一種同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重pcr引物組及檢測方法

一種同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重pcr引物組及檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重PCR引物組及方法。本發明檢測方法根據嗜水氣單胞菌，維氏氣單胞菌和鮰愛德華氏菌，分別設計和篩選出了三對特異性引物，通過多重PCR反應可以快速準確地檢測水生動物敗血癥中的嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和鮰愛德華氏菌。本發明可以同時檢測水生動物敗血癥的三種病原菌，檢測所需時間短、靈敏度高、特異性好，與常規病原診斷方法相比更加快捷、經濟，因此，可以用于水生動物敗血癥病的快速診斷和大規模的分子流行病學調查。
【專利說明】—種同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重PCR引物組及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種多重PCR檢測方法，具體涉及一種同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重PCR引物組及檢測方法。
【背景技術】
[0002]細菌性敗血癥又叫淡水魚類暴發性流行病，最早于1986年發現，1989年起開始在全國大范圍流行，很多水產養殖動物都可感染，如鯽、鳊、鯉、鰱、鳙、草魚，斑點叉尾鮰等。該病的發病率和死亡率均很高，是我國養魚史上危害魚的種類最多、流行地區最廣、流行季節最長、造成的損失最嚴重的一種急性傳染病。嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophiIa，_是引起水生動物細菌性敗血癥的主要致病菌，近年來維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii, AV)是也引起多種水生動物發生多器官敗血癥的常見致病菌，在斑點叉尾鮰中引起敗血癥的癥狀的主要病原菌為鮰愛德華氏菌iEdwardsiella ictaluri, EI)。
[0003]基于現有技術檢測水產動物致病菌大多沿用傳統的病樣細菌分離培養及鑒定等方法，而該方法檢測步驟繁瑣，周期較長，靈敏度低。在應對突發的疾病發生事件時，不能滿足診斷及時、結果準確、靈敏度和特異性高以及大量樣品檢測的要求。鑒于此，為了能夠實現快速對水生動物中多種致病菌的診斷和監控，各國學者研究出了一些新的觀點和方法，如酶聯免疫分析法(EILISA)、熒光免疫分析法(FIA)和聚合酶鏈反應(PCR)。針對嗜水氣單胞菌、鮰愛德華氏菌等單一致病菌的PCR檢驗方法已經建立起來法，在水產動物敗血癥基本上都是沿用普通PCR方法，通常一次只能檢測一種致病菌，檢測時間長且常常造成漏檢或誤檢。然而，水生動物養殖過程中，需要對魚類突發敗血癥病的致病菌進行快速檢測和分子流行病學調查，其樣本量大、時間緊，采用單一致病菌的PCR檢測技術和一般方法不能滿足要求，因此，建立簡便、快速、準確、可靠的檢測方法同時適用于這三種主要病原菌的檢測方法尤為重要。

【發明內容】

[0004]為了解決上述存在的問題，本發明提供了一種可以同時檢測水生動物敗血癥致病菌的多重PCR檢測方法。
[0005]本發明的目的在于提供一種同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重PCR引物組。
[0006]本發明的另一目的在于提供一種同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重PCR檢測方法。
[0007]本發明所采取的技術方案是: 一種同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重PCR引物組，其核苷酸序列分別如下所示:
