專利名稱：具有保留的受體結合活性的細胞因子、趨化因子、生長因子、多肽激素及其拮抗劑的聚合 ...的制作方法
背景技術：
本發明是在蛋白質生物化學及藥學和醫學領域中。尤其是，本發明提供用于生產由水溶性聚合物(如聚(乙二醇)及其衍生物)和某些生物活性成分綴合的綴合物的方法，這種綴合物與標準的聚合物-生物活性成分綴合物相比較，具有增加的受體-結合活性。更具體地說，本發明提供用于生產具有非常高受體-結合活性的某些受體-結合蛋白質的聚合物綴合物的方法。本發明也提供由這類方法所生產的綴合物、含這類綴合物的組合物、含這類綴合物和組合物的試劑盒，以及利用該綴合物和組合物來預防、診斷和治療多種醫學和獸醫疾病的方法。
相關技術下列相關技術的描述包括不在現有技術中的本發明者自身的解釋。細胞因子為以內分泌、旁分泌或自分泌方式來控制細胞的生存、生長、分化和/或效應物功能(effector function)的被分泌出的調節性蛋白質(回顧Nicola，N.A.(1994)Guidebook to Cytokinesand Their Receptors，Nicola，N.A.，ed.，pp.1-7，OxfordUniversity Press，New York)。趨化因子為一族結構上相關，具有有效的白細胞活化和/或趨化活性的糖蛋白(回顧Oppenheim，J.J.等，(1997)Clin Cancer Res 32682-2686)。就像其密切相關的物質，多肽激素和生長因子、細胞因子及趨化因子通過結合至其靶細胞表面上的特殊受體蛋白來啟動其調節功能(回顧Kossiakoff，A.A.等，(1998)Adv Protein Chem 5267-108；Onuffer，J.J.等，(2002)Trends Pharmacol Sci 23459-467)。由于其效力、特異性、尺寸較小，和相對容易在重組有機體中生產，因此，細胞因子、趨化因子、生長因子和多肽激素在作為治療劑上有多種可能的用途。
一般而言，兩種關鍵因素阻礙細胞因子，尤其是，重組蛋白在一般作為治療劑上的發展-----其在循環中普遍較短的半衰期，及其潛在的抗原性和免疫原性。此處及本領域中一般所使用的術語″抗原性″是指分子結合到預先存在的抗體的能力，而術語″免疫原性″是指分子在體內激發免疫反應的能力，不論該反應是涉及形成抗體(″體液反應″)或是刺激細胞免疫反應。
在重組的治療性蛋白質的給藥方面，靜脈內(i.v.)給藥通常較適宜用來取得最高的循環活性，并可將生物可利用性及降解問題降至最低。然而，在靜脈內給藥后小分子蛋白質的半衰期通常非常短(參看下列文獻中的實施例Mordenti，J.等，(1991)Pharm Res 81351-1359；Kuwabara，T.等，(1995)Pharm Res 121466-1469)。流體動力學半徑超過血清白蛋白(其具有約36的史托克(Stokes)半徑和約66,000道爾頓(66kDa)的分子量)的蛋白質通常可由健康腎臟保留在血流中。然而，較小的蛋白質，包括細胞因子，如粒細胞集落刺激因子(″G-CSF″)、白介素-2(″IL-2″)、干擾素-α(″IFN-α″)和干擾素-γ(″IFN-γ″)將通過腎小球過濾作用快速地從血流中清除(Brenner，B.M.等，(1978)Am J Physiol 234F455-F460；Venkatachalam.M.A.等，(1978)Circ Res 43337-347；Wilson，G.，(1979)J Gen Physiol 74495-509；Knauf，M.J.等，(1988)J Biol Chem 26315064-15070；Kita，Y.等，(1990)Drug Des Deliv6157-167；Rostaing，L.等，(1998)J Am Soc Nephrol 92344-2348)。結果是，注射后，在循環中維持小分子重組蛋白的治療上有用濃度是有疑問的。因此，一般必須施予更高濃度的這類蛋白質和更頻繁的注射。所產生的劑量方案會增加治療成本，降低患者適應的可能性，并增加不良后果如免疫反應的風險。細胞和體液免疫反應均會降低注入的重組蛋白的循環濃度，以至可能妨礙有效劑量的施予，或可能導致治療-限制性的后果，包括加速清除，藥力失效和過敏性反應(Ragnhammar，P.等，(1994)Blood 844078-4087；Wadhwa，M.等，(1999)Clin Cancer Res 51353-1361；Hjelm Skog，A.-L.等，(2001)Clin Cancer Res 71163-1170；Li，J.等，(2001)Blood 983241-3248；Basser，R.L.等，(2002)Blood 992599-2602；Schellekens，H.(2002)Clin Ther 241720-1740)。
通過共價連接聚(乙二醇)(″PEG″)的重組蛋白的修飾已被廣泛研究，以用作對付上述缺點的方法(回顧見Sherman，M.R.等，(1997)Poly(ethylene glycol)Chemistry and Biological Applications，Harris，J.M.等，eds.，pp.155-169，American Chemical Society，Washington，D.C.；Roberts，M.J.等，(2002)Adv Drug Deliv Rev.54459-476)。將PEG附著至蛋白質顯示出可穩定蛋白質，改善其體內的生物可利用性和/或降低其免疫原性。(將PEG共價連接至蛋白質或其它底物在本文中以及本領域中熟知為″聚乙二醇化″)。另外，聚乙二醇化可顯著增加蛋白質的流體動力半徑。當小分子蛋白質，如細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素偶聯至PEG(如所具有的分子量至少約18kDa)的單一長鏈時，所產生的綴合物的流體動力學半徑超過血清白蛋白，且其通過腎小球從循環中清除的速率顯著減緩。聚乙二醇化的聯合效果(降低蛋白質水解、降低免疫識別及降低腎臟清除速率)賦予作為治療劑的聚乙二醇化的蛋白質多種優點。
