專利名稱：：組裝多表達構建體的方法
背景技術：
：發明領域本發明涉及通過直接的重組克隆用多基因表達盒組裝構建體的方法。具有改造的重組位點的DNA和載體被提供用于重組克隆的方法，該方法使能夠通過單個重組克隆步驟有效和特異地將表達盒組裝成為一個多表達構建體。相關技術位點特異性的重組酶是存在于多種生物(如病毒和細菌)中的蛋白質且其特征在于同時具有內切酶和連接酶的特性。這些重組酶(有時與結合的蛋白質一起)識別DNA堿基的特定序列并交換那些區段側翼的DNA區段。該重組酶和結合的蛋白質一起被稱為“重組蛋白質”(見如LandyA.，CurrentOpinioninBiotechnology3699-707(1993))。來自多種生物的許多重組系統已被描述。見如Hoess等人(1986)NucleicAcidsRes14(6)2287；Abremski等人(1986)JBiolChem261(1)391；Campbell(1992)JBacteriol174(23)7495；Qian等人(1992)JBiolChem267(11)7794；Araki等人(1992)JMolBiol225(1)25；MaeserandKahnmann(1991)MolGenGenet230170-176)；Esposito等人(1997)NuclAcidsRes25(18)3605)。其中許多屬于重組酶的整合酶家族(Argos等人(1986)EMBOJ.5433-440)。其中的最佳研究可能是來自λ噬菌體的整合酶/att系統(LandyA(1993)CurrentOpinionsinGeneticsandDevel3699-707)、來自噬菌體P1的Cre/LoxP系統(Hoess和Abremski(1990)InNucleicAcidsandMolecularBiology，vol.4.編輯Eckstein和Lilley，Berlin-HeidelbergSpringer-Verlag；90-109頁)和來自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)2μm質粒的FLP/FRT系統(Broach等人(1982)Cell29227-234)。Backman(U.S.Pat.No.4673640)公開了λ重組酶重組產生蛋白質的DNA片段的體內用途，該重組過程使用野生型重組位點attB和attP通過酶促位點特異性重組實現。Hasan和Szybalski(Gene56145-151(1987))公開了λInt重組酶用于啟動子側翼的野生型attP和attB位點之間的分子內重組的體內用途。Boyd(Nucl.AcidsRes.21817-821(1993))公開了使用促進分子間連接至含有野生型loxP位點的去磷酸化載體的條件幫助克隆平端DNA的方法，該野生型loxP位點受到存在于大腸桿菌宿主細胞的Cre位點特異性重組酶的作用。Waterhouse等人在(NucleicAcidsRes.21(9)2265(1993))公開了將特定抗體的輕鏈和重鏈克隆在不同噬菌體載體的loxP和loxP511位點之間并用于轉染新的大腸桿菌細胞的體內方法。轉座酶家族也已被用于在復制子之間轉移遺傳信息。或簡單或復雜的轉座子是結構可變的，但通常編碼其側翼有反向組織的DNA序列的重組酶基因。轉座子的整合可以是隨機或高度特異性的。代表性的如高度位點特異性的Tn7，其已被用于體內移動復制子之間的DNA片段(Lucklow等人(1993)J.Virol.674566-4579)。Devine和Boeke在Nucl.AcidsRes.223765-3772(1994)公開了用于將DNA片段體外插入受體DNA分子的人工轉座子的構建。該系統使用酵母TY1病毒樣顆粒的整合酶。使用標準方法在轉座子類似元件TY1末端之間克隆目的DNA片段。當存在TY1整合酶時，產生的元件隨機整合入第二個靶DNA分子。US5888732描述了用于促進復雜克隆步驟的重組克隆方法。其中所述方法基于通過用重組酶代替限制性核酸內切酶和連接酶組合DNA片段。通過選擇某些重組位點和利用其組合，在克隆中可操作的應用重組酶獲得可預期的產物。其中所述方法被用于將源自文庫的cDNA插入載體、在多種表達載體之間交換插入片段、或組合，例如啟動子與編碼序列。目前，生物技術中的主要實驗涉及單個基因的操作。然而，許多重要性狀和復雜的代謝途徑決定于多個基因間的相互作用，因此基因工程必須進行多基因性狀、多性狀和多基因產物的操作。基礎和應用研究都經常需要導入和表達多個轉基因表達盒。然而，由于現有方法的限制，目前的多基因轉化方法是費時、費力的(綜述見FrancoisIEJA等人(2002)PlantScience163281-295；HalpinC等人(2001)PlantMolBiol47295-310)。當前的方法包括帶有分別的轉基因的植物間的有性雜交(MaJK等人(1995)Science268716-719；BizilySP等人(2000)NatBiotechnol.18213-217)、順序的重轉化(LapierreC等人(1999)PlantPhysiol119153-163)、使用多個質粒的共轉化(ChenL等人(1998)NatBiotechnol161060-1064；YeX等人(2000)Science287303-305；HadiMZ等人(1996)PlantCellRep.15500-505)、使用內部核糖體進入位點(IRES)組合在一個啟動子控制下的多個mRNA編碼序列(UrwinP等人(2000)PlantJ24583-589)、或在其上通過冗繁的克隆方法連入多個轉基因的單個質粒(GoderisIJ等人(2002)PlantMolBiol5017-27；DasguptaS等人(1998)PlantJ16107-116；HalpinC等人(1999)PlantJ17453-459；DecosaB等人(2001)NatBiotechnol1971-74；DeGrayG等人(2001)PlantPhysiol127852-862；ThompsonJM等人(2002)InVitroCellDev.Biol.-Plant38537-542)。LinL等人(ProcNatlAcadSciUSA2003，100(10)5962-5967)描述了基于位點特異性重組酶的隨后作用和由歸巢核酸內切酶作用產生的載體骨架去除而組裝多達10個表達盒的系統。該系統的缺點在于每個表達盒必須在單獨一輪的重組酶介導的整合和隨后載體骨架除去中加入轉化構建體，所述載體骨架除去包括單獨步驟的質粒分離和再次轉化。盡管使用該系統比標準克隆方法有進步和較少的錯誤傾向，其仍需要許多的順序操作步驟。上述所有技術都非常耗時耗力。其容易出錯并且需要通過測序對每個克隆步驟仔細驗證。因此，長期以來需要提供備選的方法使能夠周兩個或更多的表達盒對生物進行更快速和更有效的轉化。發明概述本發明提供核酸、載體和方法，其用于體外或體內使用重組蛋白質獲得含有至少兩個表達盒的DNA構建體。這些方法與標準克隆技術相比是高度特異、迅速和省力的。因此，本發明的第一個實施方案涉及產生包含至少兩個不同的表達盒的多表達構建體(MultipleExpressionConstruct)的方法，所述方法包括在體外或體內組合i)一個或更多的插入片段供體(InsertDonor)分子，所述插入片段供體分子共包含至少兩個插入片段I(n)，每個插入片段包含至少一個表達盒，所述插入片段兩側是兩個不同的重組位點A(2n)和A(2n+1)，其中n是表征每個插入片段的從1到m的整數，且m是不同插入片段的總數，和ii)包含兩個不同重組位點A1和A(2m+2)的插入片段受體(InsertAcceptor)分子，其中m是步驟i)的不同插入片段的總數，其中所有的重組位點A(1)到A(2m+2)是不同的，且其中對于具體的i，重組邊A(2i-1)可以與同一i的重組邊A(2i)重組，但是基本不與另一重組位點重組，所述i是從1到m+1的整數，和iii)至少一種位點特異性重組蛋白質，其能夠重組所述插入片段供體分子和所述插入片段受體分子中的所述重組位點，和在足以使全部所述插入片段轉移入所述插入片段受體分子的條件下溫育所述組合，由此產生多表達構建體。可以任選的從其它分子，如未反應的插入片段受體分子或插入片段供體分子或其它非計劃的副產物中選出或分離出產生的多表達構建體分子。插入片段供體DNA分子可以還包含編碼至少一種標記的DNA片段，該標記選自克隆位點、限制位點、啟動子、操縱子、復制起始點、功能性DNA、反義RNA、PCR片段、蛋白質和蛋白質片段之一。優選地，至少一種標記被包含在至少一個插入片段中。由于高效率的重組克隆方法產生的高效率的明確結果，該標記不必須是能夠分離和選擇產生的多表達構建體的選擇標記。在優選的實施方案中，插入片段受體分子包含側翼為所述兩個不同重組位點A1和A(2m+2)的DNA片段，該重組位點在重組過程中將被代替。優選地，插入片段受體分子包含至少一種選擇標記。更優選地，插入片段受體分子還包含(a)毒性基因和(b)選擇標記，其中所述毒性基因和所述選擇標記位于不同的DNA片段上，該DNA片段通過至少兩個重組位點彼此分開。優選地，毒性基因由于重組方法而從插入片段受體分子缺失。可以被包含在插入片段、插入片段供體、插入片段受體或載體供體分子的選擇標記(SelectableMarker)可以包含至少一段DNA片段，該DNA片段選自(a)其編碼產物在受體細胞或生物中提供針對其它毒性化合物抗性(“負選擇標記”)的DNA片段；(b)其編碼產物在受體細胞或生物中有毒性(“反選擇標記”)的DNA片段；(c)其編碼產物賦予受體細胞或生物生長或增殖優勢(“正選擇標記”)的DNA片段；(d)其編碼產物能夠被鑒定的DNA片段；(e)其編碼產物在受體細胞中抑制一種細胞功能的DNA片段；(f)抑制以上(a)-(e)的任何DNA片段活性的DNA片段；(g)與修飾底物的產物結合的DNA片段；(h)其編碼可以被蛋白質、RNA、DNA或化學品識別的特異性核苷酸識別序列的DNA片段；(i)當其缺失時直接或間接地賦予對由特定化合物在受體細胞內引起的細胞殺傷的敏感性的DNA片段；(j)其編碼產物在宿主細胞內抑制基因產物活性的DNA片段；(k)其編碼產物在受體細胞缺少的DNA片段，和；(1)可以用于分離或鑒定想要的分子的DNA片段。所述選擇標記可以優選包括至少一種標記，該標記選自抗生素抗性基因、除草劑抗性基因、tRNA基因、營養缺陷型標記、毒性基因、表型標記、反義寡核苷酸、限制性內切核酸酶、限制性內切核酸酶切割位點、酶切割位點、蛋白質結合位點和與PCR引物序列互補的序列。在優選的實施方案中，插入片段受體分子是優選的選自原核和/或真核載體的載體供體分子。根據本發明，載體供體分子可以包括在多種系統或宿主細胞中起作用的載體。優選的用于本發明的載體包括原核載體、真核載體或可以穿梭于多種原核和/或真核系統之間的載體(如穿梭載體)。優選的真核載體包括在酵母細胞、植物細胞、魚細胞、真核細胞、哺乳動物細胞或昆蟲細胞中復制的載體。優選的原核載體包括在革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性細菌中復制的載體，更優選在埃希菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、芽孢桿菌屬(bacillus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、農桿菌屬(Agrobacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)或假單胞菌屬(Pseudomonas)的細菌中復制的載體。最優選的載體是在大腸桿菌和農桿菌中都能夠復制的載體。用于本發明的真核載體包括在酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞(特別是人細胞)、真菌細胞、昆蟲細胞、魚細胞等中增殖和/或復制的載體。具體的目的載體包括但不限于克隆載體、測序載體、表達載體、融合載體、雙雜交載體、基因治療載體和反向雙雜交載體。這些載體可以由具體載體決定被用于原核和/或真核系統。插入片段供體DNA分子、插入片段受體DNA分子和/或載體供體DNA分子可以分別由線性或環狀DNA分子組成。插入片段供體分子可以包含載體或擴增產生的DNA片段。本發明的方法還可以包括選擇多表達構建體的步驟，該構建體含有所述插入片段供體分子的全部所述插入片段。多種重組位點和對應的重組蛋白質可以被用于本發明的方法。優選地，重組位點選自loxP、attB、attP、attL和attR。更優選地，所述重組位點含有選自如下序列之一的DNA序列和對應的或互補的DNA或RNA序列(a)RKYCWGCTTTYKTRTACNAASTSGB(m-att)(SEQIDNO1)；(b)AGCCWGCTTTYKTRTACNAACTSGB(m-attB)(SEQIDNO2)；(c)GTTCAGCTTTCKTRTACNAACTSGB(m-attR)(SEQIDNO3)；(d)AGCCWGCTTTCKTRTACNAAGTSGB(m-attL)(SEQIDNO4)；(e)GTTCAGCTTTYKTRTACNAAGTSGB(m-attP1)(SEQIDNO5)；其中R＝A或G；K＝G或T/U；Y＝C或T/U；W＝A或T/U；N＝A、C或G或T/U；S＝C或G；和B＝C、G或T/U最優選地，重組位點含有選自下列序列之一的DNA序列和對應的或互補的DNA或RNA序列(a)AGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGT(attB1)(SEQIDNO6)；(b)AGCCTGCTTTCTTGTACAAACTTGT(attB2)(SEQIDNO7)；(c)ACCCAGCTTTCTTGTACAAACTTGT(attB3)(SEQIDNO8)；(d)GTTCAGCTTTTTTGTACAAACTTGT(attR1)(SEQIDNO9)；(e)GTTCAGCTTTCTTGTACAAACTTGT(attR2)(SEQIDNO10)；(f)GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG(attR3)(SEQIDNO11)；(g)AGCCTGCTTTTTTGTACAAAGTTGG(attL1)(SEQIDNO12)；(h)AGCCTGCTTTCTTGTACAAAGTTGG(attL2)(SEQIDNO13)；(i)ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG(attL3)(SEQIDNO14)；(j)GTTCAGCTTTTTTGTACAAAGTTGG(attP1)(SEQIDNO15)；(k)GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG(attP2，P3)(SEQIDNO16)；(l)AGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGC(attB1*)(SEQIDNO52)；(m)ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGC(attB2*)(SEQIDNO53)；(N)CAACTTTATTATACATAGTTG(attB3*)(SEQIDNO54)(O)CAACTTTTCTATACAAAGTTG(attB4*)(SEQIDNO55)(p)GTTCAACTTTTTTGTACAAACTTGC(attR1*)(SEQIDNO56)(q)TTCAACTTTCTTGTACAAAGTGGG(attR2*)(SEQIDNO57)(r)GTTCAACTTTATTATACATAGTTGA(attR3*)(SEQIDNO58)(s)GTTCAACTTTTCTATACAAAGTTGA(attR4*)(SEQIDNO59)(t)AGCCTGCTTTTTTGTACAAAGTTGG(attL1*)(SEQIDNO60)(u)ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG(attL2*)(SEQIDNO61)(v)GGCAACTTTATTATACAAAGTTGG(attL3*)(SEQIDNO62)(w)ACCCAACTTTTCTATACAAAGTTGG(attL4*)(SEQIDNO63)(x)GTTCAACTTTTTTGTACAAAGTTGG(attP1*)(SEQIDNO64)(y)GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG(attP2*)(SEQIDNO65)(z)GTTCAACTTTATTATACAAAGTTGG(attP3*)(SEQIDNO66)(aa)GTTCAACTTTTCTATACAAAGTTGG(attP4*)(SEQIDNO67)優選地，所述重組蛋白質選自Int、Cre、Flp和Res。包含在插入片段供體分子的插入片段中的表達盒由可操作地連接于啟動子序列的目的核酸序列和任選的，另外的調節序列例如轉錄終止子序列、增強子等組成。根據靶生物選擇啟動子，計劃在所述生物中從所得多表達構建體表達。例如，如果計劃在植物中表達，使用在植物中具有轉錄活性的啟動子。目的核酸序列應該被廣義的理解(如上定義的)。表達盒可以導致不可翻譯或可翻譯的RNA的轉錄。不可翻譯的RNA可以包括例如反義或雙鏈RNA，其產生對應內源基因的基因沉默從而賦予有用的性狀。可翻譯的RNA可以產生蛋白質從而賦予有用的性狀。根據本領域公知的知識、本發明的下面的附圖和描述以及權利要求，本發明的其它優選的實施方案對普通的技術人員而言是顯而易見的。一般定義應該被理解的是本發明并非限于所述的具體的方法學、方案、細胞系、植物種或屬、構建體和試劑。還應該被理解的是本文所用術語僅以描述具體實施方案為目的，而并非意圖限制本發明的范圍，其范圍僅將受到所附權利要求的限制。在下列描述中，在重組DNA技術中所用的許多術語是被廣泛使用的。為了清楚和一致地理解本說明書和權利要求，包括這些術語給出的范圍，提供下列定義。必須指出的是，除非本文中有其它清楚的指示，在本文和在所附權利要求中所用的單數形式的“一個”、以及“這個”包括復數指代。因此，例如提及“一個載體”是指一個或更多的載體并包括本領域技術人員公知的其等同物等等。本文所用術語“約”意指大約的、概略的、附近或在該區域中。當術語“約”被用于數值范圍時，其通過延伸提出的數值的上下界限修飾其范圍。通常，術語“約”在文中被用于以所述數值20％上下(更高或更低)的改變來修飾高于或低于所述數值的數值。如本文所用，單詞“或”意指具體所列出的任何成員和還包括列出的成員的任意組合。術語“核苷酸”指堿基-糖-磷酸酯組合。核苷酸是核酸序列(DNA和RNA)的單體單位。術語核苷酸包括核糖核苷三磷酸ATP、UTP、CTP、GTP和脫氧核糖核苷三磷酸如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。這些衍生物包括，例如[αS]dATP、7-脫氮雜-dGTP和7-脫氮雜-dATP。文中所用術語核苷酸還指雙脫氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)和其衍生物。雙脫氧核糖核苷三磷酸的說明性實例包括但不限于ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。根據本發明，“核苷酸”可以是未標記的或通過熟知技術可檢測地標記的。可檢測的標記包括，例如放射性同位素、熒光標記、化學發光標記、生物發光標記和酶標記。術語“核酸”指單鏈或雙鏈，正義或反義形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及其聚合物或雜合物。除非另外指出，特定的核酸序列無疑還包括其保守修飾的變體(如簡并密碼子替代)和互補序列以及明確指出的序列。術語“核酸”在本文中與“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互換的使用。如本文所用的短語“核酸序列”指代表核苷酸的縮寫、字母、字符或詞的連續序列。在一個實施方案中，核酸可以是相對短的通常長度上少于100個核苷酸的核酸“探針”。通常核酸探針在長度上是從約50個核苷酸到約100個核苷酸。核酸的“靶區域”是被鑒定為重要的核酸的部分。核酸的“編碼區域”是當置于合適的調節序列控制下以序列特異性方式轉錄和翻譯產生特定多肽或蛋白質的核酸的部分。所述編碼區域編碼這類多肽或蛋白質。術語“寡核苷酸”指含有共價相連的核苷酸序列的合成或天然分子，所述核苷酸在一個核苷酸的脫氧核糖或核糖的3’位置與相鄰核苷酸的脫氧核糖或核糖的5’位置之間通過磷酸二酯鍵連接。術語“反義”被理解為意指具有互補于靶序列的序列的核酸，例如信使RNA(mRNA)序列，嘗試通過與靶序列雜交啟動其表達的阻斷。術語“正義”被理解為意指序列同源或同一于靶序列的核酸，例如結合于蛋白質轉錄因子的序列和涉及特定基因表達的序列。根據優選的實施方案，該核酸包括目的基因和允許所述目的基因表達的元件。術語“基因”指可操作地連接于合適的調節序列的編碼區，該調節序列能夠以某些方式調節多肽表達。基因包括在編碼區(可讀框，ORF)前面(上游)和后面(下游)的DNA的非翻譯的調節區(如啟動子、增強子、阻抑物等)以及適用時，在單個編碼區(即外顯子)之間的間插序列(即內含子)。如本文所用，術語“編碼區”當被用于結構基因時指編碼作為mRNA分子的翻譯結果在新生多肽中發現的氨基酸的核苷酸序列。真核生物編碼區邊界的5’側是編碼起始甲硫氨酸的核苷酸三聯體“ATG”而3’側是三個指定終止密碼子(即TAA、TAG、TGA)的三聯體之一。除了含有內含子，基因的基因組類型還可以包括同時位于RNA轉錄物序列5’和3’端的序列。這些序列被稱為“側翼”序列或區域(這些側翼序列位于mRNA轉錄物的非翻譯序列的5’或3’)。所述5’側翼區可以包含調節序列如控制或影響基因轉錄的啟動子和增強子。所述3’側翼區可以包含指導轉錄終止、轉錄后切割和多聚腺苷化作用的序列。術語“擴增”指使用聚合酶增加核苷酸序列拷貝數的任何體外方法。核酸擴增使核苷酸摻入DNA和/或RNA分子或引物由此形成與模板互補的新分子。形成的核酸分子和其模板可以被用作合成另外的核酸分子的模板。如本文所用，一個擴增反應可以由多輪的復制組成。DNA擴增反應包括，例如聚合酶鏈式反應(PCR)。一個PCR反應可以由變性和DNA分子合成的5到100個“循環”組成。術語“多肽”、“肽”、“寡肽”、“基因產物”、“表達產物”和“蛋白質”指連續氨基酸殘基的多聚體或寡聚體，在本文中可互換使用。本文所用術語“分離的”意指物質被從其原始環境中去除。例如，存在于活動物中的天然產生的多核苷酸或多肽不是分離的，但是從天然系統中的一些或全部共存物質中分離出的同樣的多核苷酸或多肽是分離的。這類多核苷酸可以是載體的部分和/或這類多核苷酸或多肽可以是組合物的部分，且由于這類載體或組合物不是其原始環境的部分因而是分離的。優選地，術語“分離的”當被用于核酸時，如在“分離的核酸序列”中指從至少一種通常在其天然來源中結合的雜質核酸中被鑒定和分離。分離的核酸以與其天然存在的不同形式或者背景存在。相反，非分離的核酸是發現以天然狀態存在的的核酸，如DNA和RNA。例如，特定的DNA序列(如基因)被發現在宿主細胞染色體中接近鄰近基因處；RNA序列，如編碼特定蛋白質的特定mRNA序列被發現在細胞中與編碼多種蛋白質的多種mRNA形成混合物。例如，編碼特定性狀的分離的核酸序列包括(例如)在通常含有所述核酸序列的細胞中的該核酸序列，其中所述核酸序列在染色體上或染色體外的位置與天然細胞中的不同，或是側翼核酸序列不同于天然發現的核酸序列。所述分離的核酸序列可以以單鏈或雙鏈形式存在。當使用分離的核酸序列表達蛋白質時，該核酸序列將最少至少含有正義或編碼鏈部分(即核酸序列可以是單鏈)。備選地，其可以同時含有正義和反義鏈(即核酸序列可以是雙鏈)。如本文所用，術語“純化的”指從天然環境中移出的分離的核酸或氨基酸序列分子。因此“分離的核酸序列”是純化的核酸序列。“基本純化的”分子至少60％沒有，優選至少75％沒有，和更優選至少90％沒有其天然結合的其它組分。如本文所用，術語“互補的”或“互補”指根據堿基配對原則相關的核苷酸序列。例如，序列5’-AGT-3’互補于序列5’-ACT-3’。互補可以是“部分的”或“全部的”。“部分的”互補是其中一個或更多的核酸堿基根據堿基配對原則不匹配。核酸之間“全部的”或“完全的”互補是每個且所有的核酸堿基在堿基配對原則下與另一堿基匹配。核酸鏈之間的互補程度對于核酸鏈之間雜交的效率和強度有顯著影響。如本文所用，核酸序列的“互補序列”指其核酸完全互補于所述核酸序列的核酸的核苷酸序列。術語“野生型”、“天然的”或“天然起源的”意指關于生物、多肽或核酸序列，所述生物是天然產生的或由至少一種沒有被人類改造、突變或其它人為操作的天然產生的生物提供的。術語“轉基因的”或“重組的”在用于細胞時指含有轉基因或通過導入轉基因而改變其基因組的細胞。術語“轉基因的”在用于組織或植物時分別指包含一個或更多的含有轉基因的細胞或通過導入轉基因改變其基因組的細胞的組織或植物。可以通過多種方法產生轉基因細胞、組織和植物，其包括通過人工干預的方法(如使用本文所述方法)將含有核酸(通常是DNA)的“轉基因”導入靶細胞或將其整合入靶細胞的染色體。本文所用術語“轉基因”指經由實驗操作導入細胞基因組的任何核酸序列。轉基因可以是“內源DNA序列”或“異源DNA序列”(即“外源DNA”)。術語“內源DNA序列”指在被導入的細胞中天然發現的核苷酸序列，只要該核苷酸序列相對于天然產生序列不包含修飾(如點突變、存在選擇標記基因等)。術語“異源DNA序列”指核苷酸序列，其連接于或被操作而連接于在天然狀態下不連接或在天然狀態下連接在不同位置的核酸序列。異源DNA對被導入的細胞不是內源的，但是已經從另一細胞獲得。異源DNA還包括含有一些修飾的內源DNA序列。通常，盡管并非必須，異源DNA編碼其被導入而表達的細胞通常不產生的RNA和蛋白質。異源DNA的實例包括報告基因、轉錄和翻譯調節序列、選擇標記蛋白質(如賦予藥物抗性的蛋白質)等。優選地，關于調節序列(如本發明的啟動子)，術語“轉基因的”或“重組的”意指所述調節序列共價連接于和相鄰于在其天然環境中不相鄰的核酸。術語“外源基因”指通過實驗操作導入細胞基因組的任何核酸(如基因序列)并且可以包括在該細胞中發現的基因序列，只要導入的基因相對于天然產生的基因含有一定的修飾(如點突變、存在選擇標記基因等等)。“重組多肽”或“重組蛋白質”指由重組DNA技術產生的，即由編碼想要的多肽或蛋白質的外源重組DNA構建體所轉化的細胞產生的多肽或蛋白質。重組核酸和多肽還可以包括非天然存在的但是是經過修飾、改變、突變或其它人工操作的分子。術語“異源核酸序列”或“異源DNA”可交換的用于指代連接于核酸序列的核苷酸序列，該連接在天然狀態下不存在或在天然中連接在不同的位置。異源DNA對被導入的細胞是非內源的，但是可以從另外的細胞獲得。一般而言，盡管并非必須，這些異源DNA在其表達的細胞中編碼該細胞一般不產生的RNA和蛋白質。術語“生物”、“宿主”、“靶生物”或“宿主生物”指任何原核或真核生物，其可以是重組克隆多表達構建體的受體。如本文所用術語“宿主”包括被基因改造的原核或真核生物。這些宿主的實例見ManiatisT、FritschEF和SambrookJ(1989)MolecularCloningALaboratoryManual，2ndEd.，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor(NY))。包括完整的生物以及源自其的器官、部分、細胞、培養物、可繁殖的材料。優選微生物、非人動物和植物生物。優選的微生物是細菌、酵母、藻類或真菌。優選的細菌是下列屬的細菌埃希氏菌屬(Escherichia)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、歐文氏菌屬(Erwinia)、農桿菌屬(Agrobacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、產堿桿菌屬(Alcaligenes)、梭菌屬(Clostridium)、Proionibacterium、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、真桿菌屬(Eubacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、褐指藻(Phaeodactylum)、豆形蟲屬(Colpidium)、被孢霉(Mortierella)、蟲霉(Entomophthora)、毛霉(Mucor)、隱甲藻(Crypthecodinium)或藍細菌屬(cyanobacteria)，例如Synechocystis。特別優選的是能夠感染植物并由此傳遞本發明構建體的微生物。優選的微生物來自農桿菌屬，具體地根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)種。優選的酵母是假絲酵母屬(Candida)、酵母屬(Saccharomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)或畢赤酵母屬(Pichia)。優選的真菌是曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、阿舒囊霉屬(Ashbya)、脈孢菌屬(Neurospora)、鐮孢霉屬(Fusarium)、白僵菌屬(Beauveria)或其它真菌。根據本發明的目的，植物生物還是那些能夠進行光合作用的另外的生物，例如藻類或藍細菌，和蘚類。優選的藻類是綠藻如，紅球藻屬(haematococcus)、Phaedactylumtricornatum、團藻屬(Volvox)或杜氏藻屬(Dunaliella)的藻類。優選的真核細胞和生物包括植物細胞和生物、動物細胞，和非人的動物生物，包括真核微生物如酵母、藻類或真菌。“非人的動物生物”包括但不限于非人的脊椎動物和無脊椎動物。優選魚類；非人哺乳動物，如奶牛、馬、綿羊、山羊、小鼠、大鼠或豬；鳥類，如雞或鵝。優選的動物細胞包括例如CHO、COS、HEK293細胞。無脊椎生物包括例如線蟲和昆蟲。昆蟲細胞包括例如果蠅S2細胞和夜蛾Sf9或Sf21細胞。優選能夠入侵植物、動物或人的線蟲。優選的線蟲包括，例如鉤蟲屬(Ancylostoma)、禽蛔蟲屬(Ascaridia)、蛔蟲屬(Ascaris)、仰口屬(Bunostomum)、隱桿線蟲屬(Caenorhabditis)、毛細線蟲屬(Capillaria)、夏氏線蟲屬(Chabertia)、古柏線蟲屬(Cooperia)、網尾線蟲屬(Dictyocaulus)、血矛線蟲屬(Haemonchus)、異刺線蟲屬(Heterakis)、細頸線蟲屬(Nematodirus)、結節線蟲屬(Oesophagostomum)、胃線蟲屬(Ostertagia)、尖尾線蟲屬(Oxyuris)、副蛔蟲屬(Parascaris)、圓線蟲屬(Strongylus)、弓蛔線蟲屬(Toxascaris)、鞭蟲屬(Trichuris)、毛圓線蟲屬(Trichostrongylus)、Tfhchonema、弓蛔蟲屬(Toxocara)或鉤蟲屬(Uncinaria)的線蟲。特別優選的是植物寄生的線蟲，如傘滑刃線蟲屬(Bursaphalenchus)、小環線蟲屬(Criconemella)、Diiylenchus、莖線蟲屬(Ditylenchus)、黃金線蟲(Globodera)、螺旋屬(Helicotylenchus)、異皮線蟲屬(Heterodera)、長針屬(Longidorus)、Melodoigyne、珍珠線蟲屬(Nacobbus)、針線蟲屬(Paratylenchus)、短體線蟲屬(Pratylenchus)、穿孔屬(Radopholus)、Rotelynchus、麥線蟲屬(Tylenchus)或劍線蟲屬(Xiphinema)。優選的昆蟲包括鞘翅目(Coleoptera)、雙翅目(Diptera)、鱗翅目(Lepidoptera)和同翅目(Homoptera)的昆蟲。優選的真菌是曲霉屬、木霉屬(Trichoderma)、阿舒囊霉屬(Ashbya)、脈孢菌屬(Neurospora)、鐮孢霉屬(Fusarium)、白僵菌屬(Beauveria)或其它真菌，如在IndianChemEngr.SectionB.Vol37，No1，2(1995)，15頁表6所述。特別優選絲狀半子囊菌Ashbyagossypii。優選的酵母是假絲酵母屬、酵母屬、漢遜酵母屬或畢赤酵母屬(Pichia)，特別優選釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)(ATCC檢索號201178)。本文所用術語“植物”或“植物生物”指眾多的植物細胞，其很大程度上分化成存在于植物發育的任何階段的結構。這樣的結構包括一個或更多的植物器官，其包括但是不限于果實、芽、莖、葉、花瓣等。優選作為轉基因生物的宿主或靶生物尤其是植物。在本發明范圍內包括植物界的高級或低級植物的所有屬和種。還包括成熟植物、種子、芽和幼苗和部分、繁殖材料和從中衍生的培養物，例如細胞培養物。術語“成熟植物”被理解為意指在幼苗階段之上的任何發育階段的植物。術語“幼苗”被理解為意指在早期發育階段的年輕的未成熟的植物。一年生植物、兩年生植物、單子葉和雙子葉植物是用于產生轉基因植物的優選宿主生物。在全部觀賞植物、有用的或觀賞的樹、花、切花、灌木或草坪中的基因表達是更為有益的。可以以實例方式提及但不作為限制的植物是被子植物、苔蘚植物如，例如苔類(Hepaticae)和蘚類Musc；蕨類植物(Pteridophytes)如羊齒植物、馬尾和石松；裸子植物如松、蘇鐵、銀杏和Gnetatae；藻類如綠藻綱(Chlorophyceae)、褐藻綱(Phaeophpyceae)、紅藻綱(Rhodophyceae)、Myxophyceae、黃藻綱(Xanthophyceae)、硅藻屬(Bacillariophyceae)和裸藻綱(Euglenophyceae)。優選用于食品或飼料目的的植物，如豆科(Leguminosae)如豌豆、苜蓿和黃豆；禾本科(Gramineae)如稻、玉米、小麥、大麥、高梁、粟、黑麥、黑小麥或燕麥；傘形科(Umbelliferae)，特別是胡蘿卜屬(Daucus)，非常特別是胡蘿卜種(carota)(胡蘿卜)和芹菜屬(Apium)，非常特別是芹菜(Graveolensdulce)和其它；茄科(Solanaceae)，特別是番茄屬(Lycopersicon)，非常特別番茄種(esculentum)(番茄)和茄屬(Solanum)，非常特別的是馬鈴薯種(tuberosum)(土豆)和茄子(melongena)(茄子)和其它(如煙草)；和辣椒屬(Capsicum)辣椒種(annuum)(辣椒)和其它；豆科(Leguminosae)，特別是大豆屬(Glycine)大豆種(max)(大豆)、苜蓿、豌豆、紫花苜蓿、豆或花生和其它；和十字花科(Brassicacae)，特別是蕓苔屬(Brassica)歐洲油菜種(napus)(油菜)、蕓苔種(campestris)(甜菜)、oleraceacvTastie(卷心菜)、oleraceacvSnowballY(花椰菜)和oleraceacvEmperor(花椰菜)；和擬南芥屬(Arabidopsis)擬南芥種(thaliana)和其它；菊科，特別是萵苣屬(Lactuca)萵苣種(sativa)(萵苣)和其它；紫菀科(Asteraceae)，如向日葵、萬壽菊、萵苣或金盞花和其它；葫蘆科(Cucurbitaceae)，如瓜、南瓜或西葫蘆(zucchini)和亞麻子。更優選棉花、甘蔗、大麻、亞麻、辣椒和多種樹、堅果和winespecies。尤其優選的是擬南芥(Arabidopsisthaliana)、煙草(Nicotianatabacum)、萬壽菊(Tageteserecta)、金盞花(Calendulaofficinalis)、大豆(Glycinemax)、玉蜀黍(Zeamays)、稻(Oryzasativa)、普通小麥(Triticumaestivum)、豌豆(Pisumsativum)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、大麥(Hordiumvulgare)、歐洲油菜(Brassicanapus)。術語“細胞”指單個細胞。術語“細胞”還指細胞群。所述群可以是包括一種細胞類型的純細胞群。同樣地，所述群可以包括多于一種細胞類型。在本發明，細胞群可以包括的細胞類型數沒有限制。所述細胞可以是同步化的或非同步化的，優選所述細胞是同步化的。關于植物的術語“器官”(或“植物器官”)意指植物的部分并且可以包括(但不應限于)例如根、果實、枝條、莖、葉、花藥、萼片、花瓣、花粉、種子等。關于植物的術語“組織”(或“植物組織”)意指包括分化的和未分化的植物組織的多個植物細胞的排列。植物組織可以構成植物器官的部分(如植物葉的表皮)但也可以構成瘤組織和多種類型的培養細胞(如單個細胞、原生質體、胚、胝、類原基體等)。植物組織可以在植物中(inplanta)、器官培養中、組織培養中或細胞培養中。術語“染色體DNA”或“染色體DNA序列”被理解為獨立于細胞周期狀態的細胞核的基因組DNA。因此染色體DNA可以被組織在染色體或染色單體中。它們可以被凝聚或解螺旋。可以通過本
技術領域：
的多種已知方法，如聚合酶鏈式反應(PCR)分析、DNA印跡分析、原位熒光雜交(FISH)和原位PCR證明和分析染色體DNA中的插入。本文所用術語“結構基因”意指轉錄成為mRNA的DNA序列，該mRNA隨后被翻譯成為特異性多肽特征性的氨基酸序列。術語“目的核苷酸序列”指任何核苷酸序列，可以由本領域普通技術人員出于任何原因(如賦予提高的品質)對該序列進行想要的操作。這些核苷酸序列包括，但不限于結構基因的編碼序列(如報告基因、選擇標記基因、癌基因、藥物抗性基因、生長因子等)和不編碼mRNA或蛋白質產物的非編碼調節序列(如啟動子序列、多腺苷化作用序列、終止序列、增強子序列等)。術語“表達”指基因產物的生物合成。例如，以結構基因為例，表達涉及結構基因轉錄成為mRNA以及任選地隨后翻譯mRNA成為一種或多種多肽。如本文所用的術語“表達盒”或“表達構建體”意指待表達的任意核酸序列可操作地連接啟動子序列和任選地另外的利于所述核酸序列表達的元件(如終止子和/或多腺苷化作用序列)的組合。如本文所用的術語“啟動子”、“啟動子元件”或“啟動子序列”指當連接于目的核苷酸序列時能夠控制目的核苷酸序列轉錄成mRNA的DNA序列。啟動子通常是，盡管并非必須，位于受其控制轉錄成為mRNA的目的核苷酸序列的5’(即上游)(如鄰近結構基因的轉錄起始位點)，并為RNA聚合酶和其它用于起始轉錄的轉錄因子提供特異性結合位點。阻抑型啟動子的轉錄速率響應抑制劑而下降。誘導型啟動子的轉錄速率響應誘導劑而上升。組成型啟動子的轉錄速率不被特異性調節，但是可以在普通的代謝條件影響下改變。啟動子可以是組織特異性或細胞特異性的。術語“組織特異性”在用于啟動子時指該啟動子能夠指導目的核苷酸序列在特定類型組織中(如花瓣)選擇性表達，而同樣的目的核苷酸序列在不同類型組織(如根)中的表達相對缺乏。啟動子的組織特異性可以被評估，通過，例如將報告基因可操作地連接于啟動子序列產生啟動子構建體，將該啟動子構建體導入植物基因組使報告基因構建體整合入產生的轉基因植物的所有組織，并在轉基因植物的不同組織中檢測報告基因的表達(如檢測由報告基因編碼的mRNA、蛋白質或蛋白質活性)。在一種或多種組織中檢測到報告基因的表達相對其它組織中更高表達水平表明該啟動子具有對檢測出具有更高表達水平的組織的特異性。術語“細胞類型特異性”在用于啟動子時指該啟動子能夠指導目的核苷酸序列在特定類型細胞中選擇性表達，而同樣的目的核苷酸序列在同樣組織的不同類型細胞中表達相對缺乏。術語“細胞類型特異性”當應用于啟動子時還指啟動子能夠促進目的核苷酸序列在單個細胞內的區域中選擇性表達。可以使用本領域熟悉的方法如GUS活性染色或免疫組化染色評價啟動子的細胞類型特異性。簡言之，將組織切片包埋于石蠟中，而后石蠟切片與一級抗體反應，該抗體特異識別由啟動子控制表達的目的核苷酸序列編碼的多肽產物。對一級抗體特異的經標記的(如過氧化物酶綴合的)二級抗體被允許結合于切片的組織并用顯微術檢測特異性結合(如用抗生物素蛋白/生物素)。啟動子可以是組成型的或可調節的。術語“組成型”在用于啟動子時意指啟動子在缺乏刺激(如熱激、化學品、光照等)下能夠指導可操作地連接的核酸序列轉錄。通常，組成型啟動子能夠在基本任何細胞和任何組織中指導轉基因的表達。相反，“可調節的”啟動子是在刺激(如熱激、化學品、光照等)存在下能夠指導可操作地連接的核酸序列轉錄水平的啟動子，該轉錄水平不同于缺乏這些刺激時可操作地連接的核酸序列的轉錄水平。術語“可操作的連接”或“操作地連接”被理解為意指，例如調節元件(如啟動子)與待表達的核酸序列和(如果適當)其他調節元件(如終止子)的順序排列，該排列方式使每一調節元件可以完成其預期功能以允許、修飾、促進或影響所述核酸序列的表達。所述表達可以由核酸序列與正義或反義RNA相關的排列決定。因此，化學含義上的直接連接并非必需的。遺傳控制序列，例如增強子序列，還可以對更遠處的靶序列或甚至對其它DNA分子發揮功能。優選的排列是其中被重組表達的核酸序列位于作為啟動子的序列之后，使兩個序列彼此共價連接的排列。在啟動子序列和被重組表達的核酸序列之間的距離優選少于200個堿基對，特別優選少于100個堿基對，更優選少于50個堿基對。可以通過如所述的常規的重組和克隆技術產生可操作地連接和表達構建體(如在ManiatisT、FritschEF和SambrookJ(1989)MolecularCloningALaboratoryManual，2nd版，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor(NY)；SilhavyTJ、BermanML和EnquistLW(1984)ExperimentswithGeneFusions，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor(NY)；AusubelFM等人(1987)CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssoc.andWileyInterscience；Gelvin等人(編輯)(1990)PlantMolecularBiologyManual；KluwerAcademicPublisher，Dordrecht，TheNetherlands)。然而，可能還有更多的序列位于這兩個序列之間，例如作為限制酶特異性切割位點的接頭或作為信號肽的序列。序列的插入還可以導致融合蛋白的表達。優選地，由啟動子和待表達的核酸序列的連接組成的表達構建體能夠以載體整合的形式存在并例如通過轉化插入植物基因組。本文所用術語“轉化”指將遺傳物質(如轉基因)導入細胞。細胞的轉化可以是穩定的或瞬時的。術語“瞬時轉化”或“瞬時轉化的”指將一個或更多的轉基因導入細胞，而轉基因不整合到宿主細胞的基因組。瞬時轉化可以通過，例如酶聯免疫吸附測定法(ELISA)檢測，其檢測由一個或更多的轉基因編碼的多肽的存在。備選地，可以如本文所證明的通過檢測由轉基因(如uidA基因)編碼的蛋白質活性(β-葡糖醛酸糖苷酶)來檢測瞬時轉化[如用X-gluc染色的GUS酶活性的組織化學測定法，在GUS酶存在下得到藍色沉淀；和使用GUS-Light試劑盒(Tropix)進行GUS酶活性的化學發光測定法]。術語“瞬時轉化體”指瞬時摻入一個或更多轉基因的細胞。相比，術語“穩定轉化”或“穩定轉化的”指向細胞基因組導入和整合一個或更多的轉基因，優選產生染色體的整合并通過減數分裂穩定遺傳。細胞的穩定轉化可以通過細胞基因組DNA與能夠結合一個或更多的轉基因的核酸序列的DNA印跡雜交檢測。備選地，還可以通過細胞基因組DNA的聚合酶鏈式反應擴增轉基因序列來檢測細胞的穩定轉化。術語“穩定轉化體”指基因組DNA中穩定的整合了一個或更多轉基因的細胞。因此，穩定轉化體與瞬時轉化體的區別在于穩定轉化體的基因組DNA含有一個或更多的轉基因，瞬時轉化體的基因組DNA不合轉基因。轉化還包括將遺傳物質以植物病毒載體的形式導入植物細胞，該病毒載體涉及表染色體(epichromosomal)的復制和基因表達，其可以在關于減數分裂穩定性方面顯示出可變特性。穩定轉化也包括以病毒載體的形式將遺傳物質導入細胞，該載體涉及表染色體復制和基因表達，其可以在關于減數分裂穩定性方面顯示出可變特性。對纖毛蟲和藻類的克隆和轉化技術操作在本領域是眾所周知的。WO98/01572；Falciatore等人(1999)MarineBiotechnology1(3)239-251；Dunahay等人(1995)JPhycol3110004-1012)。主要提到的適于植物細胞或生物(如下所述)的轉化技術還可以用于動物或酵母生物和細胞。優選直接轉化技術，如磷酸鈣或脂質體介導的轉化或電穿孔。涉及細菌的術語“感染的”和“感染”指靶生物樣品(如細胞、組織等)與細菌在一定條件下的共溫育，從而使細菌內含有的核酸序列導入靶生物樣品的一個或更多的細胞中。術語“農桿菌”指土傳、革蘭氏陰性、桿狀的產生冠癭的致植物病的細菌。術語“農桿菌”包括(但不限于)根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)(其通常在感染的植物產生冠癭)和發根土壤桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)(其通常在感染的植物產生發根病)菌株。用農桿菌感染植物細胞通常在被感染細胞產生冠癭堿(如胭脂堿、農桿堿、章魚堿等)。因此，產生胭脂堿的農桿菌菌株(如菌株LBA4301、C58、A208)被稱為“胭脂堿型”農桿菌；產生章魚堿的農桿菌菌株(如菌株LBA4404、Ach5、B6)被稱為“章魚堿型”農桿菌；和產生農桿堿的農桿菌菌株(如菌株EHA105、EHA101、A218)被稱為“農桿堿型”農桿菌。術語“轟擊的”、“轟擊”和“生物射彈轟擊”指使粒子向靶生物樣品(如細胞、組織等)加速以實現在靶生物樣品的細胞膜上產生傷口和/或使粒子進入靶生物樣品的方法。生物射彈轟擊的方法是本領域公知的(如US5584807，其內容此處被引入作為參考)，并且是通過商業途徑可獲得的(如氦氣驅動的微粒加速器(PDS-1000/He)(BioRad)。術語“同源性”或“同一性”當涉及核酸時指互補性的程度。兩個核酸之間的同源性或同一性被理解為意指貫穿每一序列全長的核酸序列的同一性，該同一性在GAP算法程序輔助下(WisconsinPackage版本10.0，成斯康星大學(UniversityofWisconsin)，遺傳計算組(GeneticsComputerGroup，GCG)，Madison，USA)經比較計算得出，所用參數設定如下間隔權重12長度權重4平均匹配2912平均錯配-2003備選地，部分互補序列被理解為至少部分地抑制完全互補序列與其靶核酸雜交的序列并涉及使用功能術語“基本同源的”。可以在低嚴格條件下使用雜交測定法(DNA印跡或RNA印跡、溶液雜交等)檢查對完全互補序列與靶序列雜交的抑制。在低嚴格條件下，基本同源的序列或探針(即能夠與另一目的寡核苷酸雜交的寡核苷酸)將競爭和抑制完全同源序列對靶標的結合(即雜交)。這不是說低嚴格條件是允許非特異結合的條件；低嚴格條件需要兩個序列間的結合是特異性(即選擇性)結合。可以通過使用缺少甚至部分互補度(如少于約30％同一性)的第二靶標證明不存在非特異結合；在不存在非特異性結合時，探針將不與第二非互補靶標雜交。當涉及雙鏈核酸序列如cDNA或基因組克隆時，術語“基本同源的”指在如下文所述低嚴格條件下可以雜交至雙鏈核酸序列的任一或兩條鏈的任何探針。當用于單鏈核酸序列時，術語“基本同源的”指在如下文所述低嚴格條件下可以雜交至單鏈核酸序列的任何探針。如本文所用，術語“雜交”和“雜交的”包括“核酸鏈通過堿基配對與互補鏈結合的任何過程”(Coombs(1994)DictionaryofBiotechnology，StocktonPress，NewYorkN.Y)。雜交和雜交強度(即核酸之間的結合強度)受到下列因素影響，如核酸之間的互補程度、有關條件的嚴格性、形成雜交分子的Tm和核酸中的G∶C比率。如本文所用，術語“Tm”指“熔解溫度”。熔解溫度是雙鏈核酸分子群半數解離成為單鏈的溫度。計算核酸Tm的等式是本領域眾所周知的。如標準參考文獻所示，可以通過等式簡單估計Tm值當核酸在1MNaCl的水溶液時，Tm＝81.5+0.41(％G+C)，[見如Anderson和Young，QuantitativeFilterHybridization，inNucleicAcidHybridization(1985)]。其它參考文獻包括更復雜的計算，其在Tm的計算中考慮結構和序列特征。低嚴格條件在涉及核酸雜交時，其包括的條件等同于當使用長度約100到約1000個核苷酸的DNA探針時，在68℃、由5xSSPE(43.8g/LNaCl、6.9g/LNaH2PO4.H2O和1.85g/LEDTA，用NaOH調節pH至7.4)、1％SDS、5xDenhardt′s試劑[50xDenhardt′s每500mL含有下列物質5g菲克(400型，Pharmacia)、5gBSA(V組分；Sigma)]和100μg/mL變性鮭精DNA組成的溶液中結合或雜交，隨后在室溫下含有0.2xSSPE和0.1％SDS的溶液中漂洗。當涉及核酸雜交時，高嚴格條件所包括的條件等同于當使用長度約100到約1000個核苷酸的DNA探針時，在68℃、由5xSSPE、1％SDS、5xDenhardt′s試劑和100μg/mL變性鮭精DNA組成的溶液中結合或雜交，繼之于68℃在含有0.1xSSPE和0.1％SDS的溶液中漂洗。當涉及目的雜交條件的雜交條件時，術語“等同”意指雜交條件和目的雜交條件導致具有相同范圍的同源性百分比(％)的核酸序列雜交。例如，如果目的雜交條件導致第一核酸序列與具有與第一核酸序列從80％到90％同源性的其它核酸序列的雜交，若另一雜交條件也導致第一核酸序列與具有與第一核酸序列從80％到90％同源性的其它核酸序列的雜交，那么此另一雜交條件被稱為等同于目的雜交條件。當涉及核酸雜交時，本領域所公知的是多種等同條件可以被用于包含低或高嚴格條件；考慮如探針的長度和性質(DNA、RNA、堿基組成)和靶標的性質(DNA、RNA、堿基組成、在溶液中存在或固定化，等等)以及鹽濃度和其它成分(如存在或缺乏甲酰胺、葡聚糖硫酸酯、聚乙二醇)的因素并且可以改變雜交溶液以產生不同于，但等同于以上列舉條件的低或高嚴格的雜交條件。本領域的技術人員知道盡管較高的嚴格性可以減少或排除目的核苷酸序列與其它核酸序列之間的非特異結合，但是較低的嚴格性可以檢測具有與目的核苷酸序列不同的同源性的許多核酸序列。術語“副產物”指缺少一個或更多的或全部想要被亞克隆的表達盒的子代分子。術語“共整合”指本發明的至少一種重組中間態的DNA分子，其同時含有兩個親本(起始的)DNA分子(供體插入片段和受體插入片段)。其通常是環狀的。在一些實施方案中其可以是線性的。術語“插入片段”在本發明的上下文中被用于指側翼為重組位點的核酸序列(優選DNA序列)。該插入片段可以包括一個或更多的表達盒。術語“插入片段供體”指本發明的兩類親本核酸分子(如RNA或DNA)之一，其攜帶插入片段。該插入片段供體分子包括在兩側具有重組位點的插入片段。該插入片段供體可以是線性或環狀的。在本發明的一個實施方案中，插入片段供體是環狀DNA分子并且還包括重組信號外的克隆載體序列。術語“多表達構建體”指在重組克隆過程中的重組事件后產生的包含了插入片段供體分子的插入片段的想要的子代分子(見圖6、7)。術語“識別序列”指蛋白質、化合物、DNA或RNA分子(如限制性內切核酸酶、修飾甲基化酶或重組酶)識別和結合的特定序列。在本發明中，識別序列通常指重組位點。例如，Cre重組酶的識別序列是loxP，其為34堿基對序列，包含在8堿基對核心序列側翼的兩個13堿基對的反向重復(作為重組酶結合位點)(見SauerB(1994)CurrentOpinioninBiotechnology5521-527；圖1)。其它識別序列的實例是由重組酶λ整合酶識別的attB、attP、attL和attR序列。attB是含有兩個9堿基對核心型Int結合位點和一個7堿基對重疊區的約為25堿基對的序列。attP是含有核心型Int結合位點和臂型Int結合位點以及輔助蛋白質整合宿主因子(IHF)、FIS和切除酶(Xis)位點的約為240堿基對的序列(見Landy，CurrentOpinioninBiotechnology3699-707(1993))。根據本發明還可以改造這些位點以提高本發明方法中產物的產量。當這些改造的位點缺少使重組反應不可逆的P1或H1結構域(如attR或attP)時，這些位點可以稱作attR’或attP’以表示這些位點的結構域已被一定程度的修飾。術語“重組酶”指在特定重組位點催化DNA片段交換的酶。術語“重組克隆”指本文所述方法，由此核酸分子的片段或這些分子群在體外或體內通過位點特異性重組酶作用被交換、插入、置換、替代或修飾。術語“重組蛋白質”指涉及一個或更多重組位點重組反應的多肽，其包括切除性或整合性蛋白質、酶、輔因子或相關蛋白質(Landy(1993)CurrentOpinioninBiotechnology3699-707)。抑制盒是在亞克隆載體中存在的含有選擇標記的阻遏物的核酸片段。術語“選擇標記”指使允許通常在特定調節下選擇或排除某一分子或含有該分子的細胞的DNA片段。這些標記可以編碼一種活性，如(但是不限于)RNA、肽或蛋白質的產生或可以提供RNA、肽、蛋白質、無機和有機化合物或組合物等的結合位點。選擇標記的實例包括但不限于(a)其編碼產物在受體細胞或生物中提供針對其它毒性化合物(如抗生素)抗性的DNA片段(“負選擇標記”)。負選擇標記賦予對殺生物劑如代謝抑制劑(如2-脫氧葡萄糖-6-磷酸，WO98/45456)、抗生素(如卡那霉素、G418、博來霉素或潮霉素)或除草劑(如膦絲菌素或草甘膦)的抗性。特別優選的負選擇標記是賦予對除草劑抗性的標記。可以提到的實例是-膦絲菌素乙酰轉移酶(PAT；又名Bialophos；bar；deBlock等人(1987)EMBOJ62513-2518；EP0333033；US4,975,374)-賦予針對Glyphosate(N-(膦酰基甲基)甘氨酸)抗性的5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Shah等人(1986)Science233478)-Glyphosate降解酶(Glyphosate氧化降解酶；gox)，-Dalapon失活性脫鹵素酶(deh)-磺酰脲-失活和咪唑啉酮-失活的乙酰乳酸合酶(例如帶有S4和/或Hra突變的突變的ALS變體)-Bromoxynil降解性腈水解酶(bxn)-卡那霉素抗性基因或G418抗性基因(NPTII；NPTI)，其編碼如新霉素磷酸轉移酶(Fraley等人(1983)ProcNatlAcadSciUSA804803)-賦予針對2-脫氧葡萄糖抗性的2-脫氧葡萄糖-6-磷酸磷酸酶(DOGR1-基因產物；WO98/45456；EP0807836)(Randez-Gil等人(1995)Yeast111233-1240)-介導對潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉移酶(HPT)(VandenElzen等人(1985)PlantMolBiol.5299)-二氫葉酸還原酶(Eichholtz等人(1987)SomaticCellandMolecularGenetics1367-76)另外的賦予對抗生素抗性的細菌來源的負選擇標記基因包括賦予對抗生素壯觀霉素抗性的aadA基因、慶大霉素乙酰轉移酶、鏈霉素磷酸轉移酶(SPT)、氨基糖苷-3-腺苷轉移酶和博來霉素抗性決定子(Hayford等人，PlantPhysiol.861216(1988)；Jones等人(1987)MolGenGenet21086；Svab等人(1990)PlantMol.Biol.14197；Hille等人(1986)PlantMol.Biol.7171)。特別優選賦予針對由D-氨基酸如D-丙氨酸和D-絲氨酸引起的毒性作用的抗性的負選擇標記(WO03/060133)。在本文中特別優選的負選擇標記是來自紅酵母(Rhodotorulagracilis)(圓紅冬孢酵母菌)的daol基因(EC1.4.3.3GenBankAcc.-No.U60066)和大腸桿菌基因dsdA(D-絲氨酸脫水酶)(D-絲氨酸脫氨酶)(EC4.3.1.18；GenBankAcc.-No.J01603)。適合于原核或非植物的真核系統的選擇標記也可以基于植物的上述選擇標記(除了表達盒是基于其它宿主特異性啟動子)。對于哺乳動物細胞，優選針對新霉素(G418)、潮霉素、博來霉素、zeocin(Gatignol等人(1987)Mo).Gen.Genet.207342；Drocourt等人(1990)Nucl.AcidsRes.184009)、嘌呤霉素(見，例如Kaufman(1990)Meth.Enzymol.185487；Kaufman(1990)Meth.Enzymol.l85537)的抗性。