嗜水氣單胞菌引物組的核酸序列如下:AH-Fl:5’ -CAGCGTCCAATACCTGGTGTTA-3’ (SEQ ID NO: 1)，或者為該序列的核酸互補序
列；
AH-Rl:5’-GCGGGTACGACGCACCTTGC-3’ (SEQ IDNO: 2)，或者為該序列的核酸互補序列； 維氏氣單胞菌引物組的核酸序列如下:
AV-F2:5’-AGCCAAGCAGGATCTGGTGAAG-3’ (SEQ ID NO: 3)，或者為該序列的核酸互補序
列；
AV-R2:5’-CTTGTTGAACTCGGGGCTCGCT-3’ (SEQ ID NO:4)，或者為該序列的核酸互補序
列；
鮰愛德華氏菌引物組的核酸序列如下:
E1-F3:5’ -CCAATTACGTGAGGATACGGCG-3’ (SEQ ID NO: 5)，或者為該序列的核酸互補序
列；
E1-R3:5’-CCCCGGCGGTTATACAGACG-3’ (SEQ ID NO:6)，或者為該序列的核酸互補序列。
[0008]一種同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重PCR檢測方法，包括以下步驟: 1)DNA模板的制備；
2)多重PCR擴增體系如下:
2Xmix23~27 μ L
10 μ mol/L AH-FlI~3 μ L
10 μ mol/L AH-Rl1-3 μ L
10 μ mol/L AV-F2I~3 μ L
10 μ mol/L AV-R2I~3 μ L
10ymol/LE1-F3I~3 μ L
10ymol/LE1-R3I~3 μ L
DNA模板I~2 μ L
ddH20加至 50 μ L ;
3)多重PCR擴增條件為:94~96°C預變性3~6min，94~95°C變性45~55s，55~60°C退火25~35s，72°C延伸5(T60s，進行28~35個循環后，然后再72°C溫度延伸7~10 min，完成PCR擴增，擴增產物4°C保存；
4)PCR產物檢測:將PCR擴增產物進行電泳、凝膠成像觀察，若有1091 bp的條帶說明樣品中有嗜水氣單胞菌，若有262 bp的條帶說明樣品中維氏氣單胞菌，若有450 bp的條帶說明樣品中有鮰愛德華氏菌，若這種大小的條帶都不存在，說明樣品中嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和鮰愛德華氏菌這三種菌為陰性。
[0009]進一步的，步驟I)所述的DNA模板制備的具體操作為:將待測水產動物的組織勻漿液750~850 g離心4~6min，取上清，900(Tl1000g離心8~12min，收集沉淀，加入0.1M的TE緩沖液，95~100°C處理8~12min ;900(Tl1000g離心8~12min，收集上清液即待測DNA模板。
[0010]進一步的，步驟2)所述的多重PCR擴增體系為:
2Xmix25 μ L
10 μ mol/L AH-FlI μ L
10 μ mol/L AH-RlI μ L
10 μ mol/L AV-F23μ L10 μ mol/L AV-R23μ L
10 μ mol/L E1-F32 μ L
10 μ mol/L E1-R32 μ L
DNA模板I μ L
ddH20加至 50 μ L。
[0011]進一步的，上述2Xmix 含有 Taq DNA Polymerase, 2XTaq PCR Buffer, 3 mM MgCl2和 400 μΜ dNTP ο
[0012]進一步的，步驟3)所述的多重PCR擴增條件為:95°C預變性4min，94°C變性50 S，59 °C退火30 s，72°C延伸I min，進行30個循環后，然后再72°C溫度延伸10 min，完成PCR擴增，擴增產物4°C保存。
[0013]本發明的有益效果是:
