一種檢測生物恐怖相關病原細菌的方法及其專用dna芯片的制作方法

專利名稱：一種檢測生物恐怖相關病原細菌的方法及其專用dna芯片的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測生物恐怖相關病原細菌的方法及其專用DNA芯片。
背景技術：
自從美國經歷“炭疽郵件”襲擊事件以后，反生物恐怖已經成為國際反恐斗爭中一個重要組成部分。應對生物恐怖威脅的先決條件之一就是要對于生物恐怖相關病原進行快速、準確的檢測。
目前，利用基因芯片技術實現細菌的通用檢測鑒定一直是國內外微生物學家研究的重要領域。目前，細菌通用檢測芯片最常用的策略是利用細菌中保守的16S rRNA基因或23SrRNA基因，設計通用的擴增引物和各細菌特異的寡核苷酸探針固定在芯片上，用通用引物擴增待檢測標本并進行標記，與芯片雜交，根據雜交信號進行判斷。但是由于種種原因，所設計的一些寡核苷酸探針特異性并不理想，有比較嚴重的交叉反應現象，檢測特異性不強。

發明內容
本發明的目的是提供一種檢測生物恐怖相關病原細菌的方法及其專用DNA芯片。
本發明所提供的檢測生物恐怖相關病原細菌的DNA芯片，包括下述1)至16)中的至少一種探針1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；2)序列表中SEQ ID №2的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；3)序列表中SEQ ID №3的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)序列表中SEQ ID №4的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；5)序列表中SEQ ID №5的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；6)序列表中SEQ ID №6的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №6限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；7)序列表中SEQ ID №7的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №7限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；8)序列表中SEQ ID №8的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №8限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；9)序列表中SEQ ID №9的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №9限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；10)序列表中SEQ ID №10的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №10限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；11)序列表中SEQ ID №11的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №11限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；12)序列表中SEQ ID №12的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №12限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；13)序列表中SEQ ID №13的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №13限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；14)序列表中SEQ ID NQ14的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №14限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；15)序列表中SEQ ID №15的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №15限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；16)序列表中SEQ ID №16的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №16限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
上述高嚴謹條件可為在2×雜交液(10×SSC，0.04％SDS，200μg/μl鮭魚精DNA，10％硫酸葡聚糖)中，在65℃下雜交，之后進行洗芯片。
序列表中的SEQ ID №1由334個脫氧核苷酸組成，是炭疽芽孢桿菌致死因子基因(Balf)，可用于檢測炭疽芽孢桿菌；序列表中的SEQ ID №2由249個脫氧核苷酸組成，是炭疽芽孢桿菌保護性抗原基因(Bapa)，可用于檢測炭疽芽孢桿菌；序列表中的SEQ ID №3由268個脫氧核苷酸組成，是類鼻疽伯克霍爾德氏菌fur基因(Bpfur)，可用于檢測類鼻疽伯克霍爾德氏菌；序列表中的SEQ ID №4由319個脫氧核苷酸組成，是類鼻疽伯克霍爾德氏菌膜蛋白基因(Bpsl)，可用于檢測類鼻疽伯克霍爾德氏菌；序列表中的SEQ ID №5由416個脫氧核苷酸組成，是布魯氏菌31kd蛋白基因(Bra31kd)，可用于檢測布魯氏菌；序列表中的SEQ ID №6由413個脫氧核苷酸組成，是布魯氏菌外膜蛋白基因omp2(Bromp)，可用于檢測布魯氏菌；序列表中的SEQ ID №7由421個脫氧核苷酸組成，是伯氏考克斯體27kd抗原基因(Coxb27kd)，可用于檢測伯氏考克斯體；序列表中的SEQ ID №8由296個脫氧核苷酸組成，是伯氏考克斯體34kd抗原基因(Coxb34kd)，可用于檢測伯氏考克斯體；序列表中的SEQ ID №9由457個脫氧核苷酸組成，是土拉弗朗西斯氏菌fop基因(Ftfop)，可用于檢測土拉弗朗西斯氏菌；序列表中的SEQ ID №10由330個脫氧核苷酸組成，是土拉弗朗西斯氏菌23kD抗原基因(Ft23kd)，可用于檢測土拉弗朗西斯氏菌；序列表中的SEQ ID №11由474個脫氧核苷酸組成，是普氏立克次體rpa基因(Rickpor)，可用于檢測普氏立克次體；序列表中的SEQ ID №12由214個脫氧核苷酸組成，是普氏立克次體glta基因(Rpglta)，可用于檢測普氏立克次體；序列表中的SEQ ID №13由371個脫氧核苷酸組成，是立氏立克次體190KD抗原基因(Rricl90kd)，可用于檢測立氏立克次體；序列表中的SEQ ID №14由385個脫氧核苷酸組成，是立氏立克次體外膜蛋白基因(Rricompb)，可用于檢測立氏立克次體；序列表中的SEQ ID №15由235個脫氧核苷酸組成，是鼠疫耶爾森氏菌莢膜抗原基因(Ypcalf)，可用于檢測鼠疫耶爾森氏菌；序列表中的SEQ ID №16由317個脫氧核苷酸組成，是鼠疫耶爾森氏菌pla基因(Yppla)，可用于檢測鼠疫耶爾森氏菌。
為了提高檢測的準確性，所述DNA芯片包括下述8對探針中的至少一對探針上述1)和2)、3)和4)、5)和6)、7)和8)、9)和10)、11)和12)、13)和14)、15)和16)。
所述生物恐怖相關病原細菌包括下述八種細菌中的至少一種炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)、類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pseudomalleii)、布魯氏菌(Brucella)、伯氏考克斯體(Coxiella burnetii)、土拉弗朗西斯氏菌(Francisellatularensis)、普氏立克次體(Rickettsia prowazekii)、立氏立克次體(Rickettsiarickettsii)和鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)。
所述DNA芯片優選為包括序列表中SEQ ID №1至16的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1至16限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