對應的選擇標記基因在本領域是公知的(見，例如Srivastava和Schlessinger，Gene10353(1991)；Romanos等人，″ExpressionofClonedGenesinYeast，″inDNACloning2ExpressionSystems，2.sup.nd版，123-167頁(IRLPress1995)；Markie，MethodsMol.Biol.54359(1996)；Pfeifer等人，Gene188183(1997)；Tucker和Burke，Gene19925(1997)；Hashida-Okado等人，FEBSLetters425117(1998))。對于原核生物，優選針對氨芐青霉素、卡那霉素、壯觀霉素或四環素的抗性。可以使用公布的核苷酸序列克隆或合成選擇標記基因，或可以商業獲得標記基因。(b)其編碼產物在受體細胞或生物中有毒性的DNA片段(“反選擇標記”)。反選擇標記特別適于選擇含有所述標記并帶有缺失的序列的生物(KoprekT等人(1999)PlantJ19(6)719-726)。反選擇標記的實例包括胸腺嘧啶核苷激酶(TK)、胞嘧啶脫氨酶(GleaveAP等人(1999)PlantMolBiol.40(2)223-35；PereraRJ等人(1993)PlantMol.Biol23(4)793-799；StougaardJ；(1993)PlantJ3755-761)、細胞色素P450蛋白質(KoprekT等人(1999)PlantJ19(6)719-726)、鹵代烷脫鹵素酶(NaestedH(1999)PlantJ18571-576)、iaaH基因產物(Sundaresan等人(1995)GeneDevelop91797-1810)、胞嘧啶脫氨酶codA(SchlamanHRM和HooykaasPJJ(1997)PlantJ111377-1385)或tms2基因產物(FedoroffNV和SmithDL(1993)PlantJ3273-289)。(c)其編碼產物賦予受體細胞或生物生長或增殖優勢的DNA片段(“正選擇標記”)。基因如來自根癌農桿菌(菌株PO22；GenbankAcc.-No.AB025109)的異戊基轉移酶作為細胞因子生物合成的關鍵酶可以促進轉化植物的再生(如通過無細胞因子的培養基選擇)。相應的選擇方法已有描述(Ebinuma等人(2000)ProcNatlAcadSciUSA942117-2121；Ebinuma等人(2000)SelectionofMarker-freetransgenicplantsusingtheoncogenes(ipt，rolA，B，C)ofAgrobacteriumasselectablemarkers，InMolecularBiologyofWoodyPlants.KluwerAcademicPublishers)。賦予轉化植物相對于未轉化植物生長優勢的另外的正選擇標記如在EP-A0601092中描述。生長刺激選擇標記可以包括(但應不限于)β-葡糖醛酸糖苷酶(與如細胞因子葡糖苷酸組合)、甘露糖-6-磷酸異構酶(與甘露糖組合)、UDP-半乳糖-4-差向異構酶(與如半乳糖組合)，其中與甘露糖組合的甘露糖-6-磷酸異構酶是特別優選的。(d)其編碼產物可以被容易的鑒定的DNA片段(“報告基因或蛋白質”；如表型標記，如β-半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白(GFP)和細胞表面蛋白質)。報告基因編碼容易定量的蛋白質并經由其顏色或酶活性使能夠對轉化效率、表達位點或表達時間進行評估。本文中尤其優選的是編碼報告基因蛋白質的基因(SchenbornE、GroskreutzD.(1999)MolBiotechnol13(1)29-44)如綠色熒光蛋白(GFP)(Sheen等人(1995)PlantJ8(5)777-784；Haseloff等人(1997)ProcNatlAcadSciUSA94(6)2122-2127；Reichel等人(1996)ProcNatlAcadSciUSA93(12)5888-5893；Tian等人(1997)PlantCellRep16267-271；WO97/41228；ChuiWL等人(1996)CurrBiol6325-330；LeffelSM等人(1997)Biotechniques.23(5)912-8)、氯霉素轉移酶、螢光素酶(Ow等人(1986)Science234856-859；Millar等人(1992)PlantMolBiolRep10324-414)、水母發光蛋白基因(Prasher等人(1985)BiochemBiophysResCommun126(3)1259-1268)、β-半乳糖苷酶、R基因座基因(編碼在植物組織中調節產生花青苷色素(紅色)的蛋白質)且因此使能夠直接分析啟動子活性而不需要加入更多的輔助物質或顯色底物(Dellaporta等人(1988)InChromosomeStructureandFunctionImpactofNewConcepts，18thStadlerGeneticsSymposium，11263-282；Ludwig等人(1990)Science247449)，更加優選β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)(Jefferson(1987b)PlantMol.Bio.Rep.，5387-405，Jefferson等人(1987a)EMBOJ.，63901-3907)。通過在組織與5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸溫育中的藍色檢測β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)表達；通過光發射檢測細菌螢光素酶(LUX)表達；在與螢光素溫育后通過光發射檢測螢火蟲螢光素酶(LUC)表達；以及用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷染色組織后通過亮藍色檢測半乳糖苷酶表達。報告基因還可以作為抗生素抗性標記備選的可評價的標記使用。使用這些標記檢測轉移的基因表達的存在或測量其表達水平。僅當細胞修飾效率高時，在植物中使用可評價的標記鑒定或標記基因修飾的細胞效果良好。(e)其編碼產物在受體細胞中抑制細胞功能的DNA片段；(f)抑制以上(a)-(e)的任何DNA片段活性的DNA片段；(g)與修飾底物的產物(如限制性內切核酸酶)結合的DNA片段；(h)編碼可以被蛋白質、RNA、DNA或化學品識別的特定核苷酸識別序列的DNA片段；(i)當缺失或不存在時直接或間接在受體細胞內對特定化合物引起的細胞殺傷賦予抗性或敏感性的DNA片段；(j)其編碼產物在受體細胞中抑制基因產物活性的DNA片段；(k)其編碼產物否則在受體細胞中缺少的DNA片段(如tRNA基因、營養缺陷型標記)，和；(1)可以用于分離或鑒定想要的分子的DNA片段(如特定的蛋白質結合位點)。本文所用術語“位點特異性重組酶”指一種類型的重組酶，其通常具有至少下列四種活性(或其組合)(1)識別一種或兩種特定核酸序列；(2)切割所述一種或兩種序列；(3)涉及鏈交換的拓撲異構酶活性；和(4)重新連接切割的核酸鏈的連接酶活性。見Sauer，B.，CurrentOpinionsinBiotechnology5521-527(1994)。保守的位點特異性重組與同源重組和轉座相的區別在于兩個配偶體的高度特異性。所述鏈交換機制涉及在不存在DNA合成時對特定DNA序列的切割和重新連接(Landy，A.(1989)Ann.Rev.Biochem.58913-949)。術語“亞克隆載體”指包括環狀或線性核酸分子的克隆載體，該核酸分子優選包括合適的復制子。在本發明中，亞克隆載體還可以含有功能元件和/或調節元件，希望所述元件整合入終產物以作用于克隆的DNA插入片段或和克隆的DNA插入片段共同起作用。亞克隆載體還可以含有選擇標記(優選DNA)。術語載體指向插入片段提供有用的生物或生化特性的核酸分子(優選DNA)。實例包括質粒、噬菌體、自主復制序列(ARS)、中心粒和能夠在體外或宿主細胞中復制或被復制，或能夠在宿主細胞中將想要的核酸片段傳遞到想要的位點的其它序列。載體可以具有一個或更多的限制性內切核酸酶識別位點，序列能夠在該位點處以可確定的方式切開而不丟失載體的基本生物功能，并且可以在載體內剪接核酸片段以使其復制和克隆。載體還可以提供引物位點，如用于PCR、轉錄和/或翻譯起始和/或調節位點、重組信號、復制子、選擇標記等。明顯的，插入所希望的核酸片段的方法(該方法不需要使用同源重組、轉座或限制性酶)(如，但不限于，PCR片段的UDG克隆(US5334575此處被完整引入作為參考)、TACloningTM商標的PCR克隆(InvitrogenCorp.，Carlsbad，Calif.)等)也可以用于將片段克隆入根據本發明所用的克隆載體。克隆載體還可以含有適用于鑒定克隆載體所轉化的細胞的一個或更多的選擇標記。術語“插入片段受體”指本發明的兩種親本核酸分子(如RNA或DNA)中的一種，其攜帶DNA骨架(如載體骨架)的DNA片段，該DNA骨架包含將成為所希望的多表達構建體的部分。優選地，插入片段受體是構成載體供體的載體分子。載體供體包含亞克隆載體(如果插入片段供體還不含有克隆載體，其可被稱為克隆載體)和側翼為重組位點的片段(見圖6、7)。側翼有重組位點的片段和在重組位點之外的片段都可以含有如以上選擇方案所述的有助于選擇想要的多表達構建體分子的元件。所述重組信號可以是相同的或不同的，并且可以被相同或不同的重組酶作用。此外，載體供體可以是線性或環狀的。術語“引物”指在核酸分子(如DNA分子)的擴增或聚合反應期間經由核苷酸單體共價鍵延伸的單鏈或雙鏈寡核苷酸。在優選的方面，引物包括一個或更多的重組位點或這些重組位點的一部分。重組位點的一部分包括目的重組位點的至少2個堿基、至少5個堿基、至少10個堿基或至少20個堿基。當使用重組位點的一部分時，重組位點丟失的部分可以由新合成的核酸分子提供。這樣的重組位點可以位于引物的一個或兩個末端內和/或上。優選地，另外的序列被加入鄰近重組位點的引物以在重組過程中增加或促進重組和/或穩定重組位點。這樣的穩定化作用序列可以是任何長度的任何序列(優選G/C豐富的序列)。優選地，這樣的序列大小范圍在從1到約1000個堿基、1到約500個堿基、1到約100個堿基、1到約60個堿基、1到約25個堿基、1到約10個堿基、2到約10個堿基以及優選約4個堿基。優選地，這樣序列長度大于1個堿基且優選長度大于2個堿基的術語“模板”指將被擴增、合成或測序的雙鏈或單鏈核酸分子。在雙鏈分子情況下，優選在這些分子擴增、合成或測序前將其鏈變性以形成第一和第二鏈，或直接用雙鏈分子作為模板。對于單鏈模板，與模板的一部分互補的引物在合適的條件下與模板雜交且一個或更多具有聚合酶活性的多肽(如DNA聚合酶和/或逆轉錄酶)可以隨后合成與所述模板的全部或部分互補的核酸分子。備選地，對于雙鏈模板，一種或多種的啟動子可以與一種或多種的聚合酶組合使用以使核酸分子互補于所述模板的全部或部分。根據本發明的新合成的分子可以與原始模板長度相同或更短。另外，在合成或擴增期間可以使用核酸模板群產生通常代表原始模板群的核酸分子群。術語“銜接子”指寡核苷酸或核酸片段或區段(優選DNA)，其含有一個或更多的重組位點(或這些重組位點的一部分)，所述重組位點根據本發明可以加入環狀或線性插入片段供體分子和其它本文所述其他的核酸分子。當使用重組位點的部分時，可以由插入片段供體分子提供缺失的部分。這樣的銜接子可以被加在環狀或線性分子內的任何位置，然而該銜接子優選被加在或接近線性分子的一個端或兩端。優選地，銜接子被置于特定目的核酸分子的兩側(側翼)。銜接子的合成(如通過寡核苷酸合成、退火操作和/或PCR)是本領域技術人員所熟知的標準技術。根據本發明，可以通過標準重組技術(如限制酶切消化和連接)將銜接子加入目的核酸分子。例如，可以通過先用合適的限制性酶消化分子，在切割位點加入銜接子和重新形成在切割位點含有銜接子的環狀分子將銜接子加入環狀分子中。備選地，銜接子可以被直接連接于線性分子一個或更多的末端且優選兩個末端，從而產生在一個末端或兩端有銜接子的線性分子。本發明一方面可以將銜接子加入線性分子群(如cDNA文庫或已被切割或消化的基因組DNA)以形成在所述分子群的全部或大部分的一端且優選在兩端含有銜接子的線性分子群。在可應用的
技術領域：
的普通技術人員將一般理解本文所用的在重組DNA技術和分子和細胞生物學領域中的其它術語。發明詳述相應地，本發明的第一個實施方案涉及產生包含至少兩個不同表達盒的多表達構建體的方法，所述方法包括在體外或體內組合i)一個或更多的插入片段供體分子，所述插入片段供體分子共含有至少兩個插入片段(n)，每個插入片段含有至少一個表達盒，所述插入片段側翼為兩個不同的重組位點A(2n)和A(2n+1)，其中n是表征每個插入片段的從1到m的整數，且m是不同插入片段的總數，和ii)插入片段受體分子IA含有兩個不同的重組位點A1和A(2m+2)，其中m是步驟i)的不同插入片段的總數其中全部重組位點A(1)到A(2m+2)是不同的，且其中特定i的重組邊A(2i-1)，可以與相同i的重組邊A(2i)重組，但是基本不和另一重組位點重組，所述i是從1到m+1的整數，和iii)至少一種位點特異性重組蛋白質，其能夠將在所述插入片段供體分子和所述插入片段受體分子中的所述重組位點重組，和在足以將全部所述插入片段轉移入所述插入片段受體分子的條件下溫育所述組合，由此產生多表達構建體。通過選擇某些重組位點，其中的每個重組位點僅允許與另一其他重組位點重組，實現了多個表達盒定向組裝成明確的產物(多表達構建體)。本發明提高的特異性、速度和/或產率有利于在一個DNA分子(如一個表達載體)中多個表達盒的成簇。根據本發明所用的插入片段供體分子含有兩個或更多的重組位點，其允許插入片段供體分子的插入片段(包括目的核酸片段的表達盒)被轉移或移動至根據本發明的一個或更多的插入片段受體分子(如載體供體分子)。可以通過用于向目的分子加入兩個或更多的重組位點的任何技術制備本發明的插入片段供體分子。這些用于包括重組位點以制備本發明的插入片段供體分子的手段包括核酸分子的突變(如隨機或位點特異性誘變)、重組技術(如銜接子或含有重組位點的核酸分子連接至線性分子)、擴增(如使用含有重組位點或其部分的引物)、轉座(如使用含有重組位點的轉座子)、重組(如使用含有重組位點的一個或更多的同源序列)、核酸合成(如含有重組位點的分子的化學合成或使用多種聚合酶或逆轉錄酶的酶促合成)等。根據本發明，被加入一個或更多的重組位點的核酸分子可以是來自任何來源的任何核酸分子且可以包括非天然產生的核酸(如RNA’s；見US5539082和5482836)。特別優選的核酸分子是DNA分子(單鏈或雙鏈)。另外，用于產生插入片段供體分子的目的核酸分子可以是線性或環狀并且還可以含有特定的目的序列(如基因)或可以是分子群(如從基因組文庫或cDNA文庫產生的分子)。1.重組蛋白質在本發明中，通過使用重組蛋白質(包括重組酶以及相關的輔因子和蛋白質)實現DNA片段的交換。本領域描述了多種重組蛋白質。這些重組酶的實例包括Cre來自噬菌體P1的蛋白質(Abremski和Hoess，J.Biol.Chem.259(3)1509-1514(1984))催化在被稱為loxP(交換基因座)位點的34bpDNA序列之間的交換(即產生重組)(見Hoess等人，Nucl.AcidsRes.14(5)2287(1986))。Cre是通過商業途徑可獲得的(Novagen，CatalogNo.69247-1)。由Cre介導的重組是自由可逆的。從熱動力學考慮，并不驚奇Cre介導的整合(兩分子間重組以形成一個分子)比Cre介導的切除(在同一分子的兩個loxP位點之間重組以形成兩個子分子)效率低得多。如本領域所熟知的，Cre在含有鎂或亞精胺作為輔因子的簡單緩沖液中起作用。DNA底物可以是線性或超螺旋的。已描述了許多突變的loxP位點(Hoess等人，上述)。其中之一loxP511與另一loxP511位點重組，但不與loxP位點重組。整合酶來自λ噬菌體的蛋白質，其介導λ基因組整合入大腸桿菌染色體。λ噬菌體Int重組蛋白質促進其底物att位點之間的重組作為溶原化狀態形成或誘導的部分。重組反應的可逆性從整合重組和切除重組的兩個獨立的途徑產生。每種途徑使用獨特但是重疊的一組15個蛋白質結合位點，其含有att位點DNA。涉及四種蛋白質(Int、Xis、IHF和FIS)的協同和競爭相互作用決定重組的方向。整合重組涉及Int和IHF蛋白質以及位點attP(240bp)和attB(25bp)。重組形成兩個新位點attL和attR。切除重組需要Int、IHF和Xis以及位點attL和attR以產生attP和attB。在某些條件下，FIS激發切除重組。除了這些常規反應，應理解attP和attB在被置于同一分子時能夠促進切除重組產生兩種切除產物，一種帶有attL，一種帶有attR。同樣地，在Int、IHF和Xis存在下，含有attL和attR的分子的分子間重組可以引起整合重組和產生attP和attB。因此，在適當的重組蛋白質存在下，可以通過使DNA片段側翼帶有工程化的att位點的適當組合，可以指導互為逆反應的切除重組或整合重組。每個att位點含有15bp核心序列；具有功能重要性的單獨序列元件存在于此共同核心的邊界內、外和交界處(Landy，A.，Ann.Rev.Biochem.58913(1989))。在多個att位點之間的有效重組需要在重組配偶體之間存在的核心共同區域相同，然而，現已發現確切的序列是可修飾的。結果，目前發現核心內部具有改變的att位點的衍生物在重組中與原始核心序列一樣低效。整合酶使λ噬菌體的attP位點(約240bp)與大腸桿菌基因組的attB位點(約25bp)重組(Weisberg，R.A.和Landy，A.inLambdaII，211頁(1983)，ColdSpringHarborLaboratory)以產生側翼為attL(約100bp)和attR(約160bp)位點的整合的λ基因組。缺少Xis時(見如下)，該反應基本不可逆。由整合酶和IHF介導的整合反應在體外含有亞精胺的簡單緩沖液中工作。可以如Nash，H.A.，MethodsofEnzymology100210-216(1983)所述獲得整合酶。可以如Filutowicz，M.等人，Gene147149-150(1994)所述獲得IHF。優選的帶有其相應輔因子的λ整合酶的待用混合物可以從InvitrogenInc.(GatewayTMLRClonaseTM加酶)獲得。GatewayTMLRClonaseTMPlus酶混合物含有λ噬菌體重組蛋白質整合酶(Int)和切除酶(Xis)，以及大腸桿菌編碼的蛋白質整合宿主因子(IHF)(Landy，A.(1989)Ann.Rev.Biochem.58，913)。GatewayTMLRClonaseTMPlus酶混合物在進入克隆與目的載體上attL和attR側翼區域之間促進體外重組，產生含有attB的表達克隆。基于本文提供的教導和指導，還可以使用來自不同生物的多種重組系統。見如Hoess等人，NucleicAcidsResearch14(6)2287(1986)；Abremski等人，J.Biol.Chem.261(1)391(1986)；Campbell，J.Bacteriol.174(23)7495(1992)；Qian等人，J.Biol.Chem.267(11)7794(1992)；Araki等人，J.Mol.Biol.225(1)25(1992)。其中很多屬于重組酶的整合酶家族(Argos等人EMBOJ.5433-440(1986))。其中的最佳研究可能是來自λ噬菌體的整合酶/att系統(LandyA(1993)CurrentOpinionsinGeneticsandDevel3699-707)、來自噬菌體P1的Cre/LoxP系統(Hoess和Abremski(1990)InNucleicAcidsandMolecularBiology，vol.4.編輯Eckstein和Lilley，Berlin-HeidelbergSpringer-Verlag；90-109頁)和來自釀酒酵母2μm質粒的FLP/FRT系統(Broach等人(1982)Cell29227-234)。位點特異性重組酶的第二家族成員解離酶家族(如γδ、Tn3解離酶、Hin、Gin和Cin)也已公知。該高度相關的重組酶家族成員通常限于分子內反應(如倒位和切除)且可以需要宿主編碼的因子。已分離出一些對宿主因子的需要(Maeser和Kahnmann(1991)Mol.Gen.Genet.230170-176)和分子內重組的限制減少的突變體。其它與λInt相似的和與P1Cre相似的位點特異性重組酶可以替代Int和Cre。這些重組酶是公知的。在很多情況下這些其它重組酶的純化在本
技術領域：
已有描述。當它們未知時，可以使用細胞提取物或可以使用關于Cre和Int的所述操作將該酶進行部分純化。盡管作為實例對Cre和Int進行了詳述，存在許多相關的重組酶系統并根據本發明還提供了其在所述發明中的應用。可以使用位點特異性重組酶的整合酶家族為本發明提供備選的重組蛋白質和重組位點，如由λ噬菌體phi80、P22、P2、186、P4和P1編碼的位點特異性重組蛋白質。該組蛋白質呈現出意想不到的序列多樣性。盡管存在多樣性，但是所有重組酶可以在其C末端一半比對。鄰近C末端的40個殘基的區域在全部該蛋白質中尤其高度保守且與酵母2μ質粒Flp蛋白質C末端鄰近的區域同源。在該家族中有三個位點完全保守組氨酸、精氨酸和酪氨酸被發現位于高度保守的C末端區域內各自的比對位置396、399和433。這些殘基有利于該重組酶家族的活性位點，并且表明酪氨酸433在鏈切割和再連接中與DNA形成瞬時共價連接。見如Argos，P.等人，EMBOJ.5433-40(1986)。一些轉座子的重組酶，如接合轉座子的重組酶(如Tn916)(Scott和Churchward.1995.AnnRevMicrobiol49367；Taylor和Churchward，1997.JBacteriol1791837)屬于重組酶的整合酶家族且在一些情況下顯示對特定整合位點的強烈偏好(Ike等人1992.JBacteriol1741801；Trieu-Cuot等人，1993.Mol.Microbiol8179)備選地，IS231和其它蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)轉座因子可以被用作重組蛋白質和重組位點。蘇云金芽孢桿菌是昆蟲致病細菌，其毒性是由于存在于孢子囊的對農業病害蟲以及人和動物疾病的載體有活性的δ內毒素晶體。大部分編碼這些毒素蛋白質的基因是質粒攜帶的且通常結構上連接于插入序列(IS231、IS232、IS240、ISBT1和ISBT2)和轉座子(Tn4430和Tn5401)。這些可移動元件中的一些已表明具有活性并參與晶體基因的移動性，因而有助于細菌毒性的變化。對iso-IS231元件的結構分析表明其與來自產氣英膜梭菌(Clostridumperfringens)的IS1151有關且與來自大腸桿菌(Escherichiacoli)的IS4和IS186關系較遠。如同其它的IS4家族成員，它們含有在其它IS家族和逆轉錄病毒中發現的保守的轉座酶-整合酶基序。而且，從大腸桿菌的IS231A收集的功能數據顯示具有特定靶標偏愛性的非復制型轉座。在枯草芽孢桿菌(Bacilliussubtilis)和蘇云金芽孢桿菌也獲得相似的結果。見如Mahillon，J.等人，Genetica9313-26(1994)；Campbell，J.Bacteriol.7495-7499(1992)。不相關家族的重組酶——轉座酶也已被用于在復制子之間轉移遺傳信息。轉座子是結構可變的(簡單或復雜)，但是通常編碼側翼有反向組織的DNA序列的重組酶基因。轉座子的整合可以是隨機或高度特異性的。高度位點特異性的代表如Tn7已被用于DNA片段在復制子之間的有效移動(Lucklow等人1993.J.Virol674566-4579)。一種相關的元件整合子也可易位地促進藥物抗性盒從一個復制子到另一個的移動。通常這些元件是缺陷型轉座子衍生物。轉座子Tn21含有被稱為In2的I類整合子。來自In2的整合酶(Intl1)對于該類的全部整合子是通用的并且介導在兩個59bp元件之間或59bp元件與attI位點之間的重組，其可導致插入到受體整合子。所述整合酶還催化切除重組(Hall，1997.CibaFoundSymp207192；Francia等人，1997.JBacteriol1794419)。組II內含子是編碼催化性RNA和蛋白質的可移動的遺傳元件。所述蛋白質組分具有反轉錄酶、成熟酶和內切核酸酶活性，而所述RNA具有內切核酸酶活性并決定內含子整合進入的靶位點的序列。通過RNA序列部分的修飾，可以限定該元件整合進入的整合位點。外源DNA序列可以被整合在內含子的兩個末端之間，使其可以靶定特定位點。該過程被稱為逆尋靶(retrohoming)，經由DNA:RNA中間體發生，該中間體被拷貝成cDNA并最終進入雙鏈DNA(Matsuura等人，GenesandDev1997；Guo等人，EMBOJ，1997)。已鑒定出多種內含子編碼的尋靶內切核酸酶(Belfort和Roberts，1997.NAR253379)。這類系統可以被容易的采納用于所述亞克隆方法。可以通過使用已知的測定法確定為了驅動重組反應而加入的重組酶的量。具體地，使用滴定測定法確定純化的重組酶的適宜量，或提取物的適宜量。2.1重組位點-概述以上的重組蛋白質和相應的重組位點適用于根據本發明的重組克隆。然而，野生型重組位點可能含有減小重組反應效率或特異性的序列，而反應效率或特異性是用本發明的方法明確組裝多表達構建體分子所需要的。另外，在attB、attR、attP、attL和loxP重組位點中的多個終止密碼子出現在兩條鏈的多個閱讀框中，因而翻譯效率被降低(如在編碼序列必須穿過重組位點的地方)，(在loxP和attB位點的每條鏈上僅一個閱讀框可用)或不能翻譯(在attP、attR或attL)。因此，本發明還提供了改造的重組位點來克服這些問題。例如，att位點可以被改造而具有一個或多個突變以提高重組反應的特異性或效率(如，att1、att2和att3位點)；減少逆反應(如，從attR除去P1和H1)。這些突變體的測試確定哪些突變體提供足夠的重組活性，其適于根據本發明的重組亞克隆。因此可以向重組位點引入增強位點特異性重組的突變。這類突變包括，但不限于由相同蛋白質識別但堿基序列不同的重組位點，從而其在很大程度上或僅與它們的同源的配偶體反應。這類突變的重組位點的平行使用使得可以考慮多個(平行的)反應。可以通過存在于反應混合物中的特定配偶體確定哪些特定反應發生。例如，可以由分別含有重組位點attR1和attR3；attL1和attR2；attL2和attL3的親代DNA構建體實現三聯蛋白質融合。一些將特定突變引入核酸序列的方法是眾所周知的。其中一些描述于AusubelFM等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，WileyInterscience，NewYork(1989-1996)。可以在寡核苷酸中設計突變用于修飾現有的克隆的序列或在擴增反應中設計突變。如果可提供合適的選擇方法分離想要的突變DNA或RNA，還可以使用隨機誘變。可以通過眾所周知的方法通過核酸測序證實所希望的突變的存在。可以使用下列非限制性方法修飾或突變給定重組位點的核心區域以提供可以在本發明中使用的突變位點1.通過位點特異性(如attL和attR以提供attB)或其它(如同源的)的重組機制通過兩條親本DNA序列重組的(其中親本DNA片段含有一個或多個堿基改變)，產生最終突變的核心序列；2.通過直接突變或誘變(位點特異性、PCR、隨機的、自發的等)所希望的核心序列；3.通過誘變(位點特異性、PCR、隨機的、自發的等)親本DNA序列，其重組產生所希望的核心序列；4.通過編碼所希望的核心序列的RNA的反轉錄；和5.通過具有所希望的堿基改變的序列的從頭合成(化學合成)。可以用多種方法證明突變重組位點的功能性，所述方法決定于所希望的具體特征。例如，可以通過表達適當的融合蛋白質證明在重組位點中缺少翻譯終止密碼子。可以通過向體外反應中引入合適的分子和測定如本文描述或本領域已知的重組產物證明同源配偶體之間的重組特異性。在重組位點中其它所希望的突變可以包括存在或缺失限制性位點、翻譯或轉錄起始信號、蛋白質結合位點和核酸堿基序列的其它已知的功能。可以根據已知的方法步驟使用重組位點中特定功能屬性的遺傳選擇方案。例如可以經由位點之間的重組來缺失編碼毒性物質的DNA序列來實現位點修飾以提供不相互作用的配偶體(從一對不相互作用的位點)。類似地，本領域的技術人員可以容易地設計除去翻譯終止序列的位點的選擇，蛋白質結合位點的存在或缺失等。2.2重組位點-組裝多表達構建體的選擇為本發明的方法提供了一個或更多的插入片段供體分子，它們一起包含至少兩個插入片段I(n)。每個插入片段包含至少一個表達盒。每個插入片段側翼為兩個不同的重組位點A(2n)和A(2n+1)，其中n是表征每個插入片段的從1到m的整數，m是不同插入片段的總數。例如插入片段I1側翼為重組位點A2和A3，插入片段12側翼為重組位點A4和A5等等。還提供了至少一個插入片段受體分子IA，其包含兩個不同的重組位點A1和A(2m+2)，其中m是不同插入片段的總數。例如，如果使用兩個不同的插入片段(I1和I2)，插入片段受體包含不同的重組位點A1和A6。現在，全部的重組位點A(1)到A(2m+2)是不同的。對于具體的i，重組位點A(2i-1)可以與相同i的重組邊A(2i)重組，但是基本不和另外的重組位點重組，所述i是從1到m+1的整數。在上述兩個插入片段(I1帶有重組位點A2和A3，且I2帶有重組位點A4和A5)和一個插入片段受體(帶有重組位點A1和A6)的例子中，A1僅可以與A2重組，A3僅可以與A4重組，且A5僅可以與A6重組。重組位點A(2i-1)僅與重組位點A(2i)重組，但基本不和另外的重組位點重組這一意指在A(2i-1)和A(2i)之間的重組頻率或速度比A(2i-1)與A(2i)旁邊的任何其他重組位點或者A(2i)與A(2i-1)旁邊的任何其他重組位點的重組頻率或速度高至少2倍，優選5倍，更優選10倍，最優選100倍。該重組頻率或速度可以，例如，通過重組反應的特異性(即通過未預期的副產物的種類和數目)來評估。通過溫育插入片段供體和插入片段受體與能夠將在所述插入片段供體分子和所述插入片段受體分子中的重組位點重組至少一種位點特異性重組蛋白質的組合，將所有的插入片段轉移進入所述插入片段受體分子，從而產生多表達構建體。僅當全部插入片段被轉移時，可獲得一個環狀、可復制的插入片段受體(如表達載體)且從前在A1和A(2m+2)之間的DNA片段被正確地替換。給出下列實例以有利于對重組位點的選擇和組合以及其彼此之間重組能力的理解。表1一個插入片段受體(載體供體)分子分別和2、3或4個插入片段組合的實例。優選地，每個插入片段被包含在分開的插入片段供體分子中。重組能力表明兩個指定的重組位點(如A1和A2＝A1/A2)可以重組，但是這些位點中沒有一個可以與其它重組位點重組。可以通過如US5888732(在此處完整引入作為參考)所述的方法容易地獲得重組位點A1到A(2m+2)。這類重組位點包含具有至少一個改造的突變的核心區域。除了改變重組特異性，重組位點的突變還可以賦予重組的增強作用，所述增強作用選自基本由下列組成的組(i)有利于整合；(ii)有利于重組；(ii)減少對宿主因子的需要；(iii)增加共整合DNA或多表達構建體DNA形成的效率；和(iv)增加所述共整合DNA或多表達構建體DNA形成的特異性。組成重組位點的核酸分子優選含有至少一個來自attB、attP、attL或attR的重組位點，如attR’或attP’。更優選地，att位點選自如本文所述的att1、att2或att3。在優選的實施方案中，重組位點的核心區域包含選自下列的DNA序列(a)RKYCWGCTTTYKTRTACNAASTSGB(m-att)(SEQIDNO1)；(b)AGCCWGCTTTYKTRTACNAACTSGB(m-attB)(SEQIDNO2)；(c)GTTCAGCTTTCKTRTACNAACTSGB(m-attR)(SEQIDNO3)；(d)AGCCWGCTTTCKTRTACNAAGTSGB(m-attL)(SEQIDNO4)；(e)GTTCAGCTTTYKTRTACNAAGTSGB(m-attP1)(SEQIDNO5)；(f)RBYCWGCTTTYTTRTACWAASTKGD(n-att)(SEQIDNO39)；(g)ASCCWGCTTTYTTRTACWAASTKGW(n-attB)(SEQIDNO40)；(h)ASCCWGCTTTYTTRTACWAAGTTGG(n-attL)(SEQIDNO41)；(i)GTTCAGCTTTYTTRTACWAASTKGW(n-attR)(SEQIDNO42)；(j)GTTCAGCTTTYTTRTACWAAGTTGG(n-attP)(SEQIDNO43)；或對應的或互補的DNA或RNA序列，其中R＝A或G；K＝G或T/U；Y＝C或T/U；W＝A或T/U；N＝A或C或G或T/U；S＝C或G；且B＝C或G或T/U，如在37C.F.R..§1.822(“Symbolsandformattobeusedfornucleotideand/oraminoacidsequencedata”)所給出，此處將其完整引入作為參考，其中所述核心區域不含有在一個或更多閱讀框中的終止密碼子。該核心區域還優選包含選自下列的DNA序列(a)AGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGT(attB1)(SEQIDNO6)；(b)AGCCTGCTTTCTTGTACAAACTTGT(attB2)(SEQIDNO7)；(c)ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGT(attB3)(SEQIDNO8)；(d)GTTCAGCTTTTTTGTACAAACTTGT(attR1)(SEQIDNO9)；(e)GTTCAGCTTTCTTGTACAAACTTGT(attR2)(SEQIDNO10)；(f)GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGT(attR3)(SEQIDNO11)；(g)AGCCTGCTTTTTTGTACAAAGTTGG(attL1)(SEQIDNO12)；(h)AGCCTGCTTTCTTGTACAAAGTTGG(attL2)(SEQIDNO13)；(i)ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG(attL3)(SEQIDNO14)；(j)GTTCAGCTTTTTTGTACAAAGTTGG(attP1)(SEQIDNO15)；(k)GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG(attP2，P3)(SEQIDNO16)；(l)AGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGC(attB1*)(SEQIDNO52)；(m)ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGC(attB2*)(SEQIDNO53)；(N)CAACTTTATTATACATAGTTG(attB3*)(SEQIDNO54)(O)CAACTTTTCTATACAAAGTTG(attB4*)(SEQIDNO55)(p)GTTCAACTTTTTTGTACAAACTTGC(attR1*)(SEQIDNO56)(q)TTCAACTTTCTTGTACAAAGTGGG(attR2*)(SEQIDNO57)(r)GTTCAACTTTATTATACATAGTTGA(attR3*)(SEQIDNO58)(s)GTTCAACTTTTCTATACAAAGTTGA(attR4*)(SEQIDNO59)(t)AGCCTGCTTTTTTGTACAAAGTTGG(attL1*)(SEQIDNO60)(u)ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG(attL2*)(SEQIDNO61)(v)GGCAACTTTATTATACAAAGTTGG(attL3*)(SEQIDNO62)(w)ACCCAACTTTTCTATACAAAGTTGG(attL4*)(SEQIDNO63)(x)GTTCAACTTTTTTGTACAAAGTTGG(attP1*)(SEQIDNO64)(y)GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG(attP2*)(SEQIDNO65)(z)GTTCAACTTTATTATACAAAGTTGG(attP3*)(SEQIDNO66)(aa)GTTCAACTTTTCTATACAAAGTTGG(attP4*)(SEQIDNO67)或對應的或互補的DNA或RNA序列。明顯地，以上特定核心區域的多種類型和排列被認為適于進行本發明的方法且構成本發明的適合的重組位點的序列數幾乎是無限的，為了簡潔而不在本文對每條序列進行描述。然而，這類變化和排列被考慮和認為是本發明的不同的實施方案。優選地，重組位點包含與以上序列的至少一條具有至少80-90％同源性(或其中任何范圍或數值)的至少一條DNA序列，或任何合適的重組位點，或在如在本領域公知的嚴格條件下雜交的序列。3.插入片段供體分子和插入片段所述插入片段供體分子可以包含一個或更多的插入片段。在優選的實施方案中，插入片段供體分子包含一個插入片段。插入片段供體分子可以由線性或環狀DNA分子組成。所述插入片段供體分子可以包含載體(優選環狀質粒載體)或由擴增產生的DNA片段。任何克隆或表達載體可以用作載體。多種實例是本領域公知的并舉例如下(見“載體供體”)。基于克隆載體的插入片段供體分子具有可以以低出錯率進行復制的優勢，避免了未預期的突變。在環狀插入片段供體分子的情況下，所述分子可以是超螺旋的或松弛的，優選超螺旋的。然而，在本發明的另一實施方案中，所述插入片段供體分子可以是線性DNA序列。可以例如通過聚合酶鏈式反應(PCR)介導的擴增方法在表達盒加入包含各自的重組位點的銜接子以獲得這類序列。可以通過使用由重組位點和表征靶表達盒的5’-或3’-末端的序列組成的寡核苷酸引物加入所述銜接子。在本發明優選的實施方案中，插入片段供體DNA分子還可以包含編碼至少一個標記的DNA片段，所述標記選自克隆位點、限制性位點、啟動子、操縱子、復制起點、功能DNA、反義RNA、PCR片段、蛋白質和蛋白質片段。優選地，至少一個標記可以被包括在至少一個插入片段之內。更優選地，所述標記是選擇標記(優選負選擇標記)或報告基因或蛋白質。優選的選擇標記是能夠選擇所產生的多表達構建體的選擇標記(通過摻入含有所述選擇標記的插入片段)。所述選擇標記可以優選包括至少一種標記，其選自抗生素抗性基因、除草劑抗性基因、tRNA基因、營養缺陷型標記、毒性基因、表型標記、反義寡核苷酸、限制性內切核酸酶、限制性內切核酸酶切割位點、酶切割位點、蛋白質結合位點和與PCR引物序列互補的序列。合適的選擇標記可以包含選自由下列組成的組的至少一種DNA片段(a)DNA片段，其編碼在受體細胞或生物中提供針對其它毒素化合物的抗性的產物(“負選擇標記”)；(b)DNA片段，其編碼在受體細胞或生物中有毒性的產物(“反選擇標記”)；(c)DNA片段，其編碼賦予受體細胞或生物生長或增殖優勢的產物；(d)DNA片段，其編碼可以被鑒定的產物；(e)DNA片段，其編碼在受體細胞中抑制細胞功能的產物；(f)DNA片段，其抑制以上(a)-(e)的任一DNA片段的活性；(g)DNA片段，其結合修飾底物的產物；(h)DNA片段，其編碼可以被蛋白質、RNA、DNA或化學品識別的特定核苷酸識別序列；(i)DNA片段，當缺失時，其在受體細胞內直接或間接賦予對特定化合物引起的細胞殺傷的敏感性；(j)DNA片段，其編碼抑制受體細胞內基因產物活性的產物；(k)DNA片段，其編碼在受體細胞中缺少的產物，和(l)DNA片段，其可以用于分離或鑒定所希望的分子。具體的實例在上文給出。本發明的方法還包括如下步驟選擇包含所述插入片段供體分子的所有所述插入片段的多表達構建體。根據本領域公知的技術、下文的附圖和發明描述以及權利要求，本發明其它優選的實施方案對于本領域普通技術人員而言是顯而易見的。4.插入片段受體分子在優選的實施方案中，插入片段受體分子包括側翼為所述兩個不同的重組位點A1和A(2m+2)的DNA片段，所述重組位點將在重組過程中被替代。插入片段受體分子可以由線性或環狀DNA分子組成。插入片段受體分子可以包含載體。在這種情況下，插入片段受體分子成為載體供體分子(優選環狀質粒載體)。任何克隆或表達載體可用作載體。本領域的多個實例是公知的并在下面舉例說明。基于克隆載體的插入片段受體分子具有能夠以低出錯率復制的優勢，避免了未預期的突變。優選的載體供體分子是可以被用于以多表達構建體轉化選擇的靶生物的載體。例如，可以使用農桿菌雙元載體作為轉化植物細胞或生物的載體供體分子的基礎(細節見下文)。在環狀插入片段受體分子(載體供體分子)的情況下，所述分子可以是超螺旋或松弛型的，優選松弛型的。然而在本發明的另一實施方案中，插入片段受體分子可以是線性DNA序列。可以通過例如聚合酶鏈式反應(PCR)介導的擴增方法向表達盒加入包含各自的重組位點的銜接予以獲得這類序列。可以通過使用由重組酶位點和表征靶表達盒的5’-或3’-末端的序列組成的寡核苷酸引物加上該銜接子。在本發明另一優選的實施方案中，插入片段受體分子是基因組DNA分子，例如染色體的或質粒的DNA分子。因此，可以將多表達構建體直接組裝入宿主生物的基因組(如通過插入片段供體分子的共轉化)。可以產生在基因組DNA含有合適的重組位點(由此提供插入片段受體分子)的細胞或生物，例如，在前面的步驟中通過標準轉化技術將含有所述重組位點的DNA構建體插入基因組DNA，由此提供在其中可以組裝多種多表達構建體的主細胞或生物。優選地，插入片段受體或載體供體分子包含至少一個選擇標記。更優選地，該插入片段受體或載體供體分子還包含(a)毒性基因和(b)選擇標記，其中所述毒性基因和所述選擇標記在不同的DNA片段上，所述DNA片段被至少兩個重組位點彼此分開。優選地，在重組方法的結果中從插入片段受體或載體供體分子中缺失毒性基因。所述選擇標記可以優選包括至少一種選自抗生素抗性基因、除草劑抗性基因、tRNA基因、營養缺陷型標記、毒性基因、表型標記、反義寡核苷酸、限制性內切核酸酶、限制性內切酶切割位點、酶切割位點、蛋白質結合位點和與PCR引物序列互補的序列的標記。可以使用載體將根據本發明的多表達構建體有利地引入細胞，優選引入植物細胞。在有利的實施方案中，多表達構建體是載體或包含在載體中或插入載體中，優選選自原核和/或真核的載體。因此，在本發明優選的實施方案中，插入片段受體是載體供體，提供有關的載體序列。在一實施方案中，本發明的方法涉及用含有本發明的多表達構建體的轉基因表達載體轉化生物或細胞(如植物或植物細胞)(如上所述)。如本文所用，術語“載體”和“運載體”可交換地使用，指將DNA片段從一個細胞轉移到另一個細胞的核酸分子。如本文所用術語“表達載體”指含有所希望的編碼序列和在特定宿主生物中表達有效連接的編碼序列所需的合適的核酸序列。本發明的方法不限于本文所公開的表達載體。任何能夠向植物細胞引入目的核酸序列的表達載體預期位于本發明的范圍之內。通常，表達載體包含本發明的轉基因表達盒與允許載體克隆入細菌或噬菌體宿主的元件的組合。載體優選(但是不必須)含有在廣泛原核宿主中有功能的復制起點。通常，但是不必須的，包含選擇標記使可以選擇帶有所希望的載體的細胞。載體的實例可以是質粒、黏粒、噬菌體、病毒或農桿菌。關于各種轉化技術的更具體的實例在下面給出。優選使得可以將表達構建體穩定整合進入宿主基因組的載體。在DNA注射或電穿孔進入細胞(如植物細胞)時，所用質粒無需滿足任何特定需要。可以使用如pUC系列的簡單的質粒。如果從轉化的細胞再生完整的植物，需要質粒中存在另外的選擇標記基因。多種可能的質粒載體可用于向植物引入外源基因，且這些質粒載體通常含有在大腸桿菌中復制的復制起點和用于選擇轉化的細菌的標記基因。實例為pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。根據本發明，載體供體分子可以包含在多種系統或宿主細胞中有功能的載體。優選用于本發明的載體包括原核載體、真核載體或可以在多種原核和/或真核系統之間穿梭的載體(如穿梭載體)。優選的真核載體包括在酵母細胞、植物細胞、魚細胞、真核細胞、哺乳動物細胞或昆蟲細胞中復制的載體。優選的原核載體包括在革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性細菌中復制的載體，更優選在埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、農桿菌屬(Agrobacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)或假單胞菌屬(Pseudemonas)的細菌中復制的載體。最優選的是在大腸桿菌和農桿菌中都能夠復制的載體。用于本發明的真核載體包括在酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞(特別是人細胞)、真菌細胞、昆蟲細胞、魚細胞等細胞中增殖和/或復制的載體。具體的目的載體包括但不限于克隆載體、測序載體、表達載體、融合載體、雙雜交載體、基因治療載體和反向雙雜交載體。取決于由具體的載體，這些載體可以用于原核和/或真核系統。根據本發明，可以使用任何載體構建本發明的載體供體。具體而言，可以根據本發明改造本領域公知的和那些通過商業途徑可獲得的載體(和其變體或衍生物)使其包括一個或更多的重組位點以用于本發明的方法。可以從，例如Invitrogen、VectorLaboratoriesInc.、InVitrogen、Promega、Novagen、NEB、Clontech、BoehringerMannheim、Pharmacia、EpiCenter、OriGenesTechnologiesInc.、Stratagene、PerkinElmer、Pharmingen、LifeTechnologies，Inc.和ResearchGenetics獲得這類載體。該類載體可以隨后例如被用于克隆或亞克隆目的核酸分子。特定目的載體的一般類別包括原核和/或真核克隆載體、表達載體、融合載體、雙雜交或反向雙雜交載體、在不同宿主使用的穿梭載體、誘變載體、轉錄載體、接受大插入片段的載體等。其它的目的載體包括病毒起源的載體(M13載體、細菌λ噬菌體載體、腺病毒載體和逆轉錄病毒載體)，拷貝數高、低和可調節的載體，具有組合用于單個宿主的相容性復制子的載體(pACYC184和pBR322)和真核的游離型復制載體(pCDM8)。特定的目的載體包括原核表達載體如pcDNAII、pSL301、pSE280、pSE380、pSE420、pTrcHisA、B和C、pRSETA、B和C(Invitrogen，Inc.)，pGEMEX-1和pGEMEX-2(Promega，Inc.)、pET載體(Novagen，Inc.)，pTrc99A、pKK223-3、pGEX載體、pEZZ18、pRIT2T和pMC1871(Pharmacia，Inc.)，pKK233-2和pKK388-1(Clontech，Inc.)，和pProEx-HT(LifeTechnologies，Inc.)和其變體和衍生物。載體供體還可以從真核表達載體制備，所述真核表達載體為諸如pFastBac、pFastBacHT、pFastBacDUAL、pSFV和pTet-Splice(LifeTechnologies，Inc)，pEUK-C1、pPUR、pMAM、pMAMneo、pBI101、pBI121、pDR2、pCMVEBNA和pYACneo(Clontech)，pSVK3、pSVL、pMSG、pCH110和pKK232-8(Pharmacia，Inc)，p3′SS、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMC1neo和pOG44(Stratagene，Inc.)和pYES2、pAC360、pBlueBacHisA、B和C，pVL1392、pBsueBacIII、pCDM8、pcDNA1、pZeoSV、pcDNA3、pREP4、pCEP4、和pEBVHis(Invitrogen，Inc.)和其變體或衍生物。其它的特定目的載體包括pUC18、pUC19、pBlueScript、pSPORT、黏粒、噬菌粒、YAC′s(酵母人工染色體)、BAC′s(細菌人工染色體)、P1(大腸桿菌噬菌體)、pQE70、pQE60、pQE9(quagan)、pBS載體、PbageScript載體、BlueScript載體、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、pcDNA3(InVitrogen)、pGEX、pTrsfus、pTrc99A、pET-5、pET-9、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)、pSPORT1、pSPORT2、pCMVSPORT2.0和pSV-SPORT1(LifeTechnologies，Inc.)和其變體或衍生物。另外的目的載體包括來自Invitrogen的pTrxFus、pThioHis、pLEX、pTrcHis、pTrcHis2、pRSET、pBlueBacHis2、pcDNA3.1/His、pcDNA3.1(-)/Myc-His、pSecTag、pEBVHis、pPIC9K、pPIC3.5K、pAO815、pPICZ、pPICZα、pGAPZ、pGAPZα、pBlueBac4.5、pBlueBacHis2、pMelBac、pSinRep5、pSinHis、pIND、pIND(SP1)、pVgRXR、pcDNA2.1.pYES2、pZErO1.1、pZErO-2.1、pCR-Blunt、pSE280、pSE380、pSE420、pVL1392、pVL1393、pCDM8、pcDNA1.1、pcDNA1.1/Amp、pcDNA3.1、pcDNA3.1/Zeo、pSe、SV2、pRc/CMV2、pRc/RSV、pREP4、pREP7、pREP8、pREP9、pREP10、pCEP4、pEBVHis、pCR3.1、pCR2.1、pCR3.1-Uni、和pCRBac；來自Pharmacia的λExCell、λgt11、pTrc99A、pKK223-3、pGEX-1λT、pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-4T-3、pGEX-3X、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2、pGEX-5X-3、pEZZ18、pRIT2T、pMC1871、pSVK3、pSVL、pMSG、pCH110、pKK232-8、pSL1180、pNEO、和pUC4K；來自Novagen的pSCREEN-1b(+)、pT7Blue(R)、pT7Blue-2、pCITE-4abc(+)、pOCUS-2、pTAg、pET-32LIC、pET-30LIC、pBAC-2cpLIC、pBACgus-2cpLIC、pT7Blue-2LIC、pT7Blue-2、λSCREEN-1、λBlueSTAR、pET-3abcd、pET-7abc、pET9abcd、pET11abcd、pET12abc、pET-14b、pET-15b、pET-16b、pET-17b-pET-17xb、pET-19b、pET-20b(+)、pET-21abcd(+)、pET-22b(+)、pET-23abcd(+)、pET-24abcd(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28abc(+)、pET-29abc(+)、pET-30abc(+)、pET-31b(+)、pET-32abc(+)、pET-33b(+)、pBAC-1、pBACgus-1、pBAC4x-1、pBACgus4x-1、pBAC-3cp、pBACgus-2cp、pBACsurf-1、plg、Signalplg、pYX、SelectaVecta-Neo、SelectaVecta-Hyg、和SelectaVecta-Gpt；來自Clontech的pLexA、pB42AD、pGBT9、pAS2-1、pGAD424、pACT2、pGADGL、pGADGH、pGAD10、pGilda、pEZM3、pEGFP、pEGFP-1、pEGFP-N、pEGFP-C、pEBFP、pGFPuv、pGFP、p6xHis-GFP、pSEAP2-Basic、pSEAP2-Control、pSEAP2-Promoter、pSEAP2-Enhancer、pβgal-Basic、pβgal-Control、pβgal-Promoter、pβgal-Enhancer、pCMV、pTet-Off、pTet-On、pTK-Hyg、pRetro-Off、pRetro-On、pIRES1neo、pIRES1hyg、pLXSN、pLNCX、pLAPSN、pMAMneo、pMAMneo-CAT、pMAMneo-LUC、pPUR、pSV2neo、pYEX4T-1/2/3、pYEX-S1、pBacPAK-His、pBacPAK8/9、pAcUW31、BacPAK6、pTripEx、λgt10、λgt11、pWE15、和TripEx；來自Stratagene的λAPII、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescriptIIKS+/-、pBluescriptIISK+/-、pAD-GAL4、pBD-GAL4Cam、pSurfscript、λFIXII、λDASH、λEMBL3、λEMBL4、SuperCos、pCR-ScrigtAmp、pCR-ScriptCam、pCR-ScriptDirect、pBS+/-、pBCKS+/-、pBCSK+/-、Phagescript、pCAL-n-EK、pCAL-n、pCAL-c、pCAL-kc、pET-3abcd、pET-11′abcd、pSPUTK、pESP-1、pCMVLacI、pOPRSVI/MCS、pOPI3CAT，pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMC1neo、pMC1neoPolyA、pOG44、pOG45、pFRTβGAL、pNEOβGAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415、和pRS416。特定目的的雙雜交和反向雙雜交載體包括pPC86、pDBLeu、pDBTrp、pPC97、p2.5、pGAD1-3、pGAD10、pACt、pACT2、pGADGL、pGADGH、pAS2-1、pGAD424、pGBT8、pGBT9、pGAD-GAL4、pLexA、pBD-GAL4、pHISi、pHISi-1、placZi、pB42AD、pDG202、pJK202、pJG4-5、pNLexA、pYESTrp和其變體或衍生物。在大腸桿菌中表達的優選的載體是pQE70、pQE60和pQE-9(QIAGEN，Inc.)；pBluescript載體、phagescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(StratageneCloningSystems，Inc.)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(PharmaciaBiotech，Inc.)。優選的在真核、動物系統表達的載體包括pWLNE0、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG(StratageneInc.)；pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(PharmaciaBiotech，Inc.)。可誘導的載體的實例是pTet-tTak、pTet-Splice、pcDNA4/TO、pcDNA4/TO/LacZ、pcDNA6/TR、pcDNA4/TO/Myc-His/LacZ、pcDNA4/TO/Myc-HisA、pcDNA4/TO/Myc-HisB、pcDNA4/TO/Myc-HisC、pVgRXR(Invitrogen，Inc.)或pMAM-Serie(Clontech，Inc.；GenBank檢索號U02443)。優選的在酵母中表達的載體包括例如pYES2、pYD1、pTEFl/Zeo、pYES2/GS、pPICZ、pGAPZ、pGAPZalph、pPIC9、pPIC3.5、PHIL-D2、PHIL-Sl、pPIC3SK、pPIC9K和PA0815(Invitrogen，Inc.)