本發明可以同時檢測水生動物敗血癥的三種病原菌，檢測所需時間短、靈敏度高、特異性好，與常規病原診斷方法相比更加快捷、經濟，可以用于水生動物敗血癥病的快速診斷和大規模的分子流行病學調查。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為嗜水 氣單胞菌特異性檢測結果；Ah:嗜水氣單胞菌，1:霍亂弧菌F2，2:溶藻弧菌Ecgy0608，3:海豚鏈球菌ATCC29177，4:無乳鏈球菌XQ-1，5:弗氏檸檬酸桿菌HD1003，6:遲緩愛德華氏菌1101，7:螄魚諾卡氏菌012L1，8:舒氏氣單胞菌WL-1，9:溫和氣單胞菌Ptl41，10:柱狀黃桿菌G4 ；
圖2為維氏氣單胞菌特異性檢測結果，Av:維氏氣單胞菌，1:霍亂弧菌F2，2:溶藻弧菌Ecgy0608，3:海豚鏈球菌ATCC29177，4:無乳鏈球菌XQ-1，5:弗氏檸檬酸桿菌HD1003，6:遲緩愛德華氏菌1101，7:螄魚諾卡氏菌012L1，8:舒氏氣單胞菌WL-1，9:溫和氣單胞菌Ptl41，10:柱狀黃桿菌G4 ；
圖3為鮰愛德華氏菌特異性檢測結果，E1:鮰愛德華氏菌，1:霍亂弧菌F2，2:溶藻弧菌Ecgy0608，3:海豚鏈球菌ATCC29177，4:無乳鏈球菌XQ-1，5:弗氏檸檬酸桿菌HD1003，6:遲緩愛德華氏菌1101，7:螄魚諾卡氏菌012L1，8:舒氏氣單胞菌WL-1，9:溫和氣單胞菌Ptl41，10:柱狀黃桿菌G4 ；
圖4為多重PCR特異性檢測結果；
圖5為嗜水氣單胞菌敏感性檢測結果；1~6樣品中的菌濃度分別為2X IO6 cfu/mL、2XIO5cfu/mL、2XIO4 cfu/mL、2XIO3 cfu/mL、2XIO2 cfu/mL、2XIO1 cfu/mL ；
圖6為維氏氣單胞菌敏感性檢測結果；1~6樣品中的菌濃度分別為3X IO6 cfu/mL、3XIO5cfu/mL、3XIO4 cfu/mL、3XIO3 cfu/mL、3XIO2 cfu/mL、3XIO1 cfu/mL ；
圖7為鮰愛德華氏菌敏感性檢測結果；1~6樣品中的菌濃度分別為2X IO6 cfu/mL、2XIO5cfu/mL、2XIO4 cfu/mL、2XIO3 cfu/mL、2XIO2 cfu/mL、2XIO1 cfu/mL。
【具體實施方式】
[0015]一種同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重PCR檢測方法，包括以下步驟: I) DNA模板的制備；2)多重PCR擴增體系如下:
2Xmix23~27 μ L
10 μ mol/L AH-Fl1~3 μ L
10 μ mol/L AH-Rl1-3 μ L
10 μ mol/L AV-F21~3 μ L
10 μ mol/L AV-R21~3 μ L
10ymol/LE1-F31~3 μ L
10ymol/LE1-R31~3 μ L DNA模板1~2 μ L
ddH20加至 50 μ L ;
其中，嗜水氣單胞菌引物組的核酸序列如下:
AH-Fl:5’ -CAGCGTCCAATACCTGGTGTTA-3’ (SEQ ID NO: 1)，或者為該序列的核酸互補序
列；
AH-Rl:5’-GCGGGTACGACGCACCTTGC-3’ (SEQ IDNO: 2)，或者為該序列的核酸互補序列； 維氏氣單胞菌引物組的核酸序列如下:
AV-F2:5’_ AGCCAAGCAGGATCTGGTGAAG-3’ (SEQ ID NO: 3)，或者為該序列的核酸互補序
列；
AV-R2:5’_ CTTGTTGAACTCGGGGCTCGCT-3’ (SEQ ID NO:4)，或者為該序列的核酸互補序
列；
鮰愛德華氏菌引物組的核酸序列如下:
E1-F3:5’ -CCAATTACGTGAGGATACGGCG-3’ (SEQ ID NO: 5)，或者為該序列的核酸互補序
列；
E1-R3:5’-CCCCGGCGGTTATACAGACG-3’ (SEQ ID NO:6)，或者為該序列的核酸互補序列。
[0016]3)多重PCR擴增條件為:94~96°C預變性3~6min，94~95°C變性45~55 s，55~60°C退火25~35s，72°C延伸5(T60s，進行28~35個循環后，然后再72°C溫度延伸7~lOmin，完成PCR擴增，擴增產物4°C保存；
