專利名稱：轉基因水稻的培育方法
技術領域：
本發明涉及水稻分子育種技術領域，具體地說，本發明涉及利用水稻基因組上特定位點培育轉基因水稻的方法以及所得的轉基因水稻細胞。
背景技術：
改善水稻性狀的一個主要方面在于提高其抗蟲性，水稻螟蟲等鱗翅目害蟲是水稻豐產穩產的主要限制因素之一。迄今為止，在中國乃至世界上沒有任何天然的稻種資源對水稻螟蟲等鱗翅目害蟲具有抗性。過去，對水稻螟蟲的防治主要依賴于化學農藥的使用，但大量地農藥使用不僅對生物環境造成嚴重的殘毒污染，而且也使稻米的衛生品質下降，從而影響人們的身體健康。另外，由于在鉆入莖桿之前螟蟲幼蟲在稻株的外表面只停留極短的時間，使得化學農藥對水稻螟蟲等鱗翅目害蟲的防治常常難以奏效。因此，培育抗蟲水稻是水稻育種界長期追求的目標。
隨著植物基因工程技術的發展，人們已逐漸嘗試通過引入外源基因的方式來提高水稻的抗蟲性，其中應用最廣泛的外源基因是來自蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)即Bt的結晶性殺蟲蛋白基因。
在毒理學上，Bt殺蟲蛋白的毒性活性位點位于昆蟲的中腸[EnglishLH and Cantley LC(1986)Delta endotoxin is a potent inhibitor of the(Na，K)-ATPase.J.Biol.Chem.2611170-1173.]，并在那里毀壞中腸內膜上皮細胞[Hfte H and Whiteley HR(1989)Insecticidal crystalprotein of Bacillus thringiensis.Microbiol Rev.53242-255；Knowles BHand Ellar DJ(1987)Colloid-osmotic lysis is a general feature of themechanism of action of Bacillus thringiensis of δ-endotoxins withdifferent insect specificity.Biochem.Biophys.Acta 924509-518]。從而造成目標昆蟲中毒死亡。
Bt內源殺蟲蛋白優于化學殺蟲劑的主要優點之一就在于它們對昆蟲的高度專一性，也即除目標害蟲之外對其他非目標害蟲和害蟲天敵以及哺乳動物和鳥類等都不具有任何毒活性，并易于在環境中降解[McGauhey wh and Whalon ME(1992)Managing insect resistance toBacillus thurienginsis toxins.Science 258(27)1451-1455]。
近年來，通過基因工程導入外源Bt基因成功獲得轉基因抗蟲水稻已經有了大量報道[謝道昕，范云六，倪沛沖(1991)蘇云芽孢桿菌殺蟲基因導入中國栽培水稻品種中花11號獲得轉基因植的研究.中國科學(B輯)，8830-834；Fujimoto H，Itoh K，Yamamoto m，kyozuka j，ShimamotoK(1993)Insect-resistant rice generated by introduction of a modified e-endotoxin gene of bacillus thuringiensis.Bio/Technology 111151-1155；李冬虎等(2004)轉sck/cry1Ac雙基因抗蟲水稻對二化螟和稻縱卷葉螟的抗蟲效果中國水稻科學18(1)43-47；馬柄田等(2004)轉抗蟲基因三系優良保持系的獲得30(1)60-65]。在以上這些報道中，研究者們大都采用基因槍或者農桿菌介導的方法，將外源的Bt基因導入水稻基因組中。但是，外源的Bt基因整合在水稻基因組上的哪一個位點是隨機的、不確定的。外源基因整合在水稻基因組上的不同位點，可能帶來不同的遺傳效應。例如，同一個Ubiquitin啟動子引導的Bt基因轉化到同一個水稻恢復系明恢86形成的兩個獨立轉基因系MSA和MSB在生長后期對二化螟的抗性就存在較大差異，前者的抗蟲表現穩定，后者的抗蟲性則隨生育期進展呈顯著下降(李冬虎等2004，出處同上)。另外不同的插入位點，還可能不同程度地影響或改變受體基因組的農藝性狀，如粳稻秀水11在轉化了cryIAb基因后，其農藝性狀發生了明顯改變，具體表現為株高降低，分蘗力增強、穗長、穗粒數、千粒重明顯下降(崔海瑞等2001)。國外也有不少類似報道。另一方面，Tu Jumin等[(2000)Fieldperformance of transgenic elite commercial hybrid rice expressingBacillus thuringiensis δ-endotoxin.Nature/Biotechnology 181101-1104和馬柄田等(2004，出處同上)]將Bt基因分別導入優良三系雜交稻恢復系明恢63和蜀恢527的基因組中，獲得高效表達的轉基因株系，它們在田間不但表現出抗蟲性的明顯提高，而且農藝性狀都沒有發生明顯的變化。因而，在轉基因育種實踐上，往往需要創造大量的獨立轉化事件，然后篩選其中對農藝性狀沒有影響或者影響輕微的獨立轉化體，進而將其培育成為有商品價值的轉基因抗蟲水稻。在這樣的有商品價值的轉基因水稻中，其目的基因的DNA序列與插入位點上下游旁側的水稻基因組DNA序列連接在一起共同組成遺傳上穩定的復合轉基因結構，并在水稻的有性繁殖過程中世代地遺傳下去。利用該復合轉基因結構可以改良其它水稻品種抵御蟲害的能力。
發明內容
本發明通過研究發現，在水稻基因組的特定位點整合外源基因，可實現在將新的有益性狀引入水稻品系的同時對受體植株的農藝性狀沒有明顯的不良影響，由此完成了本發明。
本發明的目的在于提供一個在水稻基因組上可以有效地插入外源基因并使插入的外源基因可以穩定地表達、而又對受體植株的農藝性狀沒有明顯的不良影響的特定位點，應用該位點改良水稻性狀。
為實現上述目的，本發明提供下述技術方案。
本發明的第一方面在水稻基因組上找到一個可以有效地整合了外源基因并使整合的外源基因可以穩定地表達、而又對受體植株的農藝性狀沒有明顯的不良影響的特定位點，該位點是位于水稻基因組第10染色體的第5354619至5354720位堿基之間的區域，其間的DNA序列可以因具體的受體品種的不同出現或多或少的差異。
本發明的第二方面在于提供一種復合轉基因結構，所述復合轉基因結構可以是由特定位點上下游旁側的水稻基因組DNA序列，與該位點的外源基因DNA序列相整合，構成的遺傳上穩定的復合轉基因結構，并可以通過有性雜交和體細胞雜交技術重組到新的水稻種質中去，培育成為抗蟲水稻新品種(系)。
