用于同時檢測海洋中五種致病菌以及三種毒力基因的多重pcr引物及其設計方法

用于同時檢測海洋中五種致病菌以及三種毒力基因的多重pcr引物及其設計方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于同時檢測海洋中五種致病菌以及三種毒力基因的多重PCR引物及其設計方法，該設計方法包括利用引物設計軟件設計同時檢測糞腸球菌、遲緩愛德華菌、肉桿菌、蘇云金桿菌和溶藻弧菌以及陰溝腸桿菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、糞腸球菌cylA基因的多重PCR引物組合、篩選競爭狀態優勢引物，利用PCR方法對競爭狀態優勢引物進行擴增驗證，最后去除擴增引物中的競爭狀態劣勢引物，獲得多重PCR引物組合，同時還公開了多重PCR的檢測方法，與現有技術相比，本發明的優點在于：采用本發明建立的多重PCR的引物組合同時檢測海洋中五種致病菌以及三種毒力基因，具有操作簡便、快速，特異性強，靈敏度高等優點。
【專利說明】用于同時檢測海洋中五種致病菌以及三種毒力基因的多重PCR引物及其設計方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物檢測領域，具體涉及一種用于同時檢測海洋糞腸球菌、遲緩愛德華菌、肉桿菌、蘇云金桿菌和溶藻弧菌以及陰溝腸桿菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、糞腸球菌cylA基因的多重PCR引物及其設計方法。
【背景技術】
[0002]糞腸球菌、遲緩愛德華菌、肉桿菌、蘇云金桿菌和溶藻弧菌，屬于可以通過食物、水進行傳播的病原菌。它們的生物學特性和致病性有一定的區別，但都可以引起食物中毒和消化系 統疾病。
[0003]糞腸球菌普遍存在于自然界，可引起心內膜炎，膽囊炎，腦膜炎，尿路感染及傷口感染等多種疾病。它對營養要求低，在普通營養瓊脂上也可生長，能在10°c或45°C PH9.6或含6.5% NaCl肉湯培養基中生長。該菌對惡劣的外環境和冷凍條件具有較強的抵抗力，作為監測水質衛生，環境衛生質量的污染指標更具有衛生學意義。這種細菌作為一個有衛生學意義的細菌(該菌的污染在某些食品中也常被發現)，在我國有多次出現食物中毒情況，其中有一次與海洋食物清理不凈相關。
[0004]遲緩愛德華菌屬腸桿菌科，愛德華氏菌屬，是引起魚類水生動物的一種重要病原菌疾病，也能感染人類，可導致腹瀉、營養性肝硬化、低燒等癥狀，有溶血素、侵入上皮細胞因子、殺傷吞噬細胞因子和軟骨素酶等多種毒性因子。有該菌引起的食物中毒在新聞報道中較少，但是由其的危害不容忽視。
[0005]肉桿菌是一種直長桿菌，在環境中多有分布，在腐敗物中常有發現，在長時間暴露于空氣中的肉質品和魚中也會發現該菌，在我國國內相關報道較少。肉桿菌是一種條件致病菌，一般對人不會引起致病，但是分泌的一些毒素會引起人類的腸道疾病和敗血癥，是一種在海洋中具備致病性的細菌。
[0006]蘇云金桿菌一直被認為是一種微生物源低毒殺蟲劑，對人類傷害不大，但是蘇云金桿菌和蠟狀芽孢桿菌間的區別僅僅在于后者具有殺蟲質粒編碼，該質粒的丟失可使蘇云金桿菌轉化成蠟狀芽孢桿菌，而蠟狀芽孢桿菌是常見的食品污染菌，能產生一種嘔吐毒素和多種腸毒素，主要引發嘔吐和腹瀉型食物中毒。與蠟狀芽孢桿菌同屬的蘇云金桿菌也能產生類似的腸毒素，近來發現它可能與食品中毒有關。我國應當加強對蠟狀芽孢桿菌的監測和研究。
[0007]溶藻弧菌與副溶血弧菌形態和生物學功能較為相似，能產生不耐熱性腸毒素、耐熱性腸毒素和溶血毒素。該菌在海產品中經常出現，也是海生生物的主要致病菌，對人類具有一定的致病性，在公共衛生學上具有重要意義。由該菌引起的食物中毒在沿海地區較為普遍，需要與副溶血弧菌區分鑒別。
[0008]gyrB基因在細菌的分類和檢測中具有鑒別作用。gyrB即促旋酶(gyrase)的B亞單位基因，屬于信息通路中與DNA復制、限制、修飾或修復有關的蛋白編碼基因。此基因存在于大多數細菌中，不會發生頻繁的水平轉移，在不同的蛋白及蛋白的不同位點，其氨基酸替代率也不相同，可在細菌的系統發育學，特別是在近緣種和菌株的區分及鑒定起到重要作用。
[0009]副溶血弧菌tlh基因是副溶血弧菌所特有的，因此它的編碼基因tlh基因常被用作檢測副溶血弧菌的靶基因。該基因可產生溶血素。
[0010]糞腸球菌cylA基因是與糞腸球菌致病性相關的一種毒力基因，在致病菌株中分離率較高(高于35% )，并且與其他細菌相比，該基因部分序列同源性較低，所以可選用作為檢測致病性糞腸球菌的靶基因。