本發明提供的檢測生物恐怖相關病原細菌的方法，是分別以待測樣品的DNA為模板，用下述1)至8)的8對引物對或由從所述8對引物對的每對引物對中選出的一個引物對組成的8個引物對進行PCR擴增，將得到的擴增產物和上述任意一種檢測生物恐怖相關病原細菌的DNA芯片進行雜交，如果雜交信號為陽性，則待測樣品為或含有雜交信號陽性的探針對應的生物恐怖相關病原細菌；所述8對引物對如下1)由Balf-1和Balf-B組成的引物對，和由Bapa-1和Bapa-A組成的引物對；2)由Bpfur-2和Bpfur-A組成的引物對，和由Bpsl1705-F和Bpsl1705-R組成的引物對；3)由Bra31kd-3和Bra31kd-C組成的引物對，和由Bromp2b-4和Bromp2b-D組成的引物對；4)由Coxb27kd-5和Coxb27kd-C組成的引物對，和由Coxb34kd-3和Coxb34kd-D組成的引物對；5)由Ftfop-1和Ftfop-D組成的引物對，和由Ft23kd-3和Ft23kd-B組成的引物對；6)由Rickpor-Rpa-3和Rickpor-Rpa-C組成的引物對，和由Rpglta-1和Rpglta-A組成的引物對；7)由Rric190kd-1和Rric190kd-A組成的引物對，和由Rricompb-3和Rricompb-C組成的引物對；8)由Ypcalf-2和Ypcalf-B組成的引物對，和由Yppla-2和Yppla-C組成的引物對。
上述8對引物對的序列如表1所示。
上述方法中，優選用所述1)至8)的8對引物對進行PCR擴增。
所述生物恐怖相關病原細菌包括炭疽芽孢桿菌、類鼻疽伯克霍爾德氏菌、布魯氏菌、伯氏考克斯體、土拉弗朗西斯氏菌、普氏立克次體、立氏立克次體和鼠疫耶爾森氏菌。
為了提高檢測效率，所述PCR優選為多重PCR。
本發明選擇特異基因設計引物進行普通PCR或多重PCR擴增并標記，利用單個的PCR產物作為探針，制備為DNA芯片，再進行芯片檢測分析。本發明采用特異基因多重PCR結合DNA芯片的通用檢測技術，可以克服傳統多重PCR凝膠電泳檢測方法無法區分的出現的非特異性擴增現象；而當多重PCR體系中擴增片段長度相差不大的情況下，通過傳統的凝膠電泳檢測不能區分出來，而本發明的方法可以很有效地鑒別開來。本發明不僅提高了檢測的靈敏度、特異性、穩定性和重現性，并且實現“一對多”的檢測目的，即一次實驗能檢測出一個樣品中多個目標細菌，滿足反生物恐怖的需要。
本發明選擇8種生物恐怖相關病原細菌的16個特異基因片段(每種目標細菌兩個片段)，進行普通PCR或多重PCR，完成擴增和熒光標記，從而進行DNA芯片雜交分析，給出檢測結果。本發明在檢測過程中具有較高的靈敏度和特異性，既可以避免以往多重PCR檢測中可能出現的非特異性結果，又可以避免基于保守基因的基因芯片檢測技術中經常出現的交叉反應。本發明實現了在一次實驗中同時檢測8種生物恐怖相關病原細菌(炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森氏菌、布魯氏菌、土拉弗朗西斯氏菌、類鼻疽伯克霍爾德氏菌、普氏立克次體、立氏立克次體和伯氏考克斯氏體)；而且每個靶細菌選擇兩個基因進行檢測，避免了因為基因突變等原因造成的漏檢，也提高了檢測的準確性。本發明最低可以檢測11-14CFU/ml的目標細菌菌液標本，最低可以檢測出6-10ng/μl的目標細菌DNA，比傳統的PCR-電泳方法要靈敏10倍。本發明可以有效檢測出血液和動物感染組織中的目標細菌；本發明可以穩定而特異地實現多種細菌的通用檢測，而且即使樣品存在過量的無關細菌干擾，仍可以給出正確結果。本發明在反生物恐怖領域以及臨床微生物檢測方面具有良好的應用前景。


圖1為芯片基本技術流程2為芯片點樣排列示意3為瓊脂糖凝膠電泳結果4為鼠疫耶爾森氏菌特異性試驗結果5為鼠疫耶爾森氏菌EV76菌株10-8稀釋度菌液芯片雜交結果圖6為鼠疫耶爾森氏菌EV76菌株10-7稀釋度菌液制備模擬血標本芯片雜交結果圖7為鼠疫耶爾森氏菌EV76菌株染色體DNA系列稀釋度檢測結果圖8為鼠疫耶爾森氏菌EV76菌株感染BALB/C小鼠48小時后各組織檢測結果圖9為炭疽芽孢桿菌特異性試驗結果圖10為炭疽芽孢桿菌A16R菌株10-8稀釋度菌液芯片雜交結果圖11為炭疽芽孢桿菌10-7稀釋度菌液制備模擬血標本芯片雜交結果圖12為布魯氏菌特異性試驗結果圖13為6pg/μl布魯氏菌染色體DNA芯片雜交結果圖14為土拉弗朗西斯氏菌特異性試驗結果圖15為類鼻疽伯克霍爾德氏菌特異性試驗結果圖16為普氏立克次體特異性試驗結果圖17為立氏立克次體特異性試驗結果圖18為伯氏考克斯氏體特異性試驗結果圖19為多種目標細菌同時檢測的實驗結果圖20為雜菌干擾實驗檢測結果圖21為混合樣品盲測結果具體實施方式
一、本發明的特異基因多重PCR結合DNA芯片檢測技術的原理1、DNA芯片檢測技術原理DNA微點陣芯片是指同時將大量的探針分子有序地固化于支持物固定到固相支持物(玻片)表面上，組成密集二維分子排列，然后與已標記的待測生物樣品中靶分子雜交，借助核酸分子雜交配對的特異性通過特定的儀器比如激光共聚焦掃描或電荷偶聯攝影像機(CCD)對雜交信號的強度進行快速、并行、高效地檢測分析(圖1)。
2、多重PCR原理一般PCR僅應用一對引物，通過DNA聚合酶擴增模板，復制出大量的目的片段，它主要用于單一片段的檢測，PCR是常用的微生物檢測方法。多重PCR(multiplex PCR)，又稱多重引物PCR或復合PCR，是在同一PCR反應體系內加上二對以上引物，可以同時擴增出多個核酸片段的PCR反應。一般而言，多重PCR體系中每對引物擴增片段長度不同，通過瓊脂糖凝膠電泳，區分不同大小的擴增片段，可以實現多個靶基因的同時檢測。設計多重PCR引物時，既要保證擴增的特異性，又要確保不同擴增片段之間的大小差異可以由瓊脂糖凝膠電泳加以區分。但是在實際工作中，尤其是設計擴增多個靶基因(五個以上)的多重PCR引物時，這一目標較難實現。同時由于多重PCR只是通過擴增片段的大小進行結果判斷，對于可能出現的假陽性擴增無法區分。
3、特異基因多重PCR結合DNA芯片檢測技術的原理現有的利用DNA芯片技術檢測細菌的方法一般都是基于16S rRNA或23S rRNA，設計寡核苷酸探針，利用通用引物擴增標記靶序列，通過嚴謹雜交實現檢測。由于細菌的rRNA基因序列十分保守，往往不同細菌的探針僅相差一個核苷酸，在雜交過程中可能會產生交叉反應，造成結果判讀的困難。
本發明將多重PCR擴增與DNA芯片結合起來，如果待測樣品中含有一種或多種目標細菌的核酸，多重PCR反應將擴增并標記上特異的片段，與DNA芯片進行雜交后，通過生物芯片檢測裝置檢測熒光信號，結合探針點樣模式即可以判斷待測樣品中是否含有目標細菌的核酸。
在本發明中，使用目標細菌的特異基因片段產物作為探針，制備芯片，這樣可以避免rRNA芯片中可能出現的交叉反應，提高了檢測的準確性；同時每個目標細菌選擇兩個特異片段用于檢測，在單一基因突變的情況下仍能給出結果，不會出現漏檢。此外，傳統的多重PCR僅僅通過擴增產物大小判斷結果，有時會出現假陽性結果，而使用DNA芯片雜交判斷結果，這種基于序列信息進行檢測的方法大大提高了結果的可靠性。
4、芯片點樣排列在本發明中，共使用16個探針檢測8種目標細菌；在每張片基上點32個亞矩陣(4×8排列)，每亞矩陣按4×4點陣設計，代表一種探針(見圖2)；這樣每張玻片容量為4×4×32＝512個點，每個探針點重復32次，可以避免由于雜交液分布不均等情況造成的假陰性結果。
二、本發明的檢測生物恐怖相關病原細菌的方法及其專用DNA芯片的特性實驗1、特異性實驗本實驗主要是選擇與目的菌相近緣的或無關的菌株一些菌株，進行多重PCR的擴增同時熒光標記，進行芯片的雜交檢測，觀察是否能夠特異地檢測出陽性信號，并考察其在檢測過程中是否能夠避免一些無關的干擾，考察該項技術的特異性。
2、靈敏度評價本發明的靈敏度評價是主要確定不同樣品中，以不同形式存在的目標細菌模板的最低檢出率。
(1)染色體檢測靈敏度的評價提取目標細菌的染色體DNA，測定濃度后，將其進行10倍系列稀釋，對各個稀釋度取一定的量作為模板，進行熒光標記多重PCR擴增后，與芯片雜交，考察此技術檢測純染色體標本的靈敏度。
(2)細菌菌液檢測靈敏度的評價培養目標細菌，將培養物進行10倍系列稀釋，利用平板涂抹法對各稀釋度進行菌落計數；同時取各個稀釋度菌液，提取DNA模板，進行熒光標記多重PCR擴增后，與芯片雜交，評價本技術檢測細菌菌液的靈敏度。
(3)模擬血標本靈敏度檢測培養目標細菌，將培養物進行10倍系列稀釋，然后將各個稀釋度菌液取一定的量加入動物或人的血中，形成系列濃度的模擬血標本。提取DNA模板，進行熒光標記多重PCR擴增后，與芯片雜交，評價本技術檢測血液標本的靈敏度。
3、動物感染標本的檢測以一種目標細菌感染動物，解剖后分別取出肝、脾、肺等器官并將其研磨，提取組織總DNA后，進行熒光標記多重PCR擴增后，與芯片雜交，評價本技術檢測動物感染標本的能力。
4、多種靶細菌的同時檢測人工制備含有多種靶細菌DNA的標本，進行熒光標記多重PCR擴增后，與芯片雜交。考察本技術同時檢測多種靶細菌的效果，以及以多重PCR為基礎的DNA芯片檢測方法的可行性。
5、雜菌干擾實驗的檢測任意選擇一種與目標細菌不相關的菌株與目的菌進行不同比例的混合，提取DNA模板。考察在過量無關細菌的干擾狀態下，本技術檢出目標細菌的能力。
6、樣品的盲測取幾個目標細菌的染色體DNA，進行隨機組合并編號，本操作由一人完成；然后由另一人進行多重PCR擴增標記，芯片雜交，給出檢測結果，然后與原始組合情況進行對照，考察本技術進行多樣品檢測的準確性。
除非有其它說明，本發明的實施使用本領域中的傳統分子生物學、細胞生物學，和克隆技術。