作為一個具體的例子，所述復合轉基因結構具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2以及在上述兩序列之間整合的外源基因雙拷貝的復合體。
本領域的技術人員可以理解，通過天然或人工的方式，在所述復合結構基礎上(包括其本身)通過插入、缺失、取代、替換、添加一個或多個堿基所得的功能等同的亞結構，只要在遺傳上是穩定的，都可以通過有性雜交和體細胞雜交技術重組到新的水稻種質中去，培育成為水稻新品種，則這種經修飾的復合轉基因結構也屬于本發明的范圍之內。
本發明的抗蟲復合轉基因結構或其功能等同的亞結構，可通過有性雜交方式或體細胞原生質融合技術轉育到感蟲的水稻品種中，并培育成抗蟲的新品系。
本發明的第三方面在于提供一種本發明第一方面所述的特定位點中整合了外源基因序列的水稻細胞以及包含所述的水稻細胞的植物組織。具體說來，所述的水稻細胞可以是光溫敏不育系水稻細胞，質核互作雄性不育系或者其保持系水稻細胞，雄性不育恢復系水稻細胞等各種在農業上可應用的水稻細胞。另一方面，在該位點整合的外源基因是抗蟲基因，更進一步地，所述外源基因可以是如本發明第二方面所述的復合基因結構，Bt基因，包含Bt基因的融合基因，以及其它抗蟲，抗除草劑基因等。特別地，所述外源基因可以是編碼SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的基因。
本發明的第四方面在于提供改善水稻抗性的方法，該方法包括應用上述任意一方面所述的水稻細胞或復合基因結構的步驟。
下面對本發明進行詳細描述。
在一個具體的實施方案中，本發明涉及一個整合在水稻基因組上的可穩定表達Bt抗蟲蛋白的復合轉基因結構。該復合轉基因結構能夠賦于水稻對稻縱卷葉螟、二化螟和三化螟等鱗翅目害蟲的抗性。這一發明適用于所有對鱗翅目害蟲敏感的稻種。這些稻種包括亞洲栽培稻種、非洲栽培稻種和它們的近緣野生種。所述的復合轉基因結構包括含有Bt基因雙拷貝復合體，且復合體5′端連接著基因組DNA序列SEQID NO.1，3′端連接著基因組DNA序列SEQ ID NO.2，或者與該復合基因結構功能等同的至少包含一份完整的Bt基因拷貝，且其5′端連接著水稻基因組DNA序列SEQ ID NO.1，或其3′端連接著水稻基因組DNA序列SEQ ID NO.2的功能等同的類似結構。
本發明中，基因轉化所使用的受體品種為明恢63及其所配雜種汕優63。明恢63是由福建三明市農科所選育的優良秈型細胞質雄性不育恢復系，用該系與優良的秈型細胞質雄性不育系珍汕97A配組，所生產的雜種即為汕優63。本發明中使用的明恢63種子由中國農業科學院品種資源所提供。
在該具體實施方案中，本發明使用的Bt抗蟲基因為cry1Ab/cry1Ac融合基因，并由中國農業科學院生物技術研究開發中心范云六院士等人人工合成并提供使用(Jumin TU，等Expression and Function of aHybrid Bt Toxin Gene in Transgenic Rice Conferring Resistance toInsect Pest，Plant Botechnology，15(4)，195-203，1998)，基因全長1830bp，所編碼的蛋白質由610個氨基酸殘基組成，其分子量大小為60kDa。在氨基酸組成上該基因結合了cry1Ab高效的昆蟲毒性活性位點和cry1Ac專一性極強的昆蟲識別位點，并被置于能在禾本科作物組織中有效表達的ActinI啟動子和nos終止子的調控之下。轉化所獲得的Bt明恢63株系及其雜交組合Bt汕優63也因此兼備以上這些特點。
本發明中目的Bt抗蟲基因和用于轉化子篩選的抗生素標記基因是分別構建在不同的質粒載體上，然后，應用共轉化的策略由基因槍介導的基因轉化方法導入到受體基因組中。事實上正是由于這種共轉化策略的應用，使得本發明中的目的基因和標記基因分別插入在受體基因組的不同染色體上，并通過T1代的自交分離培育出不含標記基因的轉基因株系。本發明所述的復合轉基因結構即存在于這樣的轉基因株系中。
本發明中的目的基因轉基因拷貝有兩個，他們是以尾對頭連接方式整合在受體基因組上。具體的整合順序從5′端至3′端依次為獨立整合的185bp actin I啟動子短序列，從actin I啟動子的第98堿基開始至終止子結束的第一個非完整的Bt基因拷貝序列，由不同載體片段和中間包含一段51bp-actin I啟動子短序列組成的總長度為796bp的拷貝間連接序列，從actin I啟動子的第1堿基開始至終止子結束的第二個完整的Bt基因拷貝序列，之后是連同該拷貝一起整合的1692bp載體序列，再接著是另一段128bp載體序列。由于5′端的Bt基因拷貝的actinI啟動子序列在其5′端被截短98bp，故推測其表達活性可能會有所下降或僅維持部分表達活性；而3′端的Bt基因拷貝是完整的，因而其表達活性是完全的。另外，在殘留的1692bp載體序列上發現攜帶有一段653bp長的抗氨芐霉素標記基因編碼序列，但由于它缺少了從起始密碼子至中間的長度為208bp的短片段，且沒有啟動子序列，因此不能轉錄和翻譯。因此，在本發明的轉基因復合結構中，人們所擔心的抗生素標記基因對環境生物的安全性威脅并不存在。
在該實施方式中的目的基因的整合位點位于水稻第10染色體短臂靠近著絲點的位置上，其具體的插入位置在該染色體的第5354669至5354670兩個堿基之間。這兩個堿基在正鏈上是AC，而在副鏈上是GT，根據本領域技術人員的常規以正鏈上的這兩個堿基為起點分別向5′端和3′端延伸的50個堿基序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示構成了本發明的特定插入位點。遠離該插入位點上游(5′端)5.668kb和下游0.900kb處各有一個長度均為500bp的富AT序列，即所謂MAR序列。這兩個MAR序列具有所有MAR序列應有的典型特征如A盒(AATAAAAA/CAA)或T盒(TATAAA)；拓撲異構酶II識別序列(TATACGCATGCT)；復制起始點序列(ATTA，ATTTA和ATTTTA)；富TG區；卷曲DNA花式(AAAAn7AAAn7AAAA，TTTAAA)；彎曲DNA花式[TG(CA or TA)n2-4 or 9-12TG(CA or TA)]和ATC規律等。在這兩個MAR序列之間包含1個內源的水稻基因，這個內源的水稻基因與外源的兩拷貝Bt轉基因一起組成一個相對獨立的轉錄單位。因而，能夠穩定地遺傳與表達。在該具體的實施方式中外源的兩拷貝Bt基因由如SEQ ID NO.4所示的連接序列相連。
附圖的簡要說明
