翦股穎事件asr－368和組合物及其檢測方法

專利名稱：翦股穎事件asr－368和組合物及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及植物分子生物學領域。更具體地說，本發明涉及草甘膦耐受的翦股穎植物事件ASR-368，并涉及鑒定和用于在植物樣品中檢測翦股穎植物事件ASR-368DNA的存在的方法和組合物。
背景技術：
翦股穎(Agrostis stolonifera)在世界很多地區是重要的草皮物種。
已有把生物技術的方法應用于翦股穎以改善其農學性狀。一種這樣的農學性狀是除草劑耐受性，特別是對草甘膦除草劑的耐受性。在翦股穎中控制雜草是特別成問題的。在高爾夫球綠地上使用的翦股穎對許多在其他的草皮草上或在高爾夫球場的其他區域上通常使用的除草劑特別敏感。一年生草本，例如，馬唐屬(crabgrass)、狐尾草(foxtail)、毛花雀稗(dallisgrass)和牛筋草(goosegrass)必須通過使用各種除草劑包括砜草磷(bensulide)、氟硫草定(dithiopyr)、噁草酮(oxadiazon)、噁唑禾草靈(fenoxaprop)和氨基丙氟靈(prodiamine)，以特定的比例、環境條件和季節通過專門的撒藥機施用來進行有效的控制。一年生的和多年生闊葉雜草可以在翦股穎草皮上通過施用包括2，4-D、MCPP、麥草畏(dicamba)及其混合物來控制。許多草類和闊葉除草劑不能在翦股穎高爾夫球綠地上使用，因為其對翦股穎的損傷，或因為它們沒有被注冊為在翦股穎上使用。需要一種草甘膦耐受的翦股穎來恢復這些除草劑的使用，并需要提供一種當施用的草甘膦除草劑時在翦股穎草皮中有效的控制草類和闊葉雜草的方法。
N-磷酰甲基甘氨酸，也稱為草甘膦，是一種在廣譜的植物品種上具有活性的公知除草劑。草甘膦是Roundup(Monsanto Co.)的活性成分，是在環境中具有理想的短半衰期的安全的除草劑。當施用到植物表面時，草甘膦通過植物系統性地移動。由于對莽草酸途徑的抑制，草甘膦是植物毒性的，莽草酸途徑提供用于合成芳香族氨基酸的前體。草甘膦抑制在植物中發現的5-烯醇丙酮-3-磷酸莽草酸合酶(EPSPS)。草甘膦耐受性也可以通過表達細菌EPSPS變體和植物EPSPS變體來實現，所述變體具有對草甘膦的低親合性，因此在草甘膦存在的情況下保持了它們的催化活性(美國專利No.5,633,435、5,094,945、4,535,060和6,040,497)。
已知在植物中表達外源基因受到它們的染色體位置的影響，也許是由于染色質結構(例如，異染色質)或轉錄調控元件(例如，增強子)靠近整合位點(Weising等，Ann.Rev.Genet 22421-477，1988)造成的。為此，常常必須篩選大量的事件來鑒別以導入的感興趣的基因的最優表達為特征的事件。例如，已經在植物和其他生物中觀察到，在事件之中可能存在著在導入基因的表達水平上的大范圍變化。在表達的空間或時間模式上也可能存在差異，例如，在各種植物組織中轉基因的相對表達的差異，其可能與根據存在于導入的基因結構中針對轉錄調控元件所期待的模式不相應。為此，普遍的是生產數百到數千個不同的事件并從這些事件中篩選具有用于商業目的的期望的轉基因表達水平和模式的單個事件。具有期望的轉基因表達水平或模式的事件對于利用傳統的育種方法通過有性雜交將轉基因滲入到其他的遺傳背景中是有用的。這種雜交的子代維持了原始轉化體的轉基因表達特征。這個策略被用于在許多變種中確保可靠的基因表達，這些品種很好地適應了當地的生長條件和市場需求。
能夠檢測特定事件的存在以確定有性雜交的子代是否包含感興趣的轉基因是有用的。此外，檢測特定事件的方法，比方說，對于遵守需要上市前批準的法規和對來源于重組農作物的食物進行標記是有幫助的。通過任何已知的核酸檢測方法例如聚合酶鏈式反應(PCR)或利用核酸探針的DNA雜交，有可以檢測轉基因的存在。這些檢測方法通常關注經常使用的遺傳元件，例如啟動子、終止子、標記基因等等。結果，除非鄰近于插入的DNA的染色體DNA(“側翼DNA”)的序列是已知的，這種方法對于辨別不同的事件，特別是那些利用相同的DNA構建體產生的事件可能是沒有用的。已經討論了事件特異性的PCR分析，例如，Windels等(Med.Fac.Landbouww，Univ.Gent 64/5b459-462，1999)，利用跨越了插入物和側翼DNA之間的連接的引物組，具體地說是一個包括來自插入物的序列的引物和包括來自側翼DNA的序列的第二引物，通過PCR鑒別了草甘膦耐受的大豆事件40-3-2。也已經描述了用于草甘膦耐受的玉米事件的事件特異性的DNA檢測方法(US 20020013960A1，此處將其全部引用作為參考)。
本發明涉及草甘膦除草劑耐受的翦股穎植物ASR-368，和包含被包括在ASR-368的基因組中的轉基因/基因組連接區的DNA組合物，以及用于在翦股穎植物ASR-368和其子代中檢測轉基因/基因組連接區的方法。
發明概述本發明是命名為ASR-368的翦股穎轉基因事件，其種子保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)保藏號為No.PTA-4816。本發明的另一方面是翦股穎植物ASR-368的子代植物、或種子、或植物和種子的可再生部分。本發明還包括翦股穎植物ASR-368的一部分，包括但不限于，花粉、胚珠、花、芽、根和葉子。
本發明的一個方面提供用于檢測來自翦股穎植物事件ASR-368的轉基因/基因組連接區的存在的組合物和方法。提供DNA分子，其包含選自于SEQ ID NO1和SEQ ID NO2和其互補物的至少一個轉基因/基因組連接DNA分子，其中連接分子跨越包含插入到翦股穎基因組中的異源DNA的插入位點和來自翦股穎細胞在翦股穎事件ASR-368中位于插入位點側翼的基因組DNA。包含這些分子的翦股穎植物ASR-368和種子是本發明的一個方面。
提供新的DNA分子，其是轉基因/基因組區域SEQ ID NO3或其互補物，其中這個DNA分子在翦股穎事件ASR-368中是新的。在基因組中包含SEQ ID NO3的翦股穎植物和種子是本發明的一個方面。
根據本發明的另一個方面，提供DNA分子，其是轉基因/基因組區域SEQ ID NO4或其互補物，其中這個DNA分子在翦股穎事件ASR-368中是新的。在基因組中包含SEQ ID NO4的翦股穎植物和種子是本發明的一個方面。
根據本發明的另一個方面，提供兩個DNA分子用于DNA檢測方法，其中第一個DNA分子包含SEQ ID NO3的DNA分子轉基因區域的任何部分的至少11個或更多個連續多核苷酸和SEQ ID NO3的5’側翼翦股穎基因組DNA區域的任何部分的類似長度的DNA分子，其中當共同使用這些DNA分子時它們作為DNA引物應用于生產擴增子的DNA擴增方法。利用這些DNA引物在DNA擴增方法中生產的擴增子可檢測翦股穎事件ASR-368。通過與SEQ ID NO3的任何部分同源或互補的DNA引物生產的包含SEQ ID NO1的任何擴增子是本發明的一個方面。