實施例1、含有序列表中序列1至16的探針的DNA芯片的制備及八種生物恐怖相關病原細菌的檢測1、含有序列表中序列1至16的探針的DNA芯片的制備細菌菌株八種生物恐怖相關病原細菌炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)、布魯氏菌(Brucella)、土拉弗朗西斯氏菌(Francisellatularensis)、類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pseudomalleii)、普氏立克次體(Rickettsia prowazekii)、立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)和伯氏考克斯氏體(Coxiella burnetii)；以及假結核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotubercolusis)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、傷寒沙門菌(Salmonella typhi)，均購自病原微生物生物安全國家重點實驗室。細菌模板DNA提取按照NaI裂解-玻璃粉吸附法進行(楊瑞馥，郭兆彪，張敏麗，等。核酸診斷技術規范化的研究[J].生物技術通訊，1999，8(2)81-88)。
針對以上八種生物恐怖相關病原細菌，每種細菌選擇兩條特異基因作為靶基因，設計引物，詳見表1。所有引物均由上海生工生物有限公司合成。
表1 8種生物恐怖相關病原細菌特異性探針引物及其序列


探針的制備根據表1的引物，分別以上述制備的八種細菌的DNA為模板，進行PCR擴增反應，擴增八種生物恐怖相關病原細菌的十六條特異基因片段，反應體系在30μl擴增體系中，10×PCR Master Mix(上下游引物濃度為10μmol/L，dATP、dTTP、dGTP和dCTP的濃度為均為0.8mmol/L，100mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，50mmol/L KCl，20mmol/L MgCl2，0.1％BSA)3μl，Taq DNA聚合酶(Promega公司)1.5U/μl，細菌模板DNA溶液5μl(10ng/μl)，滅菌去離子水補足反應體系；采用PE2400 DNA熱循環儀(PE)。反應程序如下先94℃預變性3min；再94℃變性50s，58℃退火50s，72℃延伸50s，進行35個循環；最后終延伸5min；反應結束后利用酚氯仿抽提法純化PCR產物，用NanoDrop ND-1000紫外分光光度計進行定量。
芯片的制備與處理純化的PCR產物99℃熱變性10min后，用50％的DMSO(二甲基亞礬)溶解成2.0μg/μl的濃度，轉移至384孔板；點樣用玻片為CSS-1000醛基化玻片(美國CEL公司)。將待點樣的玻片置于Flexys生物芯片點樣儀(Genomic Solutions Inc.)上，設置點樣程序，每張片基上點32個亞矩陣(4×8排列)，每亞矩陣按4×4點陣設計(見圖2)，這樣每張玻片容量為4×4×32＝512個點，每個點重復32次。圖2中1～16號探針依次為1Bpfur；2Bpsl；3Rric190kd；4Rricompb；5Bapa；6Balf；7Ft23kd；8Ftfop；9Coxb27kd；10Coxb34kd；11Yppla；12Ypcalf；13Bra31kd；14Bromp；15Rpglta；16Rickpor。以上探針名稱對應于表1，即1號、2號探針檢測類鼻疽伯克霍爾德氏菌，3號、4號探針檢測立氏立克次體，5號、6號探針檢測炭疽芽孢桿菌，7號、8號探針檢測土拉弗朗西斯氏菌，9號、10號檢測伯氏考克斯氏體，11號、12號檢測鼠疫耶爾森氏菌，13號、14號檢測布魯氏菌，15號、16號檢測普氏立克次體。點制完畢的芯片在使用前于室溫放置至少24h。用UV交聯儀(Heofer)在60Milli Joule下交聯。芯片表面游離醛基的封閉處理芯片浸于封閉液(1.5g NaBH4充分溶解于450ml的1×PBS中，加入133ml的無水乙醇，混勻)中10min，緩慢搖動芯片使其充分封閉。用0.1％的十二烷基磺酸鈉SDS(購自Sigma)漂洗芯片2min，水中洗滌2min，95％乙醇洗滌2min，晾干后即可用于雜交。
2、利用步驟1制備的芯片檢測八種生物恐怖相關病原細菌(1)芯片靶序列多重PCR體系的建立將表1中十六對引物組合為三個組合，以對應的細菌DNA為模板組成混合模板進行PCR擴增反應，即每組檢測六個片段(見表2)，從而利用這3個PCR反應即檢測所有八種生物恐怖劑的十六條特異基因片段。另外，在每一個組合中分別對組合中的細菌DNA模板進行單一模板的PCR擴增。在30μl擴增體系中，10×PCR Master Mix(上下游引物濃度為10μmol/L，dATP、dTTP、dGTP和dCTP的濃度為均為0.8mmol/L，100mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，50mmol/L KCl，20mmol/L MgCl2，0.1％BSA)3μl，Taq DNA聚合酶(Promega公司)1.5U/μl，細菌模板DNA溶液5μl(10ng/μl)，滅菌去離子水補足反應體系；采用PE2400DNA熱循環儀(PE)。反應程序如下先94℃預變性3min；再94℃變性50s，58℃退火50s，72℃延伸50s，進行35個循環；最后終延伸5min；利用瓊脂糖凝膠電泳觀察，考核其用于多重PCR組合的可行性。結果如圖3所示，電泳結果表明三個組合擴增單一模板時，擴增條帶明亮清晰，表明這三個組合均可以用于多重PCR檢測。但是在圖3中，用“第一組”來擴增布魯氏菌和土拉弗朗西斯氏菌的混合模板時，由于Bromp(413bp)與Ftfop(457bp)(表1)兩個基因片段的大小比較接近，在電泳結果只能觀察到一條清晰明亮的帶，表明，通過普通的電泳檢測方法難以準確區分片段大小相近的基因。圖3中A第一組多重PCR擴增結果；泳道Marker(泳道中條帶大小為100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp)，泳道1為布魯氏菌和土拉弗朗西斯氏菌的混合模的板擴增產物，泳道2為土拉弗朗西斯氏菌、炭疽芽孢桿菌、伯氏考克斯氏體和立氏立克次體的混合模板的擴增產物；泳道3為布魯氏菌、鼠疫耶爾森氏菌、土拉弗朗西斯氏菌、炭疽芽孢桿菌和立氏立克次體的混合模板的擴增產物；泳道4-9分別為布魯氏菌、鼠疫耶爾森氏菌、土拉弗朗西斯氏菌、炭疽芽孢桿菌、伯氏考克斯氏體和立氏立克次體的單一模板的擴增產物。B第二組多重PCR擴增結果；泳道Marker同上；泳道1為鼠疫耶爾森氏菌和類鼻疽伯克霍爾德氏菌的混合模板的擴增產物；泳道2為土拉弗朗西斯氏菌、伯氏考克斯氏體、類鼻疽伯克霍爾德氏菌和普氏立克次體的混合模板的擴增產物；泳道3為布魯氏菌、鼠疫耶爾森氏菌、土拉弗朗西斯氏菌、伯氏考克斯氏體和普氏立克次體的混合模板的擴增產物；泳道4-9分別為布魯氏菌、鼠疫耶爾森氏菌、土拉弗朗西斯氏菌、伯氏考克斯氏體、類鼻疽伯克霍爾德氏菌和普氏立克次體的單一模板的擴增產物。C第三組多重PCR擴增結果；泳道Marker同上；泳道1為炭疽芽孢桿菌和立氏立克次體的混合模板的擴增產物；泳道2為立氏立克次體、普氏立克次體、類鼻疽伯克霍爾德氏菌和鼠疫耶爾森氏菌的混合模板的擴增產物；泳道3為布魯氏菌、炭疽芽孢桿菌、立氏立克次體、普氏立克次體、類鼻疽伯克霍爾德氏菌和鼠疫耶爾森氏菌的混合模板的擴增產物；泳道4-9分別為布魯氏菌、炭疽芽孢桿菌、立氏立克次體、普氏立克次體、類鼻疽伯克霍爾德氏菌和鼠疫耶爾森氏菌的單一模板擴增產物。
表2三個組合的多重PCR反應體系中的引物組合

(2)待檢序列的芯片檢測對于待檢菌株的DNA(上述提取的八種細菌DNA)模板，均使用三組多重PCR體系(見表2)進行擴增。每組多重PCR體系為，在30μl擴增體系中，10×PCR Master Mix(六對上下游引物濃度分別為10μmol/L，dATP、dTTP、dGTP濃度為0.8mmol/L，dCTP的濃度為0.6mmol/L，Cy5-dCTP濃度為0.2mmol/L，100mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，20mmol/L MgCl2，0.1％BSA，pH 8.3)3μl，Taq DNA聚合酶(Promega公司)1.5U/μl，待檢模板DNA溶液5μl(都為10ng/μl)，滅菌去離子水補足反應體系；采用PE2400DNA熱循環儀(PE)。設置程序如下先94℃預變性3min；然后94℃變性50s，58℃退火50s，72℃延伸50s，進行35個循環；最后終延伸5min。擴增反應結束后將三組擴增產物混合，利用Amicon Microcon-PCR純化試劑盒(購自Millipore公司)進行純化，最終洗脫體積為30μl，取15μl純化產物99℃變性10min，冰浴驟冷2min；再與15μl2×雜交液(10×SSC，0.04％SDS，200μg/μl鮭魚精DNA，10％硫酸葡聚糖)混勻，放置于內置芯片的雜交盒內，置于雜交爐中65℃雜交45min。雜交后的芯片依次用洗液A(20×SSC，10％SDS)，洗液B(20×SSC)，洗液C(95％乙醇)中各洗3min、3min、1min。將洗滌完畢的芯片置于GenePix Pro 4.1掃描儀(Axon Instruments)內，設置掃描通道和掃描時間，進行結果掃描。當信號點的熒光讀數高于背景讀數8000以上時，結果中可以看到清晰、明亮的雜交點，以此作為判斷陰性和陽性信號的標準，熒光讀數值越高，則雜交點的亮度越大，表示信號越強。