圖1、用于本發明的一個具體實施方案的目的基因和標記基因的質粒結構圖。A質粒pfhbt1攜帶cry1Ab/cry1Ac融合而成的Bt抗蟲基因編碼序列，并由能在禾本科作物基因組中有效表達的Actin I啟動子和nos終止子驅動表達。該質粒系由中國農業科學院生物技術研究開發中心范云六院士等人構建并提供使用(Jumin TU，等Expression andFunction of a Hybrid Bt Toxin Gene in Transgenic Rice ConferringResistance to Insect Pest，Plant Botechnology，15(4)，195-203，1998)。B質粒pGL2RC7攜帶抗潮霉素基因hph和抗真菌的幾丁質酶基因RC7編碼序列，兩者都由煙草花葉病毒啟動子CaMV35S和終止子nos驅動表達。在本發明中，該質粒用于與pFHBT1質粒共轉化后所獲得的轉化子的篩選。單個大寫英文字母表示各種核苷酸內切酶，BBamH1；CClaI；HHindIII；KKpnl；PPacI；SSstI。
圖2、基于cry1Ab/cry1Ac整合基因編碼序列推定的氨基酸序列。(Jumin TU，等，1998，出處同上)
圖3、轉基因當代植株TT2、TT35和TT51的Southern雜交分析。圖中，上為Bt基因特異探針雜交結果，下為hph基因特異探針雜交結果。箭頭所指為符合期望值的特異帶。
圖4、Bt轉基因整合位點在TT51的T1中自交分離時的Southern雜交檢測結果。NT陰性對照；P陽性對照；ITT51-T0；2-16TT51-T1單株。箭頭所示的數字為各檢測片段的分子量大小。
圖5、TT51-1第二代(T2)純系Bt抗蟲蛋白的Western雜交分析。每孔上樣量為50μg可溶性蛋白質。CryIAb Toxin純化的CryIAb殺蟲蛋白；NT非轉基因對照蛋白樣品；TT51-1(T2)；TT51-1的第二代純系；1-7TT51-1第二代純系7株蛋白樣品。箭頭所指為期望分子量大小的陽性雜交帶。
圖6、外源轉基因拷貝在轉基因當代植株TT51、后代純系TT51-1及其所配雜種基因組中的整合模式的Southern雜交分析。A以Bt基因編碼序列為特異探針的雜交結果；b以hph基因編碼序列為特異探針的雜交結果。箭頭所示為各雜交片段的分子量大小。
圖7、Bt轉基因純系TT51-1在大田種植和不打藥條件下對人工接蟲的三化螟的抗性反應。中間原品種對照明恢63；兩邊相鄰株行Bt雜種。
圖8、Bt轉基因純系TT51-1在大田種植和不打藥條件下對自然發蟲的稻縱卷葉螟的抗性反應；圖中，上TT51-1；下對照明恢63。
圖9、TT51-1轉基因插入位點上游側翼片段TAIL-PCR擴增結果。II、III分別為第二和第三輪的擴增產物，M為bp分子量標記。箭頭所示為期望擴增帶Bt1747AD5。
圖10、TT51-1轉基因插入位點上游側翼片段TAIL-PCR擴增結果。II、III分別為第二和第三輪的擴增產物，M為200bp分子量標記。箭頭所示為特異擴增帶Bt1747AD2。
圖11、TT51-1轉基因插入位點上游克隆的側翼序列Bt1747AD5，序列全長2303bp。下劃線標出的是引物序列。
圖12、TT51-1轉基因插入位點上游克隆的側翼序列Bt1747AD2，序列全長1420bp。下劃線標出的是引物序列。
圖13、TT51-1轉基因插入位點下游側翼片段TAIL-PCR擴增結果。II、III分別為第二和第三輪的擴增產物；M1200bp DNA分子量標記；M2λ-HindIII酶解的分子量標記；箭頭所示為特異擴增產物Bt1747AD7。
圖14、TT51-1轉基因插入位點下游克隆的側翼序列Bt1747AD7，序列全長2297bp。下劃線標出的是引物序列。
圖15、PCR擴增的轉基因插入位點上游的緊領邊界序列MHL2714Act266(圖A泳道1)和下游的緊鄰邊界序列MHR1883Vec1993(圖B泳道3)。M1200bpDNA分子量標記；M2λ-HindIII酶解的分子量標記。
圖16、TT51-1轉基因插入位點上下游克隆的緊鄰邊界序列Bt1747AD2(1479bp)和Vec1993MHR1883(2005bp)。下劃線標出的是各引物序列。
圖17、兩個Bt轉基因拷貝之間的連接序列的PCR擴增結果。1引物對Bt1747和Act29；2引物對Bt1747和Act266；M200bpDNA分子量標記。箭頭所示為期望的擴增帶。
圖18、TT51-1上兩個Bt拷貝之間的連接序列。粗體打印的英文字母表示前一個Bt基因拷貝的終止子及其緊鄰的載體序列；斜體標出的粗體英文字母表示的是反向插入的ActI內含子序列；下劃虛線標出的正常字體表示的是前一個Bt基因拷貝上被反向插入的ActI內含子序列打斷以后的載體序列；正常字體表示的是下一個Bt基因拷貝的載體及其緊鄰的ActI啟動子序列部分；下劃線表示的是引物序列。
圖19、TT51-1轉基因插入位點的染色體位置(I)、轉基因復合結構(II)和酶切片段長度(III)。染色體的長短臂分別用長短豎線條橢圓形表示，著絲點用空白小圓圈表示。1-10分別表示的是引物AD2、AD5、MHL2714、Act266、Bt1747、Act29、Bt1747、Vec1993、AD7、MHR1883。
圖20、9311和綿恢725轉育系的插入位點的旁側序列及Bt基因拷貝間的中間序列的PCR擴增結果。M1λ-HindIII酶的分子量標記；M2200bp DNA分子量標記；I引物對Vec1993和MHR1883；2引物對Bt1747和Act29；3引物對MHL2714和Act266。箭頭所示為擴增片段大小。
圖21、9311和綿恢725轉育系的目標基因的PCR擴增結果。M200bpDNA分子量標記；1引物對Bt1和Bt2；2引物對Bt1533和Bt2。箭頭所示為擴增片段大小。
具體實施例方式
需要特別說明的是，除特別說明之外，本發明中所使用的實驗方法和試劑、材料均是本領域技術人員常規采用的基因工程操作方法和普通可商購的試劑和材料。
實施例1特定位點的鑒定
本發明的特定位點是通過下述試驗材料及試驗過程得以分析鑒定出的。
(1)包含有外源基因的質粒載體
本發明中有兩個質粒DNA用于水稻轉化(見圖1)。其中，質粒pFHBT1攜帶由cry1Ab/cry1Ac融合而成的Bt抗蟲基因編碼序列，并由能在禾本科作物基因組中有效表達的ActinI啟動子和nos終止子驅動表達。該質粒系由中國農業科學院生物技術研究開發中心范云六院士等人構建并提供使用。質粒pGL2RC7攜帶抗潮霉素基因和抗真菌的幾丁質酶基因編碼序列，兩者都由煙草花葉病毒啟動子CaMV35S和終止子nos驅動表達。在本發明中，該質粒用于與pFHBT1質粒共轉化后所獲得的轉化子的篩選。
cry1Ab/cry1Ac融合基因編碼序列的人工修飾