[0011]聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,簡稱PCR)是一種體外快速擴增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，數小時內可使目的基因片段擴增到數百萬個拷貝的分子生物學技術。PCR技術的特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性、退火(復性)、延伸三個基本反應步驟構成:①模板DNA的變性:模板DNA經加熱至93°C左右一段時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55°C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸:DNA模板與引物的結合物在72°C，Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。重復循環變性、退火(復性)、延伸三個過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。多重PCR是在普通PCR的基礎上加以改造，在一個PCR反應體系中同時加入多對特異性引物，針對多個DNA模板或同一模板的不同區域擴增多個目的片段的PCR技術。多重PCR在一次反應中能同時擴增多個目的片段的多個靶序列。該技術可用于多種病原微生物 的同時檢測或鑒定，在同一 PCR反應管中同時加上多種病原微生物的特異性引物，進行PCR擴增。多重PCR最大的問題在于引物的設計和反應條件的優化。和一般PCR相比較，多重PCR在同一 PCR反應管內需要同時擴增出多個病原菌的目的片段，一次完成多個模板的擴增。在本發明中，在同一反應管內檢出糞腸球菌、遲緩愛德華菌、肉桿菌、蘇云金桿菌和溶藻弧菌以及陰溝腸桿菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、糞腸球菌cylA基因，將大大節省時間和試劑，節約經費，為檢測提供更多更準確的信息。多重PCR的引物設計要求總體上與一般PCR的引物一致，如引物自身需要有穩定的二級結構，引物之間也不能形成發夾和引物二聚體等。這是因為單對引物擴增單個模板都能擴增出條帶清晰的目的片段，但是各種引物混和后擴增會有條帶丟失現象出現。各引物之間還存在競爭關系，強勢引物可能掩蓋弱勢引物，導致目的片段丟失。甚至引物之間相互作用產生嚴重的引物二聚體，導致目的片段丟失。
[0012]多重PCR以其快速、高效、特異性好、靈敏度高的特點，在食品病原微生物、非致病微生物及環境微生物等檢測中具有重要作用，符合口岸、衛生、質檢等部分快速檢測的需要，是一種準確、可靠、科學的分子生物學方法。有鑒于此，盡快開發一種用于同時檢測糞腸球菌、遲緩愛德華菌、肉桿菌、蘇云金桿菌和溶藻弧菌以及三種細菌的毒力基因的多重PCR勢在必行。這對于加強水產品中這些致病菌的快速檢驗檢疫、水產養殖病害的調查和防治、無公害水產品檢測和生產以及水產品衛生質量監督檢驗等方面都具有提示和警示的作用。
【發明內容】

[0013]本發明所要解決的一個技術問題是針對現有技術的現狀提供一種用于同時檢測海洋中五種致病菌以及三種毒力基因的多重PCR引物及其設計方法。
[0014]本發明所要解決的另一個技術問題是針對現有技術的現狀提供一種用于同時檢測海洋中五種致病菌以及三種毒力基因的多重PCR的檢測方法，其具有簡單、靈敏、快速、特異性強的特點。
[0015]本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為:該用于同時檢測海洋中五種致病菌以及三種毒力基因的多重PCR引物，其特征在于:該五種致病菌以及三種毒力基因的多重PCR引物分別包括糞腸球菌、遲緩愛德華菌、肉桿菌、蘇云金桿菌和溶藻弧菌以及陰溝腸桿菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、糞腸球菌cylA基因的多重PCR引物；
[0016]其中，糞腸球菌的上下游引物為:
[0017]Pl:5，-TGCCGCATGGCATAAGAGTC-3，；
[0018]P2:5， -TGCATCACCTCGCGGTCTAG-3，；
[0019]遲緩愛德華菌的上下游引物為:
[0020]P3:5， -GACTCAACGGCGGATTTCAC-3，；