實施例2、利用實施例制備的芯片對八種生物恐怖相關病原細菌的實驗驗證一、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)的檢測1、特異性實驗分別以提取的鼠疫耶爾森氏菌、假結核耶爾森氏菌、白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌或傷寒沙門菌的DNA作為模板，利用實施例1步驟2的(1)的表2中的引物對組合，按照實施例1步驟2的(2)的方法，每個菌分別單獨進行三組多重PCR，擴增反應結束后將每個菌的三組擴增產物分別各自混合，按照實施例1步驟2的(2)的方法分別與實施例1中制備的DNA芯片雜交，結果如圖4所示，表明鼠疫耶爾森氏菌的模板可以在正確的探針位置(預期兩個探針有雜交信號)產生陽性信號，而假結核耶爾森氏菌、白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的模板均無特異雜交信號產生，可見實施例1制備的DNA芯片對于鼠疫耶爾森氏菌檢測具有良好的特異性。
2、細菌菌液檢測靈敏度實驗用LB斜面轉接鼠疫耶爾森氏菌(EV76)(購自病原微生物生物安全國家重點實驗室)，26℃培養48h，懸浮菌體，制備10倍系列稀釋(原菌液稀釋10倍為10-1稀釋度，稀釋100倍為10-2稀釋度，依此類推……稀釋109倍為10-9稀釋度)直至10-9稀釋度。利用平板涂抹法對細菌進行菌落計數。取各個稀釋度菌液1ml，收集菌體，提取DNA。分別以各個稀釋度的菌液的DNA作為模板，利用實施例1步驟2的(1)的表2中的引物對組合，按照實施例1步驟2的(2)的方法，每個稀釋度的菌液分別單獨進行三組多重PCR，擴增反應結束后將每個稀釋度的菌液的三組擴增產物分別各自混合，按照實施例1步驟2的(2)的方法分別與實施例1中制備的DNA芯片雜交，考察細菌系列稀釋菌液雜交靈敏度。結果表明，DNA芯片可以檢測到10-8稀釋度的菌液(圖5)，經過平板計數，計算出鼠疫耶爾森氏菌菌液的原始濃度為1.1×109CFU/ml，因此對于鼠疫耶爾森氏菌而言，檢測靈敏度為1.1×109CFU/ml×10-8(稀釋度)＝11 CFU/ml。
3、模擬血標本靈敏度實驗用LB斜面轉接鼠疫耶爾森氏菌(EV76)，26℃培養48h，懸浮菌體，制備10倍系列稀釋(原菌液稀釋10倍為10-1稀釋度，稀釋100倍為10-2稀釋度，依此類推……稀釋109倍為10-9稀釋度)直至10-9稀釋度。利用平板涂抹法進行菌落計數。同時取各個稀釋度，各個稀釋度中各取20μl加入180μl兔血，制備成系列濃度(1-10-9稀釋度)的模擬血標本。分別取各個稀釋度菌液制備的模擬血標本，按照QIAamp全血DNA提取試劑盒操作說明提取DNA，分別以各個稀釋度菌液制備的模擬血標本的DNA作為模板，利用實施例1步驟2的(1)的表2中的引物對組合，按照實施例1步驟2的(2)的方法，每個稀釋度菌液制備的模擬血標本分別單獨進行三組多重PCR，擴增反應結束后，將每個稀釋度菌液制備的模擬血標本的三組擴增產物分別各自混合，按照實施例1步驟2的(2)的方法分別與實施例1中制備的DNA芯片雜交，結果表明，DNA芯片可以檢測到10-7稀釋度的菌液制備的模擬血標本(圖6)，經過平板計數，計算出鼠疫耶爾森氏菌菌液的原始濃度為1.1×109CFU/ml。因此對于鼠疫耶爾森氏菌而言，模擬血標本檢測靈敏度為1.1×109CFU/ml×10-7(稀釋度)＝110CFU/ml。
4、染色體稀釋靈敏度實驗用LB斜面轉接鼠疫耶爾森氏菌(EV76)，26℃培養48小時，收集菌體，用酚氯仿抽提的方法提取染色體DNA，紫外分光光度計進行核酸定量后，將其倍比稀釋為100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl和1pg/μl的溶液；隨后取各稀釋度的DNA為模板，利用實施例1步驟2的(1)的表2中的引物對組合，按照實施例1步驟2的(2)的方法，每個稀釋度的DNA分別單獨進行三組多重PCR，擴增反應結束后將每個稀釋度的DNA的三組擴增產物分別各自混合，按照實施例1步驟2的(2)的方法分別與實施例1中制備的DNA芯片雜交，結果表明，本技術可以檢測到10pg/μl鼠疫耶爾森氏菌(EV76)染色體DNA；而在常規的PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳中，在100pg/μl時可以觀察到陽性信號，10pg/μl稀釋度已經觀察不到條帶(圖7)。可見實施例1制備的DNA芯片比常規PCR凝膠電泳檢測靈敏度高一個數量級。圖7中，A為DNA芯片檢測10pg/μl染色體DNA結果，B為PCR-凝膠電泳檢測結果。
5、動物感染標本的檢測將鼠疫耶爾森氏菌EV76菌株感染BALB/C小白鼠，感染48小時解剖，取出肝、脾、肺器官并將其研磨，用全血DNA提取試劑盒(QIAGEN)分別提取組織DNA后，利用實施例1步驟2的(1)的表2中的引物對組合，按照實施例1步驟2的(2)的方法，每個組織的DNA分別單獨進行三組多重PCR，擴增反應結束后將每個組織的DNA的三組擴增產物分別各自混合，按照實施例1步驟2的(2)的方法分別與實施例1中制備的DNA芯片雜交，結果如圖8所示，表明在三種感染組織中均可以檢測到鼠疫耶爾森氏菌的特異雜交信號。
二、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)的檢測1、特異性實驗分別以提取的炭疽芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的DNA作為模板，利用實施例1步驟2的(1)的表2中的引物對組合，按照實施例1步驟2的(2)的方法，每個菌分別單獨進行三組多重PCR，擴增反應結束后將每個菌的三組擴增產物分別各自混合，按照實施例1步驟2的(2)的方法分別與實施例1中制備的DNA芯片雜交，掃描結果如圖9，表明炭疽芽孢桿菌的模板可以在正確的探針位置產生陽性信號，而枯草芽孢桿菌、白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的模板均無信號產生，可見實施例1制備的DNA芯片對于炭疽芽孢桿菌檢測具有良好的特異性。
2、細菌菌液檢測靈敏度實驗用LB斜面轉接炭疽芽孢桿菌，37℃培養24h，懸浮菌體，制備10倍系列稀釋直至10-9稀釋度(原菌液稀釋10倍為10-1稀釋度，稀釋100倍為10-2稀釋度，依此類推……稀釋109倍為10-9稀釋度)。利用平板涂抹法對細菌進行菌落計數。取各個稀釋度菌液1ml，收集菌體，提取DNA。分別以各個稀釋度的菌液的DNA作為模板，利用實施例1步驟2的(1)的表2中的引物對組合，按照實施例1步驟2的(2)的方法，每個稀釋度的菌液分別單獨進行三組多重PCR，擴增反應結束后將每個稀釋度的菌液的三組擴增產物分別各自混合，按照實施例1步驟2的(2)的方法分別與實施例1中制備的DNA芯片雜交，考察細菌系列稀釋菌液雜交靈敏度。結果如圖10所示，表明實施例1制備的DNA芯片可以檢測到10-8稀釋度的菌液。經過平板計數，計算出炭疽芽孢桿菌菌液的原始濃度為1.4×109CFU/ml。因此對于炭疽芽孢桿菌而言，檢測靈敏度為1.4×109CFU/ml×10-8＝14CFU/ml。
3、模擬血標本檢測靈敏度實驗用LB斜面轉接炭疽芽孢桿菌A16R，37℃培養24h，用0.01M的PBS溶液懸浮菌體，制備10倍系列稀釋直至10-9稀釋度(原菌液稀釋10倍為10-1稀釋度，稀釋100倍為10-2稀釋度，依此類推……稀釋109倍為10-9稀釋度)。利用平板涂抹法進行菌落計數；同時取各個稀釋度，各個稀釋度中各取20μl加入180μl兔血制備成系列濃度(1-10-9稀釋度)的模擬血標本。分別取各個稀釋度菌液制備的模擬血標本，按照QIAamp全血DNA提取試劑盒操作說明提取DNA，分別以各個稀釋度菌液制備的模擬血標本的DNA作為模板，利用實施例1步驟2的(1)的表2中的引物對組合，按照實施例1步驟2的(2)的方法，每個稀釋度菌液制備的模擬血標本分別單獨進行三組多重PCR，擴增反應結束后，將每個稀釋度菌液制備的模擬血標本的三組擴增產物分別各自混合，按照實施例1步驟2的(2)的方法分別與實施例1中制備的DNA芯片雜交，結果如圖11所示，表明實施例1制備的DNA芯片可以檢測到10-7稀釋度的菌液制備的模擬血標本。經過平板計數，計算出炭疽芽孢桿菌菌液的原始濃度為1.4×109CFU/ml。因此對于炭疽芽孢桿菌來說，模擬血標本檢測靈敏度為1.4×109CFU/ml×10-7＝140 CFU/ml。