基于cry1Ab/cry1Ac融合基因編碼序列推定的氨基酸序列見圖2。該融合基因的首447個氨基酸殘基與cry1Ab的對應區段一致，除了C4-R5、A303和Y384分別取代P5-N6-I7-N8-E9-C10-I11、D309和D390以外，余下的氨基酸序列從448至609則是沒有任何變化地由cry1Ac截取。因此，從已知功能域上分析，該基因在氨基酸組成上結合了cry1Ab高效的昆蟲毒性活性位點和cry1Ac專一性極強的昆蟲識別位點，轉化所獲得的轉基因株系也因此會兼備以上這些特點。另外，在融合前，該基因的密碼子使用經過了三位A、T堿基被G或C堿基取代的優化過程，以便適應水稻基因組的高GC含量。作為這種取代的結果，該融合基因的總G+C含量達到48.0％，而來自cry1Ab和cry1Ac抗蟲基因對應部分的原始DNA序列中的G+C含量僅為37.2％(JuminTU等1998，出處同上)。
(2)水稻轉化
從網室栽培的稻株上采集授粉12天后的未成熟籽粒，并去掉內外穎。然后將去穎的籽粒浸入70％酒精1分鐘，用50％(v/v)次氯酸鈉(商品名Clorox)表面消毒15-20分鐘。在超凈工作臺上于體視鏡下分離幼胚(即外植體)，并盾片面向上地置于10ml加有3％(w/v)M麥芽糖，2mgL-12，4-D，0.8％(w/v)I型瓊脂糖(Sigma)或0.3％Gelrite(MERCK&CO.INC.，KELCO.DIV)的固體MS培養基(簡稱為MS2)上，于28℃黑暗條件下預培養，所用的培養皿直徑為60mm。預培養16-18小時后的幼胚(80-100粒/皿)用伯樂公司(BIO-RAD，Hercules，CA)生產的PDC-1000/He系統進行轟擊轉化。所用的程序遵照廠家提供的操作步驟進行，即用Promega公司(Promega，Madison，WI)生產的魔幻大樣(Magic Maxipreps)DNA純化系統抽提的質粒DNA(hph∶Bt＝1∶4)包裹直徑1μm金微粒，并于1100帕大氣壓下轟擊目標外植體。轟擊后的目標外植體幼胚直接轉移到加有50mgL-1潮霉素B的篩選培養基(簡稱MS2H)上進行篩選，所用的培養皿直徑為90mm。產生的愈傷在相同的篩選培養基上每兩周繼代一次，5-7輪后得到的純一抗性愈傷轉移到20ml加有2mgL-1激動素(Kinetin)、1mgL-1α-萘乙酸(NAA)、2mgL-1甘氨酸、1gL-1水解酪蛋白(casein hydrolysate)，30gL-1麥芽糖，3gL-1Gelrite和50mgL-1潮霉素B的培養皿(直徑90mm)裝N 6再生培養基(簡稱3N6)上，于28℃黑暗條件下預再生7-10天。之后，再轉移到20ml去掉了潮霉素B的三角瓶(50ml)裝3N6再生培養基上進行植株再生。再生出的兩至三周大小的幼苗或移入Yoshida氏培養液過渡培養或直接移入盛土的盆栽缽中，并置于日溫29℃，夜溫23℃溫室中栽培至成熟。
(3)轉基因植株的分子分析和純系培育
應用上述步驟轉化后，總共獲得32株可育和3株不育轉基因苗。用HindIII-SstI內切酶組合酶切基因組DNA，以cry1Ab/cry1Ac編碼序列為探針對其中30株可育株基因組DNA進行Southern雜交分析，結果顯示16株呈陽性。其中，有3株包括TT2、TT35和TT51的整合模式相同(圖3)，并且都呈現與cry1Ab/cry1Ac完整編碼序列一致的1.8kb期望片段和一個比1.8kb小的缺失型重組片段。進一步以hph基因編碼序列為特異探針，對這三株進行Southern雜交分析，檢測到與該hph基因編碼序列一致的1.1-kb期望帶。這些結果證實目的基因和標記基因均完整地整合到這3株的受體基因組中，且來自同一轉化體(圖3)。
于孕穗期從上述三株陽性植株上截取8cm帶葉鞘的莖桿3-5段，置于墊有濕潤濾紙的直徑為9cm的培養皿中，每段莖桿接種6頭一齡三化螟幼蟲，結果表明接種在這三株上的三化螟蟲幼蟲全部死亡，抗蟲效率達到100％。
進一步以目的Bt基因編碼序列單一切點酶HindIII對轉基因株TT51的32株T1代植株進行酶切和分子遺傳分析，結果表明Bt轉基因符合多拷貝雙位點整合模式，每位點整合兩拷貝，部分植株的遺傳分析結果見圖4。在所檢測的32株中，有17株攜帶雙位點4拷貝，6株攜帶一位點的兩拷貝(兩高位雜交帶)，7株攜帶另一位點的兩拷貝(兩低位雜交帶)，以及2株未攜帶任何位點的任何拷貝(即無雜交信號)。經X2測驗表明該兩位點的分離比率符合獨立遺傳9∶3∶3∶1的分離比率，其符合概率P值大于0.95。
從上述經分子分析的T1代植株選20株自交獲得T2株系，并將其栽培于人工封閉溫室，里面的溫度和濕度在白天分別設在29℃和85％，在夜間分別設在25℃和90％。每系取10株抽提葉片可溶性總蛋白用于Western分析。每株一致地呈現60kDa期望蛋白帶和和一個截短的多肽分子便可初步地確定為純系(圖5)。然后，這些系中每一系的全部20個單株于最高分蘗期進行培養皿抗蟲性試驗，如一致地表現抗蟲的即可進一步肯定為純系。經如此鑒定的一個純系，設計編號為TT51-1，其每一株的抗蟲效率均達到100％，于是被選擇進行自交留種，同時將其與珍汕97A等細胞質雄性不育系配組生產雜種，以便用于進一步的分子分析和大田抗蟲實驗。
TT51-1系細胞已于2005年3月16日提交中國典型培養物保藏中心(湖北省武漢市武漢大學中國典型培養物保藏中心)進行保藏，培養物名稱稻屬秈亞種TT51-1(明恢63/Bt)保藏編號CCTCC-P200501。
(4)獨立遺傳位點的驗證及標記基因的去除
獨立遺傳位點的驗證是通過一組包括完整Bt基因編碼序列分離酶HindIII/SstI、質粒單切點酶KpnI和ClaI和質粒無切點酶PacI酶切分析來實現的。除PacI外，每一種內切酶在質粒上的酶切位點見質粒結構圖(圖1)。所用的植株DNA樣品包括轉基因T0代單株TT51及其后代純系TT51-1和由該純系配組的轉基因雜種汕優63/Bt，并以質粒DNA作正對照。酶切后的DNA片段經1％凝膠電泳和轉膜，用Bt基因完整編碼序列作特異探針進行分子雜交。結果顯示，在HindIII/SstI酶切樣品中，質粒正對照、TT51、TT51-1和汕優63/Bt樣本均檢測到一致的1.8kb期望雜交帶。這些結果表明Bt基因完整拷貝在上下代間能正常遺傳傳遞。在KpnI和KpnI/ClaI兩酶切樣品中，TT51均呈現4條帶，而它的后代純系TT51-1及其所配雜種則只呈現上下兩端的兩條帶，中間的兩條帶被自交分離出去。類似的結果也可從PacI和PacI/ClaI兩酶切樣品中觀察到，如TT51-PacI釋放兩條帶，TT51-PacI/ClaI釋放三條帶，而后代純系TT51-1及其所配雜種兩酶切樣品中各有一條帶被分離出去。因此，這些結果進一步驗證了前述獨立分離的試驗結果。另外，從TT51-KpnI和TT51-KpnI/ClaI兩酶切樣品中釋放數目相同的4條帶且其中的兩條小帶大小差異也相同可知，各位點的兩個Bt轉基因拷貝是頭尾相接的方式插入到受體基因組中，因為DNA內切酶KpnI和ClaI同位于Bt基因編碼序列下游一側，兩者相距283bp，否則不會產生這樣的結果。