4)PCR產物檢測:將PCR擴增產物進行電泳、凝膠成像觀察，若有1091 bp的條帶說明樣品中有嗜水氣單胞菌，若有262 bp的條帶說明樣品中維氏氣單胞菌，若有450 bp的條帶說明樣品中有鮰愛德華氏菌，若這種大小的條帶都不存在，說明樣品中嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和鮰愛德華氏菌這三種菌為陰性。
[0017]優選的，步驟I)所述的DNA模板制備的具體操作為:將待測水產動物的組織勻漿液750~850 g離心4~6min，取上清，900(Tl1000g離心8~12min，收集沉淀，加入0.1M的TE緩沖液，95~100°C處理8~12min ;900(Tl1000g離心8~12min，收集上清液即待測DNA模板。
[0018]優選的，步驟2)所述的 2Xmix 含有 Taq DNA Polymerase, 2XTaq PCR Buffer, 3HiMMgCl2 和 400 μΜ dNTP。
[0019]下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0020]實施例1:
Cl)多重PCR引物組
本發明前期通過引物設計原則并結合實際情況，分別設計出大量檢測嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、鮰愛德華氏菌的引物，然后通過大量實驗研究篩選出高靈敏和高特異的引物序列，最終選取檢測這三種病原菌的PCR引物分別如下所示:
其中，嗜水氣單胞菌引物組的核酸序列如下:
AH-Fl:5’ -CAGCGTCCAATACCTGGTGTTA-3’ (SEQ ID NO:1)
AH-Rl:5’ -GCGGGTACGACGCACCTTGC-3’ (SEQ ID NO:2)
維氏氣單胞菌引物組的核酸序列如下:
AV-F2:5，- AGCCAAGCAGGATCTGGTGAAG-3’ (SEQ ID NO:3)
AV-R2:5’ - CTTGTTGAACTCGGGGCTCGCT-3’ (SEQ ID NO:4)
鮰愛德華氏菌引物組的核酸序列如下:
E1-F3:5’ -CCAATTACGTGAGGATACGGCG-3’ (SEQ ID NO:5)
E1-R3:5’ -CCCCGGCGGTTATACAGACG-3’ (SEQ ID NO:6)
(2)單基因PCR反應體系和反應條件的建立
首先通過單基因特異性PCR，初步探索每對引物組擴增對應基因片段的反應體系和反應條件。
[0021]分別提取的三種病原菌(嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和鮰愛德華氏菌)的基因組DNA作為各自引物組的擴增模板，通過多次實驗發現，各對引物組分別在以下的反應體系和條件下可以很好地擴增出對應的基因片段。
[0022]I)嗜水氣單胞菌單基因特異性PCR反應體系和條件 PCR反應體系:
2Xmix25 μ L
10 μ mol/L AH-FlI μ L
10 μ mol/L AH-RlI μ L
DNA模板I μ L
ddH20加至 50 μ L ;
PCR反應條件:95°C預變性4 min，94°C變性30 s，57°C退火30 s，72°C延伸I min，進行30個循環后，然后72°C終延伸10 min。
[0023]2)維氏氣單胞菌單基因特異性PCR反應體系和條件 反應體系:
2Xmix25 μ L
10 μ mol/L AV-F2I μ L
10 μ mol/L AV-R2I μ L
DNA模板I μ L
ddH20加至 50 μ L ;
PCR反應條件:95°C預變性4min，94°C變性30 s，57°C退火30 s，72°C延伸I min，進行30個循環后，然后72°C終延伸10 min。
[0024]3)鮰愛德華菌單基因特異性PCR反應體系和條件 反應體系:
2Xmix25 μ L
10 umol/LE1-F3: IuL10 μ mol/L E1-R3: IuL DNA模板I μ L
ddH20加至 50 μ L ;
PCR反應條件:95°C預變性4 min，94°C變性30 s，57°C退火30 s，72°C延伸I min，進行30個循環后，然后72°C終延伸10 min。