根據本發明的另一個方面，提供兩個DNA分子用于DNA檢測方法，其中第一個DNA分子包含SEQ ID NO4的DNA分子轉基因區域的任何部分的至少11個或更多個連續多核苷酸和SEQ ID NO4的5’側翼翦股穎基因組DNA區域的任何部分的類似長度的DNA分子，其中當共同使用這些DNA分子時它們作為DNA引物應用于生產擴增子的DNA擴增方法。利用這些DNA引物在DNA擴增方法中生產的擴增子可檢測翦股穎事件ASR-368。通過與SEQ ID NO4的任何部分同源或互補的DNA引物生產的包含SEQ ID NO2的任何擴增子是本發明的一個方面。
根據本發明的另一個方面，提供檢測樣品中存在特定的相應于翦股穎事件ASR-368DNA的DNA的檢測方法。這種方法包含(a)使包含DNA的樣品與引物組接觸，所述引物組在用于與翦股穎事件ASR-368的基因組DNA進行核酸擴增反應時產生可檢測翦股穎事件ASR-368的擴增子，(b)進行核酸擴增反應，從而生產擴增子；和(c)檢測該擴增子。
根據本發明的另一個方面，提供檢測樣品中存在特定的相應于翦股穎事件ASR-368DNA的檢測方法。這種方法包含(a)使包含DNA的樣品與探針接觸，該探針在嚴緊雜交條件下與來自翦股穎事件ASR-368的基因組DNA雜交并且在嚴緊雜交條件下不與對照翦股穎植物DNA雜交；(b)將樣品和探針置于嚴緊雜交條件中；和(c)檢測探針與ASR-368DNA的雜交。
根據本發明的另一個方面，提供生產能耐受施用的草甘膦的翦股穎植物的方法，包含步驟(a)使對施用的草甘膦耐受的包含本發明表達盒的第一親本翦股穎事件ASR-368，與缺乏草甘膦耐受性的第二親本翦股穎植物進行有性雜交，從而生產大量子代植物；和(b)挑選耐受草甘膦的子代植物。這種方法可選擇性地包含進一步的步驟，該步驟使子代植物與第二親本翦股穎植物回交并挑選草甘膦耐受的子代來生產耐受施用的草甘膦的純育翦股穎種類。
提供包含翦股穎事件ASR-368的草類的草皮草植被(turfgrassstand)。草甘膦耐受的翦股穎ASR-368的草皮草植被在高爾夫球場上是特別有用的，這些草皮草植被是本發明的一個方面。
本發明的另一個方面是用于在翦股穎ASR-368的草皮草植被上控制雜草的方法，包含向該草皮草植被施用含草甘膦的除草劑配方的步驟。
本發明的上述及其他方面將根據以下的詳細說明和附隨的圖變得更為顯而易見。
圖的簡要說明

圖1.pMON25496的質粒2.插入在翦股穎事件ASR-368中的基因組構成圖3.ASR-368 5’轉基因/基因組DNA序列(SEQ ID NO3)圖4.ASR-368 5’轉基因/基因組DNA序列(SEQ ID NO4)圖5.ASR-368 5’轉基因/基因組連接區(SEQ ID NO1)和3’轉基因/基因組連接區(SEQ ID NO2)優選實施方式的詳細說明提供以下定義和方法來更好的定義本發明和指導本領域的普通技術人員實施本發明。除非另作說明，根據本領域普通技術人員的常規的用法來理解術語。在分子生物學中通用術語的定義也可在Rieger等，Glossary of GeneticsClassical and molecular，第五版，Springer-VerlagNew York，1991；和Lewin，Genes V，OxfordUniversity PressNew York，1994中找到。使用如37CFR§1.822中闡明的DNA堿基命名法。
如在此處使用的，術語“翦股穎”是指Agrostis stolonifera，并包括所有可以用翦股穎ASR-368繁殖的植物變種。
如在此處使用的，術語“包含”是指“包括但不限于”。
“草甘膦”指N-磷酰甲基甘氨酸和它的鹽，草甘膦是Roundup除草劑(Monsanto Co.)的活性成分。用“草甘膦除草劑”處理是指用Roundup、Roundup Ultra、Roundup Pro除草劑或任何其他包含草甘膦的除草劑配方處理。草甘膦的商用配方的實例包括但不限于，那些Monsanto Company出售的如ROUNDUP、ROUNDUPULTRA、ROUNDUPULTRAMAX、ROUNDUPCT、ROUNDUPEXTRA、ROUNDUPBIACTIVE、ROUNDUPBIOFORCE、RODEO、POLARIS、SPARK和ACCORD除草劑，所有這些都包含草甘膦作為其異丙基銨鹽；那些Monsanto Company出售的如ROUNDUPDRY和RIVAL除草劑，其包含草甘膦作為其銨鹽；Monsanto Company出售的如ROUNDUPGEOFORCE，其包含草甘膦作為其鈉鹽；和Zeneca Limited出售的如TOUCHDOWN除草劑，其包含草甘膦作為其三甲基锍鹽。
轉基因“事件”是通過異源DNA，即，包括感興趣的轉基因的核酸構建體對植物細胞進行轉化，由轉基因插入到植物基因組中再生的植物群體，和選擇插入特定基因組位置的為特征的特定的植物產生的。術語“事件”指包括異源DNA的原始轉化體和該轉化體的子代。術語“事件”還指通過在轉化體和另一個包括異源DNA的事件之間進行有性的異型雜交生產的子代。甚至在重復的對回歸親本的回交之后，來自轉化的親本的插入DNA和側翼基因組DNA存在于雜交子代的相同染色體位置。術語“事件”還指可望將來自包含插入的DNA和緊鄰插入DNA的側翼基因組序列的原始轉化體的DNA轉移到包括感興趣的轉基因的插入DNA的子代中，所述子代是包括插入DNA的一個親體株系(例如，原始轉化體和自交產生的子代)與不包含插入的DNA的親本株系進行有性雜交的結果。草甘膦耐受的翦股穎植物可以通過首先使第一親本翦股穎植物與缺乏對草甘膦除草劑的耐受性的第二親本翦股穎植物進行有性雜交，從而生產出大量的第一子代植物，其中第一親本翦股穎植物由轉基因的翦股穎植物生長出的、耐受施用的草甘膦除草劑的翦股穎植物組成，該轉基因的翦股穎植物是由包含在pMON25496(圖1)中的植物表達盒轉化的；然后挑選對施用的草甘膦除草劑耐受的第一子代植物；然后對第一子代植物進行自交，從而生產出大量第二子代植物；然后從第二子代植物中挑選出草甘膦除草劑耐受植物。這些步驟可進一步包括使第一草甘膦耐受的子代植物或第二草甘膦耐受的子代植物與第二親本翦股穎植物或第三親本翦股穎植物回交，從而生產出耐受施用的草甘膦除草劑的翦股穎植物。在本發明中，轉基因翦股穎事件也被定義為翦股穎事件ASR-368，在此也可稱為ASR-368或事件ASR-368。
還應理解的是，兩個不同的轉基因的植物也可以被配對來生產包含兩個獨立地分別添加的外源基因的后代。適當于代的自交能產生對于兩個添加的外源基因都是純合的植物。還包括對親本植物進行回交和用非轉基因植物進行異型雜交以及營養繁殖。通常被用于不同性狀和作物的其他繁育方法的說明可參見下述任一參考文獻例如，Fehr，Breeding Methods for Cultivar Development，Wilcox J.ed.，American Society of Agronomy，Madison WI(1987)。
“探針”是分離的核酸，在上面附有常規的可檢測的標記或報告分子，例如，放射性同位素、配體、化學發光劑或酶。這種探針與目標核酸的鏈互補，就本發明來說，與來自翦股穎事件ASR-368的基因組DNA的鏈互補，不論該基因組DNA是來自翦股穎事件ASR-368植物還是來自包括來自該事件的DNA的樣品。根據本發明的探針不僅包括脫氧核糖核酸或核糖核酸，還包括與目標DNA序列特異結合并可用于檢測目標DNA序列存在的聚酰胺及其他探針材料。