用hph標記基因編碼序列作特異探針對同一張DNA膜進行Southern雜交，發現HindIII(hph單切點酶)和SstI(hph無切點酶)內切酶組合的TT51酶切樣品種釋放兩條雜交帶(圖6)，證實hph標記基因在受體基因組中的整合也是復拷貝，但陽性雜交信號只出現在TT51的各種酶切DNA樣本上，而不出現在TT51-1及其所配雜種的酶切DNA樣本上，表明hph轉基因復拷貝的整合位點是單一的，且與Bt轉基因的一個整合位點完全連鎖，并一起從T1代分離子TT51-1的基因組中分離出去。因此，上述這些試驗結果表明經反復篩選鑒定的TT51-1是一個不帶標記基因的僅保留一個Bt基因插入位點但有兩個完整拷貝的轉基因純系。
(5)BT轉基因的抗螟蟲特性
為了檢測Bt轉基因在受體基因組中介導的抗螟蟲特性，我們自1999年開始先后對TT51-1轉基因純系及其與珍汕97A等不育系所配的雜種進行了多年的大田中試、環境釋放和生產示范等試驗。受測試的目標害蟲有三化螟和稻縱卷葉螟，抗蟲鑒定方法有人工接蟲法和自然發蟲法。人工接蟲所用的蟲卵卵塊一般于接蟲前1-3天采集于當地稻田，并按每管一塊卵放進盛有1ml蒸餾水的9cm長指型管中。然后，將其置于28℃黑暗條件下孵化24小時。幼蟲孵化后于6小時內接種到稻株的基部。人工接蟲的時期選在水稻生長的中后期即從秧苗最高分蘗期至抽穗期為止。人工接蟲的蟲量約為每株150條1齡幼蟲(兩塊卵量/株)。接蟲后7-10天觀察記載稻株的受害情況。測試指標有枯心率、白穗率和受害株率。
自然發蟲法的植株受害癥狀是在自然發蟲達到高峰后5-7天進行調查。調查的指標有單株受害葉片數或分蘗數和受害株率。人工接蟲田塊的試驗材料的田間設計采用雙行區，每行插31株或150株，株行距為19.8cm×26.4cm，單本植。小區按順序排列，重復3次。受試材料自移栽后不打農藥。
試驗結果表明TT51-1及其雜交雜種在人工接蟲和自然發蟲后受三化螟為害的枯心率和白穗率均不到4％，極顯著地低于明恢63和汕優63對照20-90％的水平(表1-4，圖7)；受
表1、TT51-1在大田栽培條件下對人工接蟲的三化螟的抗性反應(武漢，1999)
**表示與對照的差異達1％顯著水平
表2、汕優63/Bt在大田栽培條件下對自然發生的稻縱卷葉螟和三化螟的抗性反應a(武漢，1999)
a數據來自每重復每材料30個樣本；b在T測驗前三化螟危害數據先轉換成平方根再計算；
*與對照的差異達5％顯著水平；**與對照的差異達1％顯著水平.
表3、TT51-1和汕優63/Bt在大田栽培條件下對人工接種的三化螟的抗性反應(武漢，2000)
每重復每系測定70株和每株接種150頭一齡幼蟲；**表示與對照的差異達1％顯著水平
表4、TT51-1和汕優63/Bt在大田栽培條件下對自然發生的三化螟的抗性反應(武漢，2000)*
每重復每系測定70株；**表示與對照的差異達1％顯著水平。
稻縱卷葉螟為害的葉片數每株少于0.5張，也極顯著地低于對照的每株10-34張(表5和6)。
表5、TT51-1在大田栽培條件下對自然發生的稻縱卷葉螟的抗性反應(武漢，1999)
**表示與對照的差異達1％顯著水平
表6、TT51-1和汕優63/Bt在大田栽培條件下對自然發生的稻縱卷葉螟的抗性反應*(武漢，2000)
就受害普遍程度而言，TT51-1及其雜交組合受三化螟為害的枯心株率和白穗株率平均為0-13.3％，而對照的枯心和白穗株率在人工接種條件下為70-100％(表1-4)，在自然發蟲條件下為5-100％，兩者的差異達極顯著水平。受稻縱卷葉螟為害的受害株率在轉Bt抗蟲基因材料上為0-20％，在對照材料上為100％(表5和6，圖8)。上述結果證實在大田種植和不打農藥條件下，TT51-1及其雜交雜種基因組中所攜帶的Bt轉基因對上述鱗翅目害蟲的抗蟲效果十分顯著。
(6)Bt轉基因的保產能力
Bt轉基因的保產能力由雜種大田比產試驗進行驗證。參加產量比較試驗的材料有TT51-1、汕優63/Bt(珍汕97AX TT51-1)、II優63/Bt(II-32AXTT51-1)、協優63/Bt(協青早AX TT51-1)、馬優63/Bt(馬協AXTT51-1)和原恢復系及原雜種對照明恢63和汕優63。各實驗材料的田間排列方式采用隨機區組設計，小區面積60尺2，單本植，并設打藥和不打藥兩個處理。處理內每小區重復3次。
試驗結果表明在不打藥條件下，對照明恢63和汕優63因螟蟲危害嚴重而大幅減產，平均畝產分別為218和322公斤；汕優63/Bt、II優63/Bt、協優63/Bt、馬優63/Bt等四個雜交組合則因高度抗蟲而充分顯示其產量潛力，各組合實際產量折合畝產分別達620、773、758、751和854公斤，比對照增產1.4-2.5倍(表7)。在打藥條件下，盡管蟲害減輕，但TT51-1及其所配雜種較對照明恢63和汕優63的增產幅度仍然達到極顯著水平(表8)。因此，這些結果證實外源Bt轉基因的保產和穩產性能十分優異。
表7、TT51-1及其雜交組合在不打藥條件下產量比較試驗結果(武漢，2000)
表8、TT51-1及其雜交組合在打藥條件下產量比較試驗結果(武漢，2000)
就經濟性狀而言，轉基因材料與對照的差異主要反映在親本的生育期和親本及雜種的有效穗兩個方面。在生育期方面，TT51-1的生育期為130.5天，而原品種對照明恢63的生育期為128.2天，前者比后者長2.3天(表9和10)。就有效穗而言，無論是轉基因親本TT51-1，還是轉基因雜種汕優63/Bt，在打藥和不打藥條件下均比原親本和原雜種對照有顯著增加，增幅達5％以上。其它經濟性狀則未見顯著差異。
表9、TT51-1及其雜交組合與對照品系在大田栽培及不打藥條件下的農藝形狀比較(武漢，2000)
表10、汕優63/Bt和馬優63/Bt及對照汕優63各農藝形狀在湖北省環境釋放點的平均表現(2001)
*表示與對照的差異達5％顯著水平。其LSD0.5＝75.2公斤/畝；LSD0.1＝110.2公斤/畝
綜上所述，TT51-1受體基因組中的Bt轉基因不僅插入位點單一、整合的轉基因拷貝數相對較少和抗抗生素標記基因已經通過自交分離去除，而且其遺傳與表達穩定、抗螟蟲等鱗翅目害蟲的能力強。因此，可以認為，Bt基因在TT51-1基因組中的插入和整合的位點，就是符合本發明目的的特定位點。
實施例2復合轉基因結構的分離、測序分析和染色體定位
復合轉基因結構即包含了外源插入序列和整合位點旁側序列的全部DNA一級結構。要弄清復合轉基因結構首先必須分離鄰近插入位點的旁側序列，然后再分離出該插入位點上的外源DNA序列，測序后即可確定其全部DNA一級結構。插入位點的染色體定位可通過網上生物信息學比對分析，利用水稻已知基因組序列進行確定。