自1970年代起，已有許多努力去采用共價連接聚合物來改善用于藥學用途的不同蛋白質的安全性和有效性(見，如，Davis，F.F.，等，U.S.Patent No.4,179,337)。一些實施例包括將PEG或聚(氧乙烯)(″PEO″)偶聯至腺苷脫胺酶(EC3.5.4.4)，以用來治療嚴重的聯合免疫缺陷癥(Davis，S.等，(1981)Clin Exp Immunol 46649-652；Hershfield，M.S.等，(1987)N Engl J Med 316589-596)，偶聯至超氧化物歧化酶(EC1.15.1.1)，以治療發炎狀態(Saifer，M.等，U.S.Patent Nos.5,006,333和5,080,891)，及偶聯至尿酸氧化酶(EC1.7.3.3)，以從血液和尿液中排除過量的尿酸(Kelly，S.J.等，(2001)J Am Soc Nephrol 121001-1009；Williams，L.D.等，PCTPublication No.WO 00/007629 A2和A3及U.S.Patent No.6,576,235；Sherman，M.R.等，PCT Publication No.WO 01/59078A2)。
PEOs和PEGs是由共價連接的氧乙烯單位所組成的聚合物。這些聚合物具有下列的一般結構R1-(OCH2CH2)n-R2其中R2可為羥基基團(或其反應性衍生物)，而R1可為氫(如在二羥基PEG(″PEG二醇″)中)、甲基基團(如在單甲氧基PEG(″mPEG″)中)、或另一低級烷基(如在異丙氧基PEG或叔丁氧基PEG中)。在PEG的一般結構中的變量n表示在聚合物中的氧乙烯單位的數量，而此處和本領域中是指″聚合化程度″。具相同的一般結構的聚合物(其中R1為C1-7烷基團)也曾表示為環氧乙烷衍生物(Yasukohchi，T.等，U.S.Patent No.6,455,639)。PEG和PEO可是線性、分支(Fuke，I.等，(1994)J Control Release 3027-34)或星形(Merrill，E.W.(1993)J.Biomater Sci Polym Ed 51-11)。PEG和PEO為兩親性分子，也就是其可溶于水和某些有機溶劑中，且其可黏附至含脂的物質上，包括有包膜病毒，及動物和細菌細胞的細胞膜。某些具有下列結構 的氧乙烯(OCH2CH2)和氧丙烯的隨機、或嵌段或交替性的共聚物具有充分類似于PEG所具的性質，在某些應用中，這些共聚物被認為是PEG的合適的替代物(見，如Hiratani，H.，U.S.PatentNo.4,609,546和Saifer，M.等，U.S.Patent No.5,283,317)。此處所使用的術語″聚環氧烷″和縮寫″PAOs″一詞是指這類共聚物，以及PEGs或PEOs，和聚(氧亞乙基-氧亞甲基)共聚物(Pitt，C.G.等，U.S.Patent No.5,476,653)。此處所使用的″聚亞烷基二醇″和縮寫″PAGs″一般是指適合用于本發明綴合物中的聚合物，尤其是PEGs，更特別是含單一反應基團的PEGs(″單功能性活化的PEGs″)。
將PEG或其它聚環氧烷共價連接至蛋白質需要將至少一個聚合物的末端基團轉化成反應性功能基團。此過程常稱為″活化″，產物被稱為″活化的PEG″或活化的聚環氧烷。這類方法最常使用單甲氧基PEGs(其中在一端的氧被一個未反應的、化學上穩定的甲基團加帽(以產生″甲氧基″)，而另一端具有一個與蛋白質分子氨基基團反應的官能基團)。稱為″分支性″的mPEGs(其含有遠離單一活化的官能團的二或多個甲氧基)較不常被使用。二-mPEG-賴氨酸是分支PEG的一個實例，其中PEG偶聯至兩個氨基，而賴氨酸的羧基最常通過N-羥基琥珀酰亞胺的酯化反應來活化(Martinez，A.等，U.S.Patent No.5,643,575；Greenwald，R.B.等，U.S.Patent No.5,919,455；Harris，J.M.等，U.S.Patent No.5,932,462)。
通常，活化的聚合物與具有親核性官能基(作為附著部位)的生物活性化合物反應。一種常作為附著部位的親核性官能基為賴氨酸殘基的ε氨基。溶劑易接近的α-氨基、羧酸基團、胍基團、咪唑基團、經適當活化的羰基團、氧化的糖部分和硫醇基團也用作附著部位。
PEG的羥基在連接蛋白質前已通過氰尿酰氯活化(Abuchowski，A.，等，(1977)J Biol Chem 2523582-3586；Abuchowski，A.，等，(1981)Cancer Treat Rep 651077-1081)。然而，該方法在使用上有缺點，如氰尿酰氯有毒性，且其對具有除了氨基類之外的官能基(如對功能而言為必要的溶劑易接近的半胱氨酸或酪氨酸殘基)的蛋白質具有非特異的反應性。為了克服這些及其它缺點，此方法已引入替換的活化的PEGs，如PEG的琥珀酰亞氨基琥珀酸酯衍生物(″SS-PEG″)(Abuchowski，A.，等，(1984)Cancer Biochem Biophys7175-186)，PAG的琥珀酰亞氨基碳酸酯衍生物(″SC-PAG″)(Saifer，M.，等，U.S.Patent No.5,006,333)和PEG的醛衍生物(Royer，G.P.，U.S.Patent No.4,002,531)。