“引物”是分離的核酸，其通過核酸雜交與互補的目標DNA鏈退火形成引物和目標DNA鏈的雜合體，然后通過聚合酶，例如DNA聚合酶沿目標DNA鏈延伸。本發明的引物對涉及它們用于目標核酸序列的擴增的用途，例如，通過聚合酶鏈式反應(PCR)或其他常規的核酸擴增方法。
探針和引物的長度通常是11個多核苷酸或以上，常常是18個多核苷酸或以上、24個多核苷酸或以上、或30個多核苷酸或以上。選擇這種探針和引物使其具有足夠的長度來在高度嚴緊雜交條件下特異地與目標序列雜交。盡管可以通過常規方法設計保持對目標序列的雜交能力的、與目標序列不同的探針，優選的，根據本發明的探針和引物具有與目標序列類似的全部的序列。
制備和使用探針和引物的方法已有描述，例如，MolecularCloningA Laboratory Manual，2nd ed.，vol.1-3，ed.Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989(在下文中，“Sambrook等，1989”)；Current Protocolsin Molecular Biology，ed.Ausubel等，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York，1992(定期更新)(在下文中，“Ausubel等，1992”)；和Innis等，PCR ProtocolsA Guide toMethods and Applications，Academic PressSan Diego，1990。PCR引物對可源自已知序列，例如，通過使用為此目的設計的計算機程序，例如Primer(Version 0.5，1991，Whitehead Institute forBiomedical Research，Cambridge，MA)。
在此公開的根據側翼基因組DNA和插入序列的引物和探針可用于通過常規方法確認(和，如有必要，糾正)公開的DNA序列，例如，對這種分離自翦股穎ASR-368的DNA分子進行重克隆和測序，翦股穎ASR-368的種子保藏在ATCC，保藏號為PTA-4816。
本發明的核酸探針和引物在嚴緊條件下與目標DNA分子雜交。可使用任何常規的核酸雜交或擴增方法來鑒別樣品中來自轉基因事件的DNA的存在。核酸分子或其片段能在某些環境下與其他的核酸分子特異性的雜交。如此處使用的，如果兩個核酸分子能形成反義平行的雙鏈核酸結構，則稱為兩個核酸分子能相互特異性的雜交。如果核酸分子顯示出完全的互補性，則稱為核酸分子是另一個核酸分子的“互補物”。如此處使用的，當一個分子的每一個核苷酸與另一個分子的核苷酸互補時，稱為分子顯示出“完全的互補性”。如果它們的相互雜交具有足夠的穩定性以使它們在至少常規的“低嚴緊”條件下保持相互的退火，稱為兩個分子是“最低度互補的”。類似地，如果它們的相互雜交具有足夠的穩定性以使它們在至少常規的“高嚴緊”條件下保持相互的退火，稱為分子是“互補的”。常規的嚴緊條件由Sambrook等，1989和Haymes等，在NucleicAcid Hybridizatiorz，A PracticalApproach，IRL Press，Washington，DC(1985)中描述。因此對完全的互補性的偏離是可允許的，只要這種偏離不會完全地排除分子形成雙鏈結構的能力。為了使核酸分子充當引物或探針，僅需在序列中充分的互補，以使得在所使用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩定的雙鏈結構。
此處所用的，基本上同源的序列是在高度嚴緊條件下和與其相比較的核酸序列的互補物特異性的雜交的核酸序列。促進DNA雜交的適當嚴緊的條件，例如，6.0×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)約45℃，之后是在50℃用2.0×SSC洗滌，對本領域的技術人員是公知的，或可在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以從低度嚴緊的約2.0×SSC、50℃到高度嚴緊的約0.2×SSC、50℃之中選擇。此外，洗滌步驟中的溫度可以從低度嚴緊條件的室溫下約22℃，到高度嚴緊條件的約65℃。溫度和鹽度可以都變化，或者溫度或鹽濃度保持不變而另一個變量發生改變。在優選的方案中，本發明的核酸與SEQ ID NO1、2、3或4中列出的一個或多個核酸分子，或其互補物或其中任何一個的片段，在中度嚴緊條件下，例如，在2.0×SSC和約65℃下雜交。在特別優選的方案中，本發明的核酸與SEQ ID NO1到SEQ ID NO4中列出的一個或多個核酸分子，或其互補物或其中任何一個的片段，在高度嚴緊條件下雜交。在本發明的一個方面中，本發明的優選的標記物核酸分子具有SEQ ID NO1到SEQ ID NO4中列出的，或其互補物或其中任何一個的片段的核酸序列。在本發明的另一個方面中，本發明的優選的標記物核酸分子與SEQ ID NO1到SEQ ID NO4中列出的，或其互補物或其中任何另一個的片段的核酸序列享有80％到100％，或90％到100％的序列同一性。在本發明的更進一步的方面中，本發明的優選的標記物核酸分子與SEQ ID NO1到SEQ ID NO4中列出的，或其互補物或其中任何另一個的片段的核酸序列享有95％到100％的序列同一性。SEQ ID NO1到SEQ ID NO4可用作植物繁育方法中的標記物來鑒別遺傳雜交的子代，與對單一序列重復DNA標記物分析描述的方法類似，如“DNA markersProtocols，applications，and overviews(1997)173-185，Cregan，等，eds.，Wiley-Liss NY；全部引入作為參考。探針與目標DNA分子的雜交可以通過許多本領域技術人員已知的方法進行檢測，這些可包括但不局限于，熒光標記、放射性標記、基于抗體的標記和化學發光標記。
關于使用特定的擴增引物對目標核酸序列的擴增(例如，通過PCR)，“嚴緊條件”是允許引物對僅與目標核酸序列雜交的條件，具有相應的野生型序列(或其互補物)的引物將與目標核酸序列結合，優選的在DNA熱擴增反應中產生獨特的擴增產物，擴增子。
術語“特異于(目標序列)”是指探針或引物在嚴緊雜交條件下僅與包含目標序列的樣品中的目標序列雜交。
如此處使用的，“擴增的DNA”或“擴增子”指目標多核苷酸分子的多核苷酸擴增產物，目標多核苷酸分子是多核苷酸模板的一部分。例如，為確定有性雜交產生的翦股穎植物是否包含來自本發明的翦股穎事件ASR-368植物的轉基因事件基因組DNA，可對從翦股穎植物組織樣品中提取的DNA利用引物對通過多核苷酸擴增法產生對ASR-368事件DNA的存在有檢測價值的擴增子，其中引物對包括來源于在ASR-368植物的基因組中鄰近插入的異源DNA(轉基因DNA)的插入位點的側翼DNA的引物，和來源于插入的異源DNA的第二引物。擴增子具有一定長度并具有多核苷酸序列，對事件的檢測也是有價值的。擴增子的長度可在引物對加上一個核苷酸堿基對的組合長度范圍發生變化，優選的加上約五十個核苷酸堿基對，更優選的加上約兩百五十個核苷酸堿基對，和更進一步優選的加上約四百五十個核苷酸堿基對或以上。做為選擇，引物對可以是源自插入的異源DNA兩側的多核苷酸側翼基因組序列，以產生包含全部的插入多核苷酸序列的擴增子(例如，正向基因組引物來自SIQ ID NO3，反向基因組引物來自SEQ ID NO4，擴增插入的DNA分子，其包含轉化到翦股穎中的pMON25496 DNA片段的HindIII表達盒，約6681核苷酸堿基對，圖1)。源自ASR-368的植物基因組序列的引物對的成員可以被定位在距插入的DNA分子一定距離上，該距離可以在一個核苷酸堿基對到約兩萬核苷酸堿基對的范圍變化。術語“擴增子”的使用要特定的排除可在DNA熱擴增反應中形成的引物二聚物。