[0021]P4:5，-TGGCGACACCGAGCAGATT-3，；
[0022]肉桿菌的上下游引物為:
[0023]P5:5’ -CCATGGACAATGATTGTTG-3’ ；
[0024]P6:5， -CTCGAGGCAGCGAGATCTT-3，；
[0025]蘇云金桿菌的上下游引物為:
[0026]P7:5’ -CTATTCTCGTATGTTCATTCG-3’ ；
[0027]P8:5’ -CTTCATTACATTCAACCCAG-3’ ；
[0028]溶藻弧菌的上下游引物為:
[0029]P9:5， -GATCGTTTTGACCTGCGAAA-3，；
[0030]PlO:5， -GCATTGAGCGCTACGTGAAT-3，；
[0031]陰溝腸桿菌gyrB基因的上下游引物為:
[0032]Pll:5，-AAGCGHCCNGSNATGTAYATHGG-3，；
[0033]P12:5， -CCNGCNGARTCNCCYTCNAC-3，；
[0034]副溶血弧菌tlh基因的上下游引物為:
[0035]P13:5’ -TGAGTTGCTGTTGTTGGATGC-3’ ；
[0036]P14:5’ -GTTGATGACACTGCCAGATGC-3’ ；
[0037]糞腸球菌cylA基因的上下游引物為:
[0038]P15:5， -GACTCGGGGATTGATAGGCA-3，；
[0039]P16:5’ -GCTGCTAAAGCTGCGCTTAC-3，；
[0040]進一步地，所述糞腸球菌引物對應的PCR擴增片段大小為1097bp，遲緩愛德華菌引物對應的PCR擴增片段大小為708bp，肉桿菌引物對應的PCR擴增片段大小為566bp，蘇云金桿菌引物對應的PCR擴增片段大小為458bp，溶藻弧菌引物對應的PCR擴增片段大小為159bp，陰溝腸桿菌gyrB基因引物對應的PCR擴增片段大小為1250bp，副溶血弧菌tlh基因引物對應的PCR擴增片段大小為454bp，糞腸球菌cyIA基因引物對應的PCR擴增片段大小為 405bp。
[0041]本發明提供了一種用于同時檢測海洋中五種致病菌以及三種毒力基因的設計方法，其特征在于:包括以下步驟:
[0042]步驟1，利用引物設計軟件設計同時檢測糞腸球菌、遲緩愛德華菌、肉桿菌、蘇云金桿菌和溶藻弧菌以及陰溝腸桿菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、糞腸球菌cylA基因的多重PCR引物組合，所形成的引物組合所包含的引物堿基數為20-23個，引物的熔解溫度Tm值為 54°C _63°C，引物的 6(:%為 40% -60% ；
[0043]步驟2，對引物組合中的引物進行篩選，保留不形成引物二聚體的引物；
[0044]步驟3，判斷所保留引物的競爭優劣狀態，將上述所保留引物的GC%和堿基數進行比較，當引物的堿基數均相同且內側引物的GC %小于外側引物的GC %，或者當引物的堿基數不完全相同且內側引物的堿基數比外側引物少一個堿基時，判斷為競爭狀態劣勢引物，進行步驟4 ;否則判斷為競爭狀態優勢引物，進行步驟5 ;
[0045]步驟4，再次篩選競爭狀態引物，具體步驟為:重復步驟2，對所保留的引物按照步驟3進行再次判斷；
[0046]步驟5，利用PCR方法對競爭狀態優勢引物進行擴增驗證；
[0047]步驟6，去除擴增引物中的競爭狀態劣勢引物，獲得多重PCR引物組合。
[0048]本發明還提 供一種同時檢測海洋中五種致病菌以及三種毒力基因的多重PCR的檢測方法，其特征在于包括如下步驟:
[0049]I)細菌的初步分離:從培養基中提取基因組DNA，備作PCR模板；
[0050]2)多重PCR擴增包括:a、多重PCR擴增反應體系:取上述DNA模板I~12 μ L，反應體系為20-30.0 μ L，各反應產物分別為TaqDNA聚合酶5U/y L，0.1-0.25 μ L，PCR緩沖液
2.5 μ L，脫氧核糖核苷三磷酸混合物10mmol/L，2-3.5μ L，引物P1、P2各0.5-1.0 μ L，P3、P4各 1.0-2.5 μ L，P5、P6 各 0.75-2 μ L, P7、P8 各 1.5-4.0yL, P9、P10 各 0.25-0.75 μ L，Pll、Ρ12 各 0.5-1.5 μ L，P13、P14 各 0.25-0.75 μ L, P15、P16 各 0.25-0.75 μ L，余量用重蒸水補足山、擴增反應條件:94°C預變性5min，94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸60s，循環35次，72°C終末延伸IOmin ;c、將步驟b的擴增產物進行電泳檢測及結果分析。