通常，一個或多個PAGs的幾條(如5-10)鏈(如分子量為約5kDa至約10kDa的一個或多個PEGs)通過伯氨基基團(賴氨酸殘基的ε氨基酸，以及可能的氨基酸氨基端(″N-端″)的α氨基團)偶聯至靶蛋白質。最近，已合成含有更高分子量(如12kDa、20kDa或30kDa)的單鏈m PEG的綴合物。綴合物的血漿半衰期與增加的分子量和/或增加的偶聯的PEG鏈數間的直接相關性已被證實(Knauf，M.J.，等，同上；Katre，N.V.(1990)J Immunol 144209-213；Clark，R.，等，(1996)J Biol Chem 27121969-21977；Leong，S.R.，等，(2001)Cytokine 16106-119)。另一方面，偶聯至蛋白質各分子的PEG鏈數增加時，在蛋白質的必要區中的氨基團被修飾的機率也增加，這暗示該蛋白質的生物功能將減弱，尤其是當它是一種受體-結合蛋白質時。對含有許多氨基團的較大蛋白質，及具有低分子量底物的酶而言，由于在體內的含PEG的綴合物的生物活性凈增加，因此在增加的作用期與降低的特異活性間的平衡是可接受的。然而，在那些通過與細胞-表面受體的相互作用來發生作用的較小蛋白質(如細胞因子、趨化因子、生長因子和多肽激素)方面，已有報告表示相當高度的取代反應會將功能活性降低到甚至抹滅其在血流中的半衰期延長的優點的程度(Clark，R.，等，同上)。
因此，聚合物綴合作用是一種建立完善的用于延長治療性蛋白質(如酶)的生物活性和降低其免疫活性的技術(見，如2002年12月26日提出的U.S.臨時申請案60/436,020號和2003年6月20日提出的U.S.臨時申請案60/479,913號和60/479,914號，其公開內容全文引入作為本文的參考文獻)。然而，聚合物綴合至通過特異結合到細胞-表面受體而作用的受體-結合蛋白質上，通常會1)干擾這類結合；2)明顯削減細胞因子、趨化因子、生長因子及多肽激素激動劑的信號轉導效力；及3)明顯削減細胞因子、趨化因子、生長因子及多肽激素拮抗劑的競爭效力。已發表的這類具有削減的受體-結合活性的綴合物的實例包括人生長激素(″hGH″)(Clark，R.，等，同上)，尤其是hGH拮抗劑(Ross，R.J.M.，等，(2001)J Clin EndocrinolMetab 861716-1723；IFN-α(Bailon，P.，等，(2001)BioconjugChem 12195-202；Wylie，D.C.，等，(2001)Pharm Res 181354-1360；Wang，Y.-S.，等，(2002)Adv Drug Deliv Rev 54547-570)和G-CSF(Kinstler，O.，等，PCT申請案WO 96/11953號；Bowen，S.，等，(1999)Exp Hematol 27425-432)的聚合物綴合物。在一特殊案例中，將聚合物偶聯至白介素-15(″IL-15″)可將此類似IL-2的生長因子轉化成一種細胞增殖抑制劑(Pettit，D.K.，等，(1997)J Biol Chem 2722312-2318)。不欲受限于理論，這類不利的聚乙二醇化效果的機制可能涉及龐大的PEG基團、電荷中和，或此二者對受體相互作用所造成的空間阻礙。
因此，需要有方法生產保留大致的生物活性(如至少約40％)、接近完整的生物活性(如至少約80％)或實質上完整的生物活性(如至少約90％)的含PAG(如含PEG和/或含PEO)的綴合物(尤其是這類水溶性聚合物和受體-結合蛋白質之間的綴合物)。這類綴合物可取得由聚合物成分所提供的增加溶解度、穩定性、體內半衰期及生物可利用性的益處，且與傳統的聚合物綴合物相比較下，以預防、治療或診斷為目的而引入動物體內的該綴合物將顯現出實質增加的效力或用途。
發明簡述本發明解決了上述需要，并提供用于制備水溶性聚合物(如聚(乙二醇)，及其衍生物)與生物活性成分，尤其是受體-結合蛋白質，特別是治療性或診斷用的生物活性成分(如細胞因子、趨化因子、多肽激素及多肽生長因子)的綴合物的方法。本發明也提供由這類方法制備的綴合物。與相對應的未綴合的生物活性成分相比，本發明的綴合物具有增加的穩定性(也就是在活體內保存較久，半衰期較長)。另外，與那些由相同的生物活性成分和任意附著在沿多肽鏈的溶劑-易接近位置上的聚合物鏈制備出的綴合物相比較，本發明的綴合物具有增加的受體-結合活性(其可在體外測量或使用)，及增加的體內效力。本發明也提供這類改善的綴合物來用于工業細胞培養中。再者，本發明提供含有這類綴合物的組合物、含有這類綴合物和組合物的試劑盒，及該綴合物和組合物在多種預防、診斷及治療方案中應用的方法。
在一種實施方案中，本發明提供用于保存細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素的受體-結合效力的方法，其包含將一種或多種合成的水溶性聚合物選擇性地偶聯至細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素，或其拮抗劑的氨基端氨基酸，其中所述氨基端氨基酸位于遠離細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素，或其拮抗劑的一個或多個受體-結合結構域的位置處。在一種相關的實施方案中，本發明提供用于保存細胞因子、趨化因子、生長因子及多肽激素或其拮抗劑的受體-結合效力的方法，其包含將一種或多種合成的水溶性聚合物選擇性地偶聯至或接近于細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素或其拮抗劑的一個或多個糖基化位置處，其中所述一個或多個糖基化位置位于細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素的一個或多個受體-結合結構域的遠端。
適合用于本發明這些方法中的聚合物包括但不限于，一種或多種聚亞烷基二醇(包括但不限于，一種或多種聚(乙二醇)、一種或多種單甲氧基聚(乙二醇)及一種或多種單羥基聚(乙二醇))、一種或多種聚環氧烷、一種或多種聚環氧乙烷、一種或多種聚乙烯醇類(如聚乙烯醇)、一種或多種聚羧酸酯、一種或多種聚(乙烯基吡咯烷酮)、一種或多種聚(氧亞乙基-氧亞甲基)、一種或多種聚(氨基酸)、一種或多種聚丙烯酰嗎啉、一種或多種酰胺類和一種或多種烯化氧的一種或多種共聚物、一種或多種葡聚糖及一種或多種透明質酸類。適合用于本發明方法中的聚合物的分子量通常介于約1kDa和約100kDa之間(包含端值)，或更特別的為介于約1kDa和約5kDa之間(包含端值)；介于約10kDa和約20kDa之間(包含端值)；介于約18kDa和約60kDa之間(包含端值)；介于約12kDa和約30kDa之間(包含端值)；或約10kDa、約20kDa或約30kDa。