可以通過本領域已知的任何一種多核苷酸擴增方法，包括聚合酶鏈式反應(PCR)完成多核苷酸擴增。本領域已知一種擴增方法，特別地在美國專利NO.4,683,195和4,683,202和PCR ProtocolsA Guideto Methods and Applications，ed.Innis等，Academic Press，SanDiego，1990中描述。PCR擴增方法已經發展到可擴增達到22kb的基因組DNA和達到42kb的噬菌體DNA(Cheng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 915695-5699，1994)。這些方法以及本領域的其他DNA擴增方法可用于實施本發明。來自翦股穎事件ASR-368的異源DNA插入物或側翼基因組DNA的序列可以利用來源于此處提供的序列的引物從事件中擴增這種DNA分子，然后對PCR擴增子或克隆的DNA進行標準的DNA測序，來核實(如果有必要，可被糾正)。根據DNA擴增方法的DNA檢測試劑盒包含特異性擴增有檢測價值的擴增子的DNA引物。該試劑盒可提供基于瓊脂糖凝膠的檢測方法或本領域已知的許多檢測擴增子的方法。
可以提供大量的技術來檢測這些方法生產的擴增子。其中一個方法是Genetic Bit Analysis(Nikiforov，等Nucleic Acid Res.224167-4175，1994)，其中，設計于迭蓋鄰近側翼基因組DNA序列和插入的DNA序列的DNA寡聚核苷酸。將寡聚核苷酸固定在微量滴定板的孔中。在對感興趣的區域進行PCR之后(使用在插入的序列中的一個引物，和在鄰近側翼基因組序列中的一個引物)，單鏈PCR產物可與固定的寡聚核苷酸雜交并充當模板，用于利用DNA聚合酶和特異于期待的下一個堿基的標記脫氧核苷酸三磷酸鹽(ddNTP)進行單堿基延伸反應。讀出過程可以是基于熒光的或基于ELISA的。信號指示由于成功的擴增、雜交和單堿基延伸導致的插入/側翼序列的存在。
另一個方法是如Winge(Innov.Pharma.Tech.0018-24，2000)描述的Pyrosequencing技術。在這個方法中設計于迭蓋鄰近基因組DNA和插入DNA連接的寡聚核苷酸。使寡聚核苷酸與來自感興趣區域的單鏈PCR產物(一個引物在插入的序列中，一個在側翼基因組序列中)雜交，在存在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶、腺苷酸5’磷酸和螢光素的情況下孵育。分別地添加脫氧核糖核苷酸(DNTP)，測量導致發光的摻入。發光指示由于成功的擴增、雜交和單堿基或多堿基延伸導致的轉基因插入/側翼序列的存在。
Chen等描述的熒光偏振(Genome Res.9492-498，1999)是可用于檢測本發明的擴增子的方法。利用這個方法設計于迭蓋基因組側翼和插入的DNA連接的寡聚核苷酸。使寡聚核苷酸與來自感興趣區域的單鏈PCR產物(一個引物在插入的DNA序列中，一個在側翼基因組DNA序列中)雜交，在存在DNA聚合酶和熒光標記的ddNTP的情況下孵育。單堿基延伸導致ddNTP的摻入。利用熒光計測量偏振的變化可以測量所述的摻入。偏振的變化指示由于成功的擴增、雜交和單堿基延伸導致的轉基因插入/側翼序列的存在。
Taqman(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)是一種對DNA序列的存在進行檢測和定量的方法，可以根據廠家提供的說明完全理解。簡要地，設計于迭蓋基因組側翼和插入DNA連接區的FRET寡聚核苷酸探針。在存在熱穩定聚合酶和dNTP的情況下，FRET探針和PCR引物(一個引物在插入的DNA序列中和一個在側翼基因組序列中)進行循環。FRET探針的雜交導致FRET探針上熒光部分從淬火部分裂解和釋放。熒光信號指示由于成功的擴增和雜交導致的側翼/轉基因插入序列的存在。
如Tyangi等所述(Nature Biotech.14303-308，1996)，已經描述了用于序列檢測的Molecular Beacons。簡要地說，設計于迭蓋基因組側翼和插入那些DNA連接的FRET寡聚核苷酸探針。該FRET探針的獨特的結構造成其包含二級結構，該二級結構使熒光和淬火部分保持鄰近。在存在熱穩定聚合酶和dNTP的情況下，FRET探針和PCR引物(一個引物在插入的DNA序列中和一個在側翼基因組序列中)進行循環。在成功的PCR擴增之后，FRET探針對目標序列的雜交導致探針二級結構的消除和熒光部分與淬火部分的空間隔離。產生熒光信號。熒光信號指示了由于成功的擴增和雜交導致的側翼/轉基因插入序列的存在。
翦股穎事件ASR-368是對草甘膦除草劑耐受的，作為草皮草植被是有用的。可用于私人和公共場所培養草皮草植被。好的草皮草植被，或綠地，兼備美觀和實用性；對于高爾夫球、網球、棒球、足球及其他體育設施它的維護是一種昂貴的和專業化的程序。翦股穎ASR-368事件作為高爾夫球場上生長的草皮草植被是特別有用的。高爾夫球場有多種草皮草植被草皮草組分，其形成球洞。這些組分包括開球區、球道、障礙區和綠地。當將事件ASR-368用作草皮草時可提供通過使用包含草甘膦的除草劑有效地控制雜草，從而便于管理的草皮草植被。包含翦股穎事件ASR-368的草皮草植被是本發明的一個方面，鑒于ASR-368草皮草植被是高爾夫球場的組分，該組分也是本發明的一個方面。本發明的草皮草植被優選的包含50％或以上組分的翦股穎事件ASR-368，更優選的75％組分，更進一步優選的大于90％組分。
以下實施例用于說明本發明的某些優選的方案。那些本領域的技術人員應當了解，在實例中公開的技術代表發明人已驗證的可在實踐本發明中充分發揮其功能的方法，因此可以被認為是實施本發明的優選實施例。然而，本領域的技術人員根據當前公開的內容應當理解，可以在公開的特定的方案中進行許多變化，在不背離本發明的主旨和范圍的情況下仍獲得相象的或類似的結果。
實施例實施例1