三、布魯氏菌(Brucella)的檢測1、特異性實驗分別以布魯氏菌、白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的DNA作為模板，利用實施例1步驟2的(1)的表2中的引物對組合，按照實施例1步驟2的(2)的方法，每個菌分別單獨進行三組多重PCR，擴增反應結束后將每個菌的三組擴增產物分別各自混合，按照實施例1步驟2的(2)的方法分別與實施例1中制備的DNA芯片雜交，掃描結果如圖12所示，表明布魯氏菌的模板可以在正確的探針位置產生陽性信號，而白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的模板均無特異性信號產生，可見實施例1制備的DNA芯片對于布魯氏菌檢測具有良好的特異性。
2、染色體稀釋靈敏度實驗將布魯氏菌染色體DNA，倍比稀釋成100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl，并在1pg/μl～10pg/μl設置1ng/μl的遞進梯度；隨后取各稀釋度的DNA為模板，利用實施例1步驟2的(1)的表2中的引物對組合，按照實施例1步驟2的(2)的方法，每個稀釋度的DNA分別單獨進行三組多重PCR，擴增反應結束后將每個稀釋度的DNA的三組擴增產物分別各自混合，按照實施例1步驟2的(2)的方法分別與實施例1中制備的DNA芯片雜交，結果如圖13所示，表明本發明的方法可以檢測到6pg/μl布魯氏菌染色體DNA；而在常規的PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳中，在100pg/μl時可以觀察到陽性信號，10pg/μl稀釋度已經觀察不到條帶。
四、土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)的檢測分別以土拉弗朗西斯氏菌、白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的DNA作為模板，利用實施例1步驟2的(1)的表2中的引物對組合，按照實施例1步驟2的(2)的方法，每個菌分別單獨進行三組多重PCR，擴增反應結束后將每個菌的三組擴增產物分別各自混合，按照實施例1步驟2的(2)的方法分別與實施例1中制備的DNA芯片雜交，掃描結果如圖14所示，表明土拉弗朗西斯氏菌的模板可以在正確的探針位置產生陽性信號，而白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的模板均無信號產生，可見實施例1制備的DNA芯片對于土拉弗朗西斯氏菌檢測具有良好的特異性。
五、類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pseudomalleii)的檢測分別以類鼻疽伯克霍爾德氏菌、白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的DNA作為模板，利用實施例1步驟2的(1)的表2中的引物對組合，按照實施例1步驟2的(2)的方法，每個菌分別單獨進行三組多重PCR，擴增反應結束后將每個菌的三組擴增產物分別各自混合，按照實施例1步驟2的(2)的方法分別與實施例1中制備的DNA芯片雜交，掃描結果如圖15所示，表明類鼻疽伯克霍爾德氏菌的模板可以在正確的探針位置產生陽性信號，而白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的模板均無信號產生，可見實施例1制備的DNA芯片對于類鼻疽伯克霍爾德氏菌檢測具有良好的特異性。
六、普氏立克次體(Rickettsia prowazekii)的檢測分別以普氏立克次體、白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的DNA作為模板，利用實施例1步驟2的(1)的表2中的引物對組合，按照實施例1步驟2的(2)的方法，每個菌分別單獨進行三組多重PCR，擴增反應結束后將每個菌的三組擴增產物分別各自混合，按照實施例1步驟2的(2)的方法分別與實施例1中制備的DNA芯片雜交，掃描結果如圖16所示，表明普氏立克次體的模板可以在正確的探針位置產生陽性信號，而白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的模板均無信號產生，可見實施例1制備的DNA芯片對于普氏立克次體檢測具有良好的特異性。
七、立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)的檢測分別以立氏立克次體、白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的DNA作為模板，利用實施例1步驟2的(1)的表2中的引物對組合，按照實施例1步驟2的(2)的方法，每個菌分別單獨進行三組多重PCR，擴增反應結束后將每個菌的三組擴增產物分別各自混合，按照實施例1步驟2的(2)的方法分別與實施例1中制備的DNA芯片雜交，掃描結果如圖17所示，表明立氏立克次體的模板可以在正確的探針位置產生陽性信號，而白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的模板均無信號產生，可見實施例1制備的DNA芯片對于立氏立克次體檢測具有良好的特異性。
八、伯氏考克斯氏體(Coxiella burnetii)的檢測分別以伯氏考克斯氏體、白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的DNA作為模板，利用實施例1步驟2的(1)的表2中的引物對組合，按照實施例1步驟2的(2)的方法，每個菌分別單獨進行三組多重PCR，擴增反應結束后將每個菌的三組擴增產物分別各自混合，按照實施例1步驟2的(2)的方法分別與實施例1中制備的DNA芯片雜交，掃描結果如圖18所示，表明伯氏考克斯氏體的模板可以在正確的探針位置產生陽性信號，而白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的模板均無信號產生，可見實施例1制備的DNA芯片對于伯氏考克斯氏體檢測具有良好的特異性。
九、八種生物恐怖相關病原細菌同時檢測實驗分別以2、3、4、5、6、8個目標細菌的DNA混合物作為擴增的模板，利用實施例1步驟2的(1)的表2中的引物對組合，按照實施例1步驟2的(2)的方法，每種混合模板分別單獨進行三組多重PCR，擴增反應結束后將每種混合模板的三組擴增產物分別各自混合，按照實施例1步驟2的(2)的方法分別與實施例1中制備的DNA芯片雜交，雜交結果如圖19所示，表明各個雜交結果均有多組探針出現陽性信號，且信號模式與目標細菌完全吻合，說明本發明的方法完全能夠同時檢測多種生物恐怖相關病原細菌，同時也表明以多重PCR為基礎的DNA芯片檢測方法是可行的。其中，圖19中，鼠+布表示以鼠疫耶爾森氏菌和布魯氏菌的DNA為模板，進行三組多重PCR、芯片雜交的檢測結果；類+伯表示以類鼻疽伯克霍爾德氏菌和伯氏考克斯氏體的DNA為模板，進行三組多重PCR、芯片雜交的檢測結果；鼠+布+炭表示以鼠疫耶爾森氏菌、布魯氏菌和炭疽芽孢桿菌的DNA為模板，進行三組多重PCR、芯片雜交的檢測結果；立+土+普表示以立氏立克次體、土拉弗朗西斯氏菌和普氏立克次體的DNA為模板，進行三組多重PCR、芯片雜交的檢測結果；類+炭+伯+布表示以類鼻疽伯克霍爾德氏菌、炭疽芽孢桿菌、伯氏考克斯氏體和布魯氏菌的DNA為模板，進行三組多重PCR、芯片雜交的檢測結果；立+土+鼠+普表示以立氏立克次體、土拉弗朗西斯氏菌、鼠疫耶爾森氏菌和普氏立克次體的DNA為模板，進行三組多重PCR、芯片雜交的檢測結果；普+土+布+炭+伯表示以普氏立克次體、土拉弗朗西斯氏菌、布魯氏菌、炭疽芽孢桿菌和伯氏考克斯氏體的DNA為模板，進行三組多重PCR、芯片雜交的檢測結果；立+鼠+土+布+類表示以立氏立克次體、鼠疫耶爾森氏菌、土拉弗朗西斯氏菌、布魯氏菌和類鼻疽伯克霍爾德氏菌的DNA為模板，進行三組多重PCR、芯片雜交的檢測結果；類+鼠+伯+布+立+土表示以類鼻疽伯克霍爾德氏菌、鼠疫耶爾森氏菌、伯氏考克斯氏體、布魯氏菌、立氏立克次體和土拉弗朗西斯氏菌的DNA為模板，進行三組多重PCR、芯片雜交的檢測結果；類+炭+伯+布+立+土+鼠+普表示以類鼻疽伯克霍爾德氏茵、炭疽芽孢桿菌、伯氏考克斯氏體、布魯氏菌、立氏立克次體、土拉弗朗西斯氏菌、鼠疫耶爾森氏菌、和普氏立克次體的DNA為模板，進行三組多重PCR、芯片雜交的檢測結果。
十、雜菌干擾實驗將鼠疫耶爾森氏菌(EV76)與大腸桿菌以1∶100、1∶1000與1∶10000的細胞數目比例進行混合，以提取的各個混合比例的混合菌液的DNA為模板，利用實施例1步驟2的(1)的表2中的引物對組合，按照實施例1步驟2的(2)的方法，每個混合菌液分別單獨進行三組多重PCR，擴增反應結束后將每個混合菌液的三組擴增產物分別各自混合，按照實施例1步驟2的(2)的方法分別與實施例1中制備的DNA芯片雜交，結果如圖20所示，表明即使在10000倍無關細菌(大腸桿菌)的干擾之下，本發明的方法仍可實現對目標細菌(鼠疫耶爾森氏菌)的準確檢測。圖20中比例為鼠疫耶爾森氏菌和大腸桿菌的菌數比例。
十一、混合樣品盲測實驗選擇幾個目標細菌的模板DNA，與水一起進行隨機組合編號，樣品制備由一人完成共制備6份樣品(表3)。然后由另一人利用實施例1步驟2的(1)的表2中的引物對組合，按照實施例1步驟2的(2)的方法，每個樣品分別單獨進行三組多重PCR，擴增反應結束后將每個樣品的三組擴增產物分別各自混合，按照實施例1步驟2的(2)的方法分別與實施例1中制各的DNA芯片雜交，進行樣品盲測，根據芯片雜交圖譜給出檢測結果，判斷樣品中含有何種目標細菌的核酸，隨后與原始樣品組成信息進行復核，考察本技術檢測未知樣品(可能含有多種目標細菌)的能力。