[0025]通過上述單基因PCR特異性試驗，三種細菌的基因組DNA均能較好地擴增出相應的目的片段。
[0026](3)多重PCR反應體系和反應條件的初探試驗
在單基因特異性PCR反應的基礎上，將三種細菌的DNA模板混合，運用3對特異性引物，建立多重PCR檢測方法，研究其最佳反應條件。
[0027]為了解3對引物組同時擴增其目的基因時，引物內部間的相互影響，預先將引物的最終濃度都定為0.2 μ M，按如下反應體系及反應條件同時進行擴增。
[0028]I)多重PCR初探試驗反應體系 2Xmix5 μ L
10 μ mol/L的6種引物各IyL
3種DNA模板各I μ L ddH20加至 50 μ L ;
2)多重PCR初探試驗反應條件
95°C預變性4 min，94°C變性30 S，57°C退火30 s，72°C延伸I min，進行30個循環后，然后72°C終延伸10 min。
[0029]多重PCR檢測結果結果表明3個目的片段均能同時被擴增，無非特異性條帶產生；其中引物組AH-Fl和AH-R1、E1-F3和E1-R3的擴增的效果較好，而AV-F2和AV-R2弓丨物組的擴增效果相對稍差。
[0030]接下來對的多重PCR反應體系和條件作進一步的優化。
[0031](4)多重PCR反應體系和反應條件的優化 O引物濃度的優化
根據上述初探試驗的結果，在反應體系中，保持引物AH-Fl和AH-Rl濃度不變，分別調整另外2對引物濃度，將其加入量逐漸調高為:0.3 μΜ,Ο.4 μ Μ,0.6 μ Μ,0.8 μ Μ, 1.0 μ Μ,進行多重PCR擴增。
[0032]多重PCR的檢測結果表明:當引物E1-F3和E1-R3濃度均為0.4 μ M時，其擴增效果最好；而AV-F2和AV-R2引物組的擴增效果稍差，需要對AV-F2和AV-R2引物組濃度進行優化。
[0033]固定引物AH-Fl和AH-R1、E1-F3和E1-R3濃度分別為0.2 μ M和0.4 μ M不變，逐次提高引物AV-F2和AV-R2的濃度，對多重PCR的AV-F2和AV-R2引物濃度進行優化。
[0034]多重PCR的檢測結果表明:當引物AV-F2和AV-R2的濃度調高至0.6 μΜ時，其擴增效果明顯提高。
[0035]總合以上實驗結果，多重PCR檢測體系中3對引物的最佳濃度為=AH-Fl和AH-Rl為 0.2 μΜ, AV-F2 和 AV-R2 為 0.6 μ M，E1-F3 和 E1-R3 為 0.4 μ Μ。
[0036]2 )退火溫度的優化由于3對引物設計時，其適合退火溫度為55~60°C，因此，運用優化后的引物濃度，在溫度梯度PCR儀中設置溫度梯度，進行多重PCR擴增。結果表明當多重PCR的退火溫度為55~60°C，3對引物的擴增效果均較好，優其是59°C的退火溫度效果最佳，綜合考慮，將其最適退火溫度設定為59°C。
[0037](5)建立一種同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重PCR檢測方法
1)DNA模板的制備:取水產動物的組織勻漿液置于1.5mL的離心管中，800g離心5min，除去組織碎片取上清置于1.5mL滅菌離心管中；10000g離心10min，除去上清液，加入100 μ L0.1M的TE緩沖液，100°C沸水浴IOmin ； 1000Og離心10min,上清液即待檢測DNA模板；
2)建立多重PCR擴增體系，如下所示:
2Xmix25 μ L
10ymol/L AH-FlI μ L
10ymol/L AH-RlI μ L
10ymol/L AV-F23μ L
10ymol/L AV-R23μ L
10 μ mol/L E1-F32 μ L
10 μ mol/L E1-R32 μ L
DNA模板I μ L
ddH20加至 50 μ L ;
擴增條件為:95°C預變性4min，94°C變性50 s，59 °C退火30 s，72°C延伸I min，進行30個循環后，然后再72°C溫度延伸10 min，完成PCR擴增，擴增產物4°C保存。