通過利用來源于(圖1)包含本發明的轉基因插入物的pMON25496的線性HindIII DNA片段對翦股穎系B99061R/990028進行微彈轟擊，產生轉基因的翦股穎事件ASR-368。該DNA片段包含兩個轉基因表達盒，共同賦予翦股穎ASR-368植物對草甘膦的耐受性。第一個表達盒由水稻肌動蛋白1啟動子和內含子(P-Os.Act1，也被稱為P-ract，和內含子I-Os.Act1，也被稱為ract內含子，美國專利NO.5,641,876)組成，可操作的連接到擬南芥(Arabidopsis)EPSPS葉綠體轉運肽(TS-At.EPSPSCTP2，也稱為ctp2，Klee等，Mol.Gen.Genet.21047-442，1987)，可操作的連接到來自土壤桿菌菌株CP4(AGRTU.aroACP4 EPSPS，也稱as cp4，美國專利NO.5,633,435)的草甘膦耐受的5-烯醇-丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，和可操作的連接到胭脂氨酸合酶轉錄終止子(T-nos，也稱作NOS 3’，Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 804803-4807，1983)。第二轉基因表達盒包含串聯重復的增強子區域的花椰菜花葉病毒35S啟動子(P-CaMV.35S，也被稱為P-e35S，Kay等Science 2361299-1302，1987；美國專利NO.5,164,316)，可操作的連接到玉米(Zea Mays)Hsp70內含子(I-Zm.Hsp70，也稱為ZmHSP70內含子，美國專利No.5,362,865)，可操作的連接到擬南芥EPSPS葉綠體轉運肽(TS-At.EPSPSCTP2)，可操作的連接到來自土壤桿菌菌株CP4(AGRTU.aroACP4 EPSPS)的草甘膦耐受的5-烯醇-丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，和可操作的連接到胭脂氨酸合酶轉錄終止子(T-nos，Fraley等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 804803-4807，1983)。已經展示了DNA構建體pMON25496賦予轉基因玉米草甘膦耐受性(US20020013960A1)。在轟擊后，在包含3mM草甘膦的培養基上選擇草甘膦耐受的轉基因愈合組織，隨后再生植物。生產出轉基因事件，根據特性的優勢綜合，包括草甘膦耐受性、農學性能、和單轉基因插入，挑選出事件ASR-368。在ASR-368中發生的轉基因插入如圖2所示。
實施例2測試草甘膦耐受的翦股穎事件ASR-368對草甘膦植物損傷的耐受性。草甘膦耐受的翦股穎事件ASR-368對于用手動噴霧器噴霧的5％RoundupPro(包含草甘膦的除草劑配方)或相當于每英畝128盎斯RoundupPro的數量沒有顯示受損。標準推薦的比率是1.25到2.5％RoundupPro或相當于每英畝32到64盎司RoundupPro的數量。在生長季節期間，初夏、仲夏和早秋，施用三次包含草甘膦的除草劑配方來檢測經受事件ASR-368的草皮草植被的草甘膦耐受性。翦股穎事件ASR-368在三個檢測點顯示了對施用的全部草甘膦的耐受性。對事件ASR-368沒有觀察到植物損傷，而不包含pMON25496的翦股穎植物經過包含草甘膦的除草劑配方處理全部嚴重的損傷或被殺死。用包含草甘膦的除草劑處理作為草皮草植被的草皮草組分的翦股穎ASR-368是在草皮草植被中控制雜草及其他不需要的植物的有用的方法。
實施例3鄰近轉基因插入物的5’和3’基因組區域的DNA序列通過利用Clontech的Universal Genome WalkerTM試劑盒和RAGE法(基因組DNA末端的快速擴增)分離DNA分子來確定。通過用HindIII在37℃消化過夜從翦股穎ASR-368基因組DNA中分離出5’轉基因/基因組DNA(圖3)、用XbaI在37℃消化pBluescript KS質粒(Stratagene，La Jolla CA)3小時。將四個核苷酸堿基突出端用兩個核苷酸補平以適合于連接。通過在適當條件下與T4DNA連接酶一起孵育，使基因組DNA與用XbaI消化的、2個核苷酸堿基補平的pBluescript KS質粒連接。在連接反應之后，將5μl的連接混合物用于DNA擴增法，使用2μl 10μM M13正向引物(SEQ ID NO5)、2μl 10μM ASR-368轉基因特異的寡聚核苷酸引物(SEQ ID NO6)，1.75μl 10mM脫氧核糖核苷酸，Expand Long Template PCR System(Roche)和水至50μl。首輪反應在熱循環儀中以下循環條件進行94℃2分鐘30個循環；每次94℃10秒；56℃30秒；68℃3分鐘和最后68℃10分鐘。在第二反應中擴增1μl的首輪反應物，包括2μl 10μM T7引物(SEQ ID NO7)，2μl ASR-368特異性的引物(SEQ ID NO8)，1.75μl 10mM脫氧核糖核苷酸，Expand Long Template PCR系統(Roche)和加水至50μl，熱循環條件與初級反應使用的相同。
通過PCR證實翦股穎樣品中轉基因/基因組DNA的存在。利用一個引物(SEQ ID NO11)配合第二引物(SEQ ID NO12)生產出5’轉基因/基因組連接區擴增子，前一引物被設計為相應于插入的轉基因DNA 5’端的側面的基因組DNA序列，第二引物在插入的轉基因DNA的水稻肌動蛋白1啟動子中。5’連接擴增子通過以約50ng葉子基因組DNA(1μl)作為模板，15pmol每個引物(各1.5μl)和Expand HighFidelity PCR系統在50μl反應體積中產生。擴增反應在以下循環條件下進行94℃2分鐘進行1個循環；94℃15秒，60℃30秒，72℃1分鐘進行10個循環；94℃15秒，60℃30秒，72℃1分鐘，每循環加額外的5秒進行25個循環；72℃7分鐘進行1個循環。
在另一個方法中，從翦股穎事件ASR-368分離相應的轉基因/基因組DNA分子也可以如Genome WalkerTM試劑盒中描述的(目錄#K1807-1，CloneTech Laboratories，Inc，Palo Alto，CA)利用連接的接頭和嵌套PCR來完成。首先，用CTAB純化法(Rogers等，PlantMol.Biol.569-76，1985)從ASR-368事件分離基因組DNA。根據制造商的說明(Genome WalkerTM，CloneTech Laboratories，Inc，Palo Alto，CA)制備用于擴增的基因組DNA庫。在獨立的反應中，基因組DNA用平頭末端限制性核酸內切酶在37℃消化過夜(CloneTechLaboratories，Inc，Palo Alto，CA)。用苯酚∶氯仿提取反應混合物，向水相添加乙醇沉淀DNA，通過離心作用顆粒化，然后重懸浮在Tris-EDTA緩沖液(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)中。根據制造商的說明將純化的平頭末端基因組DNA片段連接到GenomeWalkerTM接頭上。連接之后，熱處理(70℃5分鐘)每個反應來終止反應，然后在Tris-EDTA緩沖液中稀釋10倍。1μl各連接物在50μl反應中進行擴增，包括1μl各接頭-連接的庫、1μl 10μM GenomeWalkerTM接頭引物AP1(SEQ ID NO9，制造商提供)、1μl 10μM事件ASR-368轉基因特異性的寡聚核苷酸(SEQ ID NO12)、1μl 10mM脫氧核糖核苷酸、2.5μl二甲基亞砜、5μ10X包含MgCl2的PCR緩沖液、0.5μl(2.5單位)Amplitaq熱穩定DNA聚合酶(PE AppliedBiosystems，Foster City，CA)加H2O至50μl。在熱循環儀中利用計算的溫度控制和下列循環條件進行反應95℃9分鐘1個循環；94℃2秒，70℃3分鐘進行7個循環；94℃2秒，65℃3分鐘進行36個循環；65℃4分鐘進行1個循環。1μl的每個首輪反應物用50倍水稀釋，在第二反應中擴增(1μl各稀釋的首輪反應物，1μl 10μM Genome WalkerTM嵌套接頭引物AP2，(SEQ ID NO10，由制造商提供)，1μl 10μM事件ASR-368轉基因特異性的嵌合寡聚核苷酸(SEQ ID NO12)，1μl 10mM脫氧核糖核苷酸，2.5μl二甲基亞砜，5μl包含MgCl2的10XPCR緩沖液，0.5μl(2.5單位)Amplitaq熱穩定的DNA聚合酶(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)加H2O到50μl)，使用以下循環條件95℃9分鐘1個循環；94℃2秒，70℃3分鐘5個循環；94℃2秒，65℃3分鐘24個循環；65℃4分鐘1個循環。