。優選的用于植物轉化的載體在下文中描述并且優選包括用于農桿菌介導的轉化的載體。根癌農桿菌和發根農桿菌是植物致病的土壤細菌，其遺傳轉化植物細胞。根癌農桿菌和發根農桿菌的Ti和Ri質粒分別帶有負責植物的遺傳轉化的基因(Kado(1991)CritRevPlantSci101)。本發明的載體可以是基于農桿菌Ti或Ri質粒且可以由此利用天然的DNA轉移系統進入植物基因組。作為高度發展的寄生現象的一部分，農桿菌轉移其基因組信息的確定部分(T-DNA；側翼為約25bp重復序列，被命名為左和右邊緣)進入植物細胞的染色體DNA(Kado(1991)CritRevPlantSci101)。通過所稱作的vir基因(原始Ti質粒的部分)的聯合作用介導所述DNA的轉移。為了利用這一天然系統，開發了缺乏最初腫瘤誘導基因的Ti質粒(“卸甲載體”)。在進一步的改進中，通過將T-DNA引入更容易操作的穿梭載體使的T-DNA與Ti質粒的其它功能元件(如vir基因)物理地分離(EP-A120516；US4.940.838)，所述T-DNA被稱為“雙元載體系統”。這些雙元載體包含(除了卸甲T-DNA與其邊緣序列之外)同時用于在農桿菌和大腸桿菌中復制的原核序列。農桿菌介導的轉化的優勢在于通常僅側翼為所述邊緣的DNA被轉移進入基因組且優先僅插入一個拷貝。對農桿菌載體系統和農桿菌介導的基因轉移方法的描述是本領域公知的(Miki等人(1993)″ProceduresforIntroducingForeignDNAintoPlants″inMETHODSINPLANTMOLECULARBIOLOGYANDBIOTECHNOLOGY；67-88頁；Gruber等人(1993)″VectorsforPlantTransformation，″inMETHODSINPLANTMOLECULARBIOLOGYANDBIOTECHNOLOGY；89-119頁；Moloney等人(1989)PlantCellReports8238-242)。T-DNA用于植物細胞轉化的用途已被深入研究和描述(EP120516；Hoekema(1985)InTheBinaryPlantVectorSystem，OffsetdrukkerijKantersB.V.，Alblasserdam，ChapterV；Fraley1985；以及An等人(1985)EMBOJ4277-287)。已知有多種雙元載體，其中的一些是通過商業途徑可獲得的，例如pBIN19(ClontechLaboratories，Inc.U.S.A.)。因此，對于農桿菌介導的轉化，將多表達構建體整合進入特定質粒(進入穿梭或中間載體，或進入雙元載體)。如果使用Ti或Ri質粒進行轉化，那么Ti或Ri質粒T-DNA的至少右邊緣，但多數情況下右和左邊緣以側翼區域的形式連接于將導入的轉基因表達構建體。優選使用雙元載體。雙元載體能夠同時在大腸桿菌和農桿菌中復制。它們可以包括選擇標記基因和側翼為右和左T-DNA邊緣序列的接頭或多位點接頭(用于插入例如要轉移的表達構建體)。它們可以被直接轉移進入農桿菌(Holsters等人(1978)MolGenGenet163181-187)。所述選擇標記基因允許選擇轉化的農桿菌并且是，例如賦予對卡那霉素的抗性的nptII基因。在此情況下作為宿主生物作用的農桿菌應該已經含有帶有vir區域的質粒。后者是T-DNA向植物細胞轉移所需要的。以此方式轉化的農桿菌可以被用于轉化植物細胞。T-DNA用于轉化植物細胞的用途已有深入的研究和描述(EP120516；Hoekema(1985)InTheBinaryPlantVectorSystem，OffsetdrukkerijKantersB.V.，Alblasserdam，ChapterV；An等人(1985)EMBOJ4277-287；也見下文)。普通的雙元載體是基于“寬宿主范圍”的質粒，如源自P型質粒RK2的pRK252(Bevan等人(1984)NuclAcidRes12，8711-8720)或pTJS75(Watson等人(1985)EMBOJ4(2)277-284)。這些載體大多是pBIN19的衍生物(Bevan等人(1984)NuclAcidRes12，8711-8720)。已知多種雙元載體，其中一些是通過商業途徑可獲得的，例如pBI101.2或pBIN19(ClontechLaboratories，Inc.USA)。另外的載體在大小和可操作性方面得到改進(如pPZP；Hajdukiewicz等人(1994)PlantMolBiol25989-994)。改進的載體系統也描述于WO02/00900。在優選的實施方案中，用于本發明的實踐的農桿菌菌株包括章魚堿菌株，如LBA4404或農桿堿菌株，如EHA101或EHA105。適用于DNA轉移的根癌農桿菌菌株是例如EHA101pEHA101(Hood等人(1986)JBacteriol1681291-1301)、EHA105[pEHA105](Li等人(1992)PlantMolBiol201037-1048)、LBA4404[pAL4404](Hoekema等人(1983)Nature303179-181)、C58C1[pMP90](Koncz和Schell(1986)MolGenGenet204383-396)和C58C1[pGV2260](Deblaere等人(1985)NuclAcidsRes134777-4788)。其它適用的菌株是根癌農桿菌C58、胭脂堿菌株。其它適合的菌株是根癌農桿菌C58C1(VanLaerebeke等人(1974)Nature252,169-170)、A136(Watson等人(1975)J.Bacteriol123，255-264)或LBA4011(Klapwijk等人(1980)J.Bacteriol.，141，128-136)。在優選的實施方案中，用于轉化用植物酚類化合物預培養的植物組織的農桿菌菌株含有L，L-succinamopine型Ti質粒，優選卸甲的質粒，如pEHA101。在另一優選的實施方案中，用于轉化用植物酚類化合物預培養的植物組織的農桿菌菌株含有章魚堿型Ti質粒，優選卸甲的，如pAL4404。通常，當使用章魚堿型Ti質粒或輔助質粒時，優選virF基因被缺失或滅活的。在優選的實施方案中，使用農桿菌菌株轉化用植物酚類化合物，如乙酰丁香酮預培養的植物組織。本發明的方法還可以與特定的農桿菌菌株組合使用，以進一步增加轉化效率，如其中由于存在突變或嵌合的virA或virG基因使其中vir基因表達和/或其誘導被改變的農桿菌菌株(如Hansen等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA917603-7607；Chen和Winans(1991)J.Bacteriol.1731139-1144；Scheeren-Groot等人(1994)J.Bacteriol1766418-6426)。雙元載體或任何其它載體可以通過常規的DNA重組技術修飾，在大腸桿菌中增殖并經由如電穿孔或其它轉化技術導入農桿菌(Mozo和Hooykaas，PlantMol.Biol.16(1991)，917-918)。農桿菌的生長和使用如本領域所述。包含農桿菌菌株的載體可以，例如在添加了合適的抗生素(如50mg/L壯觀霉素)的YP培養基(5g/L酵母提取物、10g/L胨、5g/LNail、15g/L瓊脂、pH6.8)生長3天。用環從固體培養基收集細菌并重懸浮。出于本發明的目的，通過例如在實施例中所述的插入位點特異性的重組位點提供農桿菌相容性載體。構建載體(如載體供體分子或插入片段供體分子或多表達構建體組成的載體)之后，可以在宿主細胞中增殖載體以合成產生核酸聚合物的核酸分子。載體，通常指“穿梭載體”，能夠在至少兩種不相關的表達系統中復制。為了有利于此復制，載體應該包括至少兩個復制起點，每個在一種復制系統中有效。通常，穿梭載體能夠在真核系統和原核系統中復制。這使能夠在真核宿主中檢測蛋白質表達、“表達細胞類型”，以及在原核宿主中擴增該質粒、“擴增細胞類型”。作為說明，一個復制起點可以源自SV40，而另一個復制起點可以源自pBR322。本領域技術人員知道多種合適的轉錄起點。構建載體(如載體供體分子或插入片段供體分子或多表達構建體組成的載體)之后，載體通常在宿主細胞中增殖。載體增殖可以方便地在原核宿主細胞，如大腸桿菌或枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilus)中進行。適合的大腸桿菌菌株包括BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、DB2、DB3.1、DH1、DH4I、DH5、DH5I、DH5IF、DH5IMCR、DH10B、DH10B/p3、DH11S、C600、HB101、JM101、JM105、JM109、JM110、K38、RR1、Y1088、Y1089、CSH18、ER1451和ER1647(見，例如Brown(編輯)，MolecularBiologyLabfax(AcademicPress1991))。適合的枯草芽孢桿菌菌株包括BR151、YB886、M1119、M1120和B170(見，例如Hardy，″BacillusCloningMethods，″inDNACloningAPracticalApproach，Glover(編輯)(IRLPress1985))。在原核宿主中增殖載體的標準技術是本領域的技術人員眾所周知的(見，例如Ausubel等人(編輯)，ShortProtocolsinMolecularBiology，3.sup.rd版(JohnWiley和Sons1995)[″Ausubel1995″]；Wu等人，MethodsinGeneBiotechnology(CRCPress，Inc.1997))。5.重組方案-多表達構建體的選擇本發明的體外或體內方法的一個通用方案在圖6和7所示，其中插入片段供體和插入片段受體(如載體供體)可以是環狀或線性DNA，但是對插入片段供體顯示為線性的，對插入片段受體(載體供體)顯示為環狀的。多表達構建體經由本發明的重組克隆操作引入(或組裝進入)插入片段受體或載體供體。產生的多表達構建體分子可以任選地從其它分子如未反應的插入片段受體分子或插入片段供體分子或其它未預期的副產物中選擇或分離。這樣的選擇優選在體內(如在大腸桿菌中)使用包含在插入片段或載體供體中的一個或更多選擇標記實現，所述選擇標記作為重組克隆操作的結果被引入最終的多表達構建體或從其中缺失。在本發明優選的實施方案中，產生的構建體(如質粒)可以首先被導入大腸桿菌進一步選擇和擴增。正確轉化的大腸桿菌得到選擇和生長，且通過技術人員已知的方法獲得重組構建體。可以使用限制性分析和測序驗證克隆步驟。在插入片段受體或載體供體分子(其可以包括阻遏物盒或反選擇標記)中側翼為重組位點的片段與在插入片段供體中的插入片段簇交換。本發明的方法使插入片段能夠被轉移進入任何數量的載體。所述插入片段可以被轉移到特定的載體或可以在一步中被轉移到許多載體。此外，可以將產生的多表達構建體中的插入片段簇從所述產生的多表達構建體順序轉移到任何數量的載體。根據本發明，所希望的是針對其它分子(包括未反應的親本分子、副產物或中間的共整合子)選擇產生的多表達構建體。為此目的，在優選的實施方案中，至少一個插入片段和/或在插入片段受體中側翼為重組位點的區域包含至少一個選擇標記、表達信號、復制起點，或用于檢測、選擇、表達、作圖或測序DNA的特化功能。可以使用本領域已知的多種其它選擇方案來選擇本發明的多表達構建體。取決于個人偏愛和需要(如靶宿主種類)，可以使用許多不同類型的選擇方案。熟練的技術人員可以利用可獲得的多個DNA片段或制備它們的方法以及本領域常規使用的不同選擇方法。這類DNA片段包括但不限于編碼一種活性如，但不限于，產生RNA、肽或蛋白質、或為這些RNA、肽或蛋白質提供結合位點的DNA片段。術語“選擇方案”指使能夠從含有插入片段供體、載體供體、任何中間體(如共整合體)和/或副產物的混合物中選擇、富集或鑒定所希望的一種或多種多表達構建體的任何方法。多種方法是本領域的技術人員公知的且，例如，描述于US5888732。優選的需要是選擇方案導致僅一種或更多的所希望的多表達構建體的選擇或富集。如本文所定義的，選擇DNA分子包括(a)對所希望的DNA分子的存在進行選擇或富集，和(b)針對不希望的DNA分子的存在進行選擇或富集。在一個實施方案中，選擇方案(其可以逆向進行)將采取三種形式之一，其將在圖6和7中討論。此處首先以使用負選擇標記(SN)和反選擇標記(如毒性基因產物；SC)選擇多表達構建體分子進行例證，所述多表達構建體分子含有插入片段并且缺少親本插入片段受體中側翼為重組位點的片段。毒性基因可以是表達為毒性基因產物(毒性蛋白質或RNA)的DNA，或可以是本身有毒性的(在后一情況中，毒性基因被理解為帶有其“可遺傳性狀”的常規定義)。這些毒性基因產物的實例是本領域眾所周知的，且包括，但不限于限制性內切核酸酶(如DpnI)、凋亡相關基因(如ASK1或bcl2/ced-9家族成員)、逆轉錄病毒基因，包括人免疫缺陷病毒(HIV)的逆轉錄病毒基因；防衛素，如NP-1；反向重復或成對的回文DNA序列；如來自X174或噬菌體T4的噬菌體溶菌基因；抗生素敏感基因，如rpsL；抗微生物敏感性基因，如pheS；質粒殺傷基因；產生細菌毒性的基因產物的真核轉錄載體基因，如GATA-1；以及在缺乏抑制功能時殺死宿主的基因，如kicB或ccdB。備選地，毒性基因可以在體外選擇，如限制性位點。在第二種形式中，一個或更多的插入片段含有負選擇標記(如，賦予針對抗生素、除草劑或其它殺生素的抗性)或正選擇標記(賦予生長優勢)的另外的表達盒。另外的實例包括，但不限于(i)產生新的PCR引物位點(如兩個原先未并列的DNA序列的并列)；(ii)由限制性內切核酸酶或其它的DNA修飾酶、化學品、核酶等作用的DNA序列的包括；(iii)由DNA結合蛋白質、RNA、DNA、化學品等識別的DNA序列的包括，如用作從群體中選擇或排除的親和標記(Davis，Nucl.AcidsRes.24702-706(1996)；J.Virol.698027-8034(1995))或用于并列啟動子以用于體外轉錄；(iv)通過使用隨機化的和來自cDNA的RNA文庫為結合EB病毒表達的RNA的核糖體L22蛋白質體外選擇RNA配體；(v)其活性需要特定的取向或并列的功能元件的定位(如(a)重組位點，其在反式是反應很弱，但是當置于順式時，在合適的蛋白質存在下導致重組，破壞某些分子群；(如使能夠體外合成RNA的啟動子序列重建)。該RNA可以直接使用，或可以逆轉錄獲得所希望的DNA構建體；(vi)通過分子的大小(如分級分離)或其它物理特性選擇所希望的產物；和(vii)使其能夠被鑒定的特定修飾(如甲基化)所需要的DNA序列的包括。在用本發明的方法形成多表達構建體和副產物之后，可以由具體的選擇方案決定，在體外或體內進行選擇步驟，所述方案是已在具體的重組克隆操作中任選設計的。例如，可以設計用于插入片段供體和插入片段受體(載體供體)DNA分子的體外選擇方法。這些方案可以包括改造在起始環狀載體中的罕見的限制性位點使在重組事件發生之后所述罕見的切割位點位于副產物中。因此，當在體外向反應混合物中加入在罕見的限制酶位點結合和切割的限制酶時，帶有罕見切割位點的全部DNA分子，即起始DNA分子、共整合子和副產物將被切割并且使其不能在目的宿主細胞中復制。同樣地，當處理線性DNA分子時，可以設計體外選擇方法。與PCR引物序列互補的DNA序列可以被改造，從而通過重組克隆方法將它們僅轉移到多表達構建體中。在反應結束后，將合適的引物加入反應溶液并對樣品進行PCR。所以，全部或部分的多表達構建體分子被擴增。其它體內篩選方案可以在多種宿主細胞，特別是大腸桿菌株系中使用。一種方法是將阻遏物基因置于插入片段受體(載體供體)分子的一段片段中，且該阻遏物控制的藥物標記置于同一質粒的另一片段上。另一方法是將殺傷基因置于插入片段受體分子中的側翼為重組位點的區域(圖6和7)。當然必須一種使這類插入片段受體分子(如質粒載體)生長的方法，即必須存在使殺傷基因不殺傷的環境。已知有許多這樣的基因需要特殊的大腸桿菌菌株。一種方案是使用限制酶DpnI，該酶只有在其識別序列GATC被甲基化時才能切割。許多常用的大腸桿菌菌株甲基化GATC序列，但是有突變體，在其中可以表達克隆的DpnI而不損傷該突變菌株。還可以使用其它限制酶基因作為毒性基因用于選擇。在這樣的情況下，含有編碼對應的甲基化酶的基因的宿主提供了用于本發明的受保護的宿主。同樣地，ccdB蛋白質是DNA旋轉酶的有效毒劑，能夠有效的捕獲可切割的復合體中的旋轉酶分子，產生DNA鏈斷裂和細胞死亡。DNA旋轉酶的gyrA亞單位的突變，特別是gyrA462突變，賦予對ccdB的抗性(Bernard和Couturier，J.Mol.Bio.226(1992)735-745)。已構建的大腸桿菌菌株DB2含有gyrA462突變。含有表達ccdB基因的質粒的DB2細胞不會被ccdB殺死。該菌株可從LifeTechnologies獲得并已于1997年10月14日被保藏于農業研究機構保藏中心(AgriculturalResearchCultureCollection)(NRRL)，1815NorthUniversityStreet，Peoria，Ill.61604USA，其保藏號為NRRLB-21852。當然，可以設計類似的選擇方案用于其它宿主生物。例如，Tn10的tet阻遏物/操縱基因已被用在真核生物中控制基因表達(Gossen，M.和Bujard，H.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA895547-5551(1992))。因此通過本文所例證的由tet阻遏物對藥物抗性的同樣的控制或本文描述的其它選擇方案可以用于在真核細胞中選擇多表達構建體。6.優選的插入片段表達盒優選地，本發明的插入片段包含至少一種表達盒，其使可以表達目的核酸且可以，例如，促進選擇標記基因、性狀基因、反義RNA或雙鏈RNA的表達。優選地，所述表達盒包含在靶宿主細胞或生物(優選植物細胞)中有功能的有效連接核酸序列的啟動子序列，所述核酸序列在表達時賦予這些細胞或生物有利的表型。本領域的技術人員知道多種可適用于本文的序列。對于植物，可以使用序列來，如增加糧食和飼料品質、產生化學品、精細化學品或藥物(如維生素、油、碳水化合物；DunwellJM(2000)JExpBot51SpecNo487-96)，賦予對除草劑的抗性，或引起雄性不育。另外，可以增加生長、產量和針對非生物的和生物的脅迫因子(像，如真菌、病毒或昆蟲)的抗性。可以通過過表達蛋白質或通過降低內源蛋白質表達，如表達相應的反義RNA(Sheehy等人(1988)ProcNatlAcadSciUSA858805-8809；US4,801,340；Mol等人(1990)FEBSLett268(2)427-430)或雙鏈RNA賦予有利的特性(MatzkeMA等人(2000)PlantMolBiol43401-415；FireA.等人(1998)Nature391806-811；Waterhouse等人(1998)ProcNatlAcadSciUSA9513959-64；WO99/32619；WO99/53050；WO00/68374；WO00/44914；WO00/44895；WO00/49035；WO00/63364)。本發明的優勢在于通過重組位點的選擇，不僅產生明確的多表達構建體(包含全部預期的表達盒)，而且在所述多表達構建體中各個表達盒的方向是預先決定的和可以按照需要安排。這有利于避免多表達盒的某些取向中可能發生的非預期的效果(例如基因沉默)。6.1優選的啟動子為了表達基因，待表達的目的核酸分子必須有效連接控制轉錄表達的調節序列，并隨后導入宿主細胞。除了轉錄調節序列，例如啟動子和增強子外，表達載體可以包括可轉錄和翻譯的調節序列(見上文“定義”中的詳細描述)。作為說明，適用于哺乳動物宿主的轉錄和翻譯調節信號可以來自病毒來源，如腺病毒、牛乳頭瘤病毒、猿猴病毒等，其中調節信號與有高表達水平的特定基因連接。合適的轉錄和翻譯調節序列還可以從哺乳動物基因，如肌動蛋白、膠原蛋白、肌球蛋白和金屬硫蛋白基因獲得。合適的轉錄調節序列包括足以指導RNA合成起始的啟動子區域。說明性的真核生物啟動子包括小鼠金屬硫蛋白I基因啟動子(Hamer等人，J.Molec.Appl.Genet.1273(1982))、皰疹病毒的TK啟動子(McKnight，Cell31355(1982))、SV40早期啟動子(Benoist等人，Nature290304(1981))、勞斯肉瘤病毒啟動子(Gorman等人，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA796777(1982))、巨細胞病毒啟動子(Foecking等人，Gene45101(1980))和小鼠乳瘤病毒啟動子(通常見于Etcheverry，″ExpressionofEngineeredProteinsinMammalianCellCulture，″inProteinEngineeringPrinciplesandPractice，Cleland等人(編輯)，163-181頁(JohnWiley和Sons，Inc.1996))。備選地，如果原核啟動子被真核啟動子調節，原核啟動子如噬菌體T3RNA聚合酶啟動子可以用于控制目的基因在哺乳動物細胞中的表達(Zhou等人，Mol.Cell.Biol.104529(1990)，和Kaufman等人，Nucl.AcidsRes.194485(1991))。在植物的表達時，優選植物特異性的啟動子。術語“植物特異性啟動子”被理解為主要意指在植物或植物的部分、植物細胞、植物組織或植物培養物中能夠控制基因表達，特別是外源基因的表達的任何啟動子。在本文中，表達可以是，例如組成型的、可誘導的或依賴發育的。以下是優選的a)組成型啟動子“組成型”啟動子指在植物發育的某一實質階段，優選在植物發育的全部時期在許多，優選在全部的組織中確保表達的啟動子。特別優選使用植物啟動子或源自植物病毒的啟動子。特別優選CaMV(花椰菜花葉病毒)35S轉錄物的啟動子(Franck等人(1980)Cell21285-294；Odell等人(1985)Nature313810-812；Shewmaker等人(1985)Virology140281-288；Gardner等人(1986)PlantMolBiol6221-228)或19SCaMV啟動子(US5,352,605；WO84/02913)。另外合適的組成型啟動子是水稻肌動蛋白啟動予(McElroy等人，PlantCell2163171(1990))、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基(SSU)啟動子(US4,962,028)、豆球蛋白B啟動子(GenBankAcc.No.X03677)、來自農桿菌的胭脂堿合酶的啟動子、TR二元啟動子、來自農桿菌的OCS(章魚堿合酶)啟動子、泛蛋白啟動子(HoltorfS等人(1995)PlantMolBiol29637-649)、泛蛋白1啟動子(Christensen等人(1989)PlantMol.Biol.12619-632，Christensen等人(1992)PlantMolBiol18675-689；Bruce等人(1989)ProcNatlAcadSciUSA869692-9696)、Smas啟動子、肉桂醇脫氫酶啟動子(US5,683,439)、液泡ATP酶亞基啟動子、pEMU啟動子(LastDI等人(1991)Theor.Appl.Genet.81，581-588)、MAS啟動子(VeltenJ等人(1984)EMBOJ.3(12)2723-2730)和玉米H3組蛋白啟動子(Lepetit等人，Mol.Gen.Genet.231276-285(1992)；Atanassova等人(1992)PlantJ2(3)291-300)、擬南芥腈水解酶1基因啟動子(GenBankAcc.No.U38846，核苷酸3862到5325或到5342)、或來自小麥的富脯氨酸蛋白質啟動子(WO91/13991)，以及另外的在植物中組成型表達基因的啟動子。b)組織特異性的或組織優選的啟動子更優選對種子特異的啟動子，例如，菜豆堿啟動子(US5,504,200；Bustos等人(1989)PlantCell1(9)839-53，Murai等人，Science23476-482(1983)；Sengupta-Gopalan等人，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA823320-3324(1985))、2S清蛋白基因啟動子(JoseffsonLG等人(1987)JBiolChem26212196-12201)、豆球蛋白啟動子(ShirsatA等人(1989)MolGenGenet215(2)326-331)、USP(未知種子蛋白質)啟動子(Bumlein等人(1991a)MolGenGenet225(3)459-467)、油菜籽蛋白基因啟動子(US5,608,152；StalbergK等人(1996)Planta199515-519)、蔗糖結合蛋白質啟動子(WO00/26388)或豆球蛋白B4啟動子(LeB4；BumleinH等人(1991b)MolGenGenet225121-128，1992)、擬南芥油質蛋白啟動子(WO98/45461)和蕓苔屬Bce4啟動子(WO91/13980)。更優選的是葉特異性和光誘導的啟動子，例如cab或核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶啟動子(Simpson等人(1985)EMBOJ42723-2729；Timko等人(1985)Nature318579-582)；花藥特異性啟動子，如LAT52的啟動子(Twell等人(1989b)MolGenGenet217240-245)；花粉特異性啟動子，如Zml3的啟動子(Guerrero等人(1993)MolGenGenet224161-168)；和小孢子優選的啟動子，如來自apg的啟動子(Twell等人(1983)Sex.PlantReprod.6217-224)。c)化學可誘導的啟動子表達盒還可以包含化學可誘導的啟動子(綜述文章Gatz等人(1997)AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol4889-108)，通過該啟動子可以控制外源基因在植物中在特定時間點表達。這類啟動子，例如PRP1啟動子(Ward等人1993)、水楊酸可誘導的啟動子(WO95/19443)、苯磺酰胺可誘導的啟動子(EP0388186)、四環素可誘導的啟動子(Gatz等人(1991)MolGenGenetics227229-237；Gatz等人(1992)PlantJ2397-404)、脫落酸可誘導的啟動子(EP0335528)或乙醇-環己酮可誘導的啟動子(WO93/21334)也同樣可以使用。同樣適用的是谷胱甘肽-S轉移酶同工型II基因(GST-II-27)啟動子，其可以被外源提供的安全劑，例如N，N-二烯丙基-2，2-二氯乙酰胺(WO93/01294)激活而且可在單子葉和雙子葉植物的許多組織中可操作。另外可舉例的能夠用于本發明的可誘導的啟動子包括應答銅的來自ACE1系統的啟動子(Mett等人PNAS904567-4571(1993))或來自玉米的應答苯磺酰胺除草劑安全劑的In2啟動子(Hershey等人(1991)MolGenGenetics227229-237；Gatz等人(1994)MolGenGenetics24332-38)。可以使用應答植物通常不響應的誘導劑的啟動子。示例性可誘導的啟動子是來自類固醇激素基因的可誘導的啟動子，其轉錄活性由糖皮質類固醇激素誘導(Schena等人(1991)ProcNat′lAcadSciUSA8810421)。特別優選的是組成型啟動子。另外，其他的啟動子可以有效連接要表達的核酸序列，該啟動子使能夠在其他植物組織或在其它生物，例如大腸桿菌中表達。合適的植物啟動子原則上是所有上述的啟動子。遺傳組分和/或表達盒可以包括除了啟動子之外其他的基因控制序列。術語“基因控制序列”應被以廣義理解并且指對根據本發明的表達盒的具體化或功能有作用的全部序列。例如，基因控制序列修飾在原核或真核生物中的轉錄和翻譯。優選地，根據本發明的表達盒包括在植物中起作用的位于將重組表達的核酸序列的5’-上游的啟動子，和3’-下游作為另外的基因控制序列的終止子序列以及，如果合適，其他常規調節元件，所有這些控制序列都有效連接待重組表達的核酸序列。基因控制序列還包括5’-非翻譯區、內含子或基因的非編碼的3’-區，例如肌動蛋白1內含子或Adh1-S內含子1、2和6(通常參考TheMaizeHandbook，Chapter116，Freeling和Walbot編輯，Springer，NewYork(1994))。已證明它們可以在基因表達的調節中行使重要作用。因此，已證明5’-非翻譯序列可以增強異源基因的瞬時表達。可以提出的翻譯增強子的實例是煙草花葉病毒5’-前導序列(Gallie等人(1987)NuclAcidsRes158693-8711)等。另外，其還可以提高組織特異性(RousterJ等人(1998)PlantJ15435-440)。表達盒可以有利地包括一個或更多的有效連接于啟動子的增強子序列，該增強子序列可以增加核酸序列的重組表達。另外的有利序列，如其他調節元件或終止子，也可以插入將重組表達的核酸序列的3’-末端。表達盒還可以包括轉錄終止序列，和任選地，多腺苷酸化信號序列。適合作為控制序列的多腺苷酸化信號是植物多腺苷酸化信號，優選基本上對應于來自根癌農桿菌的T-DNA多腺苷酸化信號，具體而言OCS(章魚堿合酶)終止子和NOS(胭脂堿合酶)終止子的多腺苷酸化信號。表達載體不需要含有轉錄終止和多腺苷酸化信號序列，因為這些元件可以由克隆的基因或基因片段提供。本發明的遺傳組分和/或表達盒可以包含其他的功能元件。術語功能元件應該被廣義理解且指對于本發明的遺傳組分、表達盒或重組生物的產生、擴增或功能具有影響的全部元件。功能元件可以包括例如(但不應限于)選擇標記基因(包括負、正以及反選擇標記，見以下詳述)、報告基因，和1)復制起點，其確保本發明表達盒或載體在例如，大腸桿菌中的擴增。可以提到的實例是ORI(DNA復制起點)、pBR322復制起點或P15A復制起點(ManiatisT、FritschEF和SambrookJ(1989)MolecularCloningALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor(NY))。在大腸桿菌中有功能的復制系統的另外的實例是ColE1、pSC101、pACYC184等。除了大腸桿菌復制系統或代替大腸桿菌復制系統，可使用寬宿主范圍的復制系統，如P-1不相容質粒的復制系統；如pRK290。這些質粒與有甲或卸甲的Ti質粒一起對于轉移T-DNA到植物種類宿主特別有效。表達載體還可以包含SV40起點。該元件可以被用在表達SV40大T抗原的細胞系中的附加體復制和挽救。2)農桿菌介導的植物轉化所需的元件，例如，T-DNA的右和/或，任選地，左邊緣或vir區域。3)克隆位點克隆位點可以優選是多克隆位點。可以使用任何多克隆位點，并且許多多克隆位點是通過商業途徑可獲得的。4)S/MAR(支架/基質附著區)。基質附著區(MARs)被可操作地定義為在體外特異結合于核基質(核支架蛋白質)的DNA元件并被提出在體內介導染色質與核支架的附著。其還可能在體內介導染色質與核基質的結合并且改變分裂間期核基因組的拓撲結構。當MAR位于轉基因的任一側時，它們的存在通常導致轉基因生物(特別是植物)或細胞系中產生更高和更穩定的表達，這很可能是通過最小化基因沉默來實現的(綜述AllenGC等人(2000)PlantMolBiol43(2-3)361-76)。描述了多種S/MAR序列和其對基因表達的影響(SidorenkoL等人(2003)TransgenicResearch.12(2)137-54；AllenCG等人(1996)PlantCell8(5)，899-913；VillemureJF等人(2001)J.Mol.Biol.312，963-974；Mlynarova，L等人(2002)Genetics160，727-40)。S/MAR元件可以優選用于減少基因沉默，基因沉默可以在多表達構建體中表達盒的某些方向發生(MlynarovaL等人(2003)PlantCell.15(9)2203-17)。S/MAR的實例是雞溶菌酶A元件(Stief等人，1989，Nature341343)。5)進一步修飾所表達的蛋白質的轉錄、翻譯和/或轉運的序列。例如表達的蛋白質可以是含有分泌信號序列的嵌合蛋白質。該分泌信號序列有效連接目的基因，使兩個序列在正確的閱讀框中連接和定位以指導新合成的目的多肽進入宿主細胞的分泌途徑。分泌信號序列通常位于編碼目的氨基酸序列的核苷酸序列的5’，然而某些分泌的信號序列可以位于目的核苷酸序列的其它位置(US5037743、US5143830)。表達載體還可以包含編碼輔助目的多肽純化的肽標記的核苷酸序列。用于分離重組多肽的肽標記包括多聚組氨酸標記(其對鎳螯合樹脂具有親和性)、c-myc標記、鈣調蛋白結合蛋白質(用鈣調蛋白親和層析分離)、物質P、RYIRS標記(其與抗RYIRS抗體結合)、Glu-Glu標記和FLAG標記(其與抗FLAG抗體結合)。見，例如Luo等人，Arch.Biochem.Biophys.329215(1996)，Morganti等人，Biotechnol.Appl.Biochem.2367(1996)，和Zheng等人，Gene18655(1997)。編碼這類肽標記的核酸分子可，例如從Sigma-AldrichCorporation(St.Louis，Mo.)獲得。本文所公開的和要求保護的全部組合物和方法可以在本公開的教導下以制備和執行而不用過度實驗。盡管本發明的組合物和方法已按照優選的實施方案進行了描述，對于本領域技術人員顯而易見的是可以改變本文所述組合物、方法以及方法的步驟或本文所述方法的步驟和步驟的順序而不背離本發明的概念、精神和范圍。更具體的，顯而易見某些化學和生理都相關的物質可以替代本文所述物質而獲得相同或相似的效果。對于本領域技術人員而言顯而易見的所有這類相似的替代和修改被認為是在由所附權利要求定義的本發明的精神、范圍和概念之內。此處引用的全部出版物、專利和專利申請為了所有目的特此引入作為參考。6.2優選的目的核酸如上所指出的，本發明的多表達構建體可以攜帶多種核苷酸序列。本發明的方法可以優選用于獲得具有有價值的性狀的轉基因細胞和生物，其需要表達兩個或更多目的核酸。目的核酸可以，例如，用于抑制內源基因(如通過表達反義或雙鏈RNA)或用于表達或過表達蛋白質。優選地，表達的蛋白質具有工業、治療、診斷或研究價值。說明性的蛋白質包括抗體和抗體片段、受體、免疫調諧劑、激素等。例如，表達盒可以包括編碼藥學活性分子的核酸分子，所述藥學活性分子為例如因子VIIa、前胰島素、胰島素、促卵泡激素、組織型纖溶酶原激活物、腫瘤壞死因子、白介素(如白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20和IL-21)、集落刺激因子(如粒細胞集落刺激因子和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)、干擾素(如干擾素-α、-β、-γ、-ο、-δ、-τ和-ε)、干細胞生長因子、促紅細胞生成素、淋巴因子、毒素(如蓖麻毒蛋白、紅豆堿、假單胞菌外毒素A、單純皰疹病毒胸苷激酶、大腸桿菌鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶、志賀菌毒素、小麥毒蛋白、抗病毒蛋白、商陸、多花白樹毒蛋白、白喉毒素)、前體藥物、前體藥物激活蛋白、刺激免疫應答的抗原、核酶和支持或抑制免疫應答的蛋白質，以及反義序列(或用于“反義應用”的正義序列)以及血小板生成素。另外的目的蛋白質的實例包括抗體、抗體片段、抗獨特型抗體(或其片段)、嵌合抗體、人源化抗體、抗體融合蛋白等。優選地，可以使用本發明的方法表達包含兩個或更多不同亞基的蛋白質。可以使用本發明的多表達構建體將所有亞單位的全部表達盒在一步中同時導入宿主細胞。可以容易地從多種來源獲得編碼上述蛋白質的序列，所述來源包括，例如美國典型培養物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC，Rockville，Md.)，或者商業來源，如BritishBio-TechnologyLimited(Cowley，Oxford，England)。還可以合成編碼上述蛋白質的序列，例如使用AppliedBiosystemsInc.DNA合成儀(如，APBDNA合成儀型號392(FosterCity，Calif.))。優選地，插入靶植物基因組的本發明的轉基因表達構建體包含至少一個表達構建體，其可以，例如，方便選擇標記、性狀基因、反義RNA或雙鏈RNA的表達。優選的所述表達構建體含有在植物細胞有功能的啟動子序列，(或者-且優選-如上所述有效連接核酸序列的本發明的啟動子或另一合適的啟動子，所述核酸序列在表達時賦予轉化的植物有利的表型)。本領域的技術人員熟知可以用于本文的多種序列，這些序列用來，如增加糧食和飼料質量、生產化學品、精細化學品或藥物(如維生素、油、碳水化合物；DunwellJM(2000)JExpBot51SpecNo487-96)，賦予對除草劑的抗性或賦予雄性不育。另外，可以增加生長、產量和針對非生物的和生物的脅迫因子(像例如真菌、病毒線蟲或昆蟲)的抗性。可以通過過表達蛋白質或降低內源蛋白質表達，如通過表達相應的反義RNA(Sheehy等人(1988)ProcNatlAcadSciUSA858805-8809；US4,801,340；Mol等人(1990)FEBSLett268(2)427-430)或雙鏈RNA賦予有利的特性(MatzkeMA等人(2000)PlantMolBiol43401-415；FireA.等人(1998)Nature391806-811；Waterhouse等人(1998)ProcNatlAcadSciUSA9513959-64；WO99/32619；WO99/53050；WO00/68374；WO00/44914；WO00/44895；WO00/49035；WO00/63364)。目的核酸可以編碼如下(但不限于)1.選擇標記和報告基因選擇標記用于選擇和分離成功轉化的或同源重組的細胞。多種負選擇標記(賦予對毒性化合物或殺生物劑化合物的抗性)，正選擇標記(賦予生長或增殖優勢)或反選擇標記(賦予毒性效果，優選與另外的非毒性化合物組合)在本領域是公知的并如上描述(見“定義”)。另外，多種報告基因和蛋白質是公知的并如上描述(見“定義”)，其使能夠容易地鑒定，優選通過目視鑒定轉化的細胞或生物。2.性狀基因技術人員熟悉多種目的核酸(或由其編碼的蛋白質)，所述核酸的轉基因表達有利的。技術人員還熟悉多種基因，通過表達該基因相應的反義或雙鏈RNA抑制或沉默所述基因也可以獲得有利效果。下列作為有利效果的實例而不作為限定提出-獲得對非生物脅迫(高和低的溫度、干燥、增加的濕度、環境毒素、UV輻射)的抗性-獲得對生物脅迫(病原體、病毒、昆蟲和疾病)的抗性-獲得對毒害植物的物質或除草劑的抗性-提高生長速度或產量。下列可用于這些應用的核酸序列或多肽作為實例而不作為限定提出1.提高對植物胚的保護以對抗非生物脅迫如干燥、高或低的溫度，包括例如通過過表達來自Myoxocephalusscorpius(WO00/00512)、Myoxocephalusoctodecemspinosus的抗凍多肽、擬南芥轉錄激活因子CBF1、谷氨酸脫氫酶(WO97/12983、WO98/11240)、例如來自大麥(WO97/13843)的晚期胚發生基因(LEA)、鈣依賴蛋白激酶基因(WO98/26045)、鈣依賴磷酸酶(WO99/05902)、法尼基轉移酶(WO99/06580，Pei1998)、鐵蛋白(Deak1999)、草酸鹽氧化酶(WO99/04013；Dunwell(1998)BiotechnologyandGeneticEngeneeringReviews151-32)、DREB1A因子(脫水應答元件B1A；Kasuga1999)、甘露醇或海藻糖合成基因，如海藻糖-磷酸鹽合酶或海藻糖-磷酸鹽磷酸酶(WO97/42326)，或通過抑制基因如海藻糖基因(WO97/50561)。特別優選的核酸是編碼來自擬南芥(GenBankAcc.No.U77378)的轉錄激活因子CBF1或Myoxocephalusoctodecemspinosus的抗凍蛋白質(GenBankAcc.No.AF306348)、或其功能等價物。2.獲得例如針對真菌、昆蟲、線蟲和由胚表皮中特定代謝物或蛋白質的靶向分泌或濃度引起的疾病的抗性。可以提出的實例是芥子油苷(防御食草動物)；幾丁質酶或葡聚糖酶以及其它損害寄生蟲細胞壁的酶；核糖體失活蛋白(RIP)；和其它植物抗性和脅迫應答的蛋白質(該脅迫應答由傷口或微生物侵襲植物引起，或由化學品，例如，水楊酸、茉莉酮酸或乙烯引起)；非植物來源的溶菌酶，例如T4溶菌酶或來自多種哺乳動物的溶菌酶；殺蟲蛋白質如蘇云金芽孢桿菌內毒素；□-淀粉酶抑制劑或蛋白酶抑制劑(豇豆胰蛋白酶抑制劑)；葡聚糖酶；凝集素如植物凝集素、雪花蓮凝集素、小麥胚芽凝集素；RNA酶或核酶。特別優選編碼Trichodermaharzianumchit42內切幾丁質酶(GenBankAcc.No.S78423)或編碼SorghumbicolorN-羥基化多功能細胞色素P-450(CYP79)蛋白質(GenBankAcc.No.U32624)的核酸，或其功能等價物。可以使用本發明的轉基因表達構建體通過“基因沉默”抑制或降低內源靶基因的表達。其抑制引起有利表型的優選的基因或蛋白質是技術人員公知的。實例可以包括但不限于下調擬南芥G蛋白的β-亞基以增加根質量(Ullah等人(2003)PlantCell15393-409)、滅活環核苷酸門控離子通道(CNGC)以提高疾病抗性(WO2001007596)，和下調4-香豆酸-CoA連接酶(4CL)基因以改變木質素和纖維素含量(US2002138870)。可以通過反義或雙鏈RNA或通過共抑制(正義抑制)實現基因沉默。“反義”核酸首先被理解為意指完全或部分互補于所述靶蛋白質的“正義”鏈的至少一部分的核酸序列。技術人員已知可以使用備選的cDNA或相應的基因作為適合的反義構建體的起始模板。“反義”核酸優選與靶蛋白質的編碼區或其部分互補。然而，“反義”核酸還可以與非編碼區或其部分互補。技術人員可以按照熟悉的方式，考慮沃森-克里克堿基配對原則從靶蛋白質的序列信息開始設計反義核酸。反義核酸可以與靶蛋白質的完整或部分的核酸序列互補。同樣包括上述序列在正義方向的使用，如技術人員公知的，其可以產生共抑制(正義抑制)。已證明正義的表達可以減少或關閉相同的表達，類似于對反義方法的描述(Goring等人(1991)Proc.NatlAcad.Sci.USA881770-1774；Smith等人(1990)Mol.Gen.Genet.224447-481；Napoli等人(1990)PlantCell2279-289；VanderKrol等人(1990)PlantCell2291-99)。在本上下文中，導入的構建體可以代表將完全或僅部分減少的基因。翻譯的可能性不是必須的。特別優選使用通過雙鏈RNAi(“雙鏈RNA干擾”)的基因調節方法。這類方法為本領域技術人員所公知(如MatzkeMA等人(2000)PlantMolBiol43401-415；FireA.等人(1998)Nature391806-811；WO99/32619；WO99/53050；WO00/68374；WO00/44914；WO00/44895；WO00/49035；WO00/63364)。特別參考在所述參考文獻中描述的方法。另外，可以在本發明的啟動子控制下表達人工轉錄因子(如鋅指蛋白型的；Beerli等人(2000)ProcNatlAcadSciUSA97(4)1495-500)以調節特定內源基因的表達。這些因子連接于待表達或抑制的內源基因的調節區并且取決于因子的設計，引起內源基因的表達或抑制。在本發明方法的優選實施方案中，組裝多表達構建體可用于復雜途徑工程化的目的或用來產生需要兩個或更多酶促反應的復雜產物。實例可以包括但不應限于a)合成多不飽和脂肪酸(PUFA)b)增加油含量c)合成維生素(如生育酚)或類胡蘿卜素(如蝦青素)為了合成蝦青素，存在選自酮酶、β-環化酶、β-羥化酶、β-羥化酶抑制序列、ε-環化酶和ε-環化酶抑制序列的至少兩種序列多種組合。更優選地，序列選自HMG-CoA-還原酶、(E)-4-羥基-3-甲基-丁-2-烯基-二磷酸還原酶、1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶、1-脫氧-D-木糖-5-磷酸-還原異構酶、異戊烯基-二磷酸-Δ-異構酶、香葉基二磷酸合酶、法呢基二磷酸合酶、香葉基香葉基二磷酸合酶、八氫番茄紅素合酶、八氫番茄紅素去飽和酶、ζ-胡蘿卜素去飽和酶、crtISO蛋白質、FtsZ蛋白質和MinD蛋白質的編碼序列。改變生物系統中的物質含量是途徑操作的目的。在多數情況下，一種或一類物質的生物合成取決于一種以上的前體。例如術語維生素E(生育酚和生育三烯酚)中所概述的物質合成取決于尿黑酸和植基焦磷酸的合成。植基焦磷酸是類異戊二烯途徑產物且尿黑酸來自莽草酸途徑。兩種產物對于涉及甲基化和環化步驟的生育酚生物合成的最終步驟都是必需的。所有這些酶促步驟和涉及的基因產物是操作途徑中可能的瓶頸。為了增加終產物維生素E，必須找到限速酶活性。這些酶活性應該按照正確順序增加。為了實現此目的，必須測試許多組合以找到最有前景的基因組合。在本發明優選的實施方案，由本發明的所述多表達構建體導入植物的表達盒能夠賦予所述轉基因植物至少一種選自如下的表型增加的營養價值、增加的油含量、增加的淀粉含量、增加的蛋白質含量、增加的維生素含量、增加的類胡蘿卜素含量、增加的病原體抗性、改變的油或淀粉組成、和增加的脅迫耐受性。術語“增加的”意指化合物的數量或特性(如脅迫耐性)的質量(如油)高于缺失表達盒的相同植物品種中的同一特性。優選地，增加至少是10％，優選至少50％，更優選至少100％，最優選至少500％。術語“修飾的”意指質量或數量的變化，優選復雜混合物組成的變化。關于油組成，“修飾的”意指優選更高含量的不飽和和/或多不飽和脂肪酸。關于淀粉組成，“修飾的”意指優選支鏈淀粉與直鏈淀粉比率的改變。因此本發明的另一實施方案涉及通過本發明的方法獲得的多表達構建體。所述多表達構建體包括至少兩個插入片段I(n)，其中n是表征每個插入片段的從1到m的整數，且m是不同插入片段的總數。每個插入片段包含至少一個表達盒。每個插入片段側翼是重組邊A(2i-1)與相同i的重組邊A(2i)重組產生的序列，其中所述重組位點與如上關于包含在插入片段供體分子中的個體插入片段所定義的相同。例如重組位點attR1*與attL1*的重組產生attB1*，attR2*與attL2*產生attB2*，attR3*與attL3*產生attB3*，attR4*與attL4*產生attB4*(序列說明見上文)。7.靶生物和轉化技術本發明的另一研究主題涉及用本發明的至少一種多表達構建體轉化的轉基因細胞或非人生物，和來自這類生物的細胞、細胞培養物、組織、器官(如植物生物的葉、根等)或繁殖物質。優選地，轉基因細胞或非人生物選自原核和真核細胞或生物(如上定義和說明的)。最優選地，所述轉基因細胞或生物選自植物細胞或生物(如上定義和說明的)。產生轉化的生物或轉化的細胞需要將所討論的DNA導入所討論的宿主細胞。多種方法可用于該步驟，其被稱為轉化(又見Keown(1990)MethodsinEnzymology185527-537)。例如，DNA可以通過顯微注射或經由DNA包被的微粒轟擊直接導入。另外，還可以化學透化細胞，例如使用聚乙二醇，使DNA可擴散進入細胞。還可以用其它含有DNA的單位如小細胞、細胞、溶酶體或脂質體通過原生質體融合導入DNA。另一導入DNA的合適方法是電穿孔，其中細胞通過電脈沖被可逆的透化。如上所述的宿主細胞或生物可以是任何原核或真核生物。優選如上定義的哺乳動物細胞、非人哺乳動物生物、植物細胞和植物生物。本發明的多表達構建體優選被導入真核細胞。其可以優選被插入基因組(如質體或染色體DNA)，但還可以存在于額外染色體或表染色體。優選的真核細胞是哺乳動物細胞、真菌細胞、植物細胞、昆蟲細胞、禽類細胞等。合適的哺乳動物宿主細胞的實例包括非洲綠猴腎細胞(Vero；ATCCCRL1587)、人胚腎細胞(293-HEK；ATCCCRL1573)、幼倉鼠腎細胞(BHK-21、BHK-570，ATCCCRL8544、ATCCCRL10314)、犬腎細胞(MDCK；ATCCCCL34)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO-K1；ATCCCCL61；CHODG44(Chasin等人，Som.CellMolec.Genet.12555，1986))、大鼠垂體細胞(GH1；ATCCCCL82)、HeLaS3細胞(ATCCCCL2.2)、大鼠肝癌細胞(H-4-II-E；ATCCCRL1548)、SV40轉化的猴腎細胞(COS-1；ATCCCRL1650)和鼠胚細胞(NIH-3T3；ATCCCRL1658)。可以使用包括磷酸鈣轉染、脂質體介導的轉染、顯微注射介導的遞送、電穿孔等多種標準技術將多表達構建體導入宿主細胞。可以選擇和繁殖轉染的細胞以提供包含穩定整合入宿主細胞基因組的目的基因的重組宿主細胞。所述多表達構建體可以是在桿狀病毒系統使用的桿狀病毒表達載體。桿狀病毒系統提供有效的手段將克隆的目的基因導入昆蟲細胞。合適的表達載體基于苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(AcMNPV)，且含有公知的啟動子，如，果蠅熱休克蛋白(hsp)70啟動子、苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒介導的早期基因啟動子(ie-1)和延遲的早期39K啟動子、桿狀病毒p10啟動子以及果蠅金屬硫蛋白啟動子。制備重組桿狀病毒的另一方法是使用如Luckow所述的基于轉座子的系統(Luckow，等人，J.Virol.674566(1993))。該系統使用轉移載體，以BAC-to-BAC試劑盒(LifeTechnologies，Rockville，Md.)銷售。該系統使用含有Tn7轉座子的轉移載體PFASTBAC(LifeTechnologies)，其移動編碼目的多肽的DNA進入維持于大腸桿菌的被稱為“桿狀病毒穿梭載體”的大質粒的桿狀病毒基因組。見Hill-Perkins和Possee，J.Gen.Virol.71971(1990)，Bonning，等人，J.Gen.Virol.751551(1994)，以及Chazenbalk和Rapoport，J.Biol.Chem.2701543(1995)。另外，轉移載體可以包括與編碼所表達的多肽的C-和N-末端的表位標記的DNA符合讀框地融合，例如Glu-Glu表位標記(Grussenmeyer等人，Proc.Nat′lAcad.Sci.827952(1985))。使用本領域已知的技術將含有目的基因的轉移載體轉化進入大腸桿菌，并篩選含有表明重組桿狀病毒的間斷lacZ基因的桿狀病毒穿梭載體。隨后使用常規技術分離所述含有重組桿狀病毒基因組的桿狀病毒穿梭載體DNA。使用所述重組病毒或桿狀病毒穿梭載體轉染宿主細胞。合適的昆蟲宿主細胞包括來自IPLB-Sf-21的細胞系(一種草地貪夜蛾蛹的卵巢細胞系)，如Sf9(ATCCCRL1711)、Sf21AE和Sf21(InvitrogenCorporation；SanDiego，Calif.)，以及果蠅Schneider-2細胞和來自粉紋夜蛾(美國專利號5300435)的HIGHFIVEO細胞系(Invitrogen)。可以使用通過商業途徑可獲得的無血清培養基生長和維持所述細胞。合適的培養基是用于Sf9細胞的Sf900IITM(LifeTechnologies)或ESF921TM(ExpressionSystems)；和用于粉紋夜蛾細胞的Ex-cellO405TM(JRHBiosciences，Lenexa，Kans.)或ExpressFiveOTM((LifeTechnologies)。當使用重組病毒時，細胞通常從約2-5×105個細胞到為1-2×106個細胞的接種密度細胞生長，此時加入感染復數為0.1到10，更通常接近3的重組病毒原種。提供用于桿狀病毒系統的已建立技術的有Bailey等人，″ManipulationofBaculovirusVectors，″inMethodsinMolecularBiology，Volume7GeneTransferandExpressionProtocols，Murray(編輯)，147-168頁(TheHumanaPress，Inc.1991)，由Patel等人，″Thebaculovirusexpressionsystem，″inDNACloning2ExpressionSystems，2ndEdition，Glover等人(編輯)，205-244頁(OxfordUniversityPress1995)，由Ausubel(1995)在16-37到16-57頁，Richardson(編輯)，BaculovirusExpressionProtocols(TheHumanaPress，Inc.1995)，和由Lucknow，″InsectCellExpressionTechnology，″inProteinEngineeringPrinciplesandPractice，Cleland等人(編輯)，183-218頁(JohnWiley&Sons，Inc.1996)。真菌細胞，包括酵母細胞，也可以用作以本發明的多表達構建體轉化的宿主細胞。在這點上，特定目的的酵母物種包括釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母和甲醇畢赤酵母(Pichiamethanolica)。適于在酵母中表達的啟動子包括來自GAL1(半乳糖)、PGK(磷酸甘油酸激酶)、ADH(醇脫氫酶)、AOX1(醇氧化酶)、HIS4(組氨醇脫氫酶)等的啟動子。已有許多酵母克隆載體被設計且可以容易的得到以，如用作基本載體以衍生插入片段受體(載體供體)分子。這些載體包括基于YIp的載體，如YIp5；YRp載體，如YRp17；YEp載體，如YEp13和YCp載體，如YCp19。用外源DNA轉化釀酒酵母細胞和從中產生重組多肽的方法公開在，例如US4599311、US4931373、US4870008、US5037743和US4845075。由選擇標記，通常是藥物抗性或在缺乏特定營養物(如亮氨酸)時生長的能力決定的表型選擇被轉化的細胞。在釀酒酵母中使用的說明性的載體系統是POTI載體系統(US4931373)，其允許轉化的細胞通過在含有葡萄糖的培養基中生長來選擇。另外的適于在酵母中使用的啟動子和終止子包括糖酵解酶基因(見，如US4599311、US4615974和US4977092)和醇脫氫酶基因的啟動子和終止子。見US4990446、5063154、5139936和4661454。其它酵母，包括多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfragilis)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilagomaydis)、巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母、季也蒙畢赤酵母(Pichiaguillermondii)和麥芽糖假絲酵母(Candidamaltosa)的轉化系統是本領域公知的。見，例如Gleeson等人，J.Gen.Microbiol.1323459(1986)和US4882279。可以根據McKnight等人(US4935349)的方法使用曲霉細胞。公開了轉化Acremoniumchrysogenum的方法(US5162228)。公開了轉化脈孢菌(Neurospora)的方法(US4486533)。例如，公開了甲醇畢赤酵母作為生產重組蛋白質的宿主的用途(US5716808、US5736383，Raymond等人，Yeast1411-23(1998)，WO97/17450、WO97/17451、WO98/02536和WO98/02565)。用于轉化甲醇畢赤酵母的DNA分子通常被作為雙鏈、環狀質粒制備，在轉化前優選將其線性化。為了在甲醇畢赤酵母中生產多肽，質粒中的啟動子和終止子可以是甲醇畢赤酵母基因的啟動子和終止子，如甲醇畢赤酵母醇利用基因(AUG1或AUG2)。其它有用的啟動子包括二羥丙酮合酶(DHAS)、甲酸脫氫酶(FMD)和過氧化氫酶(CAT)基因的啟動子。為了促進DNA整合進入宿主染色體，優選質粒的完整的表達片段的側翼兩端為宿主DNA序列。對于希望甲醇使用最小的大規模工業過程，可以使用缺失兩個甲醇利用基因(AUG1和AUG2)的宿主細胞。