鄰近插入位點的旁側序列的分離應用劉耀光等人發明的TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced-PCR)即熱不對稱巢式PCR技術進行。TAIL-PCR利用一套巢式特異引物和短的隨機簡并引物(Shortarbitary degenerate primers)，在交錯應用不同退火溫度條件下，使靶標DNA得到優先擴增，并抑制非靶標DNA的擴增。所用的巢式特異引物和簡并引物見表11和12。TAIL-PCR共分三輪完成，各輪反應體系略有不同，其中第一輪的反應體系如表13。
表11、TAIL-PCR反應中應用的隨機簡并引物(ADn)及其特點
注退火溫度根據Tm＝69.3+0.41(GC％)-650/L(L為引物長度)公式計算，平均退火溫度為GC含量最高和GC含量最低時引物退火溫度的平均值。
表12、TAIL-PCR或PCR反應中應用的特異引物(SP1-3)及其特點
表13、TAIL-PCR第一輪反應體系
a用于第一輪反應的特異引物；b用于第一輪反應的簡并引物
第一輪PCR擴增后，將其產物稀釋40倍，并取1μl作為第二輪擴增的模板，第二輪的反應體系如表14。第二輪PCR擴增后，其產物稀釋10倍，并取1μl作為第三輪擴增的模板，第三輪的反應體系如表15。
表14、TAIL-PCR第二輪反應體系
a用于第二輪反應的特異引物；b用于第二輪反應的簡并引物
表15TAIL-PCR第三輪反應體系
各輪TAIL-PCR的反應條件見表16。TAIL-PCR產物用1％凝膠電泳檢測，電泳結果由凝膠成像系統拍攝保存。對經凝膠電泳鑒定為特異帶的第二輪或第三輪TAIL-PCR產物，切膠后，用大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)生產的瓊脂糖膠DNA純化試劑盒(TakaRaAgarose Gel DNA Purification Kit)純化回收，然后用T4DNA連接酶將其連接到TA載體pMD 18-T上。連接反應系統遵照廠家提供的說明書進行。連接反應在PCR儀上進行，其反應條件如下16℃10分鐘，20℃5分鐘，4℃2分鐘；40個循環，然后65℃10分鐘，反應完畢后于4℃保存。
表16、TAIL-PCR各輪反應的反應條件
注延伸時間和退火溫度可分別根據產物長度和引物不同作相應調整。
連接產物然后用熱激法或電轉化法轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，用藍白斑法選擇陽性克隆，并用PCR擴增目標片段進行驗證。驗證后的陽性克隆送到上海生物工程有限公司或大連寶生物(Takara)工程有限公司進行測序。
(1)TT51-1轉基因插入位點上游側翼片段的克隆
首先用pFHBT1質粒單一切點酶KpnI酶切TT51-1的基因組總DNA，酶切后的DNA片段經1％凝膠電泳后按4-9kb、9-16kb和16-30kb分段回收，分別自連后作為模板；以Bt1533、Bt1593和Bt1747為巢式特異引物分別與隨機簡并引物AD1、AD2、AD3、AD4、AD5、AD6、AD7、AD8和AD9配對進行TAIL-PCR擴增，結果從16-30kb的自連片段中擴增出一條特異帶，記為Bt1747AD5，其長度為2.303kb(圖9)。為驗證這一擴增結果，重新酶切TT51-1基因組DNA，經電泳回收16-30kb的片段，自連后用作模板進行TAIL-PCR擴增，結果再次獲得Bt1747AD5特異片段。因此，初步認為Bt1747AD5是期望的側翼片段。
換用Bt基因下游290bp處另一質粒單切點酶ClaI酶切TT51-1基因組總DNA，經電泳、分段回收和分別自連后作為模板，以pBt1533、pBt1593和pBt1747為特異引物分別與隨機簡并引物AD1、AD2、AD3、AD4、AD5、AD6、AD7和AD8配組進行TAIL-PCR擴增，結果得到多條特異帶(圖10)。分別對上述特異帶進行克隆、測序和網上同源序列比較，發現ClaI酶切自連的擴增產物中有一個1.420kb的片段Bt1747AD2與先前用KpnI酶切并自連后的擴增產物Bt1747AD5(2.303kb)片段都位于水稻第10染色體的同一BAC克隆上(基因庫收錄編號是AC122146或AC091238)，兩者僅相距3015bp。因而，證實這兩個TAIL-PCR擴增產物確實是期望的側翼片段。這兩個擴增片段的測序結果見圖11和圖12。
(2)TT51-1轉基因插入位點下游旁側翼片段的克隆
直接以TT51-1基因組總DNA為模板，以pBt1533、pBt1593、pBt1747為特異引物，與隨機簡并引物AD1、AD2、AD3、AD4、AD5、AD6、AD7和AD8匹配作TAIL-PCR擴增，結果得到多條特異帶(圖13)。分別對這些特異帶進行克隆、測序和網上同源序列比較，發現其中的一個2.3kb的片段Bt1747AD7的3′端含有48個堿基長度的水稻基因組序列(后證實為緊鄰插入位點的邊界序列)，緊接著反方向上朔為128bp的未知來源序列和2kb長的Bt基因及其載體序列。由網上同源序列比較的結果顯示這個48bp短片段也是位于水稻第10染色體的同一個BAC克隆(AC122146或AC091238)上，它與上游的兩個片段的3′端分別相距11,839bp和17,030bp。因此，證實這一短序列就是插入位點下游的旁側序列(圖14)。
(3)TT51-1轉基因插入位點上下游旁側翼片段的克隆
根據網上與TT51-1轉基因插入位點對應的已知序列在轉基因插入位點的上游及其下游各合成若干特異引物，并與載體序列上的一系列特異引物分別匹配進行PCR擴增，獲得一系列特異片段。從中選擇了兩個長度為1.5kb和2.0kb的擴增產物(圖15)，MHL2714Act266和MHR1883Vec1993進行克隆、測序和網上同源序列比較，結果證實它們分別是含轉基因插入位點上游的緊鄰邊界序列和包含48bp短序列在內的下游的緊鄰邊界序列(圖16)。
(4)TT51-1基因組中兩個Bt轉基因拷貝間連接序列的克隆
考慮到前述結果已經證實兩個Bt轉基因拷貝是以頭尾相接的方式插入到受體基因組中這一事實，因此，要擴增這兩個拷貝之間的連接序列，其引物對的設計方向必須是從5′端拷貝遠下游的基因編碼區到3′端拷貝遠上游的啟動子序列。依照此思路共設計了4個PCR特異引物Act3、AcT29、Act266和Act409，將其分別與Bt基因的1個特異引物Bt1747配對擴增兩個Bt轉基因拷貝之間的連接序列，結果都得到了期望大小的片段(圖17)。從中選擇一個1.2kb的亮帶Bt1747Act29進行克隆和測序，并將測得的序列(圖18)與已知的質粒載體和基因及啟動子序列加以比較，發現自5′端開始，最前面的106bp是第一個Bt轉基因拷貝的3′端編碼序列，其中首20bp如下劃線表出的為Bt1747引物序列；接下來的349bp是終止子及其緊鄰的載體序列；接著是反向插入的長度為51bp的ActI內含子序列；再接下來的98bp仍然是第一個Bt轉基因拷貝的載體序列，只是其中的123bp被反向插入的長度為51bp的ActI內含子序列所替換；緊接著的550bp和74bp分別是第二個Bt轉基因拷貝的載體序列和ActI啟動子序列，在末端用下劃線表出的20bp為Act29引物序列。具體說來，在該實施方案中Bt基因之間的連接序列如SEQ ID NO.4所示。