混合樣品雜交圖譜如圖21所示，混合樣品組合方式和通過雜交檢測后判讀結果如表3所示，表明檢測全部正確無誤，說明本發明的方法完全可以用于檢測未知樣品中是否含有以上8種生物恐怖相關病原細菌。圖21中鼠表示以鼠疫耶爾森氏菌的DNA為模板，進行三組多重PCR、芯片雜交的檢測結果；水表示以水代替DNA模板進行三組多重PCR、芯片雜交的檢測結果；類+伯+鼠+布表示以類鼻疽伯克霍爾德氏菌、伯氏考克斯氏體、鼠疫耶爾森氏菌和布魯氏菌的DNA為模板，進行三組多重PCR、芯片雜交的檢測結果；類+土+鼠+伯表示以類鼻疽伯克霍爾德氏菌、土拉弗朗西斯氏菌、鼠疫耶爾森氏菌和伯氏考克斯氏體的DNA為模板，進行三組多重PCR、芯片雜交的檢測結果；伯+鼠表示以伯氏考克斯氏體和鼠疫耶爾森氏菌的DNA模板，進行三組多重PCR、芯片雜交的檢測結果；布+立表示布魯氏菌和立氏立克次體的DNA模板，進行三組多重PCR、芯片雜交的檢測結果。
表3.盲測樣品組合方式與雜交判讀結果

序列表<160>16<210>1<211>334<212>DNA<213>炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)<400>1aggaacatcc cacagacttt tctgtagaat tcttggaaca aaatagcaat gaggtacaag60aagtatttgc gaaagctttt gcatattata tcgagccaca gcatcgtgat gttttacagc120tttatgcacc ggaagctttt aattacatgg ataaatttaa cgaacaagaa ataaatctat180ccttggaaga acttaaagat caacggatgc tgtcaagata tgaaaaatgg gaaaagataa240aacagcacta tcaacactgg agcgattctt tatctgaaga aggaagagga cttttaaaaa300agctgcagat tcctattgag ccaaagaaag atga334<210>2<211>249<212>DNA<213>炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)<400>2caagtgctgg acctacggtt ccagaccgtg acaatgatgg aatccctgat tcattagagg60tagaaggata tacggttgat gtcaaaaata aaagaacttt tctttcacca tggatttcta120atattcatga aaagaaagga ttaaccaaat ataaatcatc tcctgaaaaa tggagcacgg180cttctgatcc gtacagtgat ttcgaaaagg ttacaggacg gattgataag aatgtatcac240cagaggcaa249<210>3<211>268<212>DNA<213>類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pseudomalleii)<400>3acggcgtaat gctctgcgcg atccgctggg tcacgctgtc gtacgacgaa caggcggcca60gtccgaccac ggcgacagct gcgatgacgg tgctccgcac gcggctcctc tgaagttgca120aaagcgatct tggaatcatg tccctcaccg tgctggccct tgtccaaggc cgcgcgagaa180tgtcacagat gactgaaaag gcgaaaagcc ggtactattg aagccctgca ttgtactcta240gggacgccta gccatgacca atccgacc 268<210>4<211>319<212>DNA<213>類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pseudomalleii)
<400>4catattgatc gggagccttg ggtccacgct gccggctgtg gctggtacgg taataggcgg60cggggctcaa taccccaatt cggtaggcgg aacgagttct acgaccggcg atttgggcaa120cagctatatt ggtgcgagcg gtatgggtac cgccattact ggggataatg attgcctgag180cttgacttcg acccgcaacg tgctaaacag tgcgaatgtc ggctggcttt tgggaacgac240ttcacagacc accgatcctg gtccgttgta ccccggcccc ggcgcggaaa acaaccagac300tatcagttac agtggcacc 319<210>5<211>416<212>DNA<213>布魯氏菌(Brucella)<400>5acgcctattt ctttgtgggc ggctatccga cgggcgcaat ctcggaactg gccatctcga60acggtatttc gctcgttccg atctccgggc cggaagcgga caagattctg gagaaatatt120ccttcttctc gaaggatgtg gttcctgccg gagcctataa ggacgtggcg gaaacaccga180cccttgccgt tgccgcacag tgggtgacga gcgccaagca gccggacgac ctcatctata240acatcaccaa ggttctctgg aacgaggata cacgcaaggc actcgatgcg ggccatgcga300agggcaagct catcaagctc gatagtgcga cgagcagcct cggtattccg ctgcatcccg360gcgcagaacg cttttacaag gaagcgggcg tgctgaaata atccctcaat gatcgg416<210>6<211>413<212>DNA<213>布魯氏菌(Brucella)<400>6tcgggcgtag atggtaaata tggtaatgaa accagcagcg gcaccgtcat ggagttcgcg60tatatccagc tcggtggtct gcgcgttggt atcgatgaat cggaattcca taccttcacc120ggttacctcg gcgatgtcat caacgatgac gtgatctcgg ctggctccta ccgcaccggc180aagatctcgt acaccttcac tggcggaaac ggcttctcgg ctgtgatcgc tctcgaacag240ggtggcgaag acgttgacaa cgattacacg atcgacggtt acatgccgca cgttgttggc300ggcctgaaat atgctggcgg ctggggttcg atcgctggtg ttgttgccta tgactcggtc360atagaagaat gggctgccaa ggttcgtggc gacgtcaaca tcaccgacca gtt 413<210>7<211>421<212>DNA<213>伯氏考克斯氏體(Coxiella burnetii)<400>7
cagtggcagg caatcctcat ggcaatgtta cattggttga atttttcgat tatcaatgtg60gccattgcaa agccatgaat tctgttattc aagctatcgt gaaacaaaat aaaaacctcc120gcgttgtctt caaagaactg cccatttttg gcggccaatc gcaatacgct gccaaagtat180cattagcagc cgctaaacaa ggaaaatatt atgctttcca cgacgcgctg ctcagtgtcg240acggccaatt atcagaacaa atcacccttc aaaccgcaga aaaagtagga ttaaatgttg300ctcagctcaa aaaagacatg gataatcctg ctatccaaaa acaactgcgt gataacttcc360aattagctca atcgttacag ctagcaggca ccccgacgtt cgtcattggt aataaagcgt420t421<210>8<211>296<212>DNA<213>伯氏考克斯氏體(Coxiella burnetii)<400>8acggaagtta tgttgcgaat gcgcattatt ggctcggtga aatttatctt caacagaaag60atcggaaaaa tgccgcccac gaatttcaaa ccgtaaggga taaatttccc aaatcggaaa120aggtacttga tgcgaaatta aaattagcca tcattgatgc ggaagacggg aaaattaaac180aggctaagga