PCR產物，代表跨越了在翦股穎事件ASR-368轉基因插入物和鄰近的側翼翦股穎基因組DNA序列之間的連接的5’區域，通過瓊脂糖凝膠電泳純化，然后利用QIAquick Gel Extraction試劑盒(目錄#28704，Qiagen Inc.，Valencia，CA)從瓊脂糖基塊上分離，直接克隆到pGEM-T Easy載體(目錄#A1360，Promega，Madison，+WI)中。通過DNA序列分析(ABI PrismTM377，PE Biosystems，FosterCity，CA和DNASTAR序列分析軟件，DNASTAR Inc.，Madison，WI)確認克隆的PCR產物與用來生產翦股穎ASR-368的pMON25496的HindIII片段的同一性和關系。5’基因組/轉基因區域DNA分子的DNA序列如圖3所示。通過用下劃線的DNA序列在圖3中進一步確認了翦股穎基因組DNA部分，雙下劃線的DNA序列是與PCR引物分子同源或互補的DNA序列，對包含SEQ ID NO3的翦股穎基因組的確認是有用的。
類似地，利用第一引物(SEQ ID NO14)和第二引物(SEQ ID NO13)擴增了翦股穎事件ASR-368 3’側翼基因組DNA序列(圖4)，前一引物被設計為位于轉基因插入物3’端側面的基因組DNA序列，第二引物位于pMON25496中包含的T-nos 3’轉錄終止區域。利用約211ng葉子基因組DNA(1μl)作為模板，15pmol每個引物(各1.5μl)和Expand Long Template PCR系統(Roche)在50μl反應體積中進行PCR。在以下循環條件下進行反應的擴增94℃2分鐘1個循環；94℃10秒，60℃30秒，68℃30秒35個循環；68℃10分鐘1個循環。
通過對GenomeWalkerTM衍生的擴增產物進行測序并與已知的轉基因序列比對，位于轉基因插入物的兩側的翦股穎基因組DNA序列被確定為事件ASR-368。對轉基因插入位點的5’區域測序，該區域包含插入連接周圍的896核苷酸堿基對(bps)的轉基因/基因組DNA序列(SEQID NO3)。該DNA序列由637bps的側翼翦股穎基因組序列(SEQ IDNO3的1-637位核苷酸)和259bps的來自P-Os.Act1 5’端的序列(SEQ ID NO3的638-896位核苷酸)組成，如圖3所示。
DNA序列被確定為3’插入連接周圍的474bps片段(SEQ ID NO4)，其來自具有T-nos轉錄終止子的248bps的5’端(SEQ ID NO4的1-248位核苷酸)，剩余序列由位于整合位點側面的翦股穎基因組DNA序列(相應于SEQ ID NO4的249-474位堿基)組成，如圖4所示。雙下劃線的DNA序列是與PCR引物分子同源或互補的DNA序列，對包含SEQ ID NO4的翦股穎基因組的鑒別是有用的。
連接序列，SEQ ID NO1和SEQ ID NO2(圖5)是來自事件ASR-368的新的DNA序列，對于檢測翦股穎植物事件ASR-368和它的子代是有價值的。在SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中的連接序列包含轉基因序列片段的插入位點的兩側的多核苷酸和翦股穎基因組DNA。連接序列SEQ ID NO1在SEQ ID NO3的626-649位的核苷酸、轉基因插入位點的5’區域。連接序列SEQ ID NO2位于SEQ ID NO4置236-259位的核苷酸、轉基因插入位點的3’區域。每個連接序列都可用作DNA探針和引物，來特異地鑒定事件ASR-368的基因組DNA。
實施例4DNA事件引物對用于生產對翦股穎事件ASR-368有檢測價值的擴增子。對ASR-368有檢測價值的擴增子包含至少一個連接序列，SEQ IDNO1或SEQ ID NO2。將產生對翦股穎ASR-368有檢測價值的擴增子的ASR-368事件引物對，包括但不限于，包括事件引物1(SEQ ID NO11)和事件引物2(SEQ ID NO12)的引物對，其提供5’擴增子DNA分子，和引物對SEQ ID NO13和SEQ NO14，其在表1列出的方案中代替引物1和引物2生產3’擴增子DNA分子。除這些引物對之外，來源于SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的、在DNA擴增反應產生對翦股穎事件ASR-368有檢測價值的擴增子的任何引物對都是本發明的一個方面。包含SEQ ID NO3的11個連續核苷酸或其互補物的任何單個分離的DNA多核苷酸引物分子，都是對生產對翦股穎事件ASR-368有檢測價值的擴增子DNA的擴增方法有用的，是本發明的一個方面。包含SEQ ID NO4的11個連續核苷酸或其互補物的任何單個分離的DNA多核苷酸引物分子，其是對生產對翦股穎事件ASR-468有檢測價值的擴增子的DNA擴增方法有用的，是本發明的一個方面。用于這些分析的擴增條件在表1和表2中說明，然而，對這些利用DNA引物生產對翦股穎事件ASR-368有檢測價值的方法的任何修改都在本領域普通技術人員的范圍內。檢測上有價值的擴增子包含至少一個轉基因/基因組連接DNA(SEQ ID NO1或SEQ ID NO2)。
對事件ASR-368植物組織樣品的分析應包括來自事件ASR-368的陽性組織對照、來自非事件ASR-368的翦股穎植物的陰性對照，和不包含翦股穎DNA的陰性對照。額外的引物序列可以由對DNA擴增方法熟練的技術人員從SEQ ID NO3和SEQ ID NO4中選擇，為生產擴增子選用的條件可以是表1和表2所示的條件或與之不同的條件，只要可產生對事件ASR-368有檢測價值的擴增子即可。對表1和表2的方法有修改的DNA引物序列的使用在本發明的范圍之內。通過至少一個來源于SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的DNA引物序列生產的、對ASR-368有檢測價值的擴增子是本發明的一個方面。