[0038]3)PCR產物檢測:被檢測樣品的PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳后用溴化乙錠染色；電泳結果在紫外分析儀下觀察PCR擴增產生DNA片段大小。
[0039]若有1091 bp的條帶說明樣品中有嗜水氣單胞菌，若有262bp的條帶說明樣品中維氏氣單胞菌，若有450 bp的條帶說明樣品中有鮰愛德華氏菌,若這三種大小的條帶都不存在，說明樣品中嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和鮰愛德華氏菌為這三種菌為陰性。
[0040]下面對本發明建立的同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重PCR檢測方法作進一步的效果檢測。
[0041]一、特異性試驗
(I)單基因PCR法檢測特異性
將提取的三種病原菌的基因組DNA作為單項PCR的擴增模板，同時設計多種細菌的DNA對照組，特異PCR擴增時的DNA對照組為霍亂弧菌F2，溶藻弧菌Ecgy0608，海豚鏈球菌ATCC29177，無乳鏈球菌XQ-1，弗氏檸檬酸桿菌HD1003，遲緩愛德華氏菌1101，螄魚諾卡氏菌012L1，舒氏氣單胞菌WL-1，溫和氣單胞菌Pt 141，柱狀黃桿菌G4這10種常見水生動物病原菌。
[0042]以設計的特異性引物進行PCR擴增，其反應體系及PCR擴增條件如下:
O嗜水氣單胞菌特異PCR
反應體系:
2Xmix25 μ L10 μ mol/L AH-FlI μ L
10 μ mol/L AH-RlI μ L
DNA模板I μ L
ddH20加至 50 μ L ;
PCR反應條件:95°C預變性4min，94°C變性50 s，59 °C退火30 s，72°C延伸I min，進行30個循環后，然后再72°C溫度延伸10 min，完成PCR擴增，擴增產物4°C保存。
[0043]對上述PCR產物進行檢測，檢測結果如圖1所示，從圖中可以看出本發明的嗜水氣單胞菌PCR引物只對嗜水氣單胞菌具有擴增現象，對其他常見水生動物病原菌不具有擴增現象。
[0044]2)維氏氣單胞菌特異PCR 反應體系:
2Xmix25 μ L
10 μ mol/L AV-F2I μ L
10 μ mol/L AV-R2I μ L DNA模板I μ L
ddH20加至 50 μ L ;
PCR反應條件:95°C預變性4min，94°C變性50 s，59 °C退火30 s，72°C延伸I min，進行30個循環后，然后再72°C溫度延伸10 min，完成PCR擴增，擴增產物4°C保存。
[0045]對上述PCR產物進行檢測，檢測結果如圖2所示，從圖中可以看出本發明的維氏氣單胞菌PCR引物只對維氏氣單胞菌具有擴增現象，對其他常見水生動物病原菌不具有擴增現象。
[0046]3)鮰愛德華菌特異PCR 反應體系:
2Xmix25 μ L
10umol/LE1-F3IuL
10 μ mol/L E1-R3IuL
DNA模板I μ L
ddH20加至 50 μ L ;
PCR反應條件:95°C預變性4min，94°C變性50 s，59 °C退火30 s，72°C延伸I min，進行30個循環后，然后再72°C溫度延伸10 min，完成PCR擴增，擴增產物4°C保存。
[0047]對上述PCR產物進行檢測，檢測結果如圖3所示，從圖中可以看出本發明的鮰愛德華菌PCR引物只對鮰愛德華菌具有擴增現象，對其他常見水生動物病原菌不具有擴增現象。
[0048]上述結果說明本發明的引物對嗜水氣單胞菌XS9141、鮰愛德華菌HSN-1、維氏氣單胞菌IB340三種細菌的基因組DNA均能擴增出相應的目的片段，而對照組無擴增產物出現，說明本發構建的這種可同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重PCR檢測方法具有很好的特異性。
[0049](2)多重PCR法檢測特異性 分別準備以下樣品:樣品I含有嗜水氣單胞菌XS9141、鮰愛德華菌HSN-1、維氏氣單胞菌IB340 ;溫和氣單胞菌Ptl41、舒氏氣單胞菌WL-1、遲緩愛德華氏菌1101。；