多種細胞因子、趨化因子、生長因子和多肽激素(和模擬(也就是激動)或拮抗相對應的細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素的生物效應(這是通過其特異性細胞-表面受體介導)的類似物)均適合用來制備本發明的綴合物。這些包括具有四個螺旋束結構的細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素(包括但不限于，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白血病抑制因子(LIF)、紅細胞生成素(EPO)、血小板生成素(Tpo)、干細胞因子(SCF)、Flt3配體、制瘤素M(OSM)、白介素-2(IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12(p35亞基)、IL-13、IL-15、IL-17、干擾素α(IFN-α)、干擾素β(IFN-β)(包括IFN-β-1b)、共有(concensus)干擾素、催乳素和生長激素、及其突變蛋白、變異體、類似物和衍生物)；具有β-折疊或β-圓筒結構的細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素(包括但不限于，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1α、IL-1β、IL-12(p40亞基)、IL-16、表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子1(IGF-1)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、酸性FGF、FGF-4及角質細胞生長因子(KGF；FGF-7)，及其突變蛋白、變異體、類似物和衍生物)；具有混合的α/β結構的細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素(包括但不限于，嗜中性白細胞活化肽-2(NAP-2)、基質細胞-衍生因子-1α(SDF-1α)、IL-8、單核細胞化學引誘蛋白-1(MCP-1)、MCP-2、MCP-3、嗜伊紅趨化素(eotaxin)-1、嗜伊紅趨化素-2、嗜伊紅趨化素-3、RANTES、髓細胞祖代抑制因子-1(myeloid progenitor inhibitory factor-1)(MPIF-1)、神經趨化素、巨噬細胞移動抑制因子(MIF)和GRO/黑色素瘤生長刺激活性(GRO-α/MGSA)，及其突變蛋白、變異體、類似物和衍生物)。適合用于本發明中的多肽激素包括但不限于，胰島素和可模擬或拮抗由胰島素受體介導的胰島素生物效應的胰島素類似物；催乳素和可模擬或拮抗由催乳素受體介導的催乳素的生物效應的催乳素類似物；及生長激素(尤其是人生長激素)和可模擬或拮抗由生長激素受體介導的生長激素的生物效應的生長激素類似物。
特別優選的適合根據本發明而應用的細胞因子、趨化因子、生長因子及多肽激素包括IL-2；IL-10；IFN-α；IFN-β(包括IFN-β-1b)；TNF-α；IGF-1；EGF；bFGF；hGH；催乳素和胰島素。特別合適者還有前述細胞因子、趨化因子、生長因子及多肽激素的競爭性拮抗劑，如TNF-α、hGH或催乳素，及這些細胞因子、趨化因子、生長因子和多肽激素的突變蛋白、變異體和衍生物的拮抗劑。
在某些實施方案中，一種或多種聚合物共價偶聯(尤其是通過仲胺的連接)至細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素的氨基端的氨基酸的α氨基團。在其它實施方案中，一種或多種聚合物共價偶聯至細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素的氨基端氨基酸的化學活性側鏈基團(如羥基、巰基、胍基、咪唑基、氨基、羧基或醛衍生物)。在額外的實施方案中，聚合物在氨基端氨基酸或者是在或接近一個或多個糖基化位置處，偶聯至細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素，可模擬細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素糖基化的有利效果。在相關實施方案中，聚合物在或接近細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素上的一個或多個糖基化位置偶聯至細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素，可模擬細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素過糖基化的有利效果，其中″過糖基化″表示除了存在于天然結構中的那些外，共價連接簡單或復雜的碳水化合物部分。
