專利名稱：一種微生物利用甘油厭氧發酵生產1,3－丙二醇的方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，涉及利用單一微生物將可發酵的甘油碳源生物轉化為1，3-丙二醇的方法。
背景技術：
眾所周知，1，3-丙二醇是重要的化工原料和醫藥中間體，是一種在生產聚酯纖維中和在制造聚亞胺酯及環狀化合物中具有潛在應用價值的單體。
目前工業上主要采取化學合成法來進行1，3-丙二醇的生產。已經知道有很多種化學途徑能夠生產1，3-丙二醇，但化學法副產物多，產品分離提純較困難，生產成本相應較高。相比之下，生物轉化法生產1，3-丙二醇以其利用再生資源、對環境污染小等特點越來越受到人們的重視。
目前生產1，3-丙二醇的微生物法大致可分為三類一是用腸道細菌將甘油歧化為1，3-丙二醇(USP5254467和EP0373230 A1)；二是以葡萄糖為底物用基因工程菌生產1，3-丙二醇(PCT/US 96/-6705、USP5599689、WO 96/35796、WO 9821340及WO 9821339)；三是將生產甘油和1，3-丙二醇的兩株菌混合培養(USP 5599689)。這些方法各有優缺點第一種方法的轉化率和產物濃度均較高，但是甘油價格偏高，影響1，3-丙二醇的生產成本；第二種方法可以降低原料成本，但基因工程菌的生產能力及其穩定性還不太理想；第三種方法有助于減少兩步發酵的時間，但由于兩種菌的生長條件不盡相同，如產甘油菌通常在好氧條件下生長，而產1，3-丙二醇菌通常在厭氧條件下生長，因此很難取得較為理想的效果。
就目前情況來看，甘油轉化1，3-丙二醇的技術最為成熟，效果也最好。比較理想的方法是利用甘油做底物，以克雷伯氏菌(Klebsieblla penumoniae)、非氏檸檬酸菌(Citrobacter freandii)和丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridiumbutyricum)等厭氧或兼性厭氧菌為發酵菌種。這些發酵菌種已經解決了底物和產物高濃度耐受能力差的問題。它們利用甘油進行厭氧或兼性厭氧代謝生產1，3-丙二醇都是通過氧化和還原兩個支路進行的，兩個支路間通過生物體的能荷(由ATP提供)與氫荷(由NADH2提供)維持代謝通量分布。氧化途徑主要步驟1)甘油經甘油脫氫酶(Glycerol dehydrogenase，GDH)催化生成2-羥基丙酮(DHA)，此酶為厭氧酶，以NAD+為輔酶，受到體系的氫荷水平的影響；2)DHA在ATP及2-羥基丙酮激酶(Dihydroxyacetone kinase)的作用下，生成磷酸二羥丙酮(DHAP)；3)DHAP進一步代謝生產丙酮酸。丙酮酸是代謝過程中很重要的中間產物，它進一步代謝為各種小分子產物，如乙酸、乳酸、乙醇、甲醇等，同時產生菌體生長和生產所必需的NADH2和ATP，這些小分子副產物再進行厭氧發酵。隨著發酵的進行，它們的累積極大地影響了菌體生長與生產的能力。還原途徑有兩步酶反應1)甘油脫水酶(Glycerol dehydrogenase，GDHt)厭氧情況下(即反應體系處在較低的氧化還原電位)將甘油轉化為中間產物3-羥基丙醛(3-HPA)；2)在NADH2存在下，3-HPA經1，3-丙二醇脫氫酶(1，3-Propanediol dehydrogenase，PDDH)催化生成1，3-丙二醇。氧化途徑為還原途徑提供足夠的NADH2。