為了生產分泌的蛋白質，使用液泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)缺陷的宿主細胞。使用電穿孔以促使將含有編碼目的多肽的DNA的質粒導入甲醇畢赤酵母細胞。可以使用指數衰減的脈沖電場通過電穿孔轉化甲醇畢赤酵母細胞，所述電場的場強為2.5到4.5kV/cm，優選約3.75kV/cm，時間常數(t)為1到40毫秒，最優選約20毫秒。將核酸分子導入細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物和植物細胞的標準方法由例如Ausubel(1995)提供。表達和回收由哺乳動物細胞系統產生的外源蛋白質的一般方法方法由例如，Etcheverry，″ExpressionofEngineeredProteinsinMammalianCellCulture，″inProteinEngineeringPrinciplesandPractice，Cleland等人(編輯)，163頁(Wiley-Liss，Inc.1996)被提供。用于從桿狀病毒系統分離重組蛋白質的已建立的方法如Richardson(編輯)，BaculovirusExpressionProtocols(TheHumanaPress，Inc.1995)所述。特別優選轉移多表達構建體進入植物細胞、組織和/或生物。導入轉基因表達構建體或載體進入植物組織的方法可以包括但不限于，如電注射(Nan等人(1995)In″BiotechnologyinAgricultureandForestry，″Ed.Y.P.S.Bajaj，Springer-VerlagBerlinHeidelberg，Vol34145-155；Griesbach(1992)Hort.Science27620)；與脂質體、溶酶體、細胞、小細胞或其它可融合的脂質-表面的小體融合(Fraley等人(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA791859-1863)；聚乙二醇(Krens等人(1982)Nature29672-74)；增加對游離DNA攝取的化學品；使用病毒的轉化等。另外，可以使用利用基因槍的生物射彈方法、電穿孔、在含DNA的溶液中溫育干胚和顯微注射。可以使用基于原生質體的方法(如用于水稻)，其中通過脂質體、PEG或電穿孔(Shimamoto等人(1989)Nature338274-276；Datta等人(1990b)Bio/Technology8736-740)將DNA遞送到原生質體。通過電穿孔的轉化涉及使用短的、高電壓電場在細胞膜產生“孔”，通過該孔得以攝入DNA。這些方法例如，用于產生穩定轉化的單子葉植物(Paszkowski等人(1984)EMBOJ32717-2722；Shillito等人(1985)Bio/Technology，31099-1103；Fromm等人(1986)Nature319791-793)特別是水稻(Shimamoto等人(1989)Nature338274-276；Datta等人(1990b)Bio/Technology8736-740；Hayakawa等人(1992)ProcNatlAcadSciUSA899865-9869)。粒子轟擊或“生物射彈”是廣泛用于轉化植物，特別是單子葉植物的方法。在“生物射彈”(微粒介導的DNA遞送)方法中，包被有DNA的微粒由機械裝置加速到足以穿透植物細胞壁和細胞核的速度(WO91/02071)。所述外源DNA整合進入宿主DNA并產生轉化的細胞。在“生物射彈”方法中有很多變通方法(Sanford(1990)PhysiologiaPlantarium79206-209；Fromm等人(1990)Bio/Technology8833-839；Christou等人(1988)PlantPhysiol87671-674；Sautter等人(1991)Bio/Technology，91080-1085)。該方法用于產生穩定轉化的單子葉植物，包括水稻、玉米、小麥、大麥和燕麥(Christou等人(1991)Bio/Technology9957-962；Gordon-Kamm等人(1990)PlantCell2603-618；Vasil等人(1992)Bio/Technology，10667-674，Wan和Lemaux(1994)PlantPhysiol-1043748)。除了這些“直接的”轉化技術，還可以通過根癌農桿菌或發根農桿菌的細菌感染實現轉化。這些菌株含有質粒(Ti或Ri質粒)，其伴隨著農桿菌感染轉移到植物中。被稱為T-DNA(轉移DNA)的該質粒的部分被整合入植物細胞的基因組(見以上對載體的描述)。為了轉移DNA進入植物細胞，將植物外植體與轉基因的根癌農桿菌或發根農桿菌共培養。從感染的植物材料(例如葉、根或莖切片，以及原生質體或植物細胞的懸浮液)開始，可以使用合適的培養基產生完整的植物，所述培養基含有例如抗生素或殺蟲劑來選擇轉化的細胞。可以隨后在獲得的植物中篩選存在導入的DNA(在此情況下指根據本發明的表達構建體)的植物。一旦DNA已經被整合進入宿主基因組，所述基因型通常是穩定的，且所述插入片段也在隨后的世代中發現。通常，整合的表達構建體包含選擇標記，其賦予轉化的植物針對殺生物劑(如除草劑)或抗生素如卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素或膦絲菌素等的抗性。所述選擇標記使可以從未轉化的細胞中選擇出轉化的細胞(McCormick1986)。獲得的植物可以以常規方式培養和雜交。應該生長兩個或更多的世代以保證基因組的整合是穩定和可遺傳的。描述了上述方法(例如，在JenesB等人(1993)TechniquesforGeneTransfer，inRecombinantPlants，Vol.1，EngineeringandUtilization，SDKung和RWu編輯，AcademicPress，128-143頁；和Potrykus(1991)AnnRevPlantPhysiolPlantMolBiol42205-225)本領域的技術人員知道可以使用本領域的多種已知方法提高農桿菌的轉化效率。例如，已顯示將天然創傷應答分子如乙酰丁香酮(AS)加入農桿菌培養物能夠增加根癌農桿菌的轉化效率(Shahla等人(1987)PlantMole.Biol.8291-298)。備選地，可以通過創傷要轉化的靶組織增加轉化效率。植物組織的創傷可以通過例如穿孔、軟化、微粒轟擊等實現(見，如Bidney等人(1992)PlantMolec.Biol.18301-313)。已報道用于轉化植物(特別是單子葉植物)的許多其它方法包括，例如“花粉管法”(WO93/18168；Luo和Wu(1988)PlantMol.Biol.Rep.6165-174)、大型注射DNA進入花管(noraltiller)(Du等人(1989)GenetManipPlants58-12；delaPena等人(1987)Nature325274-276)、注射農桿菌進入發育的穎果(WO00/63398)以及種子在DNA溶液中的組織溫育(Topfer等人(1989)PlantCell1133-139)。WO94/00583公開了在胚發育開始時將外源DNA直接注射入受精的植物胚珠。WO97/48814公開了產生穩定轉化的能育小麥的方法以及通過農桿菌基于新鮮分離的或預培養的未成熟胚、胚產生的愈傷組織和懸浮細胞轉化小麥的系統。可能希望將目的核酸序列靶定至植物基因組的特定基因座。可以通過，例如使用源自農桿菌的序列通過例如同源重組將目的核酸序列位點定向整合到植物細胞基因組。通常，將植物細胞與含有尋靶載體的農桿菌菌株溫育，所述載體中與靶基因座內DNA序列同源的序列側翼為農桿菌轉移DNA(T-DNA)序列，如前所述(US5501967，其完整內容此處引入作為參考)。本領域的技術人員知道可以使用含有與靶定的植物基因的任何部分(屬于基因的調節元件，或者是基因的編碼區)同源的序列的尋靶載體可以實現同源重組。只要待靶定的位點側翼區域的核酸序列已知，就可以在植物基因的任何區域實現同源重組。當希望同源重組時，所用的尋靶載體可以是置換或插入型的(US5501967；上述)。置換型載體通常含有兩個區域，其與靶定的基因組序列同源且其側有一段異源核酸序列，如選擇標記基因序列。置換型載體導致選擇標記基因的插入，所述標記基因破壞所靶定的基因。插入型載體含有與靶基因同源的單個的區域并使整個尋靶載體插入靶基因。如果選擇標記是導入的DNA的部分，那么可以從未轉化的細胞中選出轉化的細胞，即那些含有整合入宿主細胞DNA的所導入DNA的細胞。選擇標記基因可以賦予正或負選擇性。可以在構建體中使用正選擇標記基因用于隨機整合和位點定向的整合。正選擇標記基因包括抗生素抗性基因和除草劑抗性基因等。表達這樣的標記基因的轉化細胞能夠在將殺死未轉化細胞的抗生素或除草劑濃度下存活。實例如賦予對除草劑膦絲菌素(雙丙氨膦；Vasil等人(1992)Bio/Technology，10667-674；Weeks等人(1993)PlantPhysiol1021077-1084；Rathore等人(1993)PlantMolBiol21(5)871-884)抗性的bar基因、賦予對卡那霉素抗性的nptII基因、賦予對潮霉素抗性的hpt基因或賦予對除草劑草甘膦抗性的EPSP基因、遺傳霉素(G418)(氨基糖苷類)(Nehra等人(1994)PlantJ.5285-297)、草甘膦(Della-Cioppa等人(1987)Bio/Technology5579-584)和ALS基因(chlorsulphuron抗性)。更多優選的可選擇的和可篩選的標記基因在上文公開。在構建體中也可以含有負選擇標記基因。優選在用于同源重組的構建體中使用一個或更多的負選擇標記基因與正選擇標記基因的組合。負選擇標記基因通常被置于涉及同源重組事件的區域之外。負選擇標記基因以可表達的方式對將這些基因整合入它們的基因組的細胞提供不利之處(優選致死現象)。其中用于同源重組的尋靶載體隨機整合入基因組的細胞將由于存在負選擇標記基因而被傷害或殺死。當構建體中包括正選擇標記基因時，只有那些在其基因組整合正選擇標記的細胞能夠存活。只要負選擇標記在轉化的植物細胞中編碼有功能的多肽，對于本發明，負選擇標記的挑選并不關鍵。例如，負選擇基因可以選自來自農桿菌Ti-質粒的aux-2基因、來自SV40的tk基因、來自淺灰鏈霉菌(streptomycesgriseolus)的細胞色素P450、來自玉米或擬南芥的Adh基因等。可以使用編碼能夠將對植物細胞無害的物質轉化為對植物細胞有害的物質的酶的基因。其他優選的負選擇標記在上文公開。然而，表達盒或載體向染色體DNA的插入還可以通過本領域已知的許多其它方法(不是基于選擇標記)來證明和分析，所述方法包括，但不限于，基因組DNA的限制酶切作圖、PCR分析、DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交、DNA序列分析等。更特別地，這類方法可以包括，如PCR分析、DNA印跡分析、熒光原位雜交(FISH)、和原位PCR。一旦產生轉化的植物細胞，可以使用技術人員已知的方法獲得完整的植物。因此，本發明提供了轉基因植物。本發明的轉基因植物不限于在其中每個和所有的細胞都表達在本文所提供的啟動子序列控制下的目的核酸序列的植物。在本發明的范圍包括包含至少一個表達目的核酸序列的細胞的植物(如，嵌合植物)。優選地，但非必須地，所述轉基因植物在一個以上的細胞，和更優選在一種或多種組織中含有目的核酸序列。一旦已獲得含有表達載體的轉基因植物組織，可以使用本領域已知方法從該轉基因植物組織再生轉基因植物。如本文所用術語“再生”意指從一個植物細胞、一組植物細胞、植物部分或植物塊(如，從原生質體、愈傷組織、原基體類似的小體或組織部分)長成完整植物。下列植物屬的物種可以從轉化的原生質體再生草莓屬(Fragaria)、百脈根屬(lotus)、苜蓿屬(Medicago)、驢食豆屬(Onobrychis)、車軸草屬(Trifolium)、胡盧巴屬(Trugonella)、豇豆屬(Vigna)、柑桔屬(Citrus)、亞麻屬(Linum)、老鸛草屬(Geranium)、木薯屬(Manihot)、胡蘆巴屬(Daucus)、鼠耳芥屬(Arabidopsis)、蕓苔屬(Brassica)、蘿卜屬(Raphanus)、白芥屬(Sinapis)、顛茄屬(Atropa)、辣椒屬、天仙子屬(Hyoscyamus)、番茄屬、煙草屬(Nicotiana)、茄屬、碧冬茄屬(Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、Majorana、Ciohorium、向日葵屬(Helianthus)、萵苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Bromus)、天門冬屬(Asparagus)、金魚草屬(Antirrhinum)、Hererocallis、Nemesia、天竺葵屬(Pelargonium)、稷屬(Panicum)、狼尾草屬(Pennisetum)、毛茛屬(Ranunculus)、千里光屬(Senecio)、Salpiglossis、香瓜屬(Cucumis)、Browaalia、大豆屬(Glycine)、豌豆屬(Pisum)、黑麥草屬(Lolium)、玉蜀黍屬(Zea)、小麥屬(Triticum)、高梁屬(Sorghum)和曼陀羅屬(Datura)。為了從轉基因的原生質體再生轉基因植物，首先提供轉化的原生質體的懸浮液或含有轉化的外植體的培養皿。形成愈傷組織組織且可以從愈傷組織誘導枝條并隨后生根。備選地，可以在愈傷組織中誘導體細胞胚的形成。這些體細胞胚像天然胚一樣萌發形成植物。培養基通常含有多種氨基酸和植物激素，如植物生長素和細胞分裂素。向培養基加入谷氨酸和脯氨酸也是有利的，特別對于那些如玉米和苜蓿的物種而言。有效的再生將依賴于培養基、基因型和培養史。可以通過經驗控制這三個變量以產生可重復的再生。還可以從培養的細胞或組織再生植物。已顯示能夠從轉化的單個細胞再生獲得完整的轉基因植物的雙子葉植物包括，例如，蘋果(Maluspumila)、黑莓(懸鉤子屬(Rubus))、黑莓/木莓雜種(懸鉤子屬)、覆盆子(懸鉤子屬)、胡蘿卜(Daucuscarota)、花椰菜(甘藍(Brassicaoleracea))、芹菜(Apiumgraveolens)、黃瓜(Cucumissativus)、茄子(Solanummelongena)、萵苣(Lactucasativa)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、油菜(歐洲油菜(Brassicanapus))、野生大豆(Glycinecanescens)、草莓(Fragariaananassa)、番茄(Lycopersiconesculentum)、胡桃(Juglansregia)、瓜(甜瓜(Cucumismelo))、葡萄(Vitisvinifera)和芒果(Mangiferaindica)。已顯示可以從轉化的單個細胞再生獲得完整的轉基因植物的單子葉植物包括，例如，稻(Oryzasativa)、黑麥(Secalecereale)和玉米(Zeamays)。另外，已在下列植物中觀察到從細胞(不必要是轉化的)再生完整植物杏(Prunusarmeniaca)、蘆筍(Asparagusofficinalis)、香蕉(hybridMusa)、豆(Phaseolusvulgaris)、櫻桃(hybridPrunus)、葡萄、芒果、瓜(Cucumismelo)、ochra(咖啡黃葵(Abelmoschusesculentus))、洋蔥(hybridAllium)、橙(甜橙(Citrussinensis))、番木瓜(Carricapapaya)、桃(Prunuspersica)、李(歐洲李(Prunusdomestica))、梨(西洋梨(Pyruscommunis))、菠蘿(鳳梨(Ananascomosus))、西瓜(Citrullusvulgaris)和小麥(普通小麥(Triticumaestivum))。將再生的植物轉移到標準的土壤條件并以常規方式培養。在表達載體被穩定整合入再生的轉基因植物之后，其可以通過無性繁殖或通過有性雜交轉移到其它植物。例如，在無性繁殖的農作物中，通過扦插或組織培養技術產生多個相同的植物來繁殖成熟的轉基因植物。在種子繁殖的農作物中，成熟的轉基因植物自交以產生能夠按照孟德爾遺傳傳遞轉基因到其子代的純合的近交植物。近交植物產生含有目的核酸序列的種子。這些種子可以生長產生具有所選擇表型的植物。還可以通過近交植物與另一近交植物雜交產生雜種來開發新的雜種。可以通過PCR分析、抗生素或除草劑抗性、酶促分析和/或DNA印跡來驗證轉化以證實細胞、組織和植物的轉基因特性。可以獲得再生植物的子代并分析以驗證轉基因是否是可遺傳的。轉基因的可遺傳性進一步證明在植物中轉基因的穩定轉化。產生的植物可以用常規方式育種。可以生長兩個或更多的世代以保證基因組的整合是穩定和可遺傳的。相應的方法已被描述(JenesB等人(1993)TechniquesforGeneTransfer，inRecombinantPlants，Vol.1，EngineeringandUtilization，SDKung和RWu編輯，AcademicPress，128-143頁；Potrykus(1991)AnnRevPlantPhysiolPlantMolBiol42205-225)。還根據本發明提供了來自上述轉基因生物的細胞、細胞培養物、組織、部分、器官(例如對于轉基因植物生物為根、葉等)，和轉基因繁殖材料如種子或果實。本發明的另一實施方案涉及產生糧食或飼料產品、藥物或化學品的方法，所述方法包括提供包含本發明的多表達構建體的轉基因細胞或生物，生長所述細胞或生物和，任選地，分離所述糧食或飼料產品、藥物或化學品。可以被人或動物消費的根據本發明的基因修飾的植物也可以，例如直接或通過本身已知的方法用作糧食或飼料。本發明的另一主題涉及根據本發明的上述轉基因生物和源自其的細胞、細胞培養物、部分、組織、器官(例如對于轉基因植物生物為根、葉等)和轉基因繁殖材料(如種子或果實)用于生產糧食或飼料、藥物或精細化學品的用途。還優選在宿主生物中重組產生藥物或精細化學品的方法，在該方法中使用一種上述表達構建體轉化宿主生物，且該表達構建體包含一種或多種編碼所希望的精細化學品或催化所希望的精細化學品的生物合成的結構基因；培養轉化的宿主生物；以及從培養基分離所希望的精細化學品。所述方法可以廣泛用于精細化學品如酶、維生素、氨基酸、糖、脂肪酸、天然和合成的香料、芳香物質和著色劑。特別優選產生生育酚和生育三烯酚(tocotrienol)、類胡蘿卜素、油、多不飽和脂肪酸等。通過技術人員已知的方法培養轉化的宿主生物并從宿主生物或培養基分離。例如抗體、疫苗、酶或有藥學活性的蛋白質的藥物生產已有描述(Hood和Jilka(1999)CurrOpinBiotechnol.10(4)382-6；Ma和Vine(1999)CurrTopMicrobiol.Immunol.236275-92；Russel(1999)CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology240119-138；Cramer等人(1999)CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology24095-118；Gavilondo和Larrick(2000)Biotechniques29(1)128-138；Holliger和Bohlen(1999)Cancer&MetastasisReviews18(4)411-419)。相關領域的普通技術人員應該理解的是顯而易見，可以對本文所述的方法和應用做出其它適當的修改和改編而不背離本發明或其任何實施方案的范圍。現已對本發明做出了詳細描述，通過參考下列實施例將更清楚地理解本發明，所述實施例僅僅意在對本發明進行說明而非限定。序列1.SEQIDNO1重組位點m-att5’-RKYCWGCTTTYKTRTACNAASTSGB-3’2.SEQIDNO2重組位點m-attB5’-AGCCWGCTTTYKTRTACNAACTSGB-3’3.SEQIDNO3重組位點m-attR5’-GTTCAGCTTTCKTRTACNAACTSGB-3’4.SEQIDNO4重組位點m-attL5’-AGCCWGCTTTCKTRTACNAAGTSGB-3’5.SEQIDNO5重組位點m-attP15’-GTTCAGCTTTYKTRTACNAAGTSGB-3’6.SEQIDNO6重組位點attB15’-AGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGT-3’7.SEQIDNO7重組位點attB25’-AGCCTGCTTTCTTGTACAAACTTGT-3’8.SEQIDNO8重組位點attB35’-ACCCAGCTTTCTTGTACAAACTTGT-3’9.SEQIDNO9重組位點attR15’-GTTCAGCTTTTTTGTACAAACTTGT-3’10.SEQIDNO10重組位點attR25’-GTTCAGCTTTCTTGTACAAACTTGT-3’11.SEQIDNO11重組位點attR35’-GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG-3’12.SEQIDNO12重組位點attL15’-AGCCTGCTTTTTTGTACAAAGTTGG-3’13.SEQIDNO13重組位點attL25’-AGCCTGCTTTCTTGTACAAAGTTGG-3’14.SEQIDNO14重組位點attL35’-ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG-3’15.SEQIDNO15重組位點attP15’-GTTCAGCTTTTTTGTACAAAGTTGG-3’16.SEQIDNO16重組位點attP2、P35’-GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG-3’17.SEQIDNO17磷酸化的寡核苷酸Loy3445’-p-GTCGACCAGATCTGATATCTGCGGCCGCCTCGAGCATATG-3’18.SEQIDNO18磷酸化的寡核苷酸Loy3455’-p-GTCGACCAGATCTGATATCTGCGGCCGCCTCGAGCATATG-3’19.SEQIDNO19大腸桿菌hisA基因的雙鏈填充序列(stufferout)5’-ccggtgcaggttggcggcggcgtgcgtagcgaaga-3’20.SEQIDNO20寡核苷酸引物Loy413-attB4*fwd-a5’-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGGTACCCGGGGATCCTCTA-3’21.SEQIDNO21寡核苷酸引物Loy414-attB1*rev-a5’-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGCCATGATTACGCCAAGCTTGCA-3’22.SEQIDNO22寡核苷酸引物Loy447-a“B4*fwd-a-inv5’-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGCCATGATTACGCCAAGCTTGCA-3’23.SEQIDNO23寡核苷酸引物Loy448-attB1*rev-a-inv5’-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGGGTACCCGGGGATCCTCTA-3’24.SEQIDNO24寡核苷酸引物Loy415-attB1*-fwd-b5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGGTACCCGGGGATCCTCTA-3’25.SEQIDNO25寡核苷酸引物Loy416-attB2*rev-b5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCATGATTACGCCAAGC-TTGCA-3’26.SEQIDNO26寡核苷酸引物Loy449-attB1*fwd-b-inv5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGATTACGCCAAGC-TTGCA-3’27.SEQIDNO27寡核苷酸引物Loy450-attB2*rev-b-inv5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGGTACCCGGGGATCCTCTA-3’28.SEQIDNO28寡核苷酸引物Loy417-attB2*fwd-c5’-GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGGGTACCCGGGGATCCTCTA-3’29.SEQIDNO29寡核苷酸引物Loy418-attB3*rev-c5’-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGCCATGATTACGCCAAGCTTGCA-3’30.SEQIDNO30寡核苷酸引物Loy451-attB2*fwd-c-inv5’-GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGCCATGATTACGCCAAGCTTGCA-3’31.SEQIDNO31寡核苷酸引物Loy452-attB3*rev-c-inv5’-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGGGTACCCGGGGATCCTCTA-3’32.SEQIDNO32插入片段供體分子載體Lo391-pENTR-A133.SEQIDNO33插入片段供體分子載體Lo392-pENTR-B134.SEQIDNO34插入片段供體分子載體Lo393-pENTR-C135.SEQIDNO35插入片段供體分子載體Lo394-pENTR-A1-inv36.SEQIDNO36插入片段供體分子載體Lo395-pENTR-B1-inv37.SEQIDNO37插入片段供體分子載體Lo396-pENTR-C1-inv38.SEQIDNO38插入片段供體分子載體Lo375-pENTR-A239.SEQIDNO39插入片段供體分子載體Lo376-pENTR-B240.SEQIDNO40插入片段供體分子載體Lo377-pENTR-C241.SEQIDNO41插入片段供體分子載體Lo397-pENTR-A2-inv42.SEQIDNO42插入片段供體分子載體Lo398-pENTR-B2-inv43.SEQIDNO43插入片段供體分子載體Lo399-pENTR-C2-inv44.SEQIDNO44插入片段供體分子pENTR-A-USP∷NAN∷A7t45.SEQIDNO45插入片段供體分子pENTR-B-L1-LuFad3-GUS-E9-L246.SEQIDNO46插入片段供體分子pENTR-C-R2-LeB4-700∷GFP∷LeB3t-L347.SEQIDNO47寡核苷酸引物Loy277attR4EcoRV5′-AAAAAAGATATCGATTACGCCAAGCTATCAACT-3’48.SEQIDNO48寡核苷酸引物Loy278attR3EcoRV5′-AAAAAAGATATCCGGCCAGTGAATTATCAACT-3’49.SEQIDNO49插入片段受體(載體供體)分子載體Lo338-pSUN2-GW-R4R350.SEQIDNO50插入片段受體(載體供體)分子載體Lo339-pSUN2-GW-R3R451.SEQIDNO51多表達構建體pSUN2-B4-USP-NAN-pa7-E9-GUS-FAD3-LeB4-GFP-LeB352.SEQIDNO52重組位點attB1*5’-AGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGC-3’53.SEQIDNO53重組位點attB2*5’-ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGC54.SEQIDNO54重組位點attB3*5’-CAACTTTATTATACATAGTTG-3’55.SEQIDNO55重組位點attB4*5’-CAACTTTTCTATACAAAGTTG-3’56.SEQIDNO56重組位點attR1*5’-GTTCAACTTTTTTGTACAAACTTGC-3’57.SEQIDNO57重組位點attR2*5’-TTCAACTTTCTTGTACAAAGTGGG-3’58.SEQIDNO58重組位點attR3*5’-GTTCAACTTTATTATACATAGTTGA-3’59.SEQIDNO59重組位點attR4*5’-GTTCAACTTTTCTATACAAAGTTGA-3*60.SEQIDNO60重組位點attL1*5’-AGCCTGCTTTTTTGTACAAAGTTGG-3’61.SEQIDNO61重組位點attL2*5’-ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG-3’62.SEQIDNO62重組位點attL3*5’-GGCAACTTTATTATACAAAGTTGG-3’63.SEQIDNO63重組位點attL4*5’-ACCCAACTTTTCTATACAAAGTTGG-3’64.SEQIDNO64重組位點attP1*5’-GTTCAACTTTTTTGTACAAAGTTGG-3’65.SEQIDNO65重組位點attP2*5’-GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG-3’66.SEQIDNO66重組位點attP3*5’-GTTCAACTTTATTATACAAAGTTGG-3’67.SEQIDNO67重組位點attP4*5’-GTTCAACTTTTCTATACAAAGTTGG-3’附圖簡述圖中縮寫含義如下aadA壯觀霉素/鏈霉素抗性基因ccdBDNA旋轉酶抑制因子(反選擇標記)colE1復制起點GUSβ-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)報告基因LeB3’UTLeB-3’UT轉錄終止子LB/RB農桿菌T-DNA的左(LB)和右(RB)邊緣nanNan報告基因nosPnos啟動子nosTnos轉錄終止子nptIInptII卡那霉素抗性基因pA7T35S轉錄終止子pA7rbcSE9TrbcS(RUBISCO小亞基)E9轉錄終止子rrnBT1、rrnT2轉錄終止子重組位點以att起始命名(如attP2*、attP1R*、attP3*、attP2R*、attL4*、attR1*、attL4*、attL1*、attL2*、allR2*、attL3*、attL4*、attR1*等)。圖1A+B經修飾的pDONR載體LO351-pDONR221-mod(I)、LO348-pDONR-P4-P1R-mod(II)和LO347-pDON-P2R-P3-mod(III)的質粒圖譜。圖2A+BpENTR載體LO391-pENTR-A1(I)、LO392-pENTR-B1(II)和LO393-pENTR-C1(III)的質粒圖譜。圖3A+B插入片段供體分子載體pENTRA-L4-USP-NAN-pA7T-R1(I)、pENTRB-L1-E9-GUS-Fad3-L2(II)和pENTRC-R2-LeB4-GFP-LeB3T-L3(III)的質粒圖譜。圖4插入片段受體(載體供體)分子載體Lo338-pSUN2-R4R3(I)和Lo339-pSUN2-R3R4(II)的質粒圖譜。圖5多表達構建體載體pSUN2-B4-USP-NAN-pA7-E9-GUS-Fad3-LeB4-GFP-LeB3的質粒圖譜。圖6由兩個表達盒(由在啟動子(p1、P2)控制下的目的核酸(N1、N2)組成)組成的多表達盒的組裝的反應方案。兩個插入片段供體分子(I1和I2)與一個插入片段受體分子(IA；載體供體＝VD)重組。正方形、三角形和圓形代表不同組的重組位點(如，lox位點或att位點)。僅白色“三角形”重組位點可以與灰色“三角形”重組位點重組，白色“圓形”重組位點可以與灰色“圓形”位點重組等等。插入片段受體優選含有反選擇標記(SC；在啟動子P3控制下)的表達盒。在重組位點之間的重組導致反選擇標記的缺失。僅同時插入兩個表達盒導致完全缺失和載體供體分子的重新環化。圖7由三個表達盒(表達盒1、2、3)組成的多表達盒的組裝的反應方案。插入片段供體分子(pENTR1、2、3)與插入片段受體分子(pSUNGatewayR4R3＝載體供體)重組。僅在不同分子上具有相同尾號的重組位點可以彼此重組(如attR1和attL1、attR2和attL2等)。優選地，所述插入片段受體包含反選擇標記的ccdB表達盒。在重組位點之間的重組導致反選擇標記的缺失。僅全部三個表達盒的插入導致完全的缺失和載體供體分子的重新環化。圖8多表達構建體載體pSUN2-B4-USP-NAN-pA7-E9-GUS-Fad3-LeB4-GFP-LeB3的T-DNA區的方案。表達盒以六邊形表示。實施例化學品除非另外說明，本實施例中的化學品和試劑來自SigmaChemicalCompany(St.Louis，MO)，限制性內切核酸酶來自NewEnglandBiolabs(Beverly，MA)或Roche(Indianapolis，IN)，寡核苷酸由MWGBiotechInc.(HighPoint，NC)合成，其它修飾酶或關于生物化學和分子生物學測定的試劑盒來自Clontech(PaloAlto，CA)、PharmaciaBiotech(Piscataway，NJ)、PromegaCorporation(Madison，WI)或Stratagene(LaJolla，CA)。用于細胞培養基的物質來自Gibco/BRL(Gaithersburg，MD)或DIFCO(Detroit，MI)。如Sambrook(1989)(Sambrook等人(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress；ISBN0-87969-309-6)所述為了本發明的目的進行克隆步驟，例如限制酶切割、瓊脂糖凝膠電泳、DNA片段純化、核酸到硝酸纖維素膜和尼龍膜的轉移、連接DNA片段、轉化大腸桿菌細胞、生長細菌、繁殖噬菌體和重組DNA的序列分析。按照Sanger的方法(Sanger等人(1977)ProcNatlAcadSciUSA745463-5467)使用ABI激光熒光DNA測序儀對重組DNA分子測序。緩沖液在本發明的反應中可以使用多種已知的緩沖液。對于限制酶，建議使用制造商推薦的緩沖液。可以容易在文獻中找到或由本領域普通的技術人員設計備選的緩沖液。用于λ整合酶的一種示例性緩沖液包含50mMTris-HClpH7.5-7.8、70mMKCl、5mM亞精胺、0.5mMEDTA和0.25mg/ml牛血清白蛋白，且任選地，10％甘油。P1Cre重組酶的一種優選的緩沖液包含50mMTris-HClpH7.5、33mMNaCl、5mM亞精胺和0.5mg/ml牛血清白蛋白。與λInt和P1Cre相似的其它位點特異性重組酶的緩沖液是本領域公知的或能夠由技術人員根據經驗決定，特別在上述緩沖液的指導下。實施例1在雙子葉和單子葉植物中農桿菌介導的轉化1.1轉基因擬南芥(Columbia)植物的轉化和再生為了產生轉基因擬南芥植物，用多種ptxA或SbHRGP3啟動子/GUS載體構建體轉化根癌農桿菌(菌株C58C1pGV2260)。隨后使用農桿菌菌株產生轉基因植物。為此目的，將單個轉化的農桿菌菌落以28℃，4mL培養物(培養基含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL利福平的YEB培養基)培養過夜。隨后使用該培養物接種于相同的400mL培養基，并培養過夜(28℃、220rpm(轉/分鐘))和離心(GSA轉子，8000rpm，20min)。沉淀物在滲透培養基(1/2MS培養基；0.5g/LMES，pH5.8；50g/L蔗糖)中重懸浮。將懸浮液導入植物箱(Duchefa)，并且加入100mL的SILWETL-77(聚環氧烷修飾的七甲基三硅氧烷；OsiSpecialtiesInc.，Cat.P030196)至終濃度0.02％。在干燥器中將裝有8到12個植物的植物箱暴露于真空10到15分鐘，隨后自動通風。重復該步驟2到3次。隨即將全部植物種植于具有潮濕土壤的花盆中，并在長日照條件下生長(白天溫度22到24℃，夜晚溫度19℃；相對空氣濕度65％)。在6周后收獲種子。備選地，可以通過根轉化獲得轉基因擬南芥植物。使用具有最高齡為8周的植物的白色根莖。為此目的，使用保持在無菌條件下的1MS培養基(1％蔗糖；100mg/L肌醇；1.0mg/L硫胺素；0.5mg/L吡哆醇；0.5mg/L煙酸；0.5gMES，pH5.7；0.8％瓊脂)中的植物。根在愈傷組織誘導的培養基上生長3天(1xGamborg’sB5培養基；2％葡萄糖；0.5g/L巰基乙醇；0.8％瓊脂；0.5mg/L2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)；0.05mg/L細胞分裂素)。0.5cm長的根切片被移入10到20mL的液體愈傷組織誘導培養基(組成如上所述，但不添加瓊脂)，用1mL上述過夜的農桿菌培養物(在28℃、于LB中200rpm下生長)接種并振搖2分鐘。倒掉多余的培養基后，將根外植體轉移到含有瓊脂的愈傷組織誘導培養基，隨后轉移至沒有瓊脂的愈傷組織誘導液體培養基(500mg/L羧噻吩青霉素，SmithKlineBeechamPharmaGmbH，Munich)，振搖下培養，并最終轉移到莖誘導培養基(5mg/L2-異戊烯基腺嘌呤磷酸鹽；0.15mg/L吲哚-3-乙酸；50mg/L卡那霉素；500mg/L羧噻吩青霉素)。在5周之后，且在更換1或2次培養基之后，將綠色小莖轉移到萌發培養基(1MS培養基；1％蔗糖；100mg/L肌醇；1.0mg/L硫胺素；0.5mg/L吡哆醇；0.5mg/L煙酸；0.5gMES，pH5.7；0.8％瓊脂)并再生成為植物。1.2農作物植物的轉化和再生使用標準轉化和再生技術的農桿菌介導的植物轉化還可以用于轉化農作物植物的目的(Gelvin和Schilperoort(1995)PlantMolecularBiologyManual，第2版，DordrechtKluwerAcademicPubl.ISBN0-7923-2731-4；Glick和Thompson(1993)MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology，BocaRatonCRCPress，ISBN0-8493-5164-2)。例如，可以通過子葉或下胚軸轉化油菜(Moloney等人(1989)PlantCellReports8238-242；DeBlock等人(1989)PlantPhysiol91694-701)。用于選擇農桿菌和植物的抗生素的使用取決于用于轉化的雙元載體和農桿菌菌株。通常使用卡那霉素作為選擇性植物標記進行油菜的選擇。可以使用例如Mlynarova等人(1994)PlantCellReport13282-285所述的技術在亞麻(Linumusitatissimum)中進行農桿菌介導的基因轉移。大豆的轉化可以使用，例如在EP-A10424047或在EP-A10397687，US5376543、US5169770中所述技術進行。玉米或其它單子葉植物的轉化可以使用，例如在US5591616中所述技術進行。使用微粒轟擊、聚乙二醇介導的DNA攝取或通過硅碳酸酯(siliconcarbonate)纖維技術的植物轉化如由Freeling和Walbot(1993)”Themaizehandbook”ISBN3-540-97826-7，SpringerVerlagNewYork所述。實施例2插入片段供體分子(pENTR)的產生此處所述pENTR構建的目的是為了三個獨立的表達盒提供插入片段供體分子(穿梭系統)，所述三個表達盒作為定向的單個插入片段被導入插入作為載體供體(插入片段受體)的農桿菌雙元載體中。所述pENTR是通過末端帶有特定附著位點的PCR產物進入GATEWAYTM克隆系統的pDONRTM載體(Invitrogen)的BP重組反應產生的。為此目的，通過引入中心NotI位點周圍的一組多克隆位點修飾pDONRTM載體。這使得不僅可以將cDNA導入NotI位點還可以將5’元件和3’元件克隆入周圍的限制位點。2.1多克隆位點的構建第一步是在pUC19載體上建立多克隆位點(MCS)。為此目的，將引物Loy344與引物Loy345退火產生雙鏈銜接子序列。Loy344(SEQIDNO17)5’-p-GTCGACCAGATCTGATATCTGCGGCCGCCTCGAGCATATG-3’Loy345(SEQIDNO18)5’-p-GTCGACCAGATCTGATATCTGCGGCCGCCTCGAGCATATG-3’用XbaI和PstI切割pUC19載體，用Pfu聚合酶將突出端轉化成平末端，并去磷酸化。磷酸化的銜接子連接到載體，導致交替取向。-UNE1KpnISmaIBamHINdeIXhoINotIEcoRVBglIISaHSphIHindIII-UNE2KpnISmaIBamHISalIBglIIEcoRVNotIXhoINdeISphIHindIII產生的載體被分別命名為Lo372-pUC-多聚接頭-UNE1和Lo373-pUC-多聚接頭-UNE2。2.2由Invitrogen提供的pDONRTM載體的修飾Invitrogen載體pDONRTM-P4P1R、pDONRTM221和pDONRTMP2RP3的重組區之外載體骨架中的某些限制性內切核酸酶的切割位點被除去以利于隨后的克隆步驟在pDONRTM-P4P1R和pDONRTMP2RP3中，EcoRV和NotI位點通過用EcoRV和NotI酶切割，用Pfu聚合酶平端化(補平)，并重新連接載體而除去，最終分別形成pDONR-P4P1R-mod(A)和pDONR-P2RP3-mod(C)。在pDONRTM221中，通過EcoRV酶切割，去磷酸化，以及插入大腸桿菌hisA-基因的雙鏈填充序列(5’-ccggtgcaggttggcggcggcgtgcgtagcgaaga-3’；SEQIDNO19)來去除骨架上的EcoRV位點。產生的載體被命名為pDONR221-mod(C)。2.3att-PCR-產物的產生為了擴增所述的新的MCS，設計PCR引物以包括重組附著位點。對Lo372-pUC-多聚接頭-UNE1和Lo373-pUC-多聚接頭-UNE2進行PCR反應。2.3.1attB-PCR-A產物的產生Lo372-pUC-多聚接頭-UNE1和Lo373-pUC-多聚接頭-UNE2分別用以下序列擴增1)引物Loy413-attB4*fwd-a和Loy414-attB1*rev-a2)Loy447-attB4*fwd-a-inv和Loy448-attB1*rev-a-inv產生的兩種PCR產物分別重組入經修飾的pDONR載體Lo347-pDONR-P2R-P3-mod(A)，得到在下文表1所示的四種pENTR載體。Loy413-attB4*fwd-a(SEQIDNO20)5’-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGGTACCCGGGGATCCTCTA-3’Loy414-attB1*rev-a(SEQIDNO21)5’-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGCCATGATTACGCCAAGCTTGCA-3’Loy447-attB4*fwd-a-inv(SEQIDNO22)5’-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGCCATGATTACGCCAAGCTTGCA-3’Loy448-attB1*rev-a-inv(SEQIDNO23)5’-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGGGTACCCGGGGATCCTCTA-3’2.3.2attB-PCR-B產物的產生Lo372-pUC-多聚接頭-UNE1和Lo373-pUC-多聚接頭-UNE2被分別用以下引物擴增1)引物Loy415-attB1*-fwd-b和Loy416-attB2rev-b2)引物Loy449-attB1*fwd-b-inv和Loy450-attB2rev-b-inv產生的兩種PCR產物分別重組入修飾的pDONR載體Lo351-pDONR221-mod(B)，得到在下文表1所示的四種pENTR載體。Loy415-attB1*-fwd-b(SEQIDNO24)5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGGTACCCGGGGATCCTCTA-3’Loy416-attB2*rev-b(SEQIDNO25)5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCATGATTACGCCAAGCTTGCA-3’引物Loy449-attB1*fwd-b-inv(SEQIDNO26)5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGATTACGCCAAGCTTGCA-3’Loy450-attB2*rev-b-inv(SEQIDNO27)5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGGTACCCGGGGATCCTCTA-3’2.3.3attB-PCR-C產物的產生Lo372-pUC-多聚接頭-UNE1和Lo373-pUC-多聚接頭-UNE2分別用以下引物擴增3)引物Loy417-attB2*fwd-c和Loy418-attB3rev-c4)引物Loy451-attB2*fwd-c-inv和Loy452-attB3rev-c-inv產生的兩種PCR產物分別重組入修飾的pDONR載體Lo348-pDONR-P4P1R-mod(C)，得到在下文表1所示的四種pENTR載體。Loy417-attB2*fwd-c(SEQIDNO28)5’-GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGGGTACCCGGGGATCCTCTA-3’Loy418-attB3*rev-c(SEQIDNO29)5’-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGCCATGATTACGCCAAGCTTGCA-3’Loy451-attB2*fwd-c-inv(SEQIDNO30)5’-GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGCCATGATTACGCCAAGCTTGCA-3’Loy452-attB3*rev-c-inv(SEQIDNO31)5’-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGGGTACCCGGGGATCCTCTA-3’2.4用新的MCS產生一組pENTR為產生pENTR載體，由以上2.3中獲得的PCR產物(包含側翼為附著邊的多克隆位點，所述附著邊用于與修飾的pDONR載體進行BP反應)在如下表1所示個各自經修飾的pDONR載體中重組。根據制造商(Invitrogen)的說明書進行重組反應。表1用于表達盒插入的多種pENTR載體構建體的概括。修飾的pDONR載體(離析物1)與側翼帶有重組位點(離析物2)的多克隆位點(分別是UNE1或2)重組，產生多種pENTR載體(產物)，其包含側翼為多克隆位點的所示重組位點。3.提供插入片段供體分子3.1pENTR-A-USP∷NAN∷A7t的克隆由未知種子蛋白質(蠶豆(Viciafaba))的USP啟動子、NAN報告基因(產氣英膜梭菌(Clostridiumperfringens)的nanH的密碼子優化形式，KirbyJ等人(2002)PlantJ.32(3)391-400；WO03/052104)和A7t終止子(HirtH等人(1990)CurrGenet17473-479；源自載體pCAMBIA-1300；GenBankAcc.-No.AF234296)組成的表達盒被插入Lo375-pENTR-A2，產生pENTR-A-USP∷NAN∷A7t載體(SEQIDNO44)。3.2pENTR-B-L1-LuFad3-GUS-E9-L2的克隆將由亞麻啟動子Fad3(GenBankAcc.-No.AX771967；來自WO02/102970的序列11)、GUS(葡糖醛酸糖苷酶)基因和E9終止子(來自豌豆RUBP小亞基的終止子；GenbankAcc.-No.X00806)組成的表達盒插入Lo394-pENTR-A1-inv，產生pENTR-B-L1-LuFad3-GUS-E9-L2(SEQIDNO45)。3.3pENTR-C-R2-LeB4-700∷GFP∷LeB3t-L3的克隆將由蠶豆LeB4-700啟動子、綠色熒光蛋白質GFP5er的Aequoreavictoria基因和蠶豆豆球蛋白B3終止子組成的表達盒插入Lo394-pENTR-A，產生pENTR-C-R2-LeB4-700∷GFP∷LeB3t-L3(SEQIDNO46)。4.提供插入片段受體(載體供體)分子4.1雙元植物轉化pDEST、pSUN2-GWR4R3的克隆使用引物Lo277和Lo278經由PCR擴增在GatewayTM附著位點R4和R3側翼的DNA片段。Loy277attR4*EcoRV(SEQIDNO47)5′-AAAAAAGATATCGATTACGCCAAGCTATCAACT-3’Loy278attR3*EcoRV(SEQIDNO48)5′-AAAAAAGATATCCGGCCAGTGAATTATCAACT-3’將該DNA片段插入pTopo，產生pTopoR4R3。用HindIII/EcoRI切開雙元載體pSUN2，用Pfu聚合酶反應補平產生平端DNA。通過EcoRV消化從pTOPOR4R3分離出含有側翼為附著位點的DNA區的DNA片段，并連接到線性化的pSUN2載體片段。產生的目的載體被命名為Lo338-pSUN2-GW-R4R3(SEQIDNO49)和Lo339-pSUN2-GW-R3R4(插入片段的反方向；SEQIDNO50)。這些載體含有ccdB反選擇標記并將對標準大腸桿菌菌株(如DH5α)產生毒性影響。因此，這些質粒必須在大腸桿菌菌株如DB2或DB3.1中轉化和增殖。DB2或DB3.1細胞含有gyrA462突變，因而對旋轉酶抑制劑ccdB不敏感。5.用于產生雙元表達載體pSUN2-GW-R3R4的LR反應使用LRClonaseTMPlus-Enzym(Invitrogen)，用質粒pENTR-C-R2-LeB4-700∷GFP5er∷LeB3t-attL3、pENTR-B-L1-E9-Gus-LuFad3-L2、pENTR-A-L4-USP∷NAN∷A7t-R1、pSUN2-GW-R3R4進行LR重組反應。根據廠商指南進行重組酶反應。簡言之，將酶和緩沖液保持在-80℃直至準備用于LR反應。LR反應所用質粒(pENTR和pDEST)用TE緩沖液稀釋至所需終濃度(20-25fmol質粒/LR反應；不應超過最大濃度30fmol/質粒，在LR反應中存在的DNA總量應少于250ngDNA)。使用DNA(質粒)大小可以計算對應于將用的摩爾量的μg量按照下表所示順序準備LR反應。將所述LR-ClonaseTM-酶混合物置于干冰上運輸。使用時將LR混合物在冰上解凍約2分鐘，并溫和渦旋2秒。向每個反應管加入4μlLRClonaseTM混合物，溫和渦旋2次，每次2秒，并在25℃溫育過夜(16小時)(小臺式培養箱足夠)。加入2μl蛋白酶K(2μg/μl)終止反應，并在37℃溫育10分鐘。2μl的反應混合物用于轉化大腸桿菌DH5α細胞。在含有合適的選擇標記的LB培養基上平板接種轉化的細胞。對于pSUN2衍生物，選擇標記是鏈霉素(100μg/ml)。由于DH5α是ccdB敏感菌株，所以僅含有基于載體供體分子的質粒但由于與插入片段的重組介導的置換而缺少所述分子的ccdB片段的大腸桿菌菌落可以生長。挑取一些菌落過夜培養用于克隆分析。根據標準手冊制備質粒DNA。通過對克隆徹底的限制性分析和測序驗證多表達盒的正確組裝。產生的產物為pSUN2-B4-USP-NAN-pa7-E9-GUS-FAD3-LeB4-GFP-LeB3(SEQIDNO51)。序列表<110>巴斯福植物科學有限公司<120>組裝多表達構建體的方法<130>AE20040296<160>67<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>25<212>DNA<213>重組位點m-att<220><221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>B＝C，G或T/U<400>1rkycwgctttyktrtacnaastsgb25<210>2<211>25<212>DNA<213>重組位點m-attB<220><221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>B＝C，G或T/U<400>2agccwgctttyktrtacnaactsgb25<210>3<211>25<212>DNA<213>重組位點m-attR<220><221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>B＝C，G或T/U<400>3gttcagctttcktrtacnaactsgb25<210>4<211>25<212>DNA<213>重組位點m-attL<220><221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>B＝C，G或T/U<400>4agccwgctttcktrtacnaagtsgb25<210>5<211>25<212>DNA<213>重組位點m-attP1<220><221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>B＝C，G或T/U<400>5gttcagctttyktrtacnaagtsgb25<210>6<211>25<212>DNA<213>重組位點attB1<400>6agcctgcttttttgtacaaacttgt25<210>7<211>25<212>DNA<213>重組位點attB2<400>7agcctgctttcttgtacaaacttgt25<210>8<211>25<212>DNA<213>重組位點attB3<400>8acccagctttcttgtacaaacttgt25<210>9<211>25<212>DNA<213>重組位點attR1<400>9gttcagcttttttgtacaaacttgt25<210>10<211>25<212>DNA<213>重組位點attR2<400>10gttcagctttcttgtacaaacttgt25<210>11<211>25<212>DNA<213>重組位點attR3<400>11gttcagctttcttgtacaaagttgg25<210>12<211>25<212>DNA<213)重組位點attL1<400>12agcctgcttttttgtacaaagttgg25<210>13<211>25<212>DNA<213>重組位點attL2<400>13agcctgctttcttgtacaaagttgg25<210>14<211>25<212>DNA<213>重組位點attL3<400>14acccagctttcttgtacaaagttgg25<210>15<211>25<212>DNA<213>重組位點attP1<400>15gttcagcttttttgtacaaagttgg25<210>16<211>25<212>DNA<213>重組位點attP2，P3<400>16gttcagctttcttgtacaaagttgg25<210>17<211>40<212>DNA<213>磷酸化的寡核苷酸Loy344<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>5’-磷酸化的<400>17gtcgaccagatctgatatctgcggccgcctcgagcatatg40<210>18<211>40<212>DNA<213>磷酸化的寡核苷酸Loy345<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>5’-磷酸化的<400>18gtcgaccagatctgatatctgcggccgcctcgagcatatg40<210>19<211>35<212>DNA<213>大腸桿菌hisA-基因的雙鏈填充片段<400>19ccggtgcaggttggcggcggcgtgcgtagcgaaga35<210>20<211>45<212>DNA<213>寡核苷酸引物Loy413-attB4*fwd-a<400>20ggggacaactttgtatagaaaagttgggtacccggggatcctcta45<210>21<211>48<212>DNA<213>寡核苷酸引物Loy414-attB1*rev-a<400>21ggggactgcttttttgtacaaacttgccatgattacgccaagcttgca48<210>22<211>48<212>DNA<213>寡核苷酸引物Loy447-attB4*fwd-a-inv<400>22ggggacaactttgtatagaaaagttgccatgattacgccaagcttgca48<210>23<211>45<212>DNA<213>寡核苷酸引物Loy448-attB1*rev-a-inv<400>23ggggactgcttttttgtacaaacttgggtacccggggatcctcta45<210>24<211>48<212>DNA<213>寡核苷酸引物Loy415-attB1*-fwd-b<400>24ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctggtacccggggatcctcta48<210>25<211>51<212>DNA<213>寡核苷酸引物Loy416-attB2*rev-b<400>25ggggaccactttgtacaagaaagctgggtccatgattacgccaagcttgca51<210>26<211>51<212>DNA<213>寡核苷酸引物Loy449-attB1*fwd-b-inv<400>26ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccatgattacgccaagcttgca51<210>27<211>48<212>DNA<213>寡核苷酸引物Loy450-attB2*rev-b-inv<400>27ggggaccactttgtacaagaaagctgggtggtacccggggatcctcta48<210>28<211>45<212>DNA<213>寡核苷酸引物Loy417-attB2*fwd-c<400>28ggggacagctttcttgtacaaagtggggtacccggggatcctcta45<210>29<211>48<212>DNA<213>寡核苷酸引物Loy418-attB3*rev-c<400>29ggggacaactttgtataataaagttgccatgattacgccaagcttgca48<210>30<211>48<212>DNA<213>寡核苷酸引物Loy451-attB2*fwd-c-inv<400>30ggggacagctttcttgtacaaagtggccatgattacgccaagcttgca48<210>31<211>45<212>DNA<213>寡核苷酸引物Loy452-attB3*rev-c-inv<400>31ggggacaactttgtataataaagttgggtacccggggatcctcta45<210>32<211>2724<212>DNA<213>插入片段供體分子載體Lo391-pENTR-A1<220><221>終止子<222>(268)..