[0051]作為優選，所述步驟&中引物？1、？2各0.5 4 1^，？3、？4各1.5 4 1^，？5、？6各1“1^P7、P8 各 2 μ L，Ρ9、PlO 各 0.25 μ L, Pll、Ρ12 各 0.5 μ L, Ρ13、Ρ14 各 0.25 μ L, Ρ15、Ρ16 各
0.75 μ L0
【專利附圖】

【附圖說明】
[0052]圖1多重PCR鑒別糞腸球菌、遲緩愛德華菌、肉桿菌屬、蘇云金桿菌和溶藻弧菌的的電泳檢測結果；
[0053]圖2多重PCR鑒別陰溝腸桿菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、糞腸球菌cylA基因的電泳檢測結果。
【具體實施方式】
[0054]以下通過結合附圖及實施例對本發明作進一步說明。
[0055]I)利用primer express2.0引物設計軟件設計同時擴增糞腸球菌、遲緩愛德華菌、肉桿菌、蘇云金桿菌和溶藻弧菌和陰溝腸桿菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、糞腸球菌cylA基因的多重引物組合；
[0056]2)篩選多重引物組合中PCR檢測糞腸球菌的引物；
[0057]3)篩選多重引物組合中PCR檢測遲緩愛德華菌的引物；
[0058]4)篩選多重引物組合中PCR檢測肉桿菌的引物；
[0059]5)篩選多重引物組合中PCR檢測蘇云金桿菌的引物；
[0060]6)篩選多重引物組合中PCR檢測溶藻弧菌的引物；
[0061]7)篩選多 重PCR同時檢測糞腸球菌、遲緩愛德華菌、肉桿菌、蘇云金桿菌和溶藻弧菌的引物組合；
[0062]8)篩選多重引物組合中PCR檢測陰溝腸桿菌gyrB基因的引物；
[0063]9)篩選多重引物組合中PCR檢測副溶血弧菌tlh基因的引物；
[0064]10)篩選多重引物組合中PCR檢測糞腸球菌cylA基因的引物；
[0065]11)篩選多重PCR同時檢測陰溝腸桿菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、糞腸球菌cylA基因的引物組合。
[0066]所述的步驟I)，其中涉及的引物參照實驗室海洋分離株相應的基因序列和GenBank 上發表(E.faec.16s rRNA 為 GenBank AB362602、AB712374, E.tarda.gyrB 為GenBank FJ158597、KC665637, C.Coll.為 GenBank AF275938, B.thur.hbl 為 GenBankAJ243147, V.alg1.toxR 為 GenBank EU155576、EU155566，E.bact.gyrB 為 GenBankAF302677、AY370837, V.para, tlh 為 GenBank ⑶971655、AB012596)對應的基因序列，應用primer express2.0設計同時檢測細菌和毒力基因的特異性引物組合。
[0067]備注:在本專利文本中，E.faec.為糞腸球菌的英文縮寫，E.tarda.為遲緩愛德華菌的英文縮寫，C.Coll.為肉桿菌的英文縮寫，B.thur.為蘇云金桿菌的英文縮寫，V.alg1.為溶藻弧菌的英文縮寫，E.bact.為陰溝腸桿菌的英文縮寫，V.para.為副溶血弧菌的英文縮寫，E.faec.(16s rRNA) Pl 和 E.faec.(16s rRNA) P2 為根據糞腸球菌 16s rRNA 設計的上游引物Pl和下游引物P2, E.tarda.(gyrB)P3和E.tarda.(gyrB)P4為根據遲緩愛德華菌gyrB基因設計的上游引物P3和下游引物P4，C.Coll.P5和C.Coll.P6為根據肉桿菌公布的一段基因設計的上游引物P5和下游引物P6，B.thur.(hbl)P7和B.thur.(hbl)P8為根據蘇云金桿菌hbl基因設計的上游引物P7和下游引物P8，V.alg1.(toxR)P9和V.alg1.(toxR)P10為根據溶藻弧菌toxR基因設計的上游引物P9和下游引物P10，E.bact.(gyrB)Pll和E.bact.(gyrB)P12為根據陰溝腸桿菌gyrB基因設計的上游引物Pll和下游引物P12，V.para, (tlh)P13和V.para.(tlh)P14為根據副溶血弧菌tlh基因設計的上游引物P13和下游引物P14，E.faec.(cylA)P15和E.faec.(cylA)P16為根據糞腸球菌cylA基因設計的上游引物P15和下游引物P16。