與化學合成法相比，目前的甘油轉化法存在產物濃度低、生產周期長和甘油轉化率低等問題，導致缺乏市場競爭力而無法實現工業化應用。其中，甘油轉化率較低是導致其生產成本居高不下的一個重要因素。目前解決甘油轉化率低的問題主要是采用雙底物協同發酵的方法，例如CN 1434122A中以葡萄糖為輔助底物進行兩段雙底物集成發酵生產1，3-丙二醇，甘油轉化率有所提高，但1，3-丙二醇的產量不高，在菌體利用甘油發酵后期生長能力較弱。Sylvie等人通過調節混合培養基中葡萄糖與甘油的比例來研究，也發現添加這些輔助底物雖然可以提高甘油轉化率，但甘油向1，3-丙二醇的代謝通量不大，應用前景不甚明朗。CN 1446919A中利用1，3-丙二醇生物合成過程中需要消耗一定量還原當量的特性，在發酵培養基或在厭氧發酵過程中添加適量的還原劑，增強菌體中還原當量(NADH2)的積累，促進底物甘油沿還原途徑代謝，以提高1，3-丙二醇的合成濃度和轉化率。該方法的甘油轉化率以及發酵效率提高幅度有限。
上述各種方法都沒有很好地提高發酵效率。各種文獻資料表明，添加少量多種有機物質進行有效代謝還未有報道。
發明內容
針對單一菌體利用甘油厭氧發酵轉化率低的問題，本發明提供了一種甘油發酵合成1，3-丙二醇的改進方法，即在發酵培養基或厭氧發酵過程中添加適量的有機中間代謝分子，加強氧化代謝支路中丙酮酸以后的代謝過程，使丙酮酸的后續代謝流主要向著TCA循環進行，從而在提供給甘油還原支路中形成1，3-丙二醇時所需NADH的同時，削弱菌體在厭氧情況下較多生成乙酸、乳酸、乙醇、甲醇小分子副產物等代謝流的趨勢，改善菌體代謝過程，增加菌體生長與生產的相互耦合性，提高發酵效率。
本發明技術方案為制備用于培養克雷伯氏桿菌的發酵培養基，并往上述培養基中接入克雷伯氏桿菌種子培養液，進行厭氧發酵以合成1，3-丙二醇，其特征在于，往所述發酵培養基中加入有機中間代謝分子。所述的有機中間代謝分子選自檸檬酸、琥珀酸、延胡索酸或蘋果酸中的一種或幾種，在發酵培養基中的濃度為0.1g/L～1.0g/L。
本發明另一種方案是制備用于培養克雷伯氏桿菌的發酵培養基，并往上述培養基中接入克雷伯氏桿菌種子培養液，進行厭氧發酵以合成1，3-丙二醇，其特征在于，在進行厭氧發酵合成1，3-丙二醇的過程中，在菌體生長的指數期添加有機中間代謝分子。所述的有機中間代謝分子選自檸檬酸、琥珀酸、延胡索酸或蘋果酸中的一種或幾種，其在發酵液中的濃度為0.1g/L～1.0g/L。
本發明方法通過添加有機中間代謝分子，實現了1，3-丙二醇發酵過程中底物與產物間理想的通量分布，進而實現高效的1，3-丙二醇發酵。這種方法的益處在于大大簡化了微生物發酵生產1，3-丙二醇的工藝過程，突破了甘油生物法生產1，3-丙二醇甘油轉化率低的瓶頸，提高了底物轉化率，縮短了發酵時間，從而降低了生產成本，為微生物利用甘油發酵法生產1，3-丙二醇的工業化奠定了基礎。
具體實施例方式
本發明方案的具體實施方式
按照現有技術的步驟進行，本發明方案一具體步驟為
(1)培養基制備基本培養基中必須含有菌體生長所需的營養成分，碳源為甘油，氮源為酵母膏或銨鹽，另外還含有鈉、鉀、銨、鎂、鈣等陽離子和磷酸根、硫酸根、氯離子等陰離子，以及鋅、鐵、鎳、銅、鈷、硼和鉬等微量元素。此外往培養基中添加適量的有機中間代謝分子，所述有機中間代謝分子選自檸檬酸、琥珀酸、延胡索酸或蘋果酸中的一種或幾種，其加入濃度為0.1g/L～1.0g/L。培養基在121℃、0.1MPa下滅菌20分鐘使用。
(2)種子培養搖瓶中進行培養，溫度為32℃～42℃，轉速為100～200轉/分鐘，培養時間為15～30小時，氮氣通入量為0.1～1升/分鐘。
(3)發酵培養發酵罐中進行培養，接種量10v％～15v％，轉速為100～300轉/分鐘，溫度控制在32℃～42℃，pH控制在5.0～9.0之間。發酵罐保持厭氧條件，氮氣通入量為2～4vvm。