樣品2含有嗜水氣單胞菌XS9141，維氏氣單胞菌IB340 ；
樣品3含有嗜水氣單胞菌XS9141，鮰愛德華菌HSN-1 ；
樣品4含有維氏氣單胞菌IB340，鮰愛德華菌HSN-1 ；
樣品5含有嗜水氣單胞菌XS9141 ；
樣品6含有維氏氣單胞菌IB340 ；
樣品7含有鮰愛德華菌HSN-1 ；
樣品8含有溫和氣單胞菌Ptl41、舒氏氣單胞菌WL-1、霍亂弧菌F2、溶藻弧菌Ecgy0608、遲緩愛德華氏菌1101。
[0050]分別提取上述各樣品中病原菌的DNA作為多重PCR模板，以實施例1中(5)建立的多重PCR檢測方法對各樣品進行多重PCR檢測。
[0051]檢測結果如圖4所示，從圖中可以看出本發明的多重PCR檢測方法可以同時對嗜水氣單胞菌、鮰愛德華菌、維氏氣單胞菌進行特異性檢出；不受其他水生動物常見病原菌的干擾，本發明建立的多重PCR檢測方法特異性強。
[0052]二、敏感性試驗
取28°C培養20 h的嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、鮰愛德華氏菌菌液，參照國標法(GB/T4789.2-2003)進行細菌計數，三種菌的濃度分別為嗜水氣單胞菌:2X IO8 cfu/mL、維氏氣單胞菌:3X IO8 cfu/mL、鮰愛德華氏菌3X 108cfu/mL。上述的菌液離心收集菌體，然后提取基因組DNA，對基因組DNA進行系列梯度稀釋，分別稀釋為IOiUO2UO3UO4UO5、106和IO7倍，以實施例1中(5)建立的多重PCR檢測方法進行多重PCR檢測。
[0053]檢測結果如圖5~7所示，本發明的檢測方法對稀釋IO6倍的菌液合仍能檢出，可見本發明的多重PCR檢測對嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、鮰愛德華氏菌三種病原菌的檢測限分別可達 200 cfu/mL、300 cfu/mL、300 cfu/mL。
[0054]三、重復性試驗
對嗜水氣單胞菌、鮰愛德華菌、維氏氣單胞菌陽性模板，分13批次進行本發明的多重PCR擴增，觀察多重PCR檢測方法的穩定性。結果顯示陽性模板均能擴增出特異性目的條帶，表明該多重PCR檢測方法穩定，重復性良好，有較好的臨床應用價值。
[0055]四、臨床運用
(I)材料與方法
樣本的采集:使用采集袋，采集了湖北某養殖場的斑點叉尾鮰、草魚樣品50份，編號，待檢。
[0056](2)方法
I)傳統常規檢測方法:對組織病料進行病原菌的分離純化，培養，進行常規生理生化鑒定，和用16SrRNA通用引物進行PCR鑒定。
[0057]2)本發明多重PCR檢測:見實施例1中(5)所述。
[0058](3)結果
50份待檢樣本中，采用本發明的多重PCR方法同時檢出嗜水氣單胞菌和鮰愛德華氏菌的樣品有2份；同時檢出嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌的樣品有1份；單一檢出嗜水氣單胞菌、鮰愛德華氏菌和維氏氣單胞菌的樣品分別有31份、2份和14份，該結果與傳統常規檢測法(細菌分離鑒定)的 結果完全吻合。
【權利要求】
1.一種同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重PCR引物組，其核苷酸序列分別如下所示: 嗜水氣單胞菌引物組的核酸序列如下: AH-Fl:5’ -CAGCGTCCAATACCTGGTGTTA-3’ (SEQ ID NO: 1)，或者為該序列的核酸互補序列； AH-Rl:5’-GCGGGTACGACGCACCTTGC-3’ (SEQ IDNO: 2)，或者為該序列的核酸互補序列； 維氏氣單胞菌引物組的核酸序列如下: AV-F2:5’-AGCCAAGCAGGATCTGGTGAAG-3’ (SEQ ID NO: 3)，或者為該序列的核酸互補序列； AV-R2:5’-CTTGTTGAACTCGGGGCTCGCT-3’ (SEQ ID NO:4)，或者為該序列的核酸互補序列； 鮰愛德華氏菌引物組的核酸序列如下: E1-F3:5’ -CCAATTACGTGAGGATACGGCG-3’ (SEQ ID NO: 5)，或者為該序列的核酸互補序列； E1-R3:5’-CCCCGGCGGTTATACAGACG-3’ (SEQ ID NO:6)，或者為該序列的核酸互補序列。