(295)<223>comp1ementrrnb\T2\轉錄\終止<220><221>終止子<222>(427)..(470)<223>complementrrnb\T1\轉錄\終止<220><221>misc_feature<222>(593)..(687)<223>attL4*重組位點<220><221>misc_feature<222>(775)..(931)<223>complementattR1*重組位點<220><221>misc_feature<222>(1118)..(1927)<223>CDS編碼卡那霉素抗性<220><221>misc_feature<222>(2048)..(2721)<223>pUC起點<400>32ctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctga60taccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaaga120gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggca180cgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatacgcgtaccgc240tagccaggaagagtttgtagaaacgcaaaaaggccatccgtcaggatggccttctgctta300gtttgatgcctggcagtttatggcgggcgtcctgcccgccaccctccgggccgttgcttc360acaacgttcaaatccgctcccggcggatttgtcctactcaggagagcgttcaccgacaaa420caacagataaaacgaaaggcccagtcttccgactgagcctttcgttttatttgatgcctg480gcagttccctactctcgcgttaacgctagcatggatgttttcccagtcacgacgttgtaa540aacgacggccagtcttaagctcgggcccgagttaacgctaccatggagctccaaataatg600attttattttgactgatagtgacctgttcgttgcaacaaattgataagcaatgctttttt660ataatgccaactttgtatagaaaagttgggtacccggggatcctctagcatatgctcgag720gcggccgcagatatcagatctggtcgacggcatgcaagcttggcgtaatcatggcaagtt780tgtacaaaaaagttgaacgagaaacgtaaaatgatataaatatcaatatattaaattaga840ttttgcataaaaaacagactacataatactgtaaaacacaacatatgcagtcactatgaa900ccaactacttagatggtattagtgacctgtagaattcgagctctagagctgcagggcggc960catcccctatagtgagtcgtattacatggtcatagctgtttcctggcagctctggcccgt1020gtctcaaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatcatgaacaataaa1080actgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaac1140gtcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcg1200cgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgcttgtatgggaagcccgatgcgcc1260agagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggt1320cagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtac1380tcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccggaaaaacagcattccaggtatt1440agaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccg1500gttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgc1560tcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcg1620taatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaacttttgccattctcacc1680ggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaa1740attaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgc1800catcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaa1860atatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtt1920tttctaatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttgacg1980ggacggcgcaagctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttacgcgtcgttccactgagc2040gtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaat2100ctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaaga2160gctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgt2220tcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacata2280cctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttac2340cgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacgggggg2400ttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcg2460tgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaag2520cggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatct2580ttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtc2640aggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggcctt2700ttgctggccttttgctcacatgtt2724<210>33<211>2665<212>DNA<213>插入片段供體分子載體Lo392-pENTR-B1<220><221>終止子<222>(268)..(295)<223>complementrrnB\T2\轉錄\終止<220><221>終止子<222>(427)..(470)<223>complementrrnB\T1\轉錄\終止<220><221>misc_feature<222>(569)..(668)<223>attL1*重組位點<220><221>misc_feature<222>(755)..(853)<223>complementattL2*重組位點<220><221>misc_feature<222>(1059)..(1868)<223>CDS編碼卡那霉素抗性<220><221>misc_feature<222>(1989)..(2662)<223>pUC起點<400>33ctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctga60taccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaaga120gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggca180cgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatacgcgtaccgc240tagccaggaagagtttgtagaaacgcaaaaaggccatccgtcaggatggccttctgctta300gtttgatgcctggcagtttatggcgggcgtcctgcccgccaccctccgggccgttgcttc360acaacgttcaaatccgctcccggcggatttgtcctactcaggagagcgttcaccgacaaa420caacagataaaacgaaaggcccagtcttccgactgagcctttcgttttatttgatgcctg480gcagttccctactctcgcgttaacgctagcatggatgttttcccagtcacgacgttgtaa540aacgacggccagtcttaagctcgggccccaaataatgattttattttgactgatagtgac600ctgttcgttgcaacaaattgatgagcaatgcttttttataatgccaactttgtacaaaaa660agcaggctggtacccggggatcctctagcatatgctcgaggcggccgcagatatcagatc720tggtcgacggcatgcaagcttggcgtaatcatggacccagctttcttgtacaaagttggc780attataagaaagcattgcttatcaatttgttgcaacgaacaggtcactatcagtcaaaat840aaaatcattatttgccatccagctgatccggtgcaggttggcggcggcgtgcgtagcgaa900gaatcccctatagtgagtcgtattacatggtcatagctgtttcctggcagctctggcccg960tgtctcaaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatcatgaacaataa1020aactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaa1080cgtcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctc1140gcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgcttgtatgggaagcccgatgcgc1200cagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatgg1260tcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgta1320ctcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccggaaaaacagcattccaggtat1380tagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgcc1440ggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcg1500ctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagc1560gtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaacttttgccattctcac1620cggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgagggga1680aattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttg1740ccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaa1800aatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagt1860ttttctaatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttgac1920gggacggcgcaagctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttacgcgtcgttccactgag1980cgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaa2040tctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaag2100agctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactg2160tccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacat2220acctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtctta2280ccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggg2340gttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagc2400gtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaa2460gcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatc2520tttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgt2580caggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggcct2640tttgctggccttttgctcacatgtt2665<210>34<211>2720<212>DNA<213>插入片段供體分子載體Lo393-pENTR-C1<220><221>終止子<222>(268)..(295)<223>complementrrnB\T2\轉錄\終止<220><221>終止子<222>(427)..(470)<223>complementrrnB\T1\轉錄\終止<220><221>misc_feature<222>(591)..(747)<223>attR2*重組位點<220><221>misc_feature<222>(834)..(929)<223>complementattL3*重組位點<220><221>misc_feature<222>(1114)..(1923)<223>CDS編碼卡那霉素抗性<220><221>misc_feature<222>(2044)..(2717)<223>pUC起點<40D>34ctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctga60taccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaaga120gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggca180cgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatacgcgtaccgc240tagccaggaagagtttgtagaaacgcaaaaaggccatccgtcaggatggccttctgctta300gtttgatgcctggcagtttatggcgggcgtcctgcccgccaccctccgggccgttgcttc360acaacgttcaaatccgctcccggcggatttgtcctactcaggagagcgttcaccgacaaa420caacagataaaacgaaaggcccagtcttccgactgagcctttcgttttatttgatgcctg480gcagttccctactctcgcgttaacgctagcatggatgttttcccagtcacgacgttgtaa540aacgacggccagtcttaagctcgggccctgcagctctagagctcgaattctacaggtcac600taataccatctaagtagttggttcatagtgactgcatatgttgtgttttacagtattatg660tagtctgttttttatgcaaaatctaatttaatatattgatatttatatcattttacgttt720ctcgttcaactttcttgtacaaagtggggtacccggggatcctctagcatatgctcgagg780cggccgcagatatcagatctggtcgacggcatgcaagcttggcgtaatcatggcaacttt840attatacaaagttggcattataaaaaagcattgcttatcaatttgttgcaacgaacaggt900cactatcagtcaaaataaaatcattatttggagctccatggtagcgttaacgcggccatc960ccctatagtgagtcgtattacatggtcatagctgtttcctggcagctctggcccgtgtct1020caaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatcatgaacaataaaactg1080tctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcg1140aggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgat1200aatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgcttgtatgggaagcccgatgcgccagag1260tgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcaga1320ctaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcct1380gatgatgcatggttactcaccactgcgatccccggaaaaacagcattccaggtattagaa1440gaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttg1500cattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcag1560gcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaat1620ggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaacttttgccattctcaccggat1680tcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaatta1740ataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatc1800ctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatat1860ggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttc1920taatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttgacgggac1980ggcgcaagctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttacgcgtcgttccactgagcgtca2040gaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgc2100tgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagcta2160ccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttctt2220ctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctc2280gctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg2340ttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcg2400tgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgag2460ctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggc2520agggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttat2580agtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggg2640gggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgc2700tggccttttgctcacatgtt2720<210>35<211>2724<212>DNA<213>插入片段供體分子載體Lo394-pENTR-A1-inv<220><221>終止子<222>(268)..(295)<223>complementrrnB\T2\轉錄\終止<220><221>終止子<222>(427)..(470)<223>complementrrnB\T1\轉錄\終止<220><221>misc_feature<222>(593)..(687)<223>attL4*重組位點<220><221>misc_feature<222>(775)..(931)<223>complementattR1*重組位點<220><221>misc_feature<222>(1118)..(1927)<223>CDS編碼卡那霉素抗性<220><221>misc_feature<222>(2048)..(2721)<223>pUC起點<400>35ctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctga60taccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaaga120gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggca180cgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatacgcgtaccgc240tagccaggaagagtttgtagaaacgcaaaaaggccatccgtcaggatggccttctgctta300gtttgatgcctggcagtttatggcgggcgtcctgcccgccaccctccgggccgttgcttc360acaacgttcaaatccgctcccggcggatttgtcctactcaggagagcgttcaccgacaaa420caacagataaaacgaaaggcccagtcttccgactgagcctttcgttttatttgatgcctg480gcagttccctactctcgcgttaacgctagcatggatgttttcccagtcacgacgttgtaa540aacgacggccagtcttaagctcgggcccgagttaacgctaccatggagctccaaataatg600attttattttgactgatagtgacctgttcgttgcaacaaattgataagcaatgctttttt660ataatgccaactttgtatagaaaagttgccatgattacgccaagcttgcatgccgtcgac720cagatctgatatctgcggccgcctcgagcatatgctagaggatccccgggtacccaagtt780tgtacaaaaaagttgaacgagaaacgtaaaatgatataaatatcaatatattaaattaga840ttttgcataaaaaacagactacataatactgtaaaacacaacatatgcagtcactatgaa900ccaactacttagatggtattagtgacctgtagaattcgagctctagagctgcagggcggc960catcccctatagtgagtcgtattacatggtcatagctgtttcctggcagctctggcccgt1020gtctcaaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatcatgaacaataaa1080actgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaac1140gtcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcg1200cgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgcttgtatgggaagcccgatgcgcc1260agagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggt1320cagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtac1380tcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccggaaaaacagcattccaggtatt1440agaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccg1500gttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgc1560tcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcg1620taatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaacttttgccattctcacc1680ggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaa1740attaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgc1800catcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaa1860atatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtt1920tttctaatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttgacg1980ggacggcgcaagctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttacgcgtcgttccactgagc2040gtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaat2100ctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaaga2160gctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgt2220tcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacata2280cctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttac2340cgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacgggggg2400ttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcg2460tgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaag2520cggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatct2580ttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtc2640aggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggcctt2700ttgctggccttttgctcacatgtt2724<210>36<211>2665<212>DNA<213>插入片段供體分子載體Lo395-pENTR-B1-inv<220><221>終止子<222>(268)..(295)<223>complementrrnB\T2\轉錄\終止<220><221>終止子<222>(427)..(470)<223>complementrrnB\T1\轉錄\終止<220><221>misc_feature<222>(569)..(668)<223>attL1*重組位點<220><221>misc_feature<222>(755)..(853)<223>complementattL2*重組位點<220><221>misc_feature<222>(1059)..(1868)<223>CDS編碼卡那霉素抗性<220><221>misc_feature<222>(1989)..(2662)<223>pUC起點<400>36ctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctga60taccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaaga120gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggca180cgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatacgcgtaccgc240tagccaggaagagtttgtagaaacgcaaaaaggccatccgtcaggatggccttctgctta300gtttgatgcctggcagtttatggcgggcgtcctgcccgccaccctccgggccgttgcttc360acaacgttcaaatccgctcccggcggatttgtcctactcaggagagcgttcaccgacaaa420caacagataaaacgaaaggcccagtcttccgactgagcctttcgttttatttgatgcctg480gcagttccctactctcgcgttaacgctagcatggatgttttcccagtcacgacgttgtaa540aacgacggccagtcttaagctcgggccccaaataatgattttattttgactgatagtgac600ctgttcgttgcaacaaattgatgagcaatgcttttttataatgccaactttgtacaaaaa660agcaggctccatgattacgccaagcttgcatgccgtcgaccagatctgatatctgcggcc720gcctcgagcatatgctagaggatccccgggtaccacccagctttcttgtacaaagttggc780attataagaaagcattgcttatcaatttgttgcaacgaacaggtcactatcagtcaaaat840aaaatcattatttgccatccagctgatccggtgcaggttggcggcggcgtgcgtagcgaa900gaatcccctatagtgagtcgtattacatggtcatagctgtttcctggcagctctggcccg960tgtctcaaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatcatgaacaataa1020aactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaa1080cgtcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctc1140gcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgcttgtatgggaagcccgatgcgc1200cagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatgg1260tcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgta1320ctcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccggaaaaacagcattccaggtat1380tagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgcc1440ggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcg1500ctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagc1560gtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaacttttgccattctcac1620cggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgagggga1680aattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttg1740ccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaa1800aatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagt1860ttttctaatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttgac1920gggacggcgcaagctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttacgcgtcgttccactgag1980cgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaa2040tctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaag2100agctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactg2160tccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacat2220acctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtctta2280ccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggg2340gttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagc2400gtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaa2460gcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatc2520tttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgt2580caggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggcct2640tttgctggccttttgctcacatgtt2665<210>37<211>2720<212>DNA<213>插入片段供體分子載體Lo396-pENTR-Cl-inv<220><221>終止子<222>(268)..(295)<223>complementrrnB\T2\轉錄\終止<220><221>終止子<222>(427)..(470)<223>complementrrnB\T1\轉錄\終止<220><221>misc_feature<222>(591)..(747)<223>attR2*重組位點<220><221>misc_feature<222>(834)..(929)<223>complementattL3*重組位點<220><221>misc_feature<222>(1114)..(1923)<223>CDS編碼卡那霉素抗性<220><221>misc_feature<222>(2044)..(2717)<223>pUC起點<400>37ctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctga60taccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaaga120gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggca180cgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatacgcgtaccgc240tagccaggaagagtttgtagaaacgcaaaaaggccatccgtcaggatggccttctgctta300gtttgatgcctggcagtttatggcgggcgtcctgcccgccaccctccgggccgttgcttc360acaacgttcaaatccgctcccggcggatttgtcctactcaggagagcgttcaccgacaaa420caacagataaaacgaaaggcccagtcttccgactgagcctttcgttttatttgatgcctg480gcagttccctactctcgcgttaacgctagcatggatgttttcccagtcacgacgttgtaa540aacgacggccagtcttaagctcgggccctgcagctctagagctcgaattctacaggtcac600taataccatctaagtagttggttcatagtgactgcatatgttgtgttttacagtattatg660tagtctgttttttatgcaaaatctaatttaatatattgatatttatatcattttacgttt720ctcgttcaactttcttgtacaaagtggccatgattacgccaagcttgcatgccgtcgacc780agatctgatatctgcggccgcctcgagcatatgctagaggatccccgggtacccaacttt840attatacaaagttggcattataaaaaagcattgcttatcaatttgttgcaacgaacaggt900cactatcagtcaaaataaaatcattatttggagctccatggtagcgttaacgcggccatc960ccctatagtgagtcgtattacatggtcatagctgtttcctggcagctctggcccgtgtct1020caaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatcatgaacaataaaactg1080tctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcg1140aggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgat1200aatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgcttgtatgggaagcccgatgcgccagag1260ttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcaga1320ctaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcct1380gatgatgcatggttactcaccactgcgatccccggaaaaacagcattccaggtattagaa1440gaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttg1500cattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcag1560gcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaat1620ggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaacttttgccattctcaccggat1680tcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaatta1740ataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatc1800ctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatat1860ggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttc1920taatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttgacgggac1980ggcgcaagctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttacgcgtcgttccactgagcgtca2040gaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgc2100tgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagcta2160ccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttctt2220ctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctc2280gctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg2340ttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcg2400tgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgag2460ctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggc2520agggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttat2580agtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggg2640gggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgc2700tggccttttgctcacatgtt2720<210>38<211>2724<212>DNA<213>插入片段供體分子載體Lo375-pENTR-A2<220><221>終止子<222>(268)..(295)<223>complementrrnB\T2\轉錄\終止<220><221>終止子<222>(427)..(470)<223>complementrrnB\T1\轉錄\終止<220><221>misc_feature<222>(593)..(687)<223>attL4*重組位點<220><221>misc_feature<222>(775)..(931)<223>complementattR1*重組位點<220><221>misc_feature<222>(1118)..(1927)<223>CDS編碼卡那霉素抗性<220><221>misc_feature<222>(2048)..(2721)<223>pUC起點<400>38ctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctga60taccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaaga120gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggca180cgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatacgcgtaccgc240tagccaggaagagtttgtagaaacgcaaaaaggccatccgtcaggatggccttctgctta300gtttgatgcctggcagtttatggcgggcgtcctgcccgccaccctccgggccgttgcttc360acaacgttcaaatccgctcccggcggatttgtcctactcaggagagcgttcaccgacaaa420caacagataaaacgaaaggcccagtcttccgactgagcctttcgttttatttgatgcctg480gcagttccctactctcgcgttaacgctagcatggatgttttcccagtcacgacgttgtaa540aacgacggccagtcttaagctcgggcccgagttaacgctaccatggagctccaaataatg600attttattttgactgatagtgacctgttcgttgcaacaaattgataagcaatgctttttt660ataatgccaactttgtatagaaaagttgggtacccggggatcctctaggtcgaccagatc720tgatatctgcggccgcctcgagcatatgggcatgcaagcttggcgtaatcatggcaagtt780tgtacaaaaaagttgaacgagaaacgtaaaatgatataaatatcaatatattaaattaga840ttttgcataaaaaacagactacataatactgtaaaacacaacatatgcagtcactatgaa900ccaactacttagatggtattagtgacctgtagaattcgagctctagagctgcagggcggc960catcccctatagtgagtcgtattacatggtcatagctgtttcctggcagctctggcccgt1020gtctcaaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatcatgaacaataaa1080actgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaac1140gtcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcg1200cgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgcttgtatgggaagcccgatgcgcc1260agagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggt1320cagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtac1380tcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccggaaaaacagcattccaggtatt1440agaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccg1500gttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgc1560tcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcg1620taatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaacttttgccattctcacc1680ggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaa1740attaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgc1800catcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaa1860atatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtt1920tttctaatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttgacg1980ggacggcgcaagctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttacgcgtcgttccactgagc2040gtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaat2100ctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaaga2160gctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgt2220tcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacata2280cctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttac2340cgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacgggggg2400ttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcg2460tgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaag2520cggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatct2580ttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtc2640aggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggcctt2700ttgctggccttttgctcacatgtt2724<210>39<211>2665<212>DNA<213>插入片段供體分子載體Lo376-pENTR-B2<220><221>終止子<222>(268)..