發酵方式可以是間歇發酵、批式流加發酵或連續發酵。間歇或批式流加發酵時間為20～60小時，連續發酵的穩態時間為30～40小時，發酵液中1，3-丙二醇的最終濃度可達到20g/L～70g/L，底物的摩爾轉化率可達到50％～80％。
間歇發酵時培養基中甘油的濃度為15g/L～30g/L，批式流加發酵時補加的甘油濃度為70g/L～90g/L，連續發酵培養基中甘油濃度為15g/L～30g/L。連續發酵時以20g/L的初始甘油濃度進行一級培養，直到菌濃超過2.0g/L后，開始連續流加新鮮的培養基進行穩態發酵過程，稀釋率為0.5～1.0h-1。
本發明方案二的實施步驟為將方案一中添加的有機中間代謝分子改為在發酵過程中菌體生長的指數期加入，加入濃度不變。
本發明還可以同時在種子培養基中加入適量的有機中間代謝分子，所述有機中間代謝分子選自檸檬酸、琥珀酸、延胡索酸或蘋果酸中的一種或幾種，在種子培養基中的濃度為0.1g/L～1.0g/L。
除了加入適量的有機中間代謝分子，本發明還可以在發酵培養基或厭氧發酵過程中菌體生長的指數期添加適量的維生素C和/或維生素E還原劑，加入量為40mg/L～150mg/L。
以下通過實施例對本發明方案作進一步的闡述。本發明比較例和實施例中均采用批式流加發酵方式。
實施例1本發明實施例中所用的菌種為克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)，來自中國石化撫順石油化工研究院專利菌種，菌種在中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)，菌種保藏號0798。
培養基分種子培養基和發酵培養基兩種種子培養基組成(1L)K2HPO4 34gKH2PO4 13g(NH)4SO4 6g MgSO4·7H2O0.2gCaCl2·H2O0.02g CaCO32.0g酵母膏 1.0g甘油 60gFe2+溶液2.0mL 微量元素溶液I 1.0mL其中Fe2+溶液(FeSO45g/L HCl(37％)4.0mL)微量元素溶液I組成(mg/L)MgSO4·4H2O 100mg/L ZnCl270mg/LNa2MoO4·2H2O35mg/LH3BO3 60mg/LCoCl2·6H2O 200mg/L CuSO4·5H2O 29.28mg/LNiCl2·6H2O 25mg/L 37％HCl 0.9mL發酵培養基組成(1L)NH4Cl 5.35g KCl 0.75gNaH2PO4·H2O1.38g Na2SO4 0.28gMgCl2·6H2O 0.26g CaCl2·H2O0.0029g檸檬酸 0.2g 酵母膏 1.0g泡敵(稀)0.1mL甘油 40.0g微量元素溶液II 5mL其中微量元素溶液II組成(mg/L)FeCl3·6H2O5.0mg/L Na2MoO4·2H2O0.005mg/LZnCl2·6H2O0.68mg/L MnCl2·4H2O 0.17mg/LH3BO3 0.06mg/L CoCl2·6H2O 0.47mg/L
CuCl2·2H2O0.17mg/L 37％HCl1.0mL種子與發酵培養基在滅菌前均要把pH調節為7.0。
發酵過程分種子培養和發酵培養兩步。
種子培養在500mL的帶有擋板的三角搖瓶中進行，裝液量為200mL，瓶口用橡皮塞密封，并在瓶塞上帶有兩個進出氣口，進氣口由導管通入底部，通入氮氣流量為0.1～1升/分鐘，搖床轉速為150轉/分鐘，培養溫度為37℃，培養時間為20小時。
發酵培養在全自動發酵罐中進行，發酵體積為6L，溫度和轉速恒定在37℃和150轉/分鐘，氮氣通氣量為3vvm，用5mol/L的氫氧化鈉調節pH控制在7.0，發酵時間40～60小時。