[0068]所述的步驟2)、3)、4)、5)、6)和7)，經過篩選，糞腸球菌引物對應的PCR擴增片段大小為1097bp，遲緩愛德華菌引物對應的PCR擴增片段大小為708bp，肉桿菌引物對應的PCR擴增片段大小為566bp，蘇云金桿菌引物對應的PCR擴增片段大小為458bp，溶藻弧菌引物對應的PCR擴增片段大小為159bp。具體引物序列如下:
[0069]糞腸球菌16s rRNA的上下游引物:
[0070]E.faec.(16s rRNA)Pl:5，-TGCCGCATGGCATAAGAGTC-3，；[0071]E.faec.(16s rRNA)P2:5，-TGCATCACCTCGCGGTCTAG-3，；
[0072]遲緩愛德華菌的上下游引物:
[0073]E.tarda.(gyrB)P3:5，-GACTCAACGGCGGATTTCAC-3，；
[0074]E.tarda.(gyrB)P4:5，-TGGCGACACCGAGCAGATT-3，；
[0075]肉桿菌的上下游引物:
[0076]C.Coll.P5:5’ -CCATGGACAATGATTGTTG-3’ ；
[0077]C.Coll.P6:5，-CTCGAGGCAGCGAGATCTT-3，；
[0078]蘇云金桿菌的上下游引物:
[0079]B.thur.(hbl)P7:5，-CTATTCTCGTATGTTCATTCG-3，；
[0080]B.thur.(hb l)P8:5’ -CTTCATTACATTCAACCCAG-3’ ；
[0081]溶藻弧菌的上下游引物:
[0082]V.alg1.(toxR)P9:5，-GATCGTTTTGACCTGCGAAA-3，；
[0083]V.alg1.(toxR)PlO:5，-GCATTGAGCGCTACGTGAAT-3，；
[0084]所述的步驟8) ,9),10)和11)，經過篩選，陰溝腸桿菌gyrB基因引物對應的PCR擴增片段大小為1250bp，副溶血弧菌tlh基因引物對應的PCR擴增片段大小為454bp，糞腸球菌cylA基因引物對應的PCR擴增片段大小為405bp。具體引物序列如下:
[0085]陰溝腸桿菌gyrB基因的上下游引物:
[0086]E.bact.(gyrB)Pl1:5，-AAGCGHCCNGSNATGTAYATHGG-3，；
[0087]E.bact.(gyrB)P12:5， -CCNGCNGARTCNCCYTCNAC-3，；
[0088]副溶血弧菌tlh基因的上下游引物:
[0089]V.para.(tlh)P13:5，-TGAGTTGCTGTTGTTGGATGC-3，；
[0090]V.para.(tlh)P14:5，-GTTGATGACACTGCCAGATGC-3，；
[0091]糞腸球菌cylA基因的上下游引物:
[0092]E.faec.(cylA)P15:5，-GACTCGGGGATTGATAGGCA-3，；
[0093]E.faec.(cylA)P16:5’ -GCTGCTAAAGCTGCGCTTAC-3，；
[0094]所述的步驟7)和11)，多重PCR同時檢測糞腸球菌、遲緩愛德華菌、肉桿菌、蘇云金桿菌和溶藻弧菌以及陰溝腸桿菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、糞腸球菌cylA基因方法最佳反應條件的測定，分別利用5對引物進行5種細菌模板和利用3對引物進行3種細菌模板多重PCR最佳退火溫度、引物濃度、模板濃度等的測定，然后根據實驗結果進行多重PCR最佳循環次數的測定。
[0095]所述的步驟7)，多重PCR同時檢測糞腸球菌、遲緩愛德華菌、肉桿菌、蘇云金桿菌和溶藻弧菌方法的反應體系為25yL，具體如下:10XPCR Buffer(含25mmol/LMgCl2) 2.5 μ L, 1mmoI/L dNTP3 μ L, 1mmoI/L E.faec.(16s rRNA)上下游引物各 0.5 μ L，lOmmol/L E.tarda.(gyrB)上下游引物各 1.5 μ L, lOmmol/L C.Coll.上下游引物各 I μ L,10mmol/L B.thur.(hbl)上下游引物各 2 μ L, 10mmol/L V.alg1.(toxR)上下游引物各0.25 μ L, 5U/ μ L Taq 酶 0.2 μ L，Ε.bact.