(295)<223>complementrrnB\T2\轉錄\終止<220><221>終止子<222>(427)..(470)<223>complementrrnB\T1\轉錄\終止<220><221>misc_feature<222>(569)..(668)<223>attL1*重組位點<220><221>misc_feature<222>(755)..(853)<223>complementattL2*重組位點<220><221>misc_feature<222>(1059)..(1868)<223>CDS編碼卡那霉素抗性<220><221>misc_feature<222>(1989)..(2662)<223>pUC起點<400>39ctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctga60taccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaaga120gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggca180cgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatacgcgtaccgc240tagccaggaagagtttgtagaaacgcaaaaaggccatccgtcaggatggccttctgctta300gtttgatgcctggcagtttatggcgggcgtcctgcccgccaccctccgggccgttgcttc360acaacgttcaaatccgctcccggcggatttgtcctactcaggagagcgttcaccgacaaa420caacagataaaacgaaaggcccagtcttccgactgagcctttcgttttatttgatgcctg480gcagttccctactctcgcgttaacgctagcatggatgttttcccagtcacgacgttgtaa540aacgacggccagtcttaagctcgggccccaaataatgattttattttgactgatagtgac600ctgttcgttgcaacaaattgatgagcaatgcttttttataatgccaactttgtacaaaaa660agcaggctggtacccggggatcctctaggtcgaccagatctgatatctgcggccgcctcg720agcatatgggcatgcaagcttggcgtaatcatggacccagctttcttgtacaaagttggc780attataagaaagcattgcttatcaatttgttgcaacgaacaggtcactatcagtcaaaat840aaaatcattatttgccatccagctgatccggtgcaggttggcggcggcgtgcgtagcgaa900gaatcccctatagtgagtcgtattacatggtcatagctgtttcctggcagctctggcccg960tgtctcaaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatcatgaacaataa1020aactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaa1080cgtcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctc1140gcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgcttgtatgggaagcccgatgcgc1200cagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatgg1260tcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgta1320ctcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccggaaaaacagcattccaggtat1380tagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgcc1440ggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcg1500ctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagc1560gtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaacttttgccattctcac1620cggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgagggga1680aattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttg1740ccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaa1800aatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagt1860ttttctaatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttgac1920gggacggcgcaagctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttacgcgtcgttccactgag1980cgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaa2040tctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaag2100agctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactg2160ttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacat2220acctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtctta2280ccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggg2340gttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagc2400gtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaa2460gcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatc2520tttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgt2580caggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggcct2640tttgctggccttttgctcacatgtt2665<210>40<211>2720<212>DNA<213>插入片段供體分子載體Lo377-pENTR-C2<220><221>終止子<222>(268)..(295)<223>complementrrnB\T2\轉錄\終止<220><221>終止子<222>(427)..(470)<223>complementrrnB\T1\轉錄\終止<220><221>misc_feature<222>(591)..(747)<223>attR2*重組位點<220><221>misc_feature<222>(834)..(929)<223>complementattL3*重組位點<220><221>misc_feature<222>(1114)..(1923)<223>CDS編碼卡那霉素抗性<220><221>misc_feature<222>(2044)..(2717)<223>pUC起點<400>40ctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctga60taccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaaga120gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggca180cgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatacgcgtaccgc240tagccaggaagagtttgtagaaacgcaaaaaggccatccgtcaggatggccttctgctta300gtttgatgcctggcagtttatggcgggcgtcctgcccgccaccctccgggccgttgcttc360acaacgttcaaatccgctcccggcggatttgtcctactcaggagagcgttcaccgacaaa420caacagataaaacgaaaggcccagtcttccgactgagcctttcgttttatttgatgcctg480gcagttccctactctcgcgttaacgctagcatggatgttttcccagtcacgacgttgtaa540aacgacggccagtcttaagctcgggccctgcagctctagagctcgaattctacaggtcac600taataccatctaagtagttggttcatagtgactgcatatgttgtgttttacagtattatg660tagtctgttttttatgcaaaatctaatttaatatattgatatttatatcattttacgttt720ctcgttcaactttcttgtacaaagtggggtacccggggatcctctaggtcgaccagatct780gatatctgcggccgcctcgagcatatgggcatgcaagcttggcgtaatcatggcaacttt840attatacaaagttggcattataaaaaagcattgcttatcaatttgttgcaacgaacaggt900cactatcagtcaaaataaaatcattatttggagctccatggtagcgttaacgcggccatc960ccctatagtgagtcgtattacatggtcatagctgtttcctggcagctctggcccgtgtct1020caaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatcatgaacaataaaactg1080tctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcg1140aggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgat1200aatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgcttgtatgggaagcccgatgcgccagag1260ttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcaga1320ctaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcct1380gatgatgcatggttactcaccactgcgatccccggaaaaacagcattccaggtattagaa1440gaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttg1500cattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcag1560gcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaat1620ggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaacttttgccattctcaccggat1680tcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaatta1740ataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatc1800ctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatat1860ggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttc1920taatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttgacgggac1980ggcgcaagctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttacgcgtcgttccactgagcgtca2040gaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgc2100tgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagcta2160ccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttctt2220ctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctc2280gctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg2340ttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcg2400tgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgag2460ctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggc2520agggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttat2580agtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggg2640gggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgc2700tggccttttgctcacatgtt2720<210>41<211>2724<212>DNA<213>插入片段供體分子載體Lo397-pENTR-A2-inv<220><221>終止子<222>(427)..(470)<223>complementrrnB\T2\轉錄\終止<220><221>終止子<222>(593)..(687)<223>complementrrnB\孔\轉錄\終止<220><221>misc_feature<222>(775)..(931)<223>complementattR1*重組位點<220><221>misc_feature<222>(593)..(687)<223>attL4*重組位點<220><221>misc_feature<222>(1118)..(1927)<223>CDS編碼卡那霉素抗性<220><221>misc_feature<222>(2048)..(2721)<223>pUC起點<400>41ctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctga60taccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaaga120gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggca180cgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatacgcgtaccgc240tagccaggaagagtttgtagaaacgcaaaaaggccatccgtcaggatggccttctgctta300gtttgatgcctggcagtttatggcgggcgtcctgcccgccaccctccgggccgttgcttc360acaacgttcaaatccgctcccggcggatttgtcctactcaggagagcgttcaccgacaaa420caacagataaaacgaaaggcccagtcttccgactgagcctttcgttttatttgatgcctg480gcagttccctactctcgcgttaacgctagcatggatgttttcccagtcacgacgttgtaa540aacgacggccagtcttaagctcgggcccgagttaacgctaccatggagctccaaataatg600attttattttgactgatagtgacctgttcgttgcaacaaattgataagcaatgctttttt660ataatgccaactttgtatagaaaagttgccatgattacgccaagcttgcatgcccatatg720ctcgaggcggccgcagatatcagatctggtcgacctagaggatccccgggtacccaagtt780tgtacaaaaaagttgaacgagaaacgtaaaatgatataaatatcaatatattaaattaga840ttttgcataaaaaacagactacataatactgtaaaacacaacatatgcagtcactatgaa900ccaactacttagatggtattagtgacctgtagaattcgagctctagagctgcagggcggc960catcccctatagtgagtcgtattacatggtcatagctgtttcctggcagctctggcccgt1020gtctcaaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatcatgaacaataaa1080actgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaac1140gtcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcg1200cgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgcttgtatgggaagcccgatgcgcc1260agagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggt1320cagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtac1380tcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccggaaaaacagcattccaggtatt1440agaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccg1500gttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgc1560tcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcg1620taatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaacttttgccattctcacc1680ggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaa1740attaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgc1800catcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaa1860atatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtt1920tttctaatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttgacg1980ggacggcgcaagctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttacgcgtcgttccactgagc2040gtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaat2100ctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaaga2160gctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgt2220tcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacata2280cctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttac2340cgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacgggggg2400ttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcg2460tgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaag2520cggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatct2580ttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtc2640aggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggcctt2700ttgctggccttttgctcacatgtt2724<210>42<211>2667<212>DNA<213>插入片段供體分子載體Lo398-pENTR-B2-inv<220><221>終止子<222>(270)..(297)<223>complementrrnB\T2\轉錄\終止<220><221>終止子<222>(429)..(472)<223>complementrrnB\T1\轉錄\終止<220><221>misc_feature<222>(571)..(670)<223>attL1*重組位點<220><221>misc_feature<222>(757)..(855)<223>complementattL2*重組位點<220><221>misc_feature<222>(1061)..(1870)<223>CDS編碼卡那霉素抗性<400>42ctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctga60taccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaaga120gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctgatg180cacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatacgcgtacc240gctagccaggaagagtttgtagaaacgcaaaaaggccatccgtcaggatggccttctgct300tagtttgatgcctggcagtttatggcgggcgtcctgcccgccaccctccgggccgttgct360tcacaacgttcaaatccgctcccggcggatttgtcctactcaggagagcgttcaccgaca420aacaacagataaaacgaaaggcccagtcttccgactgagcctttcgttttatttgatgcc480tggcagttccctactctcgcgttaacgctagcatggatgttttcccagtcacgacgttgt540aaaacgacggccagtcttaagctcgggccccaaataatgattttattttgactgatagtg600acctgttcgttgcaacaaattgatgagcaatgcttttttataatgccaactttgtacaaa660aaagcaggctccatgattacgccaagcttgcatgcccatatgctcgaggcggccgcagat720atcagatctggtcgacctagaggatccccgggtaccacccagctttcttgtacaaagttg780gcattataagaaagcattgcttatcaatttgttgcaacgaacaggtcactatcagtcaaa840ataaaatcattatttgccatccagctgatccggtgcaggttggcggcggcgtgcgtagcg900aagaatcccctatagtgagtcgtattacatggtcatagctgtttcctggcagctctggcc960cgtgtctcaaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatcatgaacaat1020aaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacggga1080aacgtcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggc1140tcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgcttgtatgggaagcccgatgc1200gccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagat1260ggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccg1320tactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccggaaaaacagcattccaggt1380attagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcg1440ccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtct1500cgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacga1560gcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaacttttgccattctc1620accggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggg1680gaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatct1740tgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttca1800aaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatga1860gtttttctaatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttg1920acgggacggcgcaagctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttacgcgtcgttccactg1980agcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgt2040aatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatca2100agagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatac2160tgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctac2220atacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtct2280taccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggg2340gggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctaca2400gcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggt2460aagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggta2520tctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctc2580gtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggc2640cttttgctggccttttgctcacatgtt2667<210>43<211>2720<212>DNA<213>插入片段供體分子載體Lo399-pENTR-C2-inv<220><221>終止子<222>(268)..(295)<223>complementrrnB\T2\轉錄\終止<220><221>終止子<222>(427)..(470)<223>complementrrnB\T1\轉錄\終止<220><221>misc_feature<222>(591)..(747)<223>attR2*重組位點<220><221>misc_feature<222>(834)..(929)<223>complementattL3*重組位點<220><221>misc_feature<222>(1114)..(1923)<223>CDS編碼卡那霉素抗性<220><221>misc_feature<222>(2044)..(2717)<223>pUC起點<400>43ctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctga60taccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaaga120gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggca180cgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatacgcgtaccgc240tagccaggaagagtttgtagaaacgcaaaaaggccatccgtcaggatggccttctgctta300gtttgatgcctggcagtttatggcgggcgtcctgcccgccaccctccgggccgttgcttc360acaacgttcaaatccgctcccggcggatttgtcctactcaggagagcgttcaccgacaaa420caacagataaaacgaaaggcccagtcttccgactgagcctttcgttttatttgatgcctg480gcagttccctactctcgcgttaacgctagcatggatgttttcccagtcacgacgttgtaa540aacgacggccagtcttaagctcgggccctgcagctctagagctcgaattctacaggtcac600taataccatctaagtagttggttcatagtgactgcatatgttgtgttttacagtattatg660tagtctgttttttatgcaaaatctaatttaatatattgatatttatatcattttacgttt720ctcgttcaactttcttgtacaaagtggccatgattacgccaagcttgcatgcccatatgc780tcgaggcggccgcagatatcagatctggtcgacctagaggatccccgggtacccaacttt840attatacaaagttggcattataaaaaagcattgcttatcaatttgttgcaacgaacaggt900cactatcagtcaaaataaaatcattatttggagctccatggtagcgttaacgcggccatc960ccctatagtgagtcgtattacatggtcatagctgtttcctggcagctctggcccgtgtct1020caaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatcatgaacaataaaactg1080tctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcg1140aggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgat1200aatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgcttgtatgggaagcccgatgcgccagag1260ttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcaga1320ctaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcct1380gatgatgcatggttactcaccactgcgatccccggaaaaacagcattccaggtattagaa1440gaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttg1500cattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcag1560gcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaat1620ggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaacttttgccattctcaccggat1680tcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaatta1740ataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatc1800ctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatat1860ggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttc1920taatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttgacgggac1980ggcgcaagctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttacgcgtcgttccactgagcgtca2040gaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgc2100tgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagcta2160ccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttctt2220ctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctc2280gctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg2340ttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcg2400tgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgag2460ctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggc2520agggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttat2580agtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggg2640gggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgc2700tggccttttgctcacatgtt2720<210>44<211>4832<212>DNA<213>插入片段供體分子pENTR-A-USP∷NAN∷A7t<220><221>終止子<222>(268)..(295)<223>complementrrnB\T2\轉錄\終止<220><221>終止子<222>(427)..(470)<223>complementrrnB\T1\轉錄\終止<220><221>misc_feature<222>(593)..(687)<223>attL4*重組位點<220><221>misc_feature<222>(2883)..(3039)<223>complementattR1*重組位點<220><221>misc_feature<222>(3226)..(4035)<223>CDS編碼卡那霉素抗性<220><221>misc_feature<222>(4156)..(4829)<223>pUC起點<220><221>啟動子<222>(710)..(1388)<223>USP啟動子<220><221>終止子<222>(2624)..(2845)<223>35S\終止子\A7T<220><221>misc_feature<222>(2624)..(2845)<223>CDS編碼NAN報告基因<400>44ctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctga60taccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaaga120gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggca180cgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatacgcgtaccgc240tagccaggaagagtttgtagaaacgcaaaaaggccatccgtcaggatggccttctgctta300gtttgatgcctggcagtttatggcgggcgtcctgcccgccaccctccgggccgttgcttc360acaacgttcaaatccgctcccggcggatttgtcctactcaggagagcgttcaccgacaaa420caacagataaaacgaaaggcccagtcttccgactgagcctttcgttttatttgatgcctg480gcagttccctactctcgcgttaacgctagcatggatgttttcccagtcacgacgttgtaa540aacgacggccagtcttaagctcgggcccgagttaacgctaccatggagctccaaataatg600attttattttgactgatagtgacctgttcgttgcaacaaattgataagcaatgctttttt660ataatgccaactttgtatagaaaagttgggtacccggggatcctcctcgagcaaatttac720acattgccactaaacgtctaaacccttgtaatttgtttttgttttactatgtgtgttatg780tatttgatttgcgataaatttttatatttggtactaaatttataacaccttttatgctaa840cgtttgccaacacttagcaatttgcaagttgattaattgattctaaattatttttgtctt900ctaaatacatatactaatcaactggaaatgtaaatatttgctaatatttctactatagga960gaattaaagtgagtgaatatggtaccacaaggtttggagatttaattgttgcaatgatgc1020atggatggcatatacaccaaacattcaataattcttgaggataataatggtaccacacaa1080gatttgaggtgcatgaacgtcacgtggacaaaaggtttagtaatttttcaagacaacaat1140gttaccacacacaagttttgaggtgcatgcatggatgccctgtggaaagtttaaaaatat1200tttggaaatgatttgcatggaagccatgtgtaaaaccatgacatccacttggaggatgca1260ataatgaagaaaactacaaatttacatgcaactagttatgcatgtagtctatataatgag1320gattttgcaatactttcattcatacacactcactaagttttacacgattataatttcttc1380atagccagcggatctgatatctgcggccgcggcgcgccaattgactagtagggatccgtt1440aacaatgtgtaacaagaacaacaccttcgagaagaacctcgacatctcacacaagcctga1500accacttatcctctttaacaaggataacaacatctggaattctaagtacttcaggattcc1560taacatccagttgcttaatgacggtacaatccttaccttctctgacatcaggtacaacgg1620gcccgatgaccacgcttacattgatatcgcttctgctagatctactgaattcggtaagac1680ctggtcttacaacatcgctatgaagaacaacaggatcgactcaacctactcacgtgtgat1740ggattctaccactgtgatcactaacaccggccggatcattcttatcgctggatcttggaa1800cactaacggaaactgggctatgaccacttctaccagaaggtctgattggtctgtgcagat1860gatctactctgatgacaacggacttacttggtctaacaagatcgatctcactaaggactc1920ttcaaaagtgaagaaccagccttctaacacaattggatggctcggaggtgttggatctgg1980aatcgttatggacgatggaaccatcgttatgcctgctcagatctccttaagagaaaacaa2040cgagaacaactactattcactcatcatatattccaaggataacggcgagacttggactat2100ggggaacaaggtgccgaattccaatacgtccgagaatatggtcattgaactcgacggagc2160attgatcatgtctactaggtacgattactcaggctacagagcggcatacataagtcatga2220cctcgggacaacttgggaaatctacgagccacttaatggcaagattctcacaggcaaagg2280ttccggatgtcaaggatcattcatcaaagccacaacgagcaatggacatcgtattggact2340cattagtgcacctaagaacacaaaaggtgagtacattagagataatatcgccgtctacat2400gatcgattttgacgatctgagcaaaggtgttcaagagatctgcattccatatccagagga2460tggtaacaagctcggtggaggatactcctgtctgagttttaagaacaaccacttgggtat2520tgtttacgaagctaatggtaatatcgagtatcaggacttgacaccatactatagtcttat2580taacaagcagtgagagcctatcgattaattaaggccgcctcgaatcctgaattaacgccg2640aattaattcgggggatctggattttagtactggattttggttttaggaattagaaatttt2700attgatagaagtattttacaaatacaaatacatactaagggtttcttatatgctcaacac2760atgagcgaaaccctataggaaccctaattcccttatctgggaactactcacacattatta2820tggagaaactcgagcttgtcgagattcgagcatatgggcatgcaagcttggcgtaatcat2880ggcaagtttgtacaaaaaagttgaacgagaaacgtaaaatgatataaatatcaatatatt2940aaattagattttgcataaaaaacagactacataatactgtaaaacacaacatatgcagtc3000actatgaaccaactacttagatggtattagtgacctgtagaattcgagctctagagctgc3060agggcggccatcccctatagtgagtcgtattacatggtcatagctgtttcctggcagctc3120tggcccgtgtctcaaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatcatga3180acaataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaa3240cgggaaacgtcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaa3300tgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgcttgtatgggaagccc3360gatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagat3420gagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcatttt3480atccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccggaaaaacagcattc3540caggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttc3600ctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtattt3660cgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgat3720gacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaacttttgcca3780ttctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgac3840gaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccag3900gatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctt3960tttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctc4020gatgagtttttctaatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctg4080acttgacgggacggcgcaagctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttacgcgtcgttc4140cactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctg4200cgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccg4260gatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagatacca4320aatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccg4380cctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcg4440tgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctga4500acggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatac4560ctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtat4620ccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcc4680tggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtga4740tgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttc4800ctggccttttgctggccttttgctcacatgtt4832<210>45<211>6323<212>DNA<213>插入片段供體分子pENTR-B-L1-LuFad3-GUS-E9-L2<220><221>終止子<222>(6042)..(6069)<223>complementrrnB\T2\轉錄\終止<220><221>終止子<222>(6201)..(6244)<223>complementrrnB\T1\轉錄\終止<220><221>misc_feature<222>(20)..(119)<223>attL1*重組位點<220><221>misc_feature<222>(3864)..(3962)<223>complementattL2*重組位點<220><221>primerbind<222>(4039)..(4055)<223>M13\reverse\primer<220><221>misc_feature<222>(4039)..(4055)<223>CDS編碼卡那霉素抗性<220><221>misc_feature<222>(5098)..(5771)<223>pUC起點<220><221>終止子<222>(395)..(685)<223>complementE9\core終止子<220><221>啟動子<222>(2784)..(3849)<223>coplementLuFAD3啟動子<220><221>終止子<222>(120)..(789)<223>complementrbsc\E9\終止子<220><221>misc_feature<222>(886)..