(5)TT51-1復合轉基因結構及其插入位點的染色體定位
將上述經分離、測序和驗證的插入位點上下游旁側序列、外源Bt基因及其啟動子和終止子序列和轉基因拷貝之間的連接序列拼接起來即為本發明所述的復合轉基因一級DNA結構，也即復合轉基因結構。將克隆的轉基因插入位點的旁側序列所在的BAC克隆基因庫收錄序號(GenBank Accession No)輸入禾本科數據庫(Gramene datab se)進行搜索，得出其插入位點位于水稻第10染色體短臂靠近著絲點的位置上，具體在第5354669至第5354670堿基之間。進一步按復合轉基因結構各組成部分片段大小繪出的結構圖及其各酶切片段長度見圖19。
對插入位點兩邊的水稻基因組序列分析表明，遠離該插入位點上游(5′端)5.668kb和下游0.900kb處各有一個長度均為500bp的富AT序列，即所謂MAR序列。這兩個MAR序列具有所有MAR序列應有的典型特征如A盒(AATAAAAA/CAA)或T盒(TATAAA)；拓撲異構酶II識別序列(TATACGCATGCT)；復制起始點序列(ATTA，ATTTA和ATTTTA)；富TG區；卷曲DNA花式(AAAAn7AAAn7AAAA，TTTAAA)；彎曲DNA花式[TG(CA or TA)n2-4 or 9-12TG(CA or TA)]和ATC規律等。在這兩個MAR序列之間包含1個內源的水稻基因，外源的兩拷貝Bt轉基因與這個內源的水稻基因一起組成一個相對獨立的轉錄單位，因而，能夠穩定地遺傳與表達。
實施例3外源Bt轉基因復合結構的有性雜交轉育
無特別說明的情況下，轉育試驗中采用的試驗方法和試驗材料均是本領域技術人員常規采用的。
1轉Bt基因復合結構的BT5193的選育
以TT51-1為供體親本，以常規水稻品種9311為受體親本進行雜交，雜交后代進行系譜選育，并在系譜選育過程中輔以分子標記選擇來清除供體親本的遺傳背景和追蹤外源Bt基因的傳遞情況，于F4代獲得了含有本發明所述的復合轉基因結構的穩定抗蟲株系BT5193。從該株系葉片組織中提取DNA，擴增出Bt基因及其側翼的DNA片斷(圖20-21)。經測序分析證證實，來自于供體親本的由SEQ ID NO.1、Bt復合轉基因結構和SEQ ID NO.2構成了插入在基因組上的外源Bt復合轉基因結構保持不變，穩定的轉育到新的受體材料之中。經田間抗蟲性試驗，所育成的抗蟲株系BT5193具有良好的抗蟲性，高抗水稻螟蟲。
2轉Bt基因復合結構的BT51725的選育
以TT51-1為供體親本，以水稻三系恢復系綿恢725為受體親本進行雜交，雜交后代進行系譜選育，并在系譜選育過程中輔以分子標記選擇來清除供體親本的遺傳背景和追蹤外源Bt基因的傳遞情況，于F5代獲得了含有本發明所述的復合轉基因結構的穩定抗蟲株系BT51725。從該株系葉片組織中提取DNA，擴增出Bt基因及其側翼的DNA片斷(圖20-21)。經測序分析證證實，來自于供體親本的由SEQ IDNO.1、Bt復合轉基因結構和SEQ ID NO.2構成了插入在基因組上的外源Bt復合轉基因結構保持不變，穩定的轉育到新的受體材料之中。經田間抗蟲性試驗，所育成的抗蟲株系BT5193具有良好的抗蟲性，高抗水稻螟蟲。
3轉Bt基因復合結構的水稻抗蟲光溫敏雄性不育系BT5118的培育
根據本領域技術人員的常規操作方法，以TT51-1為供體親本，以水稻光溫敏雄性不育系2018S為受體親本進行一次雜交，3次回交和兩次自交，并在回交過程中輔以分子標記選擇來清除供體親本的遺傳背景和追蹤外源Bt基因的傳遞情況，同時進行系譜選育和水稻光溫敏雄性不育特性的選育，于BC3F2代獲得了含有本發明所述的復合轉基因結構的穩定具有光溫敏雄性不育特性的株系BT5118。從該株系葉片組織中提取DNA，擴增出Bt基因及其側翼的DNA片斷，經測序分析證證實，來自于供體親本的由SEQ ID NO.1、Bt復合轉基因結構和SEQID NO.2構成了插入在基因組上的外源Bt復合轉基因結構保持不變，穩定的轉育到新的受體材料之中。應用與實施例1類似的方式，經田間抗蟲性試驗，所育成的抗蟲株系BT5118具有良好的抗蟲性，高抗水稻螟蟲，并且具有光溫敏雄性不育特性，可以用于兩系雜交水稻制種應用。
4轉Bt基因復合結構的水稻抗蟲三系不育系的選育
以TT51-1為供體親本，以水稻三系不育系保持系為受體親本進行雜交，對雜交后代進行系譜選育，并在系譜選育過程中輔以分子標記選擇來清除供體親本的遺傳背景和追蹤外源Bt基因的傳遞情況，可以獲得含有本發明所述的復合轉基因結構的穩定抗蟲保持系。用此保持系和其相應的不育系連續雜交兩代并根據后代抗蟲性分離情況的鑒定就可以獲得含有本發明所述的復合轉基因結構的穩定抗蟲不育系。
同樣地，從技術上分析，利用雜交系譜法和體細胞雜交法，也可達到相同的目的。另外，利用上述方法進行轉育，所用的受體親本除了恢復系、保持系和不育系以外，還可以是常規水稻品種。在分類上這些品種或系可以是秈稻粳稻、爪洼稻等亞洲栽培稻，亦可以是非洲栽培稻和它們的近緣野生種。
序列表
<110>浙江大學
<110>華中農業大學
<120>一種受植物系統獲得性抗性誘導劑誘導的啟動子及其應用
<170>PatentIn version 3.1
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<400>1
CGACTTTCAA GCATCAGTAC AGGAAGGATA AAAAGTGCCG AACATGGAGA 50
<210>2
<211>50
<212>DNA
<213>水稻(Oryza Sativa)
<400>2
CAGATAAGCA GTAGTGGTGG GGCTACGAAC ATATTCCTTT TCCTTCTGGA 50
<210>3
<211>610
<212>氨基酸序列
<213>水稻(Oryza Sativa)
<400>3
MDNNCRPYNC LSNPEVEVLG GERIETGYTP IDISLSLTQF LLSEFVPGAG FVLGLVDIIW 60
GIFGPSQWDA FLVQIEQLIN QRIEEFARND AISRLEGLSN LYQIYAESFR EWEADPTNPA 120