的 DNA 模板 3 μ L, E.tarda.和 C.Coll.的 DNA 模板各 2.5 μ L，B.thur.的 DNA 模板 2 μ L, V.alg1.的 DNA 模板 0.5 μ L, ddH20 補足至 25 μ L。擴增條件為預變性94°C 5min ;變性94°C 30s，退火56°C 30s，延伸72°C 60s, 30個循環；終延伸 72°C 1min ;4°C保存；[0096]所述的步驟11)，多重PCR同時檢測陰溝腸桿菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、糞腸球菌cylA基因方法的反應體系為25 μ L，具體如下:10XPCR Buffer (含25mmol/L MgCl2) 2.5 μ L，IOmmoI/L dNTP3 μ L, IOmmoI/L E.bact.(gyrB)上下游引物各 0.5 μ L，lOmmol/LV.para, (tlh)上下游引物各 0.25 μ L, lOmmol/L E.faec.(cylA)上下游引物各
0.75 μ L, 5U/ μ LTaq 酶 0.25 μ L, Ε.bact.的 DNA 模板 2 μ L，V.para.的 DNA 模板 1.0 μ L，E.faec.的DNA模板12 μ L，ddH20補足至25 μ L。擴增條件為預變性94 V 5min ；變性940C 30s，退火56°C 30s，延伸72°C 60s, 30個循環；終延伸72°C IOmin將以上PCR產物在
0.5 X TBE,2.0%瓊脂糖凝膠、150V電壓條件下電泳30min，然后在凝膠成像系統中觀察。
[0097]圖1顯示了對糞腸球菌、遲緩愛德華菌、肉桿菌、蘇云金桿菌和溶藻弧菌樣品分別進行多重和單重PCR的檢測結果，其中M號泳道為DL2000DNA Marker ；1號泳道為五重PCR擴增結果，在分子量約為1097bp、708bp、566bp、458bp和159bp處分別呈現明亮目的擴增條帶，說明本實施例的樣品中存在糞腸球菌、遲緩愛德華菌、肉桿菌、蘇云金桿菌和溶藻弧菌；2號泳道為糞腸球菌的檢測結果，呈現分子量約為1097bp的明亮的、單一的擴增條帶，說明樣品中含有糞腸球菌；3號泳道為遲緩愛德華菌的檢測結果，呈現分子量約為708bp的明亮的、單一的擴增條帶，說明樣品中含有遲緩愛德華菌；4號泳道為肉桿菌的檢測結果，呈現分子量約為566bp的明亮的、單一的擴增條帶，說明樣品中含有肉桿菌；5號泳道為蘇云金桿菌的檢測結果，呈現分子量約為458bp的明亮的、單一的擴增條帶，說明樣品中含有蘇云金桿菌；6號泳道為溶藻弧菌的檢測結果，呈現分子量約為159bp的明亮的、單一的擴增條帶，說明樣品中含有溶藻弧菌；7號泳道為糞腸球菌和溶藻弧菌的檢測結果，呈現分子量約為1097bp和159bp的明亮的、特征的擴增條帶，說明樣品中含有糞腸球菌和溶藻弧菌；8號泳道為糞腸球菌、肉桿菌和溶藻弧菌的檢測結果，呈現分子量約為1097bp、566bp和159bp的明亮的、特征的擴增條帶，說明樣品中含有糞腸球菌、肉桿菌和溶藻弧菌；9號泳道為糞腸球菌、肉桿菌、蘇云金桿菌和溶藻弧菌的檢測結果，呈現分子量約為1097bp、566bp、458bp和159bp的明亮的、特征的擴增條帶，說明樣品中含有糞腸球菌、肉桿菌、蘇云金桿菌和溶藻弧菌。
[0098]圖2顯示了對陰溝腸桿菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、糞腸球菌cylA基因樣品分別進行多重和單重PCR的檢測結果，其中M號泳道為DL2000DNA Marker ；1號泳道為三重PCR擴增結果，在分子量約為1250bp、454bp和405bp處分別呈現明亮目的擴增條帶，說明本實施例的樣品中存在陰溝腸桿菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、糞腸球菌cylA基因；2號泳道為陰溝腸桿菌gyrB基因的檢測結果，呈現分子量約為1250bp的明亮的、單一的擴增條帶，說明樣品中含有陰溝腸桿菌gyrB基因；3號泳道為副溶血弧菌tlh基因的檢測結果，呈現分子量約為454bp的明亮的、單一的擴增條帶，說明樣品中含有副溶血弧菌tlh基因；4號泳道為糞腸球菌cylA基因的檢測結果，呈現分子量約為405bp的明亮的、單一的擴增條帶，說明樣品中含有糞腸球菌cylA基因。
[0099]實施例1
