使能表達糖原生成酶的細胞與實驗試劑接觸；和c)在存在實驗試劑的情況下或在與實驗試劑接觸后，測定糖原毒性，其中糖原毒性將實驗試劑鑒定為具有抗細胞增殖活性的試劑。
115.鑒定具有抗細胞增殖活性的試劑的方法，包括a)提供能結合糖原生成酶或糖原分解酶的實驗試劑；b)使能表達糖原生成酶或糖原分解酶的細胞與實驗試劑接觸；和c)在存在實驗試劑的情況下或在與實驗試劑接觸后，測定糖原毒性，其中糖原毒性將實驗試劑鑒定為具有抗細胞增殖活性的試劑。
116.鑒定具有抗細胞增殖活性的試劑的方法，包括a)提供能降低糖原分解酶的表達或活性的實驗試劑；b)使能表達糖原分解酶的細胞與實驗試劑接觸；和c)在存在實驗試劑的情況下或在與實驗試劑接觸后，測定糖原毒性，其中糖原毒性將實驗試劑鑒定為具有抗細胞增殖活性的試劑。
117.鑒定具有抗細胞增殖活性的試劑的方法，包括a)使糖原生成酶或糖原分解酶與實驗試劑接觸；和b)在存在實驗試劑的情況下或在與實驗試劑接觸后，測量糖原生成酶或糖原分解酶的活性，其中糖原生成酶或糖原分解酶的升高的或降低的活性分別將實驗試劑鑒定為具有抗細胞增殖活性的試劑。
118.權利要求117的方法，其中所述的接觸是在溶液中、在固相中、在體外或在體內。
119.試劑盒，其包含一定量的能增強糖原生成酶的表達或活性的試劑和在標簽或包裝插頁上的關于給需要治療的受試者施用試劑的說明書。
120.試劑盒，其包含一定量的能降低糖原分解酶的表達或活性的試劑和在標簽或包裝插頁上的關于給需要治療的受試者施用試劑的說明書。
121.試劑盒，其包含一定量的能增強胞內糖原的積累的試劑和在標簽或包裝插頁上的關于給需要治療的受試者施用試劑的說明書。
122.權利要求119至121中的任一項的試劑盒，其中所述的試劑包含底物類似物。
123.權利要求119至121中的任一項的試劑盒，還包括抗腫瘤劑或免疫增強劑。
124.權利要求119至121中的任一項的試劑盒，其中所述的試劑包含藥物制劑。
125.權利要求119至121中的任一項的試劑盒，還包括制品。
126.權利要求125的試劑盒，其中所述的制品用于將試劑局部地、區域性地或全身地輸送給受試者。
全文摘要
本發明提供了用于抑制過度增殖的細胞的生長或增殖、或誘導過度增殖細胞退化的組合物和方法。更具體地，本發明提供了用于刺激靶細胞(例如，過度增殖的細胞)中的糖原積累的組合物和方法、以使糖原增加到對靶細胞有毒性的水平。
文檔編號C12P19/04GK1741821SQ200380107844
公開日2006年3月1日 申請日期2003年10月29日 優先權日2002年10月29日
發明者B·多伊倫, S·波納爾, A·張, E·蘇 申請人:恩根尼公司