2.一種同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重PCR檢測方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)DNA模板的制備； 2)多重PCR擴增體系如下: 2Xmix23~27 μ L 10ymol/L AH-Fl1~3 μ L 10ymol/L AH-Rl1-3 μ L 10ymol/L AV-F21~3 μ L 10ymol/L AV-R21~3 μ L 10ymol/LE1-F31~3 μ L 10ymol/LE1-R31~3 μ L DNA模板1~2 μ L ddH20加至 50 μ L ; 3)多重PCR擴增條件為:94~96°C預變性3~6min，94~95°C變性45~55s，55~60°C退火25~35s，72°C延伸5(T60s，進行28~35個循環后，然后再72°C溫度延伸7~10 min，完成PCR擴增，擴增產物4°C保存； 4)PCR產物檢測:將PCR擴增產物進行電泳、凝膠成像觀察，若有1091 bp的條帶說明樣品中有嗜水氣單胞菌， 若有262 bp的條帶說明樣品中維氏氣單胞菌，若有450 bp的條帶說明樣品中有鮰愛德華氏菌，若這種大小的條帶都不存在，說明樣品中嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和鮰愛德華氏菌這三種菌為陰性。
3.根據權利要求2所述的一種同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重PCR檢測方法，其特征在于:步驟I)所述的DNA模板制備的具體操作為:將待測水產動物的組織勻漿液750~850 g離心4~6min，取上清，900(Tl1000g離心8~12min，收集沉淀，加入0.1M的TE緩沖液，95~100°C處理8~12min ;9000~1 1000g離心8~12min，收集上清液即待測DNA模板。
4.根據權利要求2所述的一種同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重PCR檢測方法，其特征在于:步驟2)所述的多重PCR擴增體系為: .2Xmix25 μ L .10ymol/L AH-FlI μ L .10ymol/L AH-RlI μ L .10ymol/L AV-F23μ L .10ymol/L AV-R23μ L .10 μ mol/L E1-F32 μ L .10 μ mol/L E1-R32 μ L DNA模板I μ L ddH20加至 50 μ L。
5.根據權利要求2或4所述的一種同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重PCR檢測方法，其特征在于:所述的2 Xmix含有Taq DNA Polymerase, 2 X Taq PCR Buffer, 3 mMMgCl2 和 400 μΜ dNTP。
6.根據權利要求2所述的一種同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重PCR檢測方法，其特征在于:步驟3)所述的多重PCR擴增條件為:95°C預變性4min，94°C變性50 S，59°C退火30 s，72°C延伸I min，進行30個循環后，然后再72°C溫度延伸10 min，完成PCR擴增，擴增產物4°C保存。
【文檔編號】C12R1/01GK104004842SQ201410229181
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月27日 優先權日:2014年5月27日
【發明者】張德鋒, 劉禮輝, 吳淑勤, 李寧求, 石存斌, 付小哲, 林強, 任燕 申請人:中國水產科學研究院珠江水產研究所