本發明也提供由本發明方法所制備的綴合物。本發明的綴合物含有偶聯至一種或多種合成的水溶性聚合物(如上述者)的選出的細胞因子、選出的趨化因子、選出的生長因子、選出的多肽激素或選出的其拮抗劑(如上述者)，其中所述一種或多種聚合物是偶聯至細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素的氨基端氨基酸上，其中所述氨基端氨基酸是位于遠離該選出的細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素的一個或多個受體-結合結構域的位置處。另外，本發明的綴合物含有偶聯至一種或多種合成的水溶性聚合物(如上述者)的選出的細胞因子、選出的趨化因子、選出的生長因子、選出的多肽激素或選出的其拮抗劑(如上述者)，其中所述一種或多種聚合物是偶聯至細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素，或其拮抗劑的一個或多個糖基化位置處，其中所述一個或多個糖基化位置是位于遠離該細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素，或其拮抗劑的一個或多個受體-結合結構域的位置處。在本發明的激動劑的聚合物綴合物方面，優選聚合物附著的位置遠離所有受體-結合結構域。在本發明的某些拮抗劑的聚合物綴合物方面，也許優選聚合物結合位置遠離某些為發生結合所必需的受體-結合結構域，但不必遠離所有為由激動劑信號轉導所必需的受體-結合結構域。本發明也提供含有一種或多種本發明的綴合物，及一種或多種其它成分(如一種或多種藥學上可接受的稀釋劑、賦形劑或載體)的組合物，尤其是藥物組合物。本發明也提供含有一種或多種本發明的綴合物、組合物和/或藥物組合物的試劑盒。
本發明也提供對患有身體疾病或易患身體疾病的動物(例如哺乳動物，如人類)進行預防、診斷，或治療其身體疾病的方法。這類方法可包含，例如，施予該動物有效量的一種或多種本發明的綴合物、組合物和/或藥物組合物。適合根據本發明這類方法治療或預防的身體疾病，包括但不限于，癌癥(如乳腺癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、肺癌、白血病、淋巴癌、結腸癌、胃腸癌、胰癌、膀胱癌、腎癌、骨癌、神經癌、頭頸部癌、皮膚癌、肉瘤、腺癌、惡性瘤及骨髓瘤)；感染性疾病(如細菌病、真菌病、寄生蟲病和病毒病如病毒性肝炎，由親心性病毒(cardiotropic Virus)引起的疾病；HIV/AIDS與類似疾病))；及遺傳病(如貧血、嗜中性白細胞減少癥、血小板減少癥、血友病、侏儒病及嚴重的聯合免疫缺陷癥(″SCID ″)；自體免疫癥(如牛皮癬、系統性紅斑性狼瘡和類風濕性關節炎)和神經變性疾病(如不同形式和階段的多發性硬化癥、克-雅病、阿爾茲海默氏癥和類似病癥)。
一般技術人員在參考本發明下列的圖形和說明以及權利要求后，將可清楚本發明的其它優選實施方案。
插圖簡述
圖1至圖8顯示以RasMol軟件(Sayle，R.A.等，(1995)TrendsBiochem Sci 20374-376)，根據結晶學資料所創造出的不同細胞因子和生長因子的分子模型。除了某些特別有意義的殘基外(以″球-和-棒″版式表示)，每一模型是以″絲帶″或″動畫(cartoon format)″版式來表達。這些版式是利用RasMol軟件選出的選項。帶狀物的暗色部分代表細胞因子和生長因子中被描述為參與結合其受體的結構域。圖中指出各結構在蛋白質數據庫(″PDB″)中的登錄號(見Laskowski，R.A.，(2001)Nucleic Acids Res 29221-222；Peitsch，M.C.，(2002)Bioinformatics 18934-938；Schein，C.H.，(2002)Curr Pharm Des82113-2129)。
圖1a顯示干擾素-α-2a(SEQ ID NO1)的模型，其中四個被描述為是羅氏(Roche′s)PEG-干擾素產物PEGASYS中的主要聚乙二醇化位置處的賴氨酸殘基(Lys31、Lys121、Lys131和Lys134)是以″球-和-棒″版式顯示(根據上述Bailon，P.，等的資料)。參與結合其受體的區域(″結合位置1和2″)已被鑒定出。四個被描述為在PEGASYS中被聚乙二醇化的賴氨酸殘基全都在結合位置1的區域中(PDB代碼1ITF)。
圖1b顯示干擾素-α-2b(SEQ ID NO2)的模型，其中被描述為是先靈-普洛(Schering-Plough)的PEG-INTRON中的主要聚乙二醇化位置的殘基(His34、Lys31、Lys121、Tyr129和Lys131)是以″球-和-棒″版式顯示(根據上述Wylie，D.C.，等的資料)。這些氨基酸殘基均在結合位置1的區域中。
圖1c顯示干擾素-α-2b的模型，其中氨基端的半胱氨酸殘基(″Cys1″)(其為根據本發明的聚乙二醇化作用的靶)是以″球-和-棒″版式顯示。Cys1遠離結合位置1和2。
圖1d顯示與圖1c圖示相同的干擾素-α-2b的模型，在N-端半胱氨酸殘基(″Cys1″)上已連接一條20-kDa PEG的單鏈。PEG的結構應用Lee，L.S.，等((1999)Bioconjug Chem 10973-981)所描述的程序產生，并使其與蛋白質具相同大小。
圖2顯示人干擾素-β-1a(SEQ ID NO3)的分子模型，其中指出數個位于受體結合結構域內或與其相鄰的賴氨酸殘基(Lys19、Lys33、Lys99和Lys134)。另外，糖基化位置(Asn80)和N-端甲硫氨酸殘基(″Met1″)是以″球-和-棒″版式顯示(根據Karpusas，M.，等，(1997)Proc Natl Acad Sci USA 9411813-11818；Karpusas，M.，等，(1998)Cell Mol Life Sci 541203-1216；Runkel，L.，等，(2000)Biochemistry 392538-2551的資料)。Met1遠離結合位置1和2，但數個賴氨酸殘基均位于受體結合結構域內。(PDB代碼1AUI)。干擾素-β-1b與干擾素-β-1a的結構不同處在于其缺少N-端甲硫氨酸殘基及碳水化合物部分，以及具有一個取代未成對的半胱氨酸殘基(Cys17)的絲氨酸殘基。
圖3顯示人類粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(″GM-CSF″，SEQ IDNO5)的分子模型，其中三個在受體結合結構域的賴氨酸殘基(Lys72、Lys107和Lys111)以及可在結晶結構中看到的接近氨基端的第一個氨基酸殘基(″Arg4″)是以″球-和-棒″版式顯示(根據Rozwarski，D.A.，等(1996)Proteins 26304-313的資料)。GM-CSF的氨基端區域遠離結合位置1和2。(PDB代碼2GMF)。
圖4顯示人白介素-2(″IL-2″，SEQ ID NO6)的分子模型，其中被描述為牽涉到所有三種受體(α、β和γ)的氨基酸殘基是以″球-和-棒″版式顯示，如在受體結合結構域或接近此結構域的數個賴氨酸殘基。可在結晶結構中看到的最接近氨基端的氨基酸殘基為遠離受體結合結構域的絲氨酸6(″Ser6″)，(根據Bamborough，P.，等，(1994)Structure 2839-851；Pettit，D.K.，等，如上述的資料)。(PDB代碼3INK)。
圖5顯示以″動畫″版式表示的人表皮生長因子(″EGF；″SEQ IDNO7)的分子模型，但涉及受體結合的殘基，及鄰近受體結合區的兩個賴氨酸(Lys28和Lys48)除外。鏈內二硫鍵以虛線顯示。根據此模型，可在此結晶結構中看到的最接近氨基端的氨基酸殘基為半胱氨酸6(″Cys6″)(根據Carpenter，G.，等，(1990)J Biol Chem 2657709-7712；Lu，H.-S.，等，(2001)J Biol Chem 27634913-34917的資料)。結晶結構中看不到的EGF氨基端的彈性部分(殘基1-5)并未顯示出是在受體結合區內(PDB代碼1JL9)。
圖6顯示以″動畫″版式來表示的堿性成纖維細胞生長因子(″bFGF；″SEQ ID NO8)的分子模型，其中涉及結合到受體及結合到肝素的殘基是通過″球-和-棒″版式來確認(根據Schlessinger，J.，等，(2000)Mol Cell 6743-750的資料)。從氨基端開始的前12個氨基酸殘基并未牽涉到受體結合(PDB代碼1FQ9)。
圖7顯示以″動畫″版式來表示的胰島素樣生長因子-1(″IGF-1″；SEQ ID NO9)的分子模型，但涉及受體結合的殘基(23-25和28-37)，及谷氨酸殘基3(″Glu3″)(其是結晶結構中可看到的最接近氨基端的氨基酸殘基)除外。鑒別了兩個賴氨酸殘基，其中之一(Lys27)是鄰近受體-結合結構域，另一個則遠離受體-結合結構域(根據Brzozowski，A.M.，等，(2002)Biochemistry 419389-9397的資料)。IGF-1的氨基端是遠離受體-結合結構域。(PDB代碼1GZR)。
圖8顯示干擾素γ(″IFN-γ；″SEQ ID NO4)的分子模型，其為同型二聚體。為了澄清兩種多肽鏈間的相互作用，單體之一(″鏈A″)是以″絲帶″版式顯示，另一(″鏈B″)則以″骨架″版式顯示。賴氨酸殘基(以亮的″球和棒″版式顯示)是沿著多肽鏈(包括牽涉到單體間的界面的區域，或鄰近涉及受體結合的氨基酸殘基的區)產生。IFN-γ的氨基端區域遠離二聚體化界面，但谷氨酰胺1(Gln1)已涉及受體結合(Thiel D.J.，等，(2000)Struchture 8927-936；PDB代碼1FG9)。
圖9顯示未聚乙二醇化的干擾素-α-2b(″IFN″)、單聚乙二醇化的干擾素-α-2b(″PEG1-IFN″)和二聚乙二醇化的干擾素-α-2b(″PEG2-IFN″)通過將含IFN，20kDa mPEG-醛和還原劑的反應混合物進行陽離子-交換層析而分離的結果。
圖10顯示對如圖9所示而分離的反應混合物，及從離子交換柱收集的選出的分離物(其結果顯示于圖9中)進行的大小-排阻層析分析。
圖11顯示將含人IL-2，20-kDa mPEG-醛和還原劑的反應混合物進行陽離子-交換層析的分離結果。在指示的洗脫條伴下，不像圖9所示的干擾素-α-2b的結果，殘余的未聚乙二醇化的IL-2并未從柱上洗脫出。
圖12顯示對如圖11所示分離的反應混合物，及從那根柱上洗脫出的選出的分離物進行的大小-排阻層析分析。
圖13顯示聚乙二醇化的干擾素-2(″PEG-IL-2″)和從陽離子交換柱收集的分離物(其層析圖顯示于圖11中)的反應混合物的電泳分析。
發明詳述除非另外定義，否則此處使用的所有技術和科學名詞與本發明的技術領域中一般技術人員所普遍理解的意思相同。雖然類似或等價于此處所描述的那些類型的任何方法和物質均可用來執行或測試本發明，但優選的方法和物質描述于下。
定義約當本文中用來指任何數值時，″約″一詞是指所陳述的數值±10％的值(如″約50℃″是包含從45℃至50℃(包括端值)的溫度范圍；類似地，″約100mM″是包含從90mM至110mM(包括端值)的濃度范圍。
氨基酸殘基此處所使用的″氨基酸殘基″一詞是指一種特定氨基酸，其通常因參與到兩個肽鍵、參與到多肽骨架或側鏈而脫水，但也指氨基酸參與到一個肽鍵如發生在線性多肽鏈的每一端。氨基酸殘基通過本領域中常用的三字代碼或單字代碼來表示。
拮抗劑此處所使用的″拮抗劑″一詞是指一種化合物、分子、部分或復合物，其對于指定的細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素通過指定的細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素的受體介導的生物學和/或生理學效應，可實質性地降低或完全抑制。拮抗劑可以多種方式行使此類效果，包括但不限于，與激動劑競爭在細胞表面上的結合位置或受體；以降低、充分降低或抑制激動劑結合到細胞表面受體的能力的方式來與激動劑相互作用；結合到細胞表面受體并誘發其構象變化，以使受體呈現一種激動劑不再結合(或僅能以減低或充分減低的親和力和/或效力結合)的結構；在細胞、組織或有機體中誘發生理學變化(如增加胞內信號傳遞復合物，增加轉錄抑制劑，降低細胞表面配體受體的表達等)以使激動劑的結合或激動劑結合至細胞所誘導的生理信號降低、充分降低或完全抑制；及本領域中一般技術人員所熟知的拮抗劑實現其活性的其它機制。如本領域中一般技術人員所知，拮抗劑可能與其所拮抗的配體具有類似結構(例如，拮抗劑可能為激動劑的突變蛋白、變異體、片段和衍生物)，或可能具有完全無關的結構。
生物活性成分此處所使用的″生物活性成分″一詞是指在體內、體外或離體對細胞、組織、或有機體具有特殊生物活性，且可結合到一種或多種聚亞烷基二醇以形成本發明的綴合物的化合物、分子、部分或復合物。優選的生物活性成分，包括但不限于，蛋白質和多肽類，例如本文中所描述的類型。
結合此處所使用的″結合″一詞是指可以是共價(如以化學方式偶聯)，或非共價(如離子性相互作用、疏水性相互作用、氫鍵等)的結合或連接。共價鍵可以是，例如酯、醚、磷酸酯、硫酯、硫醚、氨基甲酸乙酯、酰胺、胺、肽、二酰亞胺、腙、酰肼、碳-硫鍵、碳-磷鍵和類似物。″結合″一詞包含″偶聯″、″綴合″和″連接″的意義且更廣義。
綴合物/綴合作用此處所使用的″綴合物″一詞是指聚合物(如PEG或PEO)共價連接到生物活性成分(如蛋白質或糖蛋白)的產物。″綴合作用″是指形成如前句所定義的綴合物的反應。任何本領域中的技術人員所常用于將聚合物綴合至生物活性物質的方法均可用于本發明中。
偶聯的此處所使用的″偶聯的″一詞是指通過共價鍵或強的非共價相互作用的連接，典型且優選的情況為通過共價鍵連接。任何本領域技術人員所常用于偶聯生物活性物質的方法均可用于本發明中。
細胞因子/趨化因子此處所使用的″細胞因子″一詞定義為可控制細胞的存活、生長、分化和/或效應子功能，而以內分泌、旁分泌或自分泌方式分泌出的調節性蛋白質(回顧Nicola，N.A.，如上述；Kossiakoff，A.A.等，如上述)。類似地，此處所使用的″趨化因子″一詞定義為結構上相關、具有白細胞活化功效和/或趨化活性的糖蛋白家族中的一員(回顧Oppenheim，J.J.，等，如上述)。根據這些定義，細胞因子和趨化因子包括白介素、集落刺激因子、生長因子及其它由不同細胞所生產的肽因子，包括但不限于此處所具體公開或示范的那些類型。如同其相近的類似物，多肽激素和生長因子，細胞因子和趨化因子通過結合至在其靶細胞表面上的特殊受體蛋白質來起動其調節功能。
疾病、障礙、病癥此處所使用的″疾病″或″障礙″一詞是指上述任何人類或動物的不良狀態，包括腫瘤、癌癥、過敏、成癮、自體免疫、感染、中毒或對理想的精神或生理功能的損傷。此處所使用的″病癥″一詞包括疾病和障礙，但也指生理狀態。例如，生育力為一種生理狀態而非疾病或障礙。因此，適合通過降低生育力來預防懷孕的本發明組合物可被描述成處理一種病癥(生育力)，而非治療障礙或疾病。其它病癥為本領域中一般技術人員所了解。
有效量此處所使用的″有效量″一詞是指為了實現所期望的生物效應所需或足夠的給定綴合物或組合物的量。本發明的給定綴合物或組合物的有效量是可達到此選擇結果的量，且這類量可由本領域中技術人員利用本領域中已知和/或此處所描述的分析進行常規性的測定，而不需過多的實驗。例如用于治療免疫系統缺陷的有效量可為在暴露至抗原時能引起免疫系統活化，以發展出抗原-特異性免疫反應所需要的量。此名詞也與″足夠量″同義。用于任何特殊應用的有效量可根據下列因素而有不同處理的疾病或病癥、施予的特定組合物、給藥途徑、個體的尺寸，和/或疾病或病癥的嚴重程度。本領域中一般技術人員可根據經驗來測定本發明的特定綴合物或組合物的有效量，而不需過多的實驗。
一(one、a或an)除非另外指出，本公開內容中所使用的″一″詞是指″至少一″或″一或多″。
PEG此處所使用的″PEG″包括所有氧乙烯的聚合物，不論其為直鏈型、或支鏈型、或多臂型，也不論其為末端加帽型或羥基終結型。本領域使用于氧乙烯聚合物的其它名字中，″PEG″包括那些本領域中已知為聚(乙二醇)、甲氧基聚(乙二醇)、或mPEG、或聚(乙二醇)單甲醚、烷氧基聚(乙二醇)、聚(環氧乙烷)、或PEO、α-甲基-ω-羥基-聚(氧-1，2-乙二基)和聚環氧乙烷的聚合物。
聚乙二醇化作用、聚乙二醇化的及莫克(Mock)聚乙二醇化的此處所使用的″聚乙二醇化作用″一詞是指任何用來將PEG共價偶聯至生物活性靶分子，尤其是受體-結合蛋白質的過程。由此產生的綴合物稱為″經聚乙二醇化的″。此處所使用的″經莫克聚乙二醇化的″一詞是指在聚乙二醇化反應混合物中，沒有共價連接PEG的蛋白質部分或其它生物活性成分。然而，經莫克聚乙二醇化的產物可能在反應或接下去的純化步驟中被改變，如在通過還原性烷基化作用進行聚乙二醇化的期間，因暴露在還原劑中所造成的結果，和/或在處理和/或純化步驟時去除一種或多種抑制劑、化合物，等所造成的結果。
多肽此處所使用的″多肽″一詞是指通過酰胺鍵(也稱為肽鍵)以線性方式連接的單體(氨基酸)所組成的分子。它是指一種氨基酸的分子鏈，而非指特定長度的產物。因此，肽類、二肽類、三肽類、寡肽類和蛋白質均包括在多肽的定義內。此名詞也指多肽的表達后修飾的產物，如糖基化、過糖基化、乙酰基化、磷酸化作用和類似物。多肽可從天然來源衍生，或通過重組技術產生，但不一定是從指定的核酸序列翻譯而來。它也許以任何方式產生，包括通過化學合成產生。
蛋白質和糖蛋白此處所使用的蛋白質一詞通常是指其大小大于約10或更多氨基酸，20或更多氨基酸，25或更多氨基酸，50或更多氨基酸，75或更多氨基酸，100或更多氨基酸，200或更多氨基酸，500或更多氨基酸，1000或更多氨基酸，或2000或更多氨基酸的多肽。蛋白質一般具有限定的三維結構，雖然并不必然具有這種結構，且與肽類和多肽類相反(其通常不會擁有限定的三維結構，而是采取大量不同構象，并稱為未折疊的結構)，蛋白質的結構通常稱為折疊結構。然而，肽類也可有限定的三維結構。此處所使用的″糖蛋白″一詞是指與至少一個碳水化合物部分偶聯的蛋白質，該碳水化合物部分通過氨基酸殘基(如絲氨酸殘基或天門冬酰胺殘基)的含氧或含氮側鏈附著至蛋白質。
遠離此處所使用的″遠離″(如在″遠離N-端氨基酸″或″遠離糖基化位置″中)一詞是指一種結構，其中通過分子建模評估，在蛋白質上的一種或多種聚合物的一個或多個附著位置是位于該蛋白質的一個或多個受體-結合區或結構域的遠端，或與其有空間上的相隔。聚合物在這類遠端附著部位(對于受體-結合蛋白質，通常為N-端氨基酸，其因此被稱為″遠離N-端″或″RN″受體-結合蛋白質)，或在糖蛋白上的一個或多個碳水化合物部分或糖基化位置(對于受體-結合蛋白質，其因此被稱為″遠端糖基化″或″RG″受體-結合蛋白質)的綴合作用不會對其受體造成蛋白質結合的實質空間遮蔽。因此，當一水溶性聚合物分別綴合(如共價連接)至氨基端氨基酸或糖基化位置而不會實質上干擾細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素結合到其受體，尤其是細胞表面受體的能力時，在細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素上的氨基端氨基酸或糖基化位置可說成是″定位于遠離細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素的一個或多個受體-結合結構域″。當然，指定的細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素可含有超過一個受體-結合結構域。在這種情況中，細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素的氨基端氨基酸或糖基化位置可位于遠離一個或多個這類結構域的位置上，而仍被視為″位于遠離一個或多個受體-結合結構域的位置上″，只要該氨基端氨基酸或糖基化位置的綴合作用不會實質上干擾細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素通過一個或多個受體-結合結構域與其受體的結合。綴合作用是否會實質上干擾蛋白質結合其受體的能力可利用一般技術人員所熟知的本領域內已知的配體-受體結合分析而很容易地來測定。
評估配體-受體結合的方法包括但不限于，競爭性結合分析、放射性受體-結合分析、以細胞為基礎的分析、表面等離子共振測量、動態光散射及超離心。
如本說明書的圖1d所示，相對于類似分子量的蛋白質，PEG是一種在溶液中占據大體積，且具有高度延展性及彈性的聚合物。雖然PEG所附著的氨基酸殘基可能遠離一個或多個受體-結合位置，但聚合物的部分可某種程度地干擾受體-結合。這類干擾的可能性隨著分子量增加和因此造成的聚合物在溶液中所占體積的增加而增加。最后，遠離受體-結合區的聚乙二醇化作用較隨機的聚乙二醇化作用對受體-結合的干擾較少。
實質上地、實質的如此處所使用，如果綴合的蛋白質結合至受體的速度和/或量相對于未綴合的對應的細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素的結合速度和/或量，不低于約40％、約50％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％或更多時，則可說蛋白質的綴合作用不會″實質上″干擾蛋白質結合至其受體的能力。
治療此處所用的術語″治療″(treatment、treat、treated或treating)是指預防和/或治療。例如當用在感染疾病方面時，此名詞可指增加個體對病原感染的抵抗力的預防性治療(或者，換言之，降低個體受病原感染，或因感染而顯示病癥的可能性)，以及在個體受病原感染后用來對抗感染的治療，如降低或排除感染，或預防其變得更嚴重。
綜述本發明提供用于合成受體-結合蛋白質的聚合物綴合物的方法，相對于其中有一個或多個聚合物是隨機連接的同一受體-結合蛋白質的聚合物綴合物，本發明方法所合成的產物可保留出乎意料的高受體-結合活性。利用X-光結晶學和基于核磁共振的結構分析、突變分析和分子建模軟件，本發明者已鑒定出細胞因子、趨化因子、生長因子和多肽激素的聚乙二醇化的靶位置(包括涉及或不涉及與受體的結合的類型)。包括這些細胞因子、趨化因子、生長因子及多肽激素的激動劑和拮抗劑的這類蛋白質在本文中稱為受體-結合蛋白質。通過對合成策略的選擇，該策略將聚合物的連接靶向于那些受體-結合蛋白的不涉及受體相互作用的區域，可避免某些不利的空間遮蔽，而所產生的聚合物綴合物可保留非常高的效力。那些具有遠離一個或多個受體-結合區或結構域的氨基端殘基的受體-結合蛋白質在本文中被定義為″遠離N-端″或″RN″受體-結合蛋白質；它們包括所有那些氨基端氨基酸是位于遠離蛋白質的受體-結合位置處的細胞因子、趨化因子、生長因子和多肽激素，或其拮抗劑。
本發明另一實施方案中，生產出含有一種或多種經共價偶聯至如下述的細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素的合成性聚合物(如一種或多種聚(乙二醇))的綴合物，這些細胞因子、趨化因子、生長因子或多肽激素具有遠離一個或多個受體-結合區或結構域的天然糖基化位置。根據本發明的這一方面，當合成性聚合物在糖基化位置的區域中偶聯時，綴合物的生物活性成分(如蛋白質)將顯示出保存良好的受體-結合活性。受體-結合蛋白質的此亞型在本文中稱為″RG″受體-結合蛋白質。當親水性或兩親性聚合物選擇性地在這類″遠端糖基化″位置處或其近處偶聯時，尤其是當靶蛋白是一種天然糖基化蛋白質的非-糖基化形式時，該聚合物可模擬天然的碳水化合物的有利效果，例如，對聚集、穩定性和/或溶解度的作用，因此，其附著作用在此稱為″假糖基化作用″。因此，本發明提供用來合成綴合物的方法，且在此綴合物中，合成性聚合物的位置選擇性偶聯作用可使天然的碳水化合物部分被有效取代。與蛋白質的其它非糖基化形式相比，所產生的假糖基化可改善溶解度、減少聚集，并從血液中延遲清除。因此，本方法特別適合用來制備在原核宿主細胞(例如細菌如大腸桿菌)中以重組DNA技術產生的蛋白質的綴合物和組合物，因為原核有機體通常不會將其表達的蛋白質糖基化。類似地，將糖蛋白的碳水化合物部分進行選擇性聚乙二醇化可造成糖蛋白的″假性過糖基化″。本方法已被描述，例如C.Bona等，PCT
發明者謝姆·S·巴斯卡倫, 梅瑞·R·歇爾曼, 馬克·G·P·塞佛, 艾爾·D·威廉斯 申請人:山景醫藥公司