包含至少一個來源于SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的引物、用于DNA擴增方法可產生對翦股穎ASR-368有檢測價值的擴增子的DNA檢測試劑盒，是本發明的一個方面。通過至少一個來源于pMON25496的任何遺傳元件的引物序列生產的、對ASR-368有檢測價值的擴增子是本發明的一個方面。翦股穎植物或種子是本發明的一個方面，其中當使用DNA擴增方法檢測以從所述翦股穎植物或種子中擴增DNA分子時，其基因組能產生對翦股穎事件ASR-368有檢測價值的擴增子。對ASR-368擴增子的分析可通過利用如表2所示的StratageneRobocycler、MJ Engine、Perkin-Elmer 9700或EppendorfMastercycler Gradient熱循環儀，或通過本領域技術人員所知的方法和設備來進行。
表1.用于鑒定翦股穎事件ASR-368 5’轉基因插入物/基因組連接區的PCR程序和反應混合物條件。
表2.對不同熱循環儀建議的PCR參數輕輕地混合，和如果必要(熱循環儀上沒有加熱蓋)，在每個反應上添1-2滴礦物油。利用以下循環參數在StratageneRobocycler、MJEngine、Perkin-Elmer 9700、或EppendorfMastercycler Gradient熱循環儀上進行PCR。
注意MJ Engine或Eppendorf Mastercycler Gradient熱循環儀應按計算的模式運行。將變溫速度(ramp speed)設定在最大值運行Perkin-Elmer 9700熱循環儀。
Monsanto公司的保藏物，以上公開的和權利要求中所述的翦股穎種子ASR-368已經根據布達佩斯條約保藏在美國典型培養物保藏所(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110。ATCC保藏號是PTA-4816。該保藏物將維持30年、或在最后一次請求后5年、或在本專利的有效期內，取其中期限較長的，根據需要就在該時期內進行替換。
已經說明和描述了本發明的原理，對本領域的技術人員顯而易見的是，可以在安排和細節上對本發明進行修改而不背離這種原理。我們要求所有的修改都處于附加的權利要求的精神和范圍內。
在本說明書中引用的所有出版物和公開的專利文件在此通過引證來引入，其程度如同特定的或單獨的指示通過引證來引入各單獨的出版物或專利申請。
序列表<110>Guo，XiaoliHarriman，RobertLee，LisaNelson，Erick<120>翦股穎事件ASR-368和組合物及其檢測方法<130>11899.0236.PCUS00<150>60/431153<151>2002-12-05<160>14<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>翦股穎基因組DNA和轉基因插入DNA的嵌合DNA<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(24)<223>5’轉基因/基因組連接DNA，翦股穎基因組DNA和轉基因插入DNA的嵌合DNA<400>1gacatatgct taagaagaga gtcg 24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>翦股穎基因組DNA和轉基因插入DNA的嵌合DNA
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(24)<223>3’轉基因/基因組DNA連接，翦股穎基因組DNA和轉基因插入DNA的嵌合DNA<400>2aattcggtac catgtaccac gaac 24<210>3<211>896<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>翦股穎基因組DNA和轉基因插入DNA的嵌合DNA<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(896)<223>5’轉基因/基因組區，翦股穎基因組DNA和轉基因插入DNA的嵌合DNA<400>3aagcgagtat cctgataaga aaggaagaag acgatcgctc tgtctatggg cggggctcag 60ggcgacgaca gaaccagagc tttcgtcgtg aacaaaacag ggaaggacca aagcagagga120agaggagagg aaacagagag aaagaggggg ttggtaggta cttggtggtc cctgctactt180ctccaacagc agcagaaagg aaagaagaac gaaccaaggc acaagtacgc tccaaccgag240ccatcccttt cttcccttta tcattgactt taatcatgag aaatctaatt aattaattaa300actctacgca aaaggcatat aaaattgtca attatgcaag gcagttgccc tgtttctggt360agccggttac aacacaggaa gacaaccaaa agcgtcggaa aagtgagttt agtcgaatct420gaattcaatg tgaaagattt ttgtaaagaa tgaaataaat cccgataaaa aaagaatgaa480caaaaggaaa ctaaaaaact gtggatgtga gtccaacgtt taagcatatc gatgcaaacg540tgatgaagaa ccaaacgcgc cggcggaaga cggattcccg gaagaccaaa ttaaagacga600
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<223>翦股穎基因組DNA和轉基因插入DNA的嵌合DNA<400>4agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt 60aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt 120agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag 180gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc ggggatatcc ccggggaatt 240cggtaccatg taccacggaa cagaaaaaag aaaggcccac ggttgtgcag gaaacggcca 300ccgcgcgagc cagcgcctca cgcctcatcc gccattccgt cgagcacccc gcacgcgccg 360ccgctgctat gctcctccgg ccgcgcccct tcctcctcca ggtcctcacg ccgcttcgct 420cctcccgcgc ccccctcgcg gtccgccgca cgctctcagc gcacgccgcg gcag474<210>5<211>23<212>DNA<213>噬菌體M13<400>5