(2697)<223>complementGUS報道基因<400>45cagtcttaagctcgggccccaaataatgattttattttgactgatagtgacctgttcgtt60gcaacaaattgatgagcaatgcttttttataatgccaactttgtacaaaaaagcaggctg120gtacccggtcgattgatgcatgttgtcaatcaattggcaagtcataaaatgcattaaaaa180atattttcatactcaactacaaatccatgagtataactataattataaagcaatgattag240aatctgacaaggattctggaaaattacataaaggaaagttcataaatgtctaaaacacaa300gaggacatacttgtattcagtaacatttgcagcttttctaggtctgaaaatatatttgtt360gcctagtgaataagcataatggtacaactacaagtgttttactcctcatattaacttcgg420tcattagaggccacgatttgacacatttttactcaaaacaaaatgtttgcatatctctta480taatttcaaattcaacacacaacaaataagagaaaaaacaaataatattaatttgagaat540gaacaaaaggaccatatcattcattaactcttctccatccatttccatttcacagttcga600tagcgaaaaccgaataaaaaacacagtaaattacaagcacaacaaatggtacaagaaaaa660cagttttcccaatgccataatactcaaactcagtaggattctggtgtgtgcgcaatgaaa720ctgatgcattgaacttgacgaacgttgtcgaaaccgatgatacgaacgaaagctctagct780agaggatcctctagcatatgctcgaggcggccttaattaatcgataggctcggtagcaat840tcccgaggctgtagccgacgatggtgcgccaggagagttgttgattcattgtttgcctcc900ctgctgcggtttttcaccgaagttcatgccagtccagcgtttttgcagcagaaaagccgc960cgacttcggtttgcggtcgcgagtgaagatccctttcttgttaccgccaacgcgcaatat1020gccttgcgaggtcgcaaaatcggcgaaattccatacctgttcaccgacgacggcgctgac1080gcgatcaaagacgcggtgatacatatccagccatgcacactgatactcttcactccacat1140gtcggtgtacattgagtgcagcccggctaacgtatccacgccgtattcggtgatgataat1200cggctgatgcagtttctcctgccaggccagaagttctttttccagtaccttctctgccgt1260ttccaaatcgccgctttggacataccatccgtaataacggttcaggcacagcacatcaaa1320gagatcgctgatggtatcggtgtgagcgtcgcagaacattacattgacgcaggtgatcgg1380acgcgtcgggtcgagtttacgcgttgcttccgccagtggcgcgaaatattcccgtgcacc1440ttgcggacgggtatccggttcgttggcaatactccacatcaccacgcttgggtggttttt1500gtcacgcgctatcagctctttaatcgcctgtaagtgcgcttgctgagtttccccgttgac1560tgcctcttcgctgtacagttctttcggcttgttgcccgcttcgaaaccaatgcctaaaga1620gaggttaaagccgacagcagcagtttcatcaatcaccacgatgccatgttcatctgccca1680gtcgagcatctcttcagcgtaagggtaatgcgaggtacggtaggagttggccccaatcca1740gtccattaatgcgtggtcgtgcaccatcagcacgttatcgaatcctttgccacgcaagtc1800cgcatcttcatgacgaccaaagccagtaaagtagaacggtttgtggttaatcaggaactg1860ttcgcccttcactgccactgaccggatgccgacgcgaagcgggtagatatcacactctgt1920ctggcttttggctgtgacgcacagttcatagagataaccttcacccggttgccagaggtg1980cggattcaccacttgcaaagtcccgctagtgccttgtccagttgcaaccacctgttgatc2040cgcatcacgcagttcaacgctgacatcaccattggccaccacctgccagtcaacagacgc2100gtggttacagtcttgcgcgacatgcgtcaccacggtgatatcgtccacccaggtgttcgg2160cgtggtgtagagcattacgctgcgatggattccggcatagttaaagaaatcatggaagta2220agactgctttttcttgccgttttcgtcggtaatcaccattcccggcgggatagtctgcca2280gttcagttcgttgttcacacaaacggtgatacgtacacttttcccggcaataacatacgg2340cgtgacatcggcttcaaatggcgtatagccgccctgatgctccatcacttcctgattatt2400gacccacactttgccgtaatgagtgaccgcatcgaaacgcagcacgatacgctggcctgc2460ccaacctttcggtataaagacttcgcgctgataccagacgttgcccgcataattacgaat2520atctgcatcggcgaactgatcgttaaaactgcctggcacagcaattgcccggctttcttg2580taacgcgctttcccaccaacgctgatcaattccacagttttcgcgatccagactgaatgc2640ccacaggccgtcgagttttttgatttcacgggttggggtttctacaggacgtaacataag2700ggactgacctacccggggatccgttaacacctaggtacccgggactagtcaattggcgcg2760ccgcggccgcagatatcagatccgtcgtgcagagccacagttttgaagtcactgtaatct2820gcaccaaacaaacccaatatatatttttgaataataatgaatagactgagtggcctttgg2880tttcagcctcacagtatttataaccgaagagtatgtaggttggtgagaactaacgaagaa2940gaagtaatgcaggatgccaagtggatggagaagagtaaatggaaatgcaaaatgtacact3000gatttcagacaaactagcctacaccacccaacccctttttttttgctctttattgggttt3060cagtttaggcaacggttgttgttacttgctctgttgaaagacaaatgaaaaggagccgtt3120gctggctgctaggttcttcaatttcagtatcaatggtggtgggcaaatctttgattcaaa3180cacatggcaacttccttcaatggtatctaggaaacctatgtgcatgcatgagttaccaca3240aatgtgatgatatcaacttattagttcttttaattaaggattagtgatttggcggagtcg3300caacgggcactgctgagttcgcgggagctagggtggaatcgactaatcaactcatgtgac3360tcaagtgggcatcggtcttagggagtaagttcgggcaagtttcgggcagagggatttgtg3420catgtgtttaggatcacaaggggggtattggttgtccttcggtccgagaatgtgaagtac3480gaggtcttccagatgctatgtagtgggttgggaacaaggcagagatatggacgagcttga3540ctttgttttcacaaactgatgatcaaactttgggctccatttgaacttagtcgaaactct3600tacaactctcttgctttgcaatcgaataatagatggattattgaattgcaaagtgaacac3660taatgaaagtgagtgcatagaaaactaaggattaatgatgctgatgatgatgagtgatgc3720tggtaacaactgtggtaaagaatggcactgtaaaggtgaacaaaacatccacccacgtac3780tgatcaataaactttagcagacaatcagaccattttccttttgtttggacccttttgtgg3840gaataagcttggcgtaatcatggacccagctttcttgtacaaagttggcattataagaaa3900gcattgcttatcaatttgttgcaacgaacaggtcactatcagtcaaaataaaatcattat3960ttgccatccagctgatccggtgcaggttggcggcggcgtgcgtagcgaagaatcccctat4020agtgagtcgtattacatggtcatagctgtttcctggcagctctggcccgtgtctcaaaat4080ctctgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatcatgaacaataaaactgtctgct4140tacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcgaggccg4200cgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtc4260gggcaatcaggtgcgacaatctatcgcttgtatgggaagcccgatgcgccagagttgttt4320ctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaac4380tggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgat4440gcatggttactcaccactgcgatccccggaaaaacagcattccaggtattagaagaatat4500cctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcg4560attcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaa4620tcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctgg4680cctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaacttttgccattctcaccggattcagtc4740gtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggt4800tgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatgg4860aactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtatt4920gataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaatca4980gaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttgacgggacggcgca5040agctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttacgcgtcgttccactgagcgtcagacccc5100gtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttg5160caaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaact5220ctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtg5280tagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctg5340ctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggac5400tcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcaca5460cagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcattga5520gaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc5580ggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcct5640gtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcgg5700agcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggcct5760tttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcc5820tttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagc5880gaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcat5940taatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaatt6000aatacgcgtaccgctagccaggaagagtttgtagaaacgcaaaaaggccatccgtcagga6060tggccttctgcttagtttgatgcctggcagtttatggcgggcgtcctgcccgccaccctc6120cgggccgttgcttcacaacgttcaaatccgctcccggcggatttgtcctactcaggagag6180cgttcaccgacaaacaacagataaaacgaaaggcccagtcttccgactgagcctttcgtt6240ttatttgatgcctggcagttccctactctcgcgttaacgctagcatggatgttttcccag6300tcacgacgttgtaaaacgacggc6323<210>46<211>4586<212>DNA<213>插入片段供體分子pENTR-C-R2-LeB4-700∷GFP∷LeB3t-L3<220><221>終止子<222>(268)..(295)<223>complementrrnB\T2\轉錄\終止<220><221>終止子<222>(427)..(470)<223>complementrrnB\T1\轉錄\終止<220><221>misc_feature<222>(591)..(747)<223>attR2*重組位點<220><221>misc_feature<222>(2700)..(2795)<223>complementattL3*重組位點<220><221>misc_feature<222>(2980)..(3789)<223>CDS編碼卡那霉素抗性<220><221>misc_feature<222>(3910)..(4583)<223>PUC起點<220><221>終止子<222>(2372)..(2668)<223>LeB3’UT終止子<220><221>misc_feature<222>(1544)..(2361)<223>CDScodingforGFP\5er報道基因<220><221>啟動子<222>(777)..(1540)<223>LeB4-700啟動子<400>46ctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctga60taccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaaga120gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggca180cgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatacgcgtaccgc240tagccaggaagagtttgtagaaacgcaaaaaggccatccgtcaggatggccttctgctta300gtttgatgcctggcagtttatggcgggcgtcctgcccgccaccctccgggccgttgcttc360acaacgttcaaatccgctcccggcggatttgtcctactcaggagagcgttcaccgacaaa420caacagataaaacgaaaggcccagtcttccgactgagcctttcgttttatttgatgcctg480gcagttccctactctcgcgttaacgctagcatggatgttttcccagtcacgacgttgtaa540aacgacggccagtcttaagctcgggccctgcagctctagagctcgaattctacaggtcac600taataccatctaagtagttggttcatagtgactgcatatgttgtgttttacagtattatg660tagtctgttttttatgcaaaatctaatttaatatattgatatttatatcattttacgttt720ctcgttcaactttcttgtacaaagtggggtacccggggatcctctagcatatgctcgagt780taccatttctttttcctgcatctcaatagtatatagggtatcaaatagtgattatccaaa840cttaaataagttagaggaaacaccaagatatgccatatactctcaaatttgacactatga900ttcaaagttgcacttgcataaaacttattaattcaatagtaaaaccaaacttgtgcgtga960tacagttaaaatgactaaactactaattaaggtccctcccattagtaaataagttatttt1020tttagaaaaagaaaataataaaaagaatgacgagtctatctaaatcatattaacaagtaa1080tacatattgattcattcgatggaggaggccaataattgtagtaaacaagcagtgccgagg1140ttaatatatgctcaagacagtaaataatctaaatgaattaagacagtgatttgcaaagag1200tagatgcagagaagagaactaaagatttgctgctacacgtatataagaatagcaacagat1260attcattctgtctctttgtggaatatggatatctactaatcatcatctatctgtgaagaa1320taaaagaagcggccacaagcgcagcgtcgcacatatgatgtgtatcaaattaggactcca1380tagccatgcatgctgaagaatgtcacacacgttctgtcacacgtgttactctctcactgt1440tctcctcttcctataaatcaccgcgccacagcttctccacttcaccacttcaccacttca1500ctcacaatccttcattagttgtttactatcacagtcacagatccaaggagatataacaat1560gaagactaatctttttctctttctcatcttttcacttctcctatcattatcctcggccga1620attcagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatgg1680tgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacgg1740aaaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacact1800tgtcactactttctcttatggtgttcaatgcttttcaagatacccagatcatatgaagcg1860gcacgacttcttcaagagcgccatgcctgagggatacgtgcaggagaggaccatcttctt1920caaggacgacgggaactacaagacacgtgctgaagtcaagtttgagggagacaccctcgt1980caacaggatcgagcttaagggaatcgatttcaaggaggacggaaacatcctcggccacaa2040gttggaatacaactacaactcccacaacgtatacatcatggccgacaagcaaaagaacgg2100catcaaagccaacttcaagacccgccacaacatcgaagacggcggcgtgcaactcgctga2160tcattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccatta2220cctgtccacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatggtcct2280tcttgagtttgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaacatga2340tgagctttaagagaacggatctggtcgaccgatcctgcaatagaatgttgaggtgaccac2400tttctgtaataaaataattataaaataaatttagaattgctgtagtcaagaacatcagtt2460ctaaaatattaataaagttatggccttttgacatatgtgtttcgataaaaaaatcaaaat2520aaattgagatttattcgaaatacaatgaaagtttgcagatatgagatatgtttctacaaa2580ataataacttaaaactcaactatatgctaatgtttttcttggtgtgtttcatagaaaatt2640gtatccgtttcttagaaaatgctcgtaaggatcggcatgcaagcttggcgtaatcatggc2700aactttattatacaaagttggcattataaaaaagcattgcttatcaatttgttgcaacga2760acaggtcactatcagtcaaaataaaatcattatttggagctccatggtagcgttaacgcg2820gccatcccctatagtgagtcgtattacatggtcatagctgtttcctggcagctctggccc2880gtgtctcaaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatcatgaacaata2940aaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaa3000acgtcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggct3060cgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgcttgtatgggaagcccgatgcg3120ccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatg3180gtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgt3240actcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccggaaaaacagcattccaggta3300ttagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgc3360cggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctc3420gctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgag3480cgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaacttttgccattctca3540ccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgagggg3600aaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatctt3660gccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaa3720aaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgag3780tttttctaatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttga3840cgggacggcgcaagctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttacgcgtcgttccactga3900gcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgta3960atctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa4020gagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatact4080gttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctaca4140tacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtctt4200accgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacgggg4260ggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacag4320cgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggta4380agcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtat4440ctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcg4500tcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggcc4560ttttgctggccttttgctcacatgtt4586<210>47<211>33<212>DNA<213>寡核苷酸引物Loy277attR4EcoRV<400>47aaaaaagatatcgattacgccaagctatcaact33<210>48<211>32<212>DNA<213>寡核苷酸引物Loy278attR3EcoRV<400>48aaaaaagatatccggccagtgaattatcaact32<210>49<211>9227<212>DNA<213>插入片段受體(載體供體)分子載體L0338-pSUN2-GW-R4R3<220><221>misc_feature<222>(24)..(148)<223>attR4*重組位點<220><221>misc_feature<222>(1601)..(1725)<223>complementattR3*重組位點<220><221>misc_feature<222>(188)..(493)<223>complementCDS-編碼ccdB反選擇標記<220><221>misc_feature<222>(813)..(1493)<223>complementCDS-編碼氯霉素抗性var<220><221>misc_feature<222>(9044)..(9189)<223>農桿菌T-DNA右邊緣(RB)<220><221>misc_feature<222>(3285)..(3499)<223>complement農桿菌T-DNA左邊緣(LB)<220><221>啟動子<222>(1788)..(2124)<223>nos啟動子<220><221>misc_feature<222>(2145)..(2923)<223>CDS編碼ntpII卡那霉素抗性<220><221>終止子<222>(3016)..(3271)<223>nos終止子(nosT)<220><221>misc_feature<222>(8079)..(8870)<223>complementCDS-編碼壯觀霉素/鏈霉素抗性(aadA)<220><221>rep_origin<222>(7064)..(7910)<223>ColE1復制起點<400>49agctatcgattacgccaagctatcaactttgtatagaaaagttgaacgagaaacgtaaaa60tgatataaatatcaatatattaaattagattttgcataaaaaacagactacataatactg120taaaacacaacatatccagtcactatggtcgacctgcagactggctgtgtataagggagc180ctgacatttatattccccagaacatcaggttaatggcgtttttgatgtcattttcgcggt240ggctgagatcagccacttcttccccgataacggagaccggcacactggccatatcggtgg300tcatcatgcgccagctttcatccccgatatgcaccaccgggtaaagttcacgggggactt360tatctgacagcagacgtgcactggccagggggatcaccatccgtcgcccgggcgtgtcaa420taatatcactctgtacatccacaaacagacgataacggctctctcttttataggtgtaaa480ccttaaactgcatttcaccagcccctgttctcgtcggcaaaagagccgttcatttcaata540aaccgggcgacctcagccatcccttcctgattttccgctttccagcgttcggcacgcaga600cgacgggcttcattctgcatggttgtgcttaccgaaccggagatattgacatcatatatg660ccttgagcaactgatagctgtcgctgtcaactgtcactgtaatacgctgcttcatagcat720acctctttttgacatacttcgggtatacatatcagtatatattcttataccgcaaaaatc780agcgcgcaaatacgcatactgttatctggcttttagtaagccggatcctctagattacgc840cccgcctgccactcatcgcagtactgttgtaattcattaagcattctgccgacatggaag900ccatcacaaacggcatgatgaacctgaatcgccagcggcatcagcaccttgtcgccttgc960gtataatatttgcccatggtgaaaacgggggcgaagaagttgtccatattggccacgttt1020aaatcaaaactggtgaaactcacccagggattggctgagacgaaaaacatattctcaata1080aaccctttagggaaataggccaggttttcaccgtaacacgccacatcttgcgaatatatg1140tgtagaaactgccggaaatcgtcgtggtattcactccagagcgatgaaaacgtttcagtt1200tgctcatggaaaacggtgtaacaagggtgaacactatcccatatcaccagctcaccgtct1260ttcattgccatacggaattccggatgagcattcatcaggcgggcaagaatgtgaataaag1320gccggataaaacttgtgcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgtaatatccagc1380tgaacggtctggttataggtacattgagcaactgactgaaatgcctcaaaatgttcttta1440cgatgccattgggatatatcaacggtggtatatccagtgatttttttctccattttagct1500tccttagctcctgaaaatctcgacggatcctaactcaaaatccacacattatacgagccg1560gaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgcggccgccatagtgactggatatgtt1620gtgttttacagtattatgtagtctgttttttatgcaaaatctaatttaatatattgatat1680ttatatcattttacgtttctcgttcaactttattatacatagttgataattcactggccg1740gataattcactggccgtcgttttacaacgactcaggatcctgtcaaacactgatagttta1800aactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatg1860acccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgt1920tgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaa1980accattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgt2040caaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatatt2100cactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatg2160gattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcac2220aacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccgg2280ttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgc2340ggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactg2400aagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctc2460accttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgc2520ttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgta2580ctcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcg2640cgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcg2700tgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggat2760tcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctaccc2820gtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggta2880tcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgag2940cgggacccaagctctagatcttgctgcgttcggatattttcgtggagttcccgccacaga3000cccggatgatccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctg3060ttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataa3120ttaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaat3180tatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgc3240gcgcggtgtcatctatgttactagatcgggcctcctgtcaagctctgcttggtaataatt3300gtcattagattgtttttatgcatagatgcactcgaaatcagccaattttagacaagtatc3360aaacggatgttaattcagtacattaaagacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagc3420gtcaatttgtttacaccacaatatatcctgccaccagccagccaacagctccccgaccgg3480cagctcggcacaaaatcaccacgcgttaccaccacgccggccggccgcatggtgttgacc3540gtgttcgccggcattgccgagttcgagcgttccctaatcatcgaccgcacccggagcggg3600cgcgaggccgccaaggcccgaggcgtgaagtttggcccccgccctaccctcaccccggca3660cagatcgcgcacgcccgcgagctgatcgaccaggaaggccgcaccgtgaaagaggcggct3720gcactgcttggcgtgcatcgctcgaccctgtaccgcgcacttgagcgcagcgaggaagtg3780acgcccaccgaggccaggcggcgcggtgccttccgtgaggacgcattgaccgaggccgac3840gccctggcggccgccgagaatgaacgccaagaggaacaagcatgaaaccgcaccaggacg3900gccaggacgaaccgtttttcattaccgaagagatcgaggcggagatgatcgcggccgggt3960acgtgttcgagccgcccgcgcacgtctcaaccgtgcggctgcatgaaatcctggccggtt4020tgtctgatgccaagctggcggcctggccggccagcttggccgctgaagaaaccgagcgcc4080gccgtctaaaaaggtgatgtgtatttgagtaaaacagcttgcgtcatgcggtcgctgcgt4140atatgatgcgatgagtaaataaacaaatacgcaaggggaacgcatgaaggttatcgctgt4200acttaaccagaaaggcgggtcaggcaagacgaccatcgcaacccatctagcccgcgccct4260gcaactcgccggggccgatgttctgttagtcgattccgatccccagggcagtgcccgcga4320ttgggcggccgtgcgggaagatcaaccgctaaccgttgtcggcatcgaccgcccgacgat4380tgaccgcgacgtgaaggccatcggccggcgcgacttcgtagtgatcgacggagcgcccca4440ggcggcggacttggctgtgtccgcgatcaaggcagccgacttcgtgctgattccggtgca4500gccaagcccttacgacatatgggccaccgccgacctggtggagctggttaagcagcgcat4560tgaggtcacggatggaaggctacaagcggcctttgtcgtgtcgcgggcgatcaaaggcac4620gcgcatcggcggtgaggttgccgaggcgctggccgggtacgagctgcccattcttgagtc4680ccgtatcacgcagcgcgtgagctacccaggcactgccgccgccggcacaaccgttcttga4740atcagaacccgagggcgacgctgcccgcgaggtccaggcgctggccgctgaaattaaatc4800aaaactcatttgagttaatgaggtaaagagaaaatgagcaaaagcacaaacacgctaagt4860gccggccgtccgagcgcacgcagcagcaaggctgcaacgttggccagcctggcagacacg4920ccagccatgaagcgggtcaactttcagttgccggcggaggatcacaccaagctgaagatg4980tacgcggtacgccaaggcaagaccattaccgagctgctatctgaatacatcgcgcagcta5040ccagagtaaatgagcaaatgaataaatgagtagatgaattttagcggctaaaggaggcgg5100catggaaaatcaagaacaaccaggcaccgacgccgtggaatgccccatgtgtggaggaac5160gggcggttggccaggcgtaagcggctgggttgtctgccggccctgcaatggcactggaac5220ccccaagcccgaggaatcggcgtgagcggtcgcaaaccatccggcccggtacaaatcggc5280gcggcgctgggtgatgacctggtggagaagttgaaggccgcgcaggccgcccagcggcaa5340cgcatcgaggcagaagcacgccccggtgaatcgtggcaagcggccgctgatcgaatccgc5400aaagaatcccggcaaccgccggcagccggtgcgccgtcgattaggaagccgcccaagggc5460gacgagcaaccagattttttcgttccgatgctctatgacgtgggcacccgcgatagtcgc5520agcatcatggacgtggccgttttccgtctgtcgaagcgtgaccgacgagctggcgaggtg5580atccgctacgagcttccagacgggcacgtagaggtttccgcagggccggccggcatggcc5640agtgtgtgggattacgacctggtactgatggcggtttcccatctaaccgaatccatgaac5700cgataccgggaagggaagggagacaagcccggccgcgtgttccgtccacacgttgcggac5760gtactcaagttctgccggcgagccgatggcggaaagcagaaagacgacctggtagaaacc5820tgcattcggttaaacaccacgcacgttgccatgcagcgtacgaagaaggccaagaacggc5880cgcctggtgacggtatccgagggtgaagccttgattagccgctacaagatcgtaaagagc5940gaaaccgggcggccggagtacatcgagatcgagctagctgattggatgtaccgcgagatc6000acagaaggcaagaacccggacgtgctgacggttcaccccgattactttttgatcgatccc6060ggcatcggccgttttctctaccgcctggcacgccgcgccgcaggcaaggcagaagccaga6120tggttgttcaagacgatctacgaacgcagtggcagcgccggagagttcaagaagttctgt6180ttcaccgtgcgcaagctgatcgggtcaaatgacctgccggagtacgatttgaaggaggag6240gcggggcaggctggcccgatcctagtcatgcgctaccgcaacctgatcgagggcgaagca6300tccgccggttcctaatgtacggagcagatgctagggcaaattgccctagcaggggaaaaa6360ggtcgaaaaggtctctttcctgtggatagcacgtacattgggaacccaaagccgtacatt6420gggaaccggaacccgtacattgggaacccaaagccgtacattgggaaccggtcacacatg6480taagtgactgatataaaagagaaaaaaggcgatttttccgcctaaaactctttaaaactt6540attaaaactcttaaaacccgcctggcctgtgcataactgtctggccagcgcacagccgaa6600gagctgcaaaaagcgcctacccttcggtcgctgcgctccctacgccccgccgcttcgcgt6660cggcctatcgcggccgctggccgctcaaaaatggctggcctacggccaggcaatctacca6720gggcgcggacaagccgcgccgtcgccactcgaccgccggcgcccacatcaaggcaccctg6780cctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggt6840cacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcggg6900tgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatac6960tggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaa7020ataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctc7080actgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcg7140gtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggc7200cagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgc7260ccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacagga7320ctataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgacc7380ctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat7440agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtg7500cacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtcc7560aacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcaga7620gcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacact7680agaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagtt7740ggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaag7800cagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacgggg7860tctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgcatgatatatct7920cccaatttgtgtagggcttattatgcacgcttaaaaataataaaagcagacttgacctga7980tagtttggctgtgagcaattatgtgcttagtgcatctaacgcttgagttaagccgcgccg8040cgaagcggcgtcggcttgaacgaatttctagctagacattatttgccgactaccttggtg8100atctcgcctttcacgtagtggacaaattcttccaactgatctgcgcgcgaggccaagcga8160tcttcttcttgtccaagataagcctgtctagcttcaagtatgacgggctgatactgggcc8220ggcaggcgctccattgcccagtcggcagcgacatccttcggcgcgattttgccggttact8280gcgctgtaccaaatgcgggacaacgtaagcactacatttcgctcatcgccagcccagtcg8340ggcggcgagttccatagcgttaaggtttcatttagcgcctcaaatagatcctgttcagga8400accggatcaaagagttcctccgccgctggacctaccaaggcaacgctatgttctcttgct8460tttgtcagcaagatagccagatcaatgtcgatcgtggctggctcgaagatacctgcaaga8520atgtcattgcgctgccattctccaaattgcagttcgcgcttagctggataacgccacgga8580atgatgtcgtcgtgcacaacaatggtgacttctacagcgcggagaatctcgctctctcca8640ggggaagccgaagtttccaaaaggtcgttgatcaaagctcgccgcgttgtttcatcaagc8700cttacggtcaccgtaaccagcaaatcaatatcactgtgtggcttcaggccgccatccact8760gcggagccgtacaaatgtacggccagcaacgtcggttcgagatggcgctcgatgacgcca8820actacctctgatagttgagtcgatacttcggcgatcaccgcttcccccatgatgtttaac8880tttgttttagggcgactgccctgctgcgtaacatcgttgctgctccataacatcaaacat8940cgacccacggcgtaacgcgcttgctgcttggatgcccgaggcatagactgtaccccaaaa9000aaacagtcataacaagccatgaaaaccgccactgcgttccatggacatacaaatggacga9060acggataaaccttttcacgcccttttaaatatccgattattctaataaacgctcttttct9120cttaggtttacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaa9180acgacaatcagatctagtaggaaacagctatgaccatgattacgcca9227<210>50<211>9227<212>DNA<213>插入片段受體(載體供體)分子載體L0339-pSUN2-GW-R3R4<220><221>misc_feature<222>(9022)..(9167)<223>農桿菌T-DNA右邊緣(RB)<220><221>misc_feature<222>(3263)..(3477)<223>農桿菌T-DNA左邊緣(LB)<220><221>啟動子<222>(1766)..(2102)<223>nos啟動子(nosP)<220><221>misc_feature<222>(2123)..(2901)<223>CDS-編碼nptII卡那霉素抗性<220><221>終止子<222>(2994)..(3249)<223>nos終止子(nosT)<220><221>misc_feature<222>(1578)..(1702)<223>complementattR4*重組位點<220><221>misc_feature<222>(1)..(125)<223>attR3*重組位點<220><221>misc_feature<222>(1233)..(1538)<223>CDS-編碼ccdB反選擇標記<220><221>misc_feature<222>(233)..(913)<223>CDS-編碼氯霉素抗性var<400>50caactatgtataataaagttgaacgagaaacgtaaaatgatataaatatcaatatattaa60attagattttgcataaaaaacagactacataatactgtaaaacacaacatatccagtcac120tatggcggccgcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtataatgt180gtggattttgagttaggatccgtcgagattttcaggagctaaggaagctaaaatggagaa240aaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttga300ggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggc360ctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattct420tgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggt480gatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttc540atcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaaga600tgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtt660tttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatat720ggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggt780gctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgccgtttgtgatggcttccatgtcggcag840aatgcttaatgaattacaacagtactgcgatgagtggcaggcggggcgtaatctagagga900tccggcttactaaaagccagataacagtatgcgtatttgcgcgctgatttttgcggtata960agaatatatactgatatgtatacccgaagtatgtcaaaaagaggtatgctatgaagcagc1020gtattacagtgacagttgacagcgacagctatcagttgctcaaggcatatatgatgtcaa1080tatctccggttcggtaagcacaaccatgcagaatgaagcccgtcgtctgcgtgccgaacg1140ctggaaagcggaaaatcaggaagggatggctgaggtcgcccggtttattgaaatgaacgg1200ctcttttgccgacgagaacaggggctggtgaaatgcagtttaaggtttacacctataaaa1260gagagagccgttatcgtctgtttgtggatgtacagagtgatattattgacacgcccgggc1320gacggatggtgatccccctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtcccccgtgaac1380tttacccggtggtgcatatcggggatgaaagctggcgcatgatgaccaccgatatggcca1440gtgtgccggtctccgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaaaatgaca1500tcaaaaacgccattaacctgatgttctggggaatataaatgtcaggctcccttatacaca1560gccagtctgcaggtcgaccatagtgactggatatgttgtgttttacagtattatgtagtc1620tgttttttatgcaaaatctaatttaatatattgatatttatatcattttacgtttctcgt1680tcaacttttctatacaaagttgatagcttggcgtaatcgataattcactggccgtcgttt1740tacaacgactcaggatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaa1800tctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggac1860aagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgg1920gtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaag1980tcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttc2040cataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctg2100caccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggc2160cgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctga2220tgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacct2280gtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgac2340gggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgct2400attgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagt2460atccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccatt2520cgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgt2580cgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccag2640gctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgctt2700gccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctggg2760tgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttgg2820cggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcg2880catcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggacccaagctctagatctt2940gctgcgttcggatattttcgtggagttcccgccacagacccggatgatccccgatcgttc3000aaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattat3060catataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgtt3120atttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgataga3180aaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttact3240agatcgggcctcctgtcaagctctgcttggtaataattgtcattagattgtttttatgca3300tagatgcactcgaaatcagccaattttagacaagtatcaaacggatgttaattcagtaca3360ttaaagacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaat3420atatcctgccaccagccagccaacagctccccgaccggcagctcggcacaaaatcaccac3480gcgttaccaccacgccggccggccgcatggtgttgaccgtgttcgccggcattgccgagt3540tcgagcgttccctaatcatcgaccgcacccggagcgggcgcgaggccgccaaggcccgag3600gcgtgaagtttggcccccgccctaccctcaccccggcacagatcgcgcacgcccgcgagc3660tgatcgaccaggaaggccgcaccgtgaaagaggcggctgcactgcttggcgtgcatcgct3720cgaccctgtaccgcgcacttgagcgcagcgaggaagtgacgcccaccgaggccaggcggc3780gcggtgccttccgtgaggacgcattgaccgaggccgacgccctggcggccgccgagaatg3840aacgccaagaggaacaagcatgaaaccgcaccaggacggccaggacgaaccgtttttcat3900taccgaagagatcgaggcggagatgatcgcggccgggtacgtgttcgagccgcccgcgca3960cgtctcaaccgtgcggctgcatgaaatcctggccggtttgtctgatgccaagctggcggc4020ctggccggccagcttggccgctgaagaaaccgagcgccgccgtctaaaaaggtgatgtgt4080atttgagtaaaacagcttgcgtcatgcggtcgctgcgtatatgatgcgatgagtaaataa4140acaaatacgcaaggggaacgcatgaaggttatcgctgtacttaaccagaaaggcgggtca4200ggcaagacgaccatcgcaacccatctagcccgcgccctgcaactcgccggggccgatgtt4260ctgttagtcgattccgatccccagggcagtgcccgcgattgggcggccgtgcgggaagat4320caaccgctaaccgttgtcggcatcgaccgcccgacgattgaccgcgacgtgaaggccatc4380ggccggcgcgacttcgtagtgatcgacggagcgccccaggcggcggacttggctgtgtcc4440gcgatcaaggcagccgacttcgtgctgattccggtgcagccaagcccttacgacatatgg4500gccaccgccgacctggtggagctggttaagcagcgcattgaggtcacggatggaaggcta4560caagcggcctttgtcgtgtcgcgggcgatcaaaggcacgcgcatcggcggtgaggttgcc4620gaggcgctggccgggtacgagctgcccattcttgagtcccgtatcacgcagcgcgtgagc4680tacccaggcactgccgccgccggcacaaccgttcttgaatcagaacccgagggcgacgct4740gcccgcgaggtccaggcgctggccgctgaaattaaatcaaaactcatttgagttaatgag4800gtaaagagaaaatgagcaaaagcacaaacacgctaagtgccggccgtccgagcgcacgca4860gcagcaaggctgcaacgttggccagcctggcagacacgccagccatgaagcgggtcaact4920ttcagttgccggcggaggatcacaccaagctgaagatgtacgcggtacgccaaggcaaga4980ccattaccgagctgctatctgaatacatcgcgcagctaccagagtaaatgagcaaatgaa5040taaatgagtagatgaattttagcggctaaaggaggcggcatggaaaatcaagaacaacca5100ggcaccgacgccgtggaatgccccatgtgtggaggaacgggcggttggccaggcgtaagc5160ggctgggttgtctgccggccctgcaatggcactggaacccccaagcccgaggaatcggcg5220tgagcggtcgcaaaccatccggcccggtacaaatcggcgcggcgctgggtgatgacctgg5280tggagaagttgaaggccgcgcaggccgcccagcggcaacgcatcgaggcagaagcacgcc5340ccggtgaatcgtggcaagcggccgctgatcgaatccgcaaagaatcccggcaaccgccgg5400cagccggtgcgccgtcgattaggaagccgcccaagggcgacgagcaaccagattttttcg5460ttccgatgctctatgacgtgggcacccgcgatagtcgcagcatcatggacgtggccgttt5520tccgtctgtcgaagcgtgaccgacgagctggcgaggtgatccgctacgagcttccagacg5580ggcacgtagaggtttccgcagggccggccggcatggccagtgtgtgggattacgacctgg5640tactgatggcggtttcccatctaaccgaatccatgaaccgataccgggaagggaagggag5700acaagcccggccgcgtgttccgtccacacgttgcggacgtactcaagttctgccggcgag5760ccgatggcggaaagcagaaagacgacctggtagaaacctgcattcggttaaacaccacgc5820acgttgccatgcagcgtacgaagaaggccaagaacggccgcctggtgacggtatccgagg5880gtgaagccttgattagccgctacaagatcgtaaagagcgaaaccgggcggccggagtaca5940tcgagatcgagctagctgattggatgtaccgcgagatcacagaaggcaagaacccggacg6000tgctgacggttcaccccgattactttttgatcgatcccggcatcggccgttttctctacc6060gcctggcacgccgcgccgcaggcaaggcagaagccagatggttgttcaagacgatctacg6120aacgcagtggcagcgccggagagttcaagaagttctgtttcaccgtgcgcaagctgatcg6180ggtcaaatgacctgccggagtacgatttgaaggaggaggcggggcaggctggcccgatcc6240tagtcatgcgctaccgcaacctgatcgagggcgaagcatccgccggttcctaatgtacgg6300agcagatgctagggcaaattgccctagcaggggaaaaaggtcgaaaaggtctctttcctg6360tggatagcacgtacattgggaacccaaagccgtacattgggaaccggaacccgtacattg6420ggaacccaaagccgtacattgggaaccggtcacacatgtaagtgactgatataaaagaga6480aaaaaggcgatttttccgcctaaaactctttaaaacttattaaaactcttaaaacccgcc6540tggcctgtgcataactgtctggccagcgcacagccgaagagctgcaaaaagcgcctaccc6600ttcggtcgctgcgctccctacgccccgccgcttcgcgtcggcctatcgcggccgctggcc6660gctcaaaaatggctggcctacggccaggcaatctaccagggcgcggacaagccgcgccgt6720cgccactcgaccgccggcgcccacatcaaggcaccctgcctcgcgcgtttcggtgatgac6780ggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggat6840gccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgca6900gccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcag6960agcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaagga7020gaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcg7080ttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaat7140caggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgta7200aaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaa7260atcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttc7320cccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgt7380ccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctca7440gttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccg7500accgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttat7560cgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgcta7620cagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatct7680gcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaac7740aaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaa7800aaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaa7860actcacgttaagggattttggtcatgcatgatatatctcccaatttgtgtagggcttatt7920atgcacgcttaaaaataataaaagcagacttgacctgatagtttggctgtgagcaattat7980gtgcttagtgcatctaacgcttgagttaagccgcgccgcgaagcggcgtcggcttgaacg8040aatttctagctagacattatttgccgactaccttggtgatctcgcctttcacgtagtgga8100caaattcttccaactgatctgcgcgcgaggccaagcgatcttcttcttgtccaagataag8160cctgtctagcttcaagtatgacgggctgatactgggccggcaggcgctccattgcccagt8220cggcagcgacatccttcggcgcgattttgccggttactgcgctgtaccaaatgcgggaca8280acgtaagcactacatttcgctcatcgccagcccagtcgggcggcgagttccatagcgtta8340aggtttcatttagcgcctcaaatagatcctgttcaggaaccggatcaaagagttcctccg8400ccgctggacctaccaaggcaacgctatgttctcttgcttttgtcagcaagatagccagat8460caatgtcgatcgtggctggctcgaagatacctgcaagaatgtcattgcgctgccattctc8520caaattgcagttcgcgcttagctggataacgccacggaatgatgtcgtcgtgcacaacaa8580tggtgacttctacagcgcggagaatctcgctctctccaggggaagccgaagtttccaaaa8640ggtcgttgatcaaagctcgccgcgttgtttcatcaagccttacggtcaccgtaaccagca8700aatcaatatcactgtgtggcttcaggccgccatccactgcggagccgtacaaatgtacgg8760ccagcaacgtcggttcgagatggcgctcgatgacgccaactacctctgatagttgagtcg8820atacttcggcgatcaccgcttcccccatgatgtttaactttgttttagggcgactgccct8880gctgcgtaacatcgttgctgctccataacatcaaacatcgacccacggcgtaacgcgctt8940gctgcttggatgcccgaggcatagactgtaccccaaaaaaacagtcataacaagccatga9000aaaccgccactgcgttccatggacatacaaatggacgaacggataaaccttttcacgccc9060ttttaaatatccgattattctaataaacgctcttttctcttaggtttacccgccaatata9120tcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatcagatctagtagga9180aacagctatgaccatgattacgccaagctatccggccagtgaattat9227<210>51<211>15506<212>DNA<213>多表達構建體pSUN2-B4-USP-NAN-pa7-E9-GUS-FAD3-LeB4-GFP-LeB3<220><221>misc_feature<222>(15323)..(15468)<223>農桿菌T-DNA右邊緣(RB)<220><221>misc_feature<222>(9564)..(9778)<223>complement農桿菌T-DNA左邊緣(LB)<220><221>啟動子<222>(8067)..(8403)<223>nos啟動子(nosP)<220><221>啟動子<222>(67)..(745)<223>USP啟動子<220><221>啟動子<222>(4928)..(5993)<223>complementLuFAD3啟動子<220><221>啟動子<222>(6061)..(6824)<223>LeB4-700啟動子<220><221>終止子<222>(9295)..(9550)<223>nos終止子(nosT)<220><221>終止子<222>(1981)..(2202)<223>pA7終止子(pA7T)<220><221>終止子<222>(2264)..(2933)<223>complementrbcs\E9終止子<220><221>終止子<222>(7656)..(7952)<223>LeB3’UT終止子<220><221>misc_feature<222>(8424)..(9202)<223>CDS-編碼nptII卡那霉素抗性<220><221>misc_feature<222>(14358)..(15149)<223>complementCDS-編碼壯觀霉素/鏈霉素抗性(aadA)<220><221>misc_feature<222>(802)..(1947)<223>CDS-編碼NAN報道基因<220><221>misc_feature<222>(3030)..(4841)<223>complementCDS-編碼GUS報道基因<220><221>misc_feature<222>(6828)..(7645)<223>CDS-編碼GFP報道基因<220><221>rep_origin<222>(13343)..(14189)<223>complementColE1復制起點<220><221>misc_feature<222>(7984)..(8004)<223>complement重組位點attB3*<220><221>misc_feature<222>(24)..(44)<223>重組位點attB4*<220><221>misc_feature<222>(2240)..(2263)<223>重組位點attB1*<220><221>misc_feature<222>(6008)..(6031)<223>重組位點attB2*<400>51agctatcgattacgccaagctatcaactttgtatagaaaagttggggtacccggggatcc60tcctcgagcaaatttacacattgccactaaacgtctaaacccttgtaatttgtttttgtt120ttactatgtgtgttatgtatttgatttgcgataaatttttatatttggtactaaatttat180aacaccttttatgctaacgtttgccaacacttagcaatttgcaagttgattaattgattc240taaattatttttgtcttctaaatacatatactaatcaactggaaatgtaaatatttgcta300atatttctactataggagaattaaagtgagtgaatatggtaccacaaggtttggagattt360aattgttgcaatgatgcatggatggcatatacaccaaacattcaataattcttgaggata420ataatggtaccacacaagatttgaggtgcatgaacgtcacgtggacaaaaggtttagtaa480tttttcaagacaacaatgttaccacacacaagttttgaggtgcatgcatggatgccctgt540ggaaagtttaaaaatattttggaaatgatttgcatggaagccatgtgtaaaaccatgaca600tccacttggaggatgcaataatgaagaaaactacaaatttacatgcaactagttatgcat660gtagtctatataatgaggattttgcaatactttcattcatacacactcactaagttttac720acgattataatttcttcatagccagcggatctgatatctgcggccgcggcgcgccaattg780actagtagggatccgttaacaatgtgtaacaagaacaacaccttcgagaagaacctcgac840atctcacacaagcctgaaccacttatcctctttaacaaggataacaacatctggaattct900aagtacttcaggattcctaacatccagttgcttaatgacggtacaatccttaccttctct960gacatcaggtacaacgggcccgatgaccacgcttacattgatatcgcttctgctagatct1020actgaattcggtaagacctggtcttacaacatcgctatgaagaacaacaggatcgactca1080acctactcacgtgtgatggattctaccactgtgatcactaacaccggccggatcattctt1140atcgctggatcttggaacactaacggaaactgggctatgaccacttctaccagaaggtct1200gattggtctgtgcagatgatctactctgatgacaacggacttacttggtctaacaagatc1260gatctcactaaggactcttcaaaagtgaagaaccagccttctaacacaattggatggctc1320ggaggtgttggatctggaatcgttatggacgatggaaccatcgttatgcctgctcagatc1380tccttaagagaaaacaacgagaacaactactattcactcatcatatattccaaggataac1440ggcgagacttggactatggggaacaaggtgccgaattccaatacgtccgagaatatggtc1500attgaactcgacggagcattgatcatgtctactaggtacgattactcaggctacagagcg1560gcatacataagtcatgacctcgggacaacttgggaaatctacgagccacttaatggcaag1620attctcacaggcaaaggttccggatgtcaaggatcattcatcaaagccacaacgagcaat1680ggacatcgtattggactcattagtgcacctaagaacacaaaaggtgagtacattagagat1740aatatcgccgtctacatgatcgattttgacgatctgagcaaaggtgttcaagagatctgc1800attccatatccagaggatggtaacaagctcggtggaggatactcctgtctgagttttaag1860aacaaccacttgggtattgtttacgaagctaatggtaatatcgagtatcaggacttgaca1920ccatactatagtcttattaacaagcagtgagagcctatcgattaattaaggccgcctcga1980atcctgaattaacgccgaattaattcgggggatctggattttagtactggattttggttt2040taggaattagaaattttattgatagaagtattttacaaatacaaatacatactaagggtt2100tcttatatgctcaacacatgagcgaaaccctataggaaccctaattcccttatctgggaa2160ctactcacacattattatggagaaactcgagcttgtcgagattcgagcatatgggcatgc2220aagcttggcgtaatcatggcaagtttgtacaaaaaagcaggctggtacccggtcgattga2280tgcatgttgtcaatcaattggcaagtcataaaatgcattaaaaaatattttcatactcaa2340ctacaaatccatgagtataactataattataaagcaatgattagaatctgacaaggattc2400tggaaaattacataaaggaaagttcataaatgtctaaaacacaagaggacatacttgtat2460tcagtaacatttgcagcttttctaggtctgaaaatatatttgttgcctagtgaataagca2520taatggtacaactacaagtgttttactcctcatattaacttcggtcattagaggccacga2580tttgacacatttttactcaaaacaaaatgtttgcatatctcttataatttcaaattcaac2640acacaacaaataagagaaaaaacaaataatattaatttgagaatgaacaaaaggaccata2700tcattcattaactcttctccatccatttccatttcacagttcgatagcgaaaaccgaata2760aaaaacacagtaaattacaagcacaacaaatggtacaagaaaaacagttttcccaatgcc2820ataatactcaaactcagtaggattctggtgtgtgcgcaatgaaactgatgcattgaactt2880gacgaacgttgtcgaaaccgatgatacgaacgaaagctctagctagaggatcctctagca2940tatgctcgaggcggccttaattaatcgataggctcggtagcaattcccgaggctgtagcc3000gacgatggtgcgccaggagagttgttgattcattgtttgcctccctgctgcggtttttca3060ccgaagttcatgccagtccagcgtttttgcagcagaaaagccgccgacttcggtttgcgg3120tcgcgagtgaagatccctttcttgttaccgccaacgcgcaatatgccttgcgaggtcgca3180aaatcggcgaaattccatacctgttcaccgacgacggcgctgacgcgatcaaagacgcgg3240tgatacatatccagccatgcacactgatactcttcactccacatgtcggtgtacattgag3300tgcagcccggctaacgtatccacgccgtattcggtgatgataatcggctgatgcagtttc3360tcctgccaggccagaagttctttttccagtaccttctctgccgtttccaaatcgccgctt3420tggacataccatccgtaataacggttcaggcacagcacatcaaagagatcgctgatggta3480tcggtgtgagcgtcgcagaacattacattgacgcaggtgatcggacgcgtcgggtcgagt3540ttacgcgttgcttccgccagtggcgcgaaatattcccgtgcaccttgcggacgggtatcc3600ggttcgttggcaatactccacatcaccacgcttgggtggtttttgtcacgcgctatcagc3660tctttaatcgcctgtaagtgcgcttgctgagtttccccgttgactgcctcttcgctgtac3720agttctttcggcttgttgcccgcttcgaaaccaatgcctaaagagaggttaaagccgaca3780gcagcagtttcatcaatcaccacgatgccatgttcatctgcccagtcgagcatctcttca3840gcgtaagggtaatgcgaggtacggtaggagttggccccaatccagtccattaatgcgtgg3900tcgtgcaccatcagcacgttatcgaatcctttgccacgcaagtccgcatcttcatgacga3960ccaaagccagtaaagtagaacggtttgtggttaatcaggaactgttcgcccttcactgcc4020actgaccggatgccgacgcgaagcgggtagatatcacactctgtctggcttttggctgtg4080acgcacagttcatagagataaccttcacccggttgccagaggtgcggattcaccacttgc4140aaagtcccgctagtgccttgtccagttgcaaccacctgttgatccgcatcacgcagttca4200acgctgacatcaccattggccaccacctgccagtcaacagacgcgtggttacagtcttgc4260gcgacatgcgtcaccacggtgatatcgtccacccaggtgttcggcgtggtgtagagcatt4320acgctgcgatggattccggcatagttaaagaaatcatggaagtaagactgctttttcttg4380ccgttttcgtcggtaatcaccattcccggcgggatagtctgccagttcagttcgttgttc4440acacaaacggtgatacgtacacttttcccggcaataacatacggcgtgacatcggcttca4500aatggcgtatagccgccctgatgctccatcacttcctgattattgacccacactttgccg4560taatgagtgaccgcatcgaaacgcagcacgatacgctggcctgcccaacctttcggtata4620aagacttcgcgctgataccagacgttgcccgcataattacgaatatctgcatcggcgaac4680tgatcgttaaaactgcctggcacagcaattgcccggctttcttgtaacgcgctttcccac4740caacgctgatcaattccacagttttcgcgatccagactgaatgcccacaggccgtcgagt4800tttttgatttcacgggttggggtttctacaggacgtaacataagggactgacctacccgg4860ggatccgttaacacctaggtacccgggactagtcaattggcgcgccgcggccgcagatat4920cagatccgtcgtgcagagccacagttttgaagtcactgtaatctgcaccaaacaaaccca4980atatatatttttgaataataatgaatagactgagtggcctttggtttcagcctcacagta5040tttataaccgaagagtatgtaggttggtgagaactaacgaagaagaagtaatgcaggatg5100ccaagtggatggagaagagtaaatggaaatgcaaaatgtacactgatttcagacaaacta5160gcctacaccacccaacccctttttttttgctctttattgggtttcagtttaggcaacggt5220tgttgttacttgctctgttgaaagacaaatgaaaaggagccgttgctggctgctaggttc5280ttcaatttcagtatcaatggtggtgggcaaatctttgattcaaacacatggcaacttcct5340tcaatggtatctaggaaacctatgtgcatgcatgagttaccacaaatgtgatgatatcaa5400cttattagttcttttaattaaggattagtgatttggcggagtcgcaacgggcactgctga5460gttcgcgggagctagggtggaatcgactaatcaactcatgtgactcaagtgggcatcggt5520cttagggagtaagttcgggcaagtttcgggcagagggatttgtgcatgtgtttaggatca5580caaggggggtattggttgtccttcggtccgagaatgtgaagtacgaggtcttccagatgc5640tatgtagtgggttgggaacaaggcagagatatggacgagcttgactttgttttcacaaac5700tgatgatcaaactttgggctccatttgaacttagtcgaaactcttacaactctcttgctt5760tgcaatcgaataatagatggattattgaattgcaaagtgaacactaatgaaagtgagtgc5820atagaaaactaaggattaatgatgctgatgatgatgagtgatgctggtaacaactgtggt5880aaagaatggcactgtaaaggtgaacaaaacatccacccacgtactgatcaataaacttta5940gcagacaatcagaccattttccttttgtttggacccttttgtgggaataagcttggcgta6000atcatggacccagctttcttgtacaaagtggggtacccggggatcctctagcatatgctc6060gagttaccatttctttttcctgcatctcaatagtatatagggtatcaaatagtgattatc6120caaacttaaataagttagaggaaacaccaagatatgccatatactctcaaatttgacact6180atgattcaaagttgcacttgcataaaacttattaattcaatagtaaaaccaaacttgtgc6240gtgatacagttaaaatgactaaactactaattaaggtccctcccattagtaaataagtta6300tttttttagaaaaagaaaataataaaaagaatgacgagtctatctaaatcatattaacaa6360gtaatacatattgattcattcgatggaggaggccaataattgtagtaaacaagcagtgcc6420gaggttaatatatgctcaagacagtaaataatctaaatgaattaagacagtgatttgcaa6480agagtagatgcagagaagagaactaaagatttgctgctacacgtatataagaatagcaac6540agatattcattctgtctctttgtggaatatggatatctactaatcatcatctatctgtga6600agaataaaagaagcggccacaagcgcagcgtcgcacatatgatgtgtatcaaattaggac6660tccatagccatgcatgctgaagaatgtcacacacgttctgtcacacgtgttactctctca6720ctgttctcctcttcctataaatcaccgcgccacagcttctccacttcaccacttcaccac6780ttcactcacaatccttcattagttgtttactatcacagtcacagatccaaggagatataa6840caatgaagactaatctttttctctttctcatcttttcacttctcctatcattatcctcgg6900ccgaattcagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattag6960atggtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacat7020acggaaaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccatggccaa7080cacttgtcactactttctcttatggtgttcaatgcttttcaagatacccagatcatatga7140agcggcacgacttcttcaagagcgccatgcctgagggatacgtgcaggagaggaccatct7200tcttcaaggacgacgggaactacaagacacgtgctgaagtcaagtttgagggagacaccc7260tcgtcaacaggatcgagcttaagggaatcgatttcaaggaggacggaaacatcctcggcc7320acaagttggaatacaactacaactcccacaacgtatacatcatggccgacaagcaaaaga7380acggcatcaaagccaacttcaagacccgccacaacatcgaagacggcggcgtgcaactcg7440ctgatcattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaacc7500attacctgtccacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatgg7560tccttcttgagtttgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaac7620atgatgagctttaagagaacggatctggtcgaccgatcctgcaatagaatgttgaggtga7680ccactttctgtaataaaataattataaaataaatttagaattgctgtagtcaagaacatc7740agttctaaaatattaataaagttatggccttttgacatatgtgtttcgataaaaaaatca7800aaataaattgagatttattcgaaatacaatgaaagtttgcagatatgagatatgtttcta7860caaaataataacttaaaactcaactatatgctaatgtttttcttggtgtgtttcatagaa7920aattgtatccgtttcttagaaaatgctcgtaaggatcggcatgcaagcttggcgtaatca7980tggcaactttattatacatagttgataattcactggccggataattcactggccgtcgtt8040ttacaacgactcaggatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgaca8100atctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcggga8160caagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcg8220ggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaa8280gtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgtt8340ccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatct8400gcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccgg8460ccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctg8520atgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacc8580tgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacga8640cgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgc8700tattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaag8760tatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccat8820tcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttg8880tcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgcca8940ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgct9000tgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgg9060gtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttg9120gcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagc9180gcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggacccaagctctagatct9240tgctgcgttcggatattttcgtggagttcccgccacagacccggatgatccccgatcgtt9300caaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgatta9360tcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgt9420tatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatag9480aaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttac9540tagatcgggcctcctgtcaagctctgcttggtaataattgtcattagattgtttttatgc9600atagatgcactcgaaatcagccaattttagacaagtatcaaacggatgttaattcagtac9660attaaagacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaa9720tatatcctgccaccagccagccaacagctccccgaccggcagctcggcacaaaatcacca9780cgcgttaccaccacgccggccggccgcatggtgttgaccgtgttcgccggcattgccgag9840ttcgagcgttccctaatcatcgaccgcacccggagcgggcgcgaggccgccaaggcccga9900ggcgtgaagtttggcccccgccctaccctcaccccggcacagatcgcgcacgcccgcgag9960ctgatcgaccaggaaggccgcaccgtgaaagaggcggctgcactgcttggcgtgcatcgc10020tcgaccctgtaccgcgcacttgagcgcagcgaggaagtgacgcccaccgaggccaggcgg10080cgcggtgccttccgtgaggacgcattgaccgaggccgacgccctggcggccgccgagaat10140gaacgccaagaggaacaagcatgaaaccgcaccaggacggccaggacgaaccgtttttca10200ttaccgaagagatcgaggcggagatgatcgcggccgggtacgtgttcgagccgcccgcgc10260acgtctcaaccgtgcggctgcatgaaatcctggccggtttgtctgatgccaagctggcgg10320cctggccggccagcttggccgctgaagaaaccgagcgccgccgtctaaaaaggtgatgtg10380tatttgagtaaaacagcttgcgtcatgcggtcgctgcgtatatgatgcgatgagtaaata10440aacaaatacgcaaggggaacgcatgaaggttatcgctgtacttaaccagaaaggcgggtc10500aggcaagacgaccatcgcaacccatctagcccgcgccctgcaactcgccggggccgatgt10560tctgttagtcgattccgatccccagggcagtgcccgcgattgggcggccgtgcgggaaga10620tcaaccgctaaccgttgtcggcatcgaccgcccgacgattgaccgcgacgtgaaggccat10680cggccggcgcgacttcgtagtgatcgacggagcgccccaggcggcggacttggctgtgtc10740cgcgatcaaggcagccgacttcgtgctgattccggtgcagccaagcccttacgacatatg10800ggccaccgccgacctggtggagctggttaagcagcgcattgaggtcacggatggaaggct10860acaagcggcctttgtcgtgtcgcgggcgatcaaaggcacgcgcatcggcggtgaggttgc10920cgaggcgctggccgggtacgagctgcccattcttgagtcccgtatcacgcagcgcgtgag10980ctacccaggcactgccgccgccggcacaaccgttcttgaatcagaacccgagggcgacgc11040tgcccgcgaggtccaggcgctggccgctgaaattaaatcaaaactcatttgagttaatga11100ggtaaagagaaaatgagcaaaagcacaaacacgctaagtgccggccgtccgagcgcacgc11160agcagcaaggctgcaacgttggccagcctggcagacacgccagccatgaagcgggtcaac11220tttcagttgccggcggaggatcacaccaagctgaagatgtacgcggtacgccaaggcaag11280accattaccgagctgctatctgaatacatcgcgcagctaccagagtaaatgagcaaatga11340ataaatgagtagatgaattttagcggctaaaggaggcggcatggaaaatcaagaacaacc11400aggcaccgacgccgtggaatgccccatgtgtggaggaacgggcggttggccaggcgtaag11460cggctgggttgtctgccggccctgcaatggcactggaacccccaagcccgaggaatcggc11520gtgagcggtcgcaaaccatccggcccggtacaaatcggcgcggcgctgggtgatgacctg11580gtggagaagttgaaggccgcgcaggccgcccagcggcaacgcatcgaggcagaagcacgc11640cccggtgaatcgtggcaagcggccgctgatcgaatccgcaaagaatcccggcaaccgccg11700gcagccggtgcgccgtcgattaggaagccgcccaagggcgacgagcaaccagattttttc11760gttccgatgctctatgacgtgggcacccgcgatagtcgcagcatcatggacgtggccgtt11820ttccgtctgtcgaagcgtgaccgacgagctggcgaggtgatccgctacgagcttccagac11880gggcacgtagaggtttccgcagggccggccggcatggccagtgtgtgggattacgacctg11940gtactgatggcggtttcccatctaaccgaatccatgaaccgataccgggaagggaaggga12000gacaagcccggccgcgtgttccgtccacacgttgcggacgtactcaagttctgccggcga12060gccgatggcggaaagcagaaagacgacctggtagaaacctgcattcggttaaacaccacg12120cacgttgccatgcagcgtacgaagaaggccaagaacggccgcctggtgacggtatccgag12180ggtgaagccttgattagccgctacaagatcgtaaagagcgaaaccgggcggccggagtac12240atcgagatcgagctagctgattggatgtaccgcgagatcacagaaggcaagaacccggac12300gtgctgacggttcaccccgattactttttgatcgatcccggcatcggccgttttctctac12360cgcctggcacgccgcgccgcaggcaaggcagaagccagatggttgttcaagacgatctac12420gaacgcagtggcagcgccggagagttcaagaagttctgtttcaccgtgcgcaagctgatc12480gggtcaaatgacctgccggagtacgatttgaaggaggaggcggggcaggctggcccgatc12540ctagtcatgcgctaccgcaacctgatcgagggcgaagcatccgccggttcctaatgtacg12600gagcagatgctagggcaaattgccctagcaggggaaaaaggtcgaaaaggtctctttcct12660gtggatagcacgtacattgggaacccaaagccgtacattgggaaccggaacccgtacatt12720gggaacccaaagccgtacattgggaaccggtcacacatgtaagtgactgatataaaagag12780aaaaaaggcgatttttccgcctaaaactctttaaaacttattaaaactcttaaaacccgc12840ctggcctgtgcataactgtctggccagcgcacagccgaagagctgcaaaaagcgcctacc12900cttcggtcgctgcgctccctacgccccgccgcttcgcgtcggcctatcgcggccgctggc12960cgctcaaaaatggctggcctacggccaggcaatctaccagggcgcggacaagccgcgccg13020tcgccactcgaccgccggcgcccacatcaaggcaccctgcctcgcgcgtttcggtgatga13080cggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcgga13140tgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgc13200agccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatca13260gagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaagg13320agaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtc13380gttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaa13440tcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgt13500aaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaa13560aatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgttt13620ccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctg13680tccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctc13740agttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagccc13800gaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgactta13860tcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgct13920acagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatc13980tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaa14040caaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaa14100aaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaa14160aactcacgttaagggattttggtcatgcatgatatatctcccaatttgtgtagggcttat14220tatgcacgcttaaaaataataaaagcagacttgacctgatagtttggctgtgagcaatta14280tgtgcttagtgcatctaacgcttgagttaagccgcgccgcgaagcggcgtcggcttgaac14340gaatttctagctagacattatttgccgactaccttggtgatctcgcctttcacgtagtgg14400acaaattcttccaactgatctgcgcgcgaggccaagcgatcttcttcttgtccaