專利名稱：含npt－ii標記基因轉基因水稻的快速檢測方法
1.發明領域本發明涉及快速檢測含NPT-II選擇標記基因的轉基因水稻的一種方法，此種方法中使用了一種特殊的抗生素，其檢測臨界濃度能使轉基因水稻中的非轉化植株葉片黃化死亡而轉化植株因含有外源基因能抵抗抗生素的傷害而存活；或者使轉基因水稻種子和幼胚中的非轉化種子或幼胚芽白化死亡，而轉化種子或幼胚因含有外源基因能抵抗抗生素的傷害而正常生長發育。公開的檢測方法抗生素臨界濃度有益于水稻基因工程研究者和水稻育種工作者。
2.背景技術在水稻基因工程中，為了把轉化體篩選出來，最直接的方法是根據轉化質粒或目的基因直接對個體進行分子檢測，一般有PCR檢測或分子雜交。但分子檢測速度慢，耗資大，隨著轉基因水稻后代群體的擴大，分子檢測方法受到了一定的限制，因此，探索一種快速、簡單、準確檢測轉基因水稻的方法是很有必要的。
在水稻遺傳轉化中，一般在表達載體中構建一個以上的選擇標記基因，通過相對應的選擇試劑對轉基因水稻進行篩選，未轉化的細胞不能正常生長發育，而攜帶選擇標記基因(攜帶轉化質粒)的轉化細胞因對選擇試劑產生抗性而不受其影響，能正常生長、發育和分化，從而把轉化體選擇出來。這樣得到的轉化植株既攜帶目的基因，同時也攜帶有選擇基因。
新霉素磷酸轉移酶基因一NPT-II基因是最早引入水稻研究的，也是在植物轉基因研究中應用最為廣泛的選擇標記基因之一。它來源于細菌轉座子Tn5上的aphA2。該基因編碼氨基糖苷-3′-磷酸轉移酶(aminnoglycoside-3′-phosphotransferase II)，又稱Npt-II(neomycinphosphotransferase II)，該酶通過酶促磷酸化使某些氨基糖苷類抗生素如卡那霉素、新霉素、G418等磷酸化而失活。此類抗生素對植物細胞表現毒性的機理是與植物細胞葉綠體和線粒體中的核糖體30S亞基結合，影響70S起始復合體生成，干擾葉綠體及線粒體的蛋白質生物合成，最終導致植物細胞死亡。Npt-II使ATP分子上的γ-磷酸基轉移到抗生素分子上，影響抗生素與核糖體亞基的結合，從而使抗生素失活。使用Npt-II基因轉化植物，可以使植物細胞產生對上述抗生素的抗性。
由于不同作物對不同抗生素的敏感程度不一樣，且同一作物不同外植體對某一抗生素敏感程度不同，因此在基因工程中對轉化植株進行檢測所采用的抗生素濃度也有差異。
3.發明內容本發明的一個目的在于提供一種快速檢測含NPT-II轉基因水稻的方法，通過G418溶液或含G418的培養基可實現該目的。
本發明的另一個目的在于實現對轉基因水稻整個生育期的檢測。通過不同濃度的G418溶液或含G418的培養基可實現對轉基因水稻后代的葉片、種子、幼苗和幼胚的快速檢測。
4.本發明詳細說明本發明提供在轉基因水稻整個生育期各個階段的檢測，在對轉基因水稻進行檢測前，首先應該確定抗生素篩選的臨界濃度，其濃度一方面可以殺死轉基因水稻中的非轉化植株，另一方面又能保證轉基因水稻中轉化株的正常生長。
用于實施本發明的抗生素是G418，其檢測試劑包括檢測葉片和種子的溶液和檢測幼胚和幼苗的培養基，檢測方法是以轉基因水稻和其對應的轉化受體為材料，對G418設定一系列的濃度梯度，確定檢測轉基因水稻的最佳臨界濃度。
根據本發明中通過檢測葉片來檢測轉基因水稻，將G418濃度設為0，40，60，80，100，150，200mg/l七個不同的處理濃度，每處理隨機分別取含NPT-II轉基因水稻材料(以下用R表示)和其轉化受體對照材料(以下用CK表示)大田生長分蘗期同一部位綠色健康葉片3片，每片葉剪成2cm左右長的葉段三段(兩端均留有剪刀口)放入裝有G418溶液的培養皿中，每皿中放的3個葉段均來源于為同一葉片。將葉片置于室內室溫下(光強約為10000μmol.m-2·s-1，光照時間約為12h·d-1，溫度約為25℃)，定期觀察其變化情況。
水稻葉段用不同濃度的G418處理后，CK的葉段均出現不同程度的褐化、黃化，并且隨著G418濃度和處理時間的增加，葉段褐化或黃化程度加重。處理4天后，60mg/l以上G418處理的CK葉面全部變黃，80mg/l時整個葉面黃化；到200mg/l時，葉段已枯黃，而R在各個處理濃度葉面基本上沒有出現黃化。使用60mg/l以上濃度G418時，R與CK葉段耐G418的能力開始出現明顯差異，故把70-90mg/l的G418作為檢測轉基因水稻葉片的最適濃度(處理結果見表1)。
根據本發明中通過檢測種子來檢測轉基因水稻，G418濃度分別設置0，150，200，250，300，350mg/l五個不同處理，每處理分別取R和CK各20粒種子，設3次重復，浸種培養至破胸時，分放在裝有不同濃度G418溶液的培養皿中，培養皿底覆蓋有兩層濾紙。將種子置于光照培養箱內(光強約為10000μmol.m-2·s-1，光照時間約為12h·d-1，溫度約為29℃)，定期觀察其發芽情況，7天后統計發芽率和白化死亡率。
處理后的CK種子發芽率隨G418濃度的增加而降低，相應芽的白化死亡率隨G418濃度的增加而升高；但R種子的發芽率和芽的白化死亡率在各個處理濃度基本不受G418的影響。在G418為0mg/l和100mg/l時，CK的發芽率和白化死亡率都沒有受到影響。到150mg/l以上時，其發芽率開始出現下降，部分發出的芽開始出現白化死亡。對于CK種子的白化死亡率，G418濃度在300mg/l以上各處理與300mg/l以下各處理呈顯著差異，濃度為350mg/l時，白化死亡率達到100％。故把280-320mg/l的G418作為檢測轉基因水稻種子的最適濃度(處理結果見表2)。
根據本發明中通過檢測幼胚來檢測轉基因水稻，以R和CK開花授粉后12～15天的幼胚為材料，G418濃度分別設置0，100，150，200，250mg/l五個不同處理，每處理分別取轉基因水稻R和CK各20顆幼胚，重復3次。用0.1％升汞滅菌12分鐘后用無菌水沖洗3～5次，然后接種于1/2MS+0.5mg/l 6-BA+1.5％蔗糖培養基上，4天后，在無菌條件下將開始萌發幼胚接種于加有G418的相同培養基上。將幼胚置于光照培養室內(光強約為10000μmol·m-2·s-1，光照時間約為12h·d-1，溫度約為25℃)，定期觀察其發芽情況，10天后統計發芽率和白化死亡率。
利用不同濃度的G418對水稻幼胚進行敏感性檢測。結果表明R發芽率基本上不受G418濃度的影響，只是當濃度達到300mg/l時，有個別幼胚出現白化死亡。而CK則隨著G418濃度的增加，幼胚發芽率漸漸下降，相應的白化死亡率也逐步上升，到200mg/l以上時，白化死亡率達到了85％以上，且200mg/l以上各處理與200mg/l以下各處理呈顯著差異。因此本試驗中取180-220mg/l的G418作為篩選轉基因水稻幼胚的臨界濃度(處理結果見表3)。
根據本發明中通過檢測幼苗來檢測轉基因水稻，G418濃度分別設置0，100，150，200，250mg/l五個不同處理，取R和CK成熟胚在1/2MS+0.5mg/l 6-BA+1.5％蔗糖培養基上培養成幼苗(約4葉期)，每處理分別取R和CK各60棵幼苗，在無菌條件下將幼苗接種于加有G418的相同培養基上。將幼苗置于光照培養室內(光強約為10000μmol·m-2·s-1，光照時間約為12h·d-1，溫度約為25℃)，定期觀察其生長變化情況。
在G418濃度分別為0和100mg/l時，培養不同天數CK幼苗生長發育正常；G418濃度為150mg/l和200mg/l時，CK在4天后葉尖開始卷曲，8天后葉片開始變黃，12天后整株黃化；當G418濃度為250mg/l時，到第12天幼苗整株枯死。而不同G418濃度處理的R在整個培養過程中均沒有明顯變化。第12天，在G418濃度為150mg/1時，R和CK之間表現出明顯差異，因此把130-170mg/l的G418作為篩選轉基因水稻幼苗的最適濃度(處理結果見表4)。5本發明的分子檢測驗證根據以上發明方法，取G418篩選陽性葉片對應的植株60株(對R和CK各占60株的混合群體進行葉片篩選)、G418篩選發芽種子后的存活苗65株(對R和CK種子各60粒混合后進行篩選)、幼胚發芽篩選后的存活苗67株(對R和CK幼胚各60顆混合后進行篩選)和幼苗篩選后的62株(對R和CK幼苗各60株混合后進行篩選)分別提取DNA，根據NPT-II基因的核苷酸序列設計引物進行PCR擴增。結果表明大部分G418篩選陽性株擴增出了與NPT-II基因序列長度完全一致DNA特征帶。
在驗證葉片檢測方法中，通過對60株成株所提DNA進行PCR檢測，發現陽性株為60，跟80mg/l G418條件下的檢測結果完全一致。在驗證種子篩選方法中，發現PCR呈陽性的種子有60粒，占整個存活種子的92.31％，適合大批量種子的快速檢測。在驗證幼胚篩選方法中，發現PCR呈陽性的幼胚有60顆，占整個存活幼胚的89.55％，在驗證幼苗篩選方法中，發現PCR呈陽性株幼苗也有60株，占整個存活幼苗的96.77％，適合室內組培苗的快速檢測(檢測結果見表5)。
本發明的優越性操作簡便、快速、費用低、省時省力、準確性高。
6.實施范例范例一該抗生素對轉基因水稻葉片的篩選以R為父本，明恢63(MH63)、9311、培矮64s(PA64s)、288、E32為母本，雜交后獲得F1代，再以MH63、9311、PA64s、288和E32為輪回親本，與F1代回交獲得BC1F1代，應用本研究建立的標記基因葉片快速檢測技術，以70～90mg/l濃度的G418對BC1F1群體中個體的葉片進行篩選，同時同一群體的各個個體提DNA進行PCR檢測，效果非常明顯。到第4天，G418篩選的部分葉片保持正常綠色，而部分葉片黃化死亡。經PCR檢測驗證，G418篩選的正確率達99.32％，因此G418篩選后保持正常綠色的基本上為轉基因陽性株(檢測結果見表6)。
范例二該抗生素對轉基因水稻種子的篩選以轉基因水稻R為父本，明恢63(MH63)、9311、培矮64s(PA64s)、288、E32為母本，雜交后獲得F1代，再以MH63、9311、PA64s、288和E32為輪回親本，經兩次回交獲得BC2F1代種子，應用本研究建立的標記基因種子快速檢測技術以280～320mg/l濃度的G418對BC2F1種子進行篩選，同時取存活苗提DNA進行PCR檢測，效果非常明顯。7天后，部分種子發出的芽能正常地分化出幼苗，而部分種子發出的芽白化死亡，經PCR驗證，G418篩選的正確率達94.68％。因此G418篩選后的存活苗基本上為轉基因陽性株(檢測結果見表7)。
范例三該抗生素對轉基因水稻幼胚的篩選將轉基因水稻R(父本)分別與明恢63(MH63)和9311(母本)雜交后獲得F1代，以MH63和9311為輪回親本再經三次回交獲得BC3F1幼胚；將轉基因水稻R(父本)分別與E32、288(母本)雜交后獲得F1代，以E32、288為輪回親本再經二次回交獲得BC2F1幼胚。應用本研究建立的標記基因幼胚快速檢測技術以180～220mg/l濃度的G418對BC3F1和BC2F1群體的幼胚進行篩選，同時取存活苗提DNA進行PCR檢測，效果非常明顯。10天后，部分幼胚發出的芽能正常地分化出幼苗，而部分幼胚發出的芽白化死亡。經PCR驗證，G418篩選的正確率達93.30％。因此G418篩選后的存活苗基本上為轉基因陽性株(檢測結果見表8)。
范例四該抗生素對轉基因水稻幼苗的篩選將轉基因水稻R(父本)分別與明恢63(MH63)和9311(母本)雜交后獲得F1代，再經三次回交獲得BC3F1種子；將轉基因水稻R(父本)分別與E32、288(母本)雜交后獲得F1代，再經二次回交獲得BC2F1種子。應用本研究建立的標記基因幼苗快速檢測技術以130-170mg/l濃度的G418對BC3F1和BC2F1群體的幼苗進行抗性鑒定，同時取存活苗提DNA進行PCR檢測，效果非常明顯。12天后，部分幼苗能正常生長，而部分幼苗黃化死亡。經PCR驗證，G418篩選的正確率達96.36％。因此G418篩選后的存活苗基本上為轉基因陽性株(檢測結果見表9)。
表1水稻葉片對G418敏感性的測定結果
注“-”無變化；“+”切口處褐化；“++”葉面淺黃；“+++”整個葉面黃化；“++++”葉段枯死表2水稻種子對G418敏感性的測定結果
同一性狀不同處理下有相同字母表示無顯著性差異，字母完全不同表示有顯著性差異(P＜0.01)。
表3水稻幼胚對G418敏感性的測定結果
同一性狀不同處理下有相同字母表示無顯著性差異，字母完全不同表示有顯著性差異(P＜0.01)表4水稻幼苗對G418敏感性的測定結果
注“-”無變化；“+”葉尖開始卷曲；“++”葉面開始變黃；“+++”整株黃化；“++++”整株枯死表5 R和CK的PCR檢測結果
表6 G418和PCR檢測BC1F1葉片結果
表7 G418和PCR檢測BC2F1種子結果
表8 G418和PCR檢測BC2F1和BC3F1幼胚結果
表9 G418和PCR檢測BC2F1和BC3F1幼苗結果
權利要求
1.一種快速檢測含NPT-II標記基因轉基因水稻的方法，此方法是使用一種抗生素，這種抗生素可以提供在轉基因水稻整個生育期各個階段的檢測，其特征在于在對轉基因水稻進行檢測前，首先應該確定該抗生素檢測的臨界濃度，其濃度一方面可以殺死轉基因水稻中的非轉化植株，另一方面又能保證轉基因水稻中轉化株的正常生長。此種方法包括對轉基因水稻葉片、種子、幼胚和幼苗的檢測。
2.權利要求1所述的方法中包括一種抗生素G418的溶液或培養基。
3.權利要求2所述的溶液中只含有抗生素G418。
4.權利要求2所述的培養基為MS培養基。
5.權利要求4中的MS培養基含有抗生素G418、0.5mg/l 6-BA和1.5％蔗糖。
6.根據權利要求1和3所述的快速檢測轉基因水稻葉片，其特征在于葉片為成株離體葉片，檢測試劑是臨界濃度為70-90mg/l的G418溶液。
7.根據權利要求1和3所述的快速檢測轉基因水稻種子，其特征在于種子為剛破胸的活種子，檢測試劑是臨界濃度為280-320mg/l的G418溶液。
8.根據權利要求1和4所述的快速檢測轉基因水稻幼胚，其特征在于幼胚為剛萌發的無菌幼胚，檢測培養基中含有臨界濃度為180-220mg/l的G418。
9.根據權利要求1和4所述的快速檢測轉基因水稻幼苗，其特征在于幼苗為三葉或三葉以上的無菌苗，檢測培養基中含有臨界濃度為130-170mg/l的G418。
全文摘要
本發明公開了一種快速檢測含NPT－II標記基因轉基因水稻的方法，此方法能實現轉基因水稻在整個生育期各個階段的快速檢測，此方法包括一種抗生素溶液或含這種抗生素的培養基，此抗生素為G418。水稻不同外植體對G418的敏感性不同，因此檢測的濃度有差異。本發明確定了通過G418溶液或含G418的培養基檢測轉基因水稻的臨界濃度，其濃度一方面可以殺死轉基因水稻中的非轉化植株，另一方面又能保證轉基因水稻中轉化株的正常生長。本發明的優越性在于操作簡便、快速、費用低、省時省力、準確性高。
文檔編號C12Q1/68GK1706965SQ20041002329
公開日2005年12月14日 申請日期2004年6月10日 優先權日2004年6月10日
發明者易自力, 王紫萱, 蔣建雄, 覃靜萍, 張昊, 譚炎寧 申請人:易自力, 王紫萱, 蔣建雄