[0100]利用引物設計軟件01igo6.0設計同時檢測糞腸球菌、遲緩愛德華菌、肉桿菌、蘇云金桿菌和溶藻弧菌以及陰溝腸桿菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、糞腸球菌cylA基因的多重PCR引物組合，所形成的引物組合所包含的引物堿基數為23個，引物的熔解溫度Tm值為60°C，引物的6(:%為60% ；[0101]步驟2，對引物組合中的引物進行篩選，保留不形成引物二聚體的引物；
[0102]步驟3，判斷所保留引物的競爭優劣狀態，將上述所保留引物的GC%和堿基數進行比較，當引物的堿基數均相同且內側引物的GC %小于外側引物的GC %，或者當引物的堿基數不完全相同且內側引物的堿基數比外側引物少一個堿基時，判斷為競爭狀態劣勢引物，進行步驟4 ;否則判斷為競爭狀態優勢引物，進行步驟5 ；
[0103]步驟4，再次篩選競爭狀態引物，具體步驟為:重復步驟2，對所保留的引物按照步驟3進行再次判斷；
[0104]步驟5，利用PCR方法對競爭狀態優勢引物進行擴增驗證；
[0105]步驟6，去除擴增引物中的競爭狀態劣勢引物，獲得多重PCR引物組合。
[0106]具體引物序列如下:
[0107]E.faec.(16s rRNA)Pl:5’ -TGCCGCATGGCATAAGAGTC-3’
[0108]E.faec.(16s rRNA)P2:5’ -TGCATCACCTCGCGGTCTAG-3’
[0109]E.tarda.(gyrB)P3:5， -GACTCAACGGCGGATTTCAC-3，
[0110]E.tarda.(gyrB)P4:5，-TGGCGACACCGAGCAGATT-3，
[0111]C.Co11.P5:5 ’ -CCATGGACAATGATTGTTG-3，
[0112]C.Co11.P6:5，-CTCGAGGCAGCGAGATCTT-3，
[0113]B.thur.(hbI)P7:5 ’ -CTATTCTCGTATGTTCATTCG-3’
[0114]B.thur.(hbl)P8:5’ -CTTCATTACATTCAACCCAG-3’
[0115]V.alg1.(toxR)P9:5，-GATCGTTTTGACCTGCGAAA-3’
[0116]V.alg1.(toxR)PlO:5，-GCATTGAGCGCTACGTGAAT-3，。
[0117]E.bact.(gyrB)Pl1:5，-AAGCGHCCNGSNATGTAYATHGG-3，
[0118]E.bact.(gyrB)P12:5，-CCNGCNGARTCNCCYTCNAC-3，
[0119]V.para.(tlh)P13:5’ -TGAGTTGCTGTTGTTGGATGC-3’
[0120]V.para.(tlh)P14:5’ -GTTGATGACACTGCCAGATGC-3J
[0121]E.faec.(cylA)P15:5，-GACTCGGGGATTGATAGGCA-3’
[0122]E.faec.(cylA)P16:5，-GCTGCTAAAGCTGCGCTTAC-3，
[0123]實施例2用于同時檢測糞腸球菌、遲緩愛德華菌、肉桿菌、蘇云金桿菌和溶藻弧菌以及陰溝腸桿菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、糞腸球菌cylA基因的多重PCR引物設計方法，該方法包括以下步驟:
[0124]步驟I,利用引物設計軟件Primer Premier5.0設計同時檢測糞腸球菌、遲緩愛德華菌、肉桿菌、蘇云金桿菌和溶藻弧菌以及陰溝腸桿菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、糞腸球菌cylA基因的多重PCR引物組合，所形成的引物組合所包含的引物堿基數為22個，弓丨物的熔解溫度Tm值為54°C，引物的GC %為40 % ;
[0125]步驟2，對引物組合中的引物進行篩選，保留不形成引物二聚體的引物；
[0126]步驟3，判斷所保留引物的競爭優劣狀態，將上述所保留引物的GC%和堿基數進行比較，當引物的堿基數均相同且內側引物的GC %小于外側引物的GC %，或者當引物的堿基數不完全相同且內側引物的堿基數比外側引物少一個堿基時，判斷為競爭狀態劣勢引物，進行步驟4 ;否則判斷為競爭狀態優勢引物，進行步驟5 ；
[0127]步驟4，再次篩選競爭狀態引物，具體步驟為:重復步驟2，對所保留的引物按照步驟3進行再次判斷；
[0128]步驟5，利用PCR方法對競爭狀態優勢引物進行擴增驗證；
[0129]步驟6，去除擴增引物中的競爭狀態劣勢引物，獲得多重PCR引物組合。