具體的發酵實驗結果如下起始甘油濃度為20g/L，有機中間代謝分子起始濃度為0.2g/L，完全厭氧發酵過程中甘油濃度維持在～40g/L。本發酵周期的時間為40小時，最終測得發酵液中1，3-丙二醇的濃度為54.5g/L，甘油摩爾轉化率為52.1％。
比較例1為未添加有機酸時進行的發酵實驗。
實施例2-5分別為添加不同有機酸和不同濃度有機酸進行的發酵實驗，比較例1和實施例1-5所得的實驗結果列于表1。
實施例6-10是在發酵過程中菌體生長的指數期(約第4-12小時)加入有機酸，在發酵培養基中不加有機酸，其它條件不變，實驗結果列于表2。
由表1可見，在發酵培養基中加入0.1g/L～1.0g/L的有機中間代謝分子，在維持1，3-丙二醇的濃度相當的情況下，能使甘油的摩爾轉化率提高2.0到15.4個百分點。而表2則顯示，在發酵過程中菌體生長的指數期加入0.1g/L～1.0g/L的有機中間代謝分子，在維持1，3-丙二醇的濃度相當時，能使甘油的摩爾轉化率提高4.3到31.5個百分點。
通過上述實驗證明，本發明提出的添加有機中間代謝分子促進菌體合成1，3-丙二醇的方法，在保證菌體高產的同時，大幅提高了菌體生產產物的效率，降低了生產成本。
表1發酵培養基中添加有機中間代謝分子實驗結果
表2菌體生長指數期添加有機中間代謝分子實驗結果
權利要求
1.一種微生物利用甘油厭氧發酵生產1，3-丙二醇的方法，含有制備用于培養克雷伯氏桿菌的發酵培養基，并往上述培養基中接入克雷伯氏桿菌種子培養液，進行厭氧發酵合成1，3-丙二醇的步驟，其特征在于，在所述發酵培養基中加入濃度為0.1g/L～1.0g/L的有機中間代謝分子。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述有機中間代謝分子選自檸檬酸、琥珀酸、延胡索酸或蘋果酸中的一種或幾種。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述發酵培養基中加入維生素C和/或維生素E還原劑，加入量為40mg/L～150mg/L。
4.一種微生物利用甘油厭氧發酵生產1，3-丙二醇的方法，含有制備用于培養克雷伯氏桿菌的發酵培養基，并往上述培養基中接入克雷伯氏桿菌種子培養液，進行厭氧發酵合成1，3-丙二醇的過程，其特征在于，在進行厭氧發酵合成1，3-丙二醇的過程中，在菌體生長的指數期添加有機中間代謝分子，所述有機中間代謝分子在發酵液中的濃度為0.1g/L～1.0g/L。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述有機中間代謝分子選自檸檬酸、琥珀酸、延胡索酸或蘋果酸中的一種或幾種。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，在菌體生長的指數期加入維生素C和/或維生素E還原劑，加入量為40mg/L～150mg/L。
全文摘要
本發明提供了一種添加有機中間代謝分子促進菌體合成1，3－丙二醇的方法，屬于1，3－丙二醇生物合成技術領域。針對現有技術中單一菌體利用甘油厭氧發酵轉化率低的問題，本發明通過在發酵培養基中或在菌體生長的指數期添加適量有機中間代謝成分，實現了1，3－丙二醇發酵過程中底物與產物間理想的通量分布，進而實現高效的丙二醇發酵。本發明方法突破了利用甘油生物法生產1，3－丙二醇轉化率低的瓶頸，提高了底物轉化率，縮短了發酵時間，從而降低了生產成本。
文檔編號C12R1/22GK1955304SQ200510047540
公開日2007年5月2日 申請日期2005年10月26日 優先權日2005年10月26日
發明者王領民, 金平, 佟明友 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院