cgccagggtt ttcccagtca cga 23<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA引物分子<400>6tgacgtatca aagtaccgac aaaaacatcc 30<210>7<211>23<212>DNA<213>噬菌體T7<400>7taatacgact cactataggg cga 23<210>8<211>30<212>DNA<213>匍匐剪股穎<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)<223>ASR-368基因組DNA引物分子<400>8ccttgtttt attttggact atcccgactc30<210>9<211>26<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物分子AP1<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(26)<223>來自Genome Walker的人工引物分子AP1<400>9agattgaatc ctgttgccgg tcttgc 26<210>10<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的引物分子AP2<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<223>來自Genome Walker的人工引物分子AP2<400>10gcggtgtcat ctatgttact agatcggg 28<210>11<211>29<212>DNA<213>匍匐剪股穎<400>11aagcgagtat cctgataaga aaggaagaa29<210>12<211>30<212>DNA<213>秈稻
<400>12aaccgactc aaatacagat atgcatttcc30<210>13<211>25<212>DNA<213>根癌農桿菌<400>13agattgaatc ctgttgcggt cttgc25<210>14<211>21<212>DNA<213>匍匐剪股穎<400>14ctgccgcggc gtgcgctgag a2權利要求
1.命名為ASR-368的翦股穎植物的種子，其是典型的翦股穎植物的種子，以保藏號PTA-4816保藏在ATCC。
2.翦股穎植物ASR-368或其部分，其是由權利要求1所述的種子產生的。
3.權利要求2的翦股穎植物ASR-368或其部分，其包含花粉、胚珠、種子、根或葉。
4.權利要求2的翦股穎植物ASR-368，其進一步包含該植物的子代。
5.權利要求4的翦股穎植物ASR-368，其中，所述翦股穎植物或其子代的基因組包含選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的DNA分子。
6.權利要求5的翦股穎植物ASR-368，其中，所述翦股穎植物是對草甘膦耐受的。
7.權利要求5的翦股穎植物ASR-368，其中，所述DNA分子分離自翦股穎植物ASR-368的基因組。
8.權利要求6的翦股穎植物ASR-368，其包括草皮草植被。
9.權利要求8的翦股穎植物ASR-368，其中所述草皮草用于高爾夫球場。
10.權利要求9的翦股穎植物ASR-368，其中所述高爾夫球場包含綠地、發球區或球道。
11.翦股穎植物或種子，在通過從所述翦股穎植物或種子提取的DNA中產生擴增子的DNA擴增方法進行的檢測中，由其基因組產生用于檢測翦股穎植物ASR-368的擴增子，其中所述擴增子包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO2。
12.權利要求11的翦股穎植物或種子，其中所述擴增子是用選自SEQ ID NO11和SEQ ID NO12、以及SEQ ID NO13和SEQ ID NO14的引物對生產的。
13.特異的用于在樣品中檢測翦股穎事件ASR-368或其子代基因組DNA的DNA檢測試劑盒，其包含具有SEQ ID NO3或SEQ ID NO4或其互補物的至少11個連續核苷酸的分離的DNA引物分子，其中所述DNA引物分子用于具有翦股穎植物ASR-368基因組DNA的DNA擴增方法中時，產生包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的擴增子。
14.權利要求13的DNA檢測試劑盒，包含選自SEQ ID NO11和SEQ ID NO12、或SEQ ID NO13和SEQ ID NO14的經分離的DNA引物分子。
15.權利要求13的DNA檢測試劑盒，其中該試劑盒包含選自著色、遺傳比特分析、焦磷酸測序、熒光偏振、Taqman和分子信標的DNA擴增檢測方法。
16.在樣品中檢測是否存在DNA的方法，所述DNA相應于翦股穎ASR-368DNA該方法包含(a)從翦股穎ASR-368植物或植物部分提取DNA樣品；和(b)使該DNA樣品與DNA引物對接觸；和(c)進行核酸擴增反應，從而產生擴增子；和(d)檢測該擴增子，其中，所述擴增子包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO2。
17.在樣品中檢測是否存在DNA的方法，所述DNA相應于翦股穎ASR-368DNA，該方法包含(a)從翦股穎ASR-368植物或植物部分提取DNA樣品；和(b)使包含DNA的樣品與探針接觸，所述探針在嚴緊雜交條件下與來自翦股穎事件ASR-368的基因組DNA雜交，但不與對照翦股穎植物基因組DNA雜交，該探針與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2同源或互補；和(c)將樣品和探針置于嚴緊雜交條件下；和(d)檢測探針與該DNA的雜交。
18.生產耐受施用的草甘膦除草劑的植物的方法，包含(a)使第一草甘膦耐受的翦股穎植物ASR-368與缺乏對草甘膦除草劑的耐受性的第二親本翦股穎植物有性雜交，從而生產大量第一子代植物；和(b)挑選耐受施用的草甘膦的第一子代植物；和(c)使所述第一子代植物自交，從而生產大量第二子代植物；和(d)從所述第二子代植物挑選草甘膦耐受植物。
19.權利要求18的方法，其進一步包含使草甘膦耐受的第一子代植物或草甘膦耐受的第二子代植物與第二親本植物或第三親本植物回交，從而生產草甘膦耐受的植物。
20.包含草甘膦耐受性狀的翦股穎植物，其中草甘膦耐受性狀與標記物多核苷酸的互補物遺傳性偶聯，所述標記物多核苷酸分子選自SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。
全文摘要
本發明提供翦股穎ASR－368植物和種子。還提供根據DNA序列用于檢測翦股穎ASR－368的存在的方法，和在DNA檢測方法中這些DNA序列作為分子標記物的用途。
文檔編號C12N15/82GK1753615SQ200380109549
公開日2006年3月29日 申請日期2003年12月3日 優先權日2002年12月5日
發明者郭小麗, R·W·哈里曼, L·李, E·K·納爾遜 申請人:孟山都技術有限公司, 斯科茲公司