[0130]具體引物序列如下:
【權利要求】
1.一種用于同時檢測海洋中五種致病菌以及三種毒力基因的多重PCR引物，其特征在于:該五種致病菌以及三種毒力基因的多重PCR引物分別包括糞腸球菌、遲緩愛德華菌、肉桿菌、蘇云金桿菌和溶藻弧菌以及陰溝腸桿菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、糞腸球菌cylA基因的多重PCR引物； 其中，糞腸球菌的上下游引物為:
2.根據權利要求1所述的同時檢測海洋中五種致病菌以及三種毒力基因的多重PCR引物，所述糞腸球菌引物對應的PCR擴增片段大小為1097bp，所述遲緩愛德華菌引物對應的PCR擴增片段大小為708bp，所述肉桿菌引物對應的PCR擴增片段大小為566bp，所述蘇云金桿菌引物對應的PCR擴增片段大小為458bp，所述溶藻弧菌引物對應的PCR擴增片段大小為159bp，所述陰溝腸桿菌gyrB基因引物對應的PCR擴增片段大小為1250bp，所述副溶血弧菌tlh基因引物對應的PCR擴增片段大小為454bp，所述糞腸球菌cylA基因引物對應的PCR擴增片段大小為405bp。
3.一種根據權利要求1所述的用于同時檢測海洋中五種致病菌以及三種毒力基因的設計方法，其特征在于:包括以下步驟: 步驟1，利用引物設計軟件設計同時檢測糞腸球菌、遲緩愛德華菌、肉桿菌、蘇云金桿菌和溶藻弧菌以及陰溝腸桿菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、糞腸球菌cylA基因的多重PCR引物組合，所形成的引物組合所包含的引物堿基數為20-23個，引物的熔解溫度Tm值為540C _63°C，引物的 GC%^ 40% -60% ； 步驟2，對引物組合中的引物進行篩選，保留不形成引物二聚體的引物； 步驟3，判斷所保留引物的競爭優劣狀態，將上述所保留引物的GC%和堿基數進行比較，當引物的堿基數均相同且內側引物的GC %小于外側引物的GC %，或者當引物的堿基數不完全相同且內側引物的堿基數比外側引物少一個堿基時，判斷為競爭狀態劣勢引物，進行步驟4 ;否則判斷為競爭狀態優勢引物，進行步驟5 ； 步驟4，再次篩選競爭狀態引物，具體步驟為:重復步驟2，對所保留的引物按照步驟3進行再次判斷； 步驟5，利用PCR方法對競爭狀態優勢引物進行擴增驗證； 步驟6，去除擴增引物中的競爭狀態劣勢弓丨物，獲得多重PCR弓丨物組合。
4.一種應用如權利要求1所述的同時檢測海洋中五種致病菌以及三種毒力基因的多重PCR的檢測方法，其特征在于包括如下步驟: 1)細菌的初步分離:從培養基中提取基因組DNA，備作PCR模板； 2)多重PCR擴增 包括:a、多重PCR擴增反應體系:取上述DNA模板I~12μ L，反應體系為20-30.0 μ L，各反應產物分別為TaqDNA聚合酶5U/μ L，0.1-0.25 μ L，PCR緩沖液2.5 μ L，脫氧核糖核苷三磷酸混合物10mmol/L，2-3.5μ L，引物Ρ1、Ρ2各0.5-1.0 μ L，Ρ3、Ρ4各 1.0-2.5μ L，P5、P6 各 0.75_2μ L，P7、P8 各 1.5_4.0 μ L，P9、PlO 各 0.25-0.75μ L，P11、Ρ12 各 0.5-1.5μ L，P13、P14 各 0.25-0.75μ L，P15、P16 各 0.25-0.75 μ L，余量用重蒸水補足山、擴增反應條件:94°C預變性5min，94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸60s，循環35次，72°C終末延伸IOmin ;c、將步驟b的擴增產物進行電泳檢測及結果分析。
5.根據權利要求4所述的用于同時檢測海洋中五種致病菌以及三種毒力基因的多重PCR的檢測方法，其特征在于:所述步驟a中引物P1、P2各0.5 μ L，P3、P4各1.5 μ L，P5、Ρ6 各 I μ L，Ρ7、Ρ8 各 2 μ L, Ρ9、PlO 各 0.25 μ L, Pll、Ρ12 各 0.5 μ L, Ρ13、Ρ14 各 0.25 μ L,Ρ15、Ρ16 各 0.75 μ L0
【文檔編號】C12Q1/68GK104017873SQ201410239848
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年5月30日 優先權日:2014年5月30日
【發明者】楊季芳, 管峰, 陳吉剛, 毛芝娟 申請人:浙江萬里學院