LREEMRIQFN DMNSALTTAI PLFAVQNYQV PLLSVYVQAA NLHLSVLRDV SVFGQRWGFD 180
AATINSRYND LTRLIGNYTD HAVRWYNTGL ERVWGPDSRD WIRYNQFRRE LTLTVLDIVS 240
LFPNYDSRTY PIRTVSQLTR EIYTNPVLEN FDGSFRGSAQ GIEGSIRSPH LMDILNSITI 300
YTDDHRGEYY WSGHQIMASP VGFSGPEFTF PLYGTMGNAA PQQRIVAQLG QGVYRTLSST 360
LYRRPFNIGI NNQQLSVLDG TEFADGTSSN LPSAVYRKSG TVDSLDEIPP QNNNVPPRQG 420
FSHRLSHVSM FRSGFSNSSV SIIRAPMFSW IHRSAEFNNI IASDSITQIP AVRGNFLFNG 480
SVISGPGFTG GDLVRLNSSG NNIQNRGYIE VPINFPSTST RYRVRVRYAS VTPIHLNVNW 540
GNSSIFSNTV PATATSLDNL QSSDFGYFES ANAFTSSLGN IVGVRNFSGT AGVIIDRFEF 600
IPVTATLEAE610
<210>4
<211>797
<212>DNA
<213>水稻(Oryza Sativa)
<400>4
CATCGATGAT ATCAGATCTG CCGGTCTCCC TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGATAAGCC 60
AGCACATCTA AGCCTGACGA AGCAGCAGAA ATATATAAAA ATATAAACCA TGCTCACTCA120
AAGGCGGTAA CACGGTTATC CACAGAATCA GGGGATAACG CAGGAAAGAA CATGTGAGCA180
AAAGGCCAGC AAAAGGCCAG GAACCGTAAA GCGTTTCTGG GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC240
AAAATGCCGC AAAAAAGGGA ATAAGGGCGA CACGGAAATG TTGAATACTC ATACTCTTCC300
TTTTTCAATA TTATTGAAGC ATTTATCAGG GTTATTGTCT CATGAGCGGA TACATATTTG360
AATGTATTTA GAAAAATAAA CAAATAGGGG TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA AAAGTGCCAC420
CTGACGTCTA AGAAACCATT ATTATCATGA CATTAACCTA TAAAAATAGG CGTATCACGA480
GGCCCTTTCG TCTCGCGCGT TTCGGTGATG ACGGTGAAAA CCTCTGACAC ATGCAGCTCC540
CGGAGACGGT CACAGCTTGT CTGTAAGCGG ATGCCGGGAG CAGACAAGCC CGTCAGGGCG600
CGTCAGCGGG TGTTGGCGGG TGTCGGGGCT GGCTTAACTA TGCGGCATCA GAGCAGATTG660
TACTGAGAGT GCACCATATG GACATATTGT CGTTAGAACG CGGCTACAAT TAATGCATAA720
CCTTATGTAT CATACACATA CGATTTAGGT GACACTATAG AACTCGAGCA GCTGAAGCTT780
GCATGCCTGC AGGTCGA 79權利要求
1.一種重組水稻細胞，其特征在于在該細胞的基因組的特定位點上攜帶了一種能穩定遺傳的復合轉基因結構，所述特定位點是水稻基因組第10染色體的第5354619與5354720位堿基之間的區域。
2.如權利要求1所述的水稻細胞，其特征在于，所述的細胞是光溫敏不育系水稻細胞、雄性不育恢復系水稻細胞、質核互作雄性不育系或者質核互作雄性不育系保持系水稻細胞。
3.如權利要求1或2中任意一項所述的水稻細胞，其特征在于，所述的一種能穩定遺傳的復合轉基因結構是由以下幾部分序列沿5′到3′方向順序連接而成
(i)SEQ ID NO.1所示的序列，或其中經插入、缺失、替換、添加一個或幾個核苷酸所得的不導致水稻細胞不良表型的核酸序列；
(ii)外源基因序列；
(iii)SEQ ID NO.2所示的核酸序列，或其中經插入、缺失、替換、添加一個或幾個核苷酸所得的不導致水稻細胞不良表型的核酸序列。
4.如權利要求3所述的水稻細胞，其中(ii)中所述的外源基因是編碼SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核酸序列，或在所述核酸序列中經插入、缺失、替換、添加一個或幾個核苷酸后所得的與編碼SEQ ID NO.3所示氨基酸序列功能相同的核酸序列。
5.如權利要求3所述的水稻細胞，其中(ii)中所述的外源基因是間以連接序列的兩個拷貝的Bt基因。
6.如權利要求5所述的水稻細胞，其中所述的連接序列是如SEQID NO.4所示的核酸序列，或其中經插入、缺失、替換、添加一個或幾個核苷酸所得的不影響所插入的Bt基因功能的核酸序列。
7.如權利要求1所述的水稻細胞，其特征在于，所述細胞是保藏號為CCTCC-P200501的細胞。
8.包含如權利要求1-7中任意一項所述的水稻細胞的植物組織。
9.一種改善水稻抗蟲特性的方法，該方法包括應用權利要求1-8中任意一項所述的水稻細胞或植物組織的步驟。
10.一種外源基因整合位點，其特征在于，所述位點是水稻基因組第10染色體的第5354619至5354720位堿基之間的區域。
全文摘要
本發明提供在水稻基因組上的一個可以有效地整合了外源基因并使整合的外源基因可以穩定地表達、而又對受體植株的農藝性狀沒有明顯的不良影響的特定位點。此外，還提供一種復合基因結構，該基因結構可以是由特定位點上下游旁側的水稻基因組DNA序列，與該位點的外源基因DNA序列相整合，構成的遺傳上穩定的復合轉基因結構，并可以通過有性雜交和體細胞雜交技術重組到新的水稻種質中去，培育成為水稻新品種(系)。
文檔編號C12N15/82GK1840655SQ200510062980
公開日2006年10月4日 申請日期2005年3月31日 優先權日2005年3月31日
發明者凃巨民, 張啟發, 黃海清, 潘剛, 何予卿, 張集文 申請人:浙江大學, 華中農業大學