agaattaacc gaaattaaaa aacaacaccc tgaatctacg gcagcacaac240tcgccaatat ccgactccaa caattggagg aagtcgattc agcaacaaca acgcct296<210>9<211>457<212>DNA<213>土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)<400>9aatttcattg ctccttttgc aaatacttat agcgctttga ctaacaagga caatacttgg60ggtcctcaag atagaactgg ccagtggtac ttaggtgtag atgctaacgg tctagctaga120actcctaact ctccatcagg tgctggtgct aacttcacaa tcggttataa catcaataaa180tacttcgctg tacagtacaa ccaattagtt ggtagagtat ttgctggttt aggtgaaggt240gttgtaaact ttagtaataa tactatgttt actccatatg ctgcaggtgg tgctggttgg300gcaaatctag caggtcaagc aacaggtgct tgggatgtgg gtggtggtct taagtttgaa360ctatctagaa atgttcaagc aagtgttgac tacagatata tccaaacaat ggcacctagt420aatatttctg gtgctaatgg cagagcgggt actaaca 457<210>10<211>330<212>DNA<213>土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)<400>10gaaagctgat tcggctacag ctgctgctag tgtaatacgt ttatctataa cgccaggctc60tataaatcca acaataagta ttactcttgg tgttctaatt aaatcaaatg ttagaactaa120
aattgaagag aaagtttcga gtatattaca agcaagtgct acagatatga aaattaagtt180aggtaattct aataaaaaac aagagtataa aactgatgaa gcatggggta ttatgataga240tctatctaat ttagagttat atccaataag tgctaaggct tttagtatta gtatagagcc300aacagaactt atgggtgttt caaaagatgg 330<210>11<211>474<212>DNA<213>普氏立克次體(Rickettsia prowazekii)<400>11aggtggcaat gatgagcgtg agcaaacctt aaaccaaatg ttagtcgaaa tggatgggtt60tgaggcaaac gagggtgtgg taattattgc agctacaaac cgtccagacg ttcttgatcg120tgcattactg cgtcctggta gatttgatcg tcaaattgct gttgcaaacc ctgatataaa180tggtcgtgag caaattctaa aagtacattt aaaaaaaatt aaatataata gtacggtact240agcacgaatt attgctcgtg gaactcctgg tttctccggt gctgaacttg ctaatttagt300taatgaagct gcgcttattg ctgcgaggct tggtaaaaaa gaagtagata tgcacgatat360ggaagaagca aaagataagg ttttgatggg tgttgtgcgt cgctctattg caatgtcaga420gaaggagaaa agattaactg cgtatcatga aggaggacac gcattagtcg ggct 474<210>12<211>214<212>DNA<213>普氏立克次體(Rickettsia prowazekii)<400>12gctaatgaag cagtgataaa tatgcttaaa gaaattggca gttctgagaa tattcctaaa60tatgtagcta aagctaaaga taagaatgat ccatttaggt taatgggttt tggtcatcga120gtatataaaa gctatgaccc gcgtgccgca gtacttaaag aaacttgtaa agaagtatta180aatgaattag gtcagttaga caataatccg ctgt214<210>13<211>371<212>DNA<213>立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)<400>13aaggagcggg agattgtagc acggcaggta ccacttttaa tacaacaaat atagtacttg60atattacagg tcaattagaa cttggagcta ctacggcaaa tgtagtttta tttaatgatg120ctgttcaatt aactcaaacc ggtaatattg gcggtttctt agattttaat gcaaaaaacg180gtatggtaac attaaataac aatgtaaatg ttgcgggagc agtccaaaat accggcggta240ctaataacgg tacgttaata gttttaggtg caagtaatct taatagagta aacgggattg300ctatgttaaa agtaggtgca ggaaatgtaa ctattgccaa aggcggtaaa gttaaaatcg360gcgaaatcca a 371
<210>14<211>385<212>DNA<213>立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)<400>14tggtgccgtg actgatacga ttgcttttga aaattcaagt ttaggtgcag ttgtattctt60acctagaggc attccattca atgatgcagg caacacaatg cctttaacaa ttaaaagtac120cgtaggtaat aaaacagcta aaggttttga tgttcctagc gtggttgttt taggtgttga180tagtgtcatc gctgacggtc aagtaatcgg tgatcaaaat aatatcgtag gtctaggtct240tggaagcgat aacggcataa tcgttaatgc tactacatta tatgcaggta tcagtactct300aaacaataat caaggtactg tcacacttag cggtggtgtt cctaataccc ctggtacagt360ttatggctta ggcacaggta ttggc 385<210>15<211>235<212>DNA<213>鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)<400>15ccccaatgtc aaacggctct taattgtatt caatcctcgc tcggcataaa tatacgaacg60ctgccatcct tgttgtttcc accatgaggt tgaactacga aagcgccaag cccctatgtt120taatcccggt tgcaactgag cataataaga gtccagagac ttgcctcctt ctctgaattt180tcttgtctgc atgttcgtat tataattcat gaacagagca ggaatgccgt catcc 235<210>16<211>317<212>DNA<213>鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)<400>16tccatactca tttctgaccc tgaatgccag ggggtggacg tctctggctt ccgggtcagg60taatatggat gactacgact ggatgaatga aaatcaatct gagtggacag atcactcatc120tcatcctgct acaaatgtta atcatgccaa tgaatatgac ctcaatgtga aaggctggtt180actccaggat gagaattata aagcaggtat aacagcagga tatcaggaaa cacgtttcag240ttggacagct acaggtggtt catatagtta taataatgga gcttataccg gaaacttccc300gaaaggagtg cgggtaa 31權利要求
1.一種檢測生物恐怖相關病原細菌的DNA芯片，包括下述1)至16)中的至少一種探針1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；2)序列表中SEQ ID №2的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；3)序列表中SEQ ID №3的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)序列表中SEQ ID №4的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；5)序列表中SEQ ID №5的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；6)序列表中SEQ ID №6的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №6限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；7)序列表中SEQ ID №7的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №7限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；8)序列表中SEQ ID №8的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №8限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；9)序列表中SEQ ID №9的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №9限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；10)序列表中SEQ ID №10的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID№10限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；11)序列表中SEQ ID №11的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID№11限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；12)序列表中SEQ ID №12的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID№12限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；13)序列表中SEQ ID №13的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID№13限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；14)序列表中SEQ ID №14的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID№14限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；15)序列表中SEQ ID №15的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID№15限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；16)序列表中SEQ ID №16的DNA序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID№16限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的DNA芯片，其特征在于所述DNA芯片包括下述8對探針中的至少一對探針所述1)和2)、3)和4)、5)和6)、7)和8)、9)和10)、11)和12)、13)和14)、15)和16)。
3.根據權利要求1或2所述的DNA芯片，其特征在于所述生物恐怖相關病原細菌包括下述八種細菌中的至少一種炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pseudomalleii)、布魯氏菌(Brucella)、伯氏考克斯體(Coxiella burnetii)、土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、普氏立克次體(Rickettsia prowazekii)、立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)和鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)。
4.根據權利要求1或2所述的DNA芯片，其特征在于所述DNA芯片包括序列表中SEQ ID №1至16的DNA序列和/或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1至16限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.根據權利要求4所述的DNA芯片，其特征在于所述生物恐怖相關病原細菌包括炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderiapseudomalleii)、布魯氏菌(Brucella)、伯氏考克斯體(Coxiella burnetii)、土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、普氏立克次體(Rickettsia prowazekii)、立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)和鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)。
6.一種檢測生物恐怖相關病原細菌的方法，是分別以待測樣品的DNA為模板，用下述1)至8)的8對引物對或由從所述8對引物對的每對引物對中選出的一個引物對組成的8個引物對進行PCR擴增，將得到的擴增產物和權利要求1至4中任一所述的檢測生物恐怖相關病原細菌的DNA芯片進行雜交，如果雜交信號為陽性，則待測樣品為或含有雜交信號陽性的探針對應的生物恐怖相關病原細菌；所述8對引物對如下1)由Balf-1和Balf-B組成的引物對，和由Bapa-1和Bapa-A組成的引物對；2)由Bpfur-2和Bpfur-A組成的引物對，和由Bpsl1705-F和Bpsl1705-R組成的引物對；3)由Bra31kd-3和Bra31kd-C組成的引物對，和由Bromp2b-4和Bromp2b-D組成的引物對；4)由Coxb27kd-5和Coxb27kd-C組成的引物對，和由Coxb34kd-3和Coxb34kd-D組成的引物對；5)由Ftfop-1和Ftfop-D組成的引物對，和由Ft23kd-3和Ft23kd-B組成的引物對；6)由Rickpor-Rpa-3和Rickpor-Rpa-C組成的引物對，和由Rpglta-1和Rpglta-A組成的引物對；7)由Rric190kd-1和Rric190kd-A組成的引物對，和由Rricompb-3和Rricompb-C組成的引物對；8)由Ypcalf-2和Ypcalf-B組成的引物對，和由Yppla-2和Yppla-C組成的引物對。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述方法中，用所述1)至8)的8對引物對進行PCR擴增。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于所述生物恐怖相關病原細菌包括炭疽芽孢桿菌、類鼻疽伯克霍爾德氏菌、布魯氏菌、伯氏考克斯體、土拉弗朗西斯氏菌、普氏立克次體、立氏立克次體和鼠疫耶爾森氏菌。
9.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于所述PCR為多重PCR。
全文摘要
本發明公開了一種檢測生物恐怖相關病原細菌的方法及其專用DNA芯片。該檢測生物恐怖相關病原細菌的方法，是將待測樣品的DNA用表1中的引物對進行PCR擴增，得到的擴增產物與下述DNA芯片進行雜交，然后檢測雜交信號，如果雜交信號為陽性，則待測樣品為或含有雜交信號陽性的探針對應的生物恐怖相關病原細菌。所述DNA芯片包括序列表中序列1至序列16中的至少一種探針。本發明在反生物恐怖領域以及臨床微生物檢測方面具有良好的應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK1786197SQ20051012405
公開日2006年6月14日 申請日期2005年11月23日 優先權日2005年11月23日
發明者宋亞軍, 王豫, 翟俊輝, 郭兆彪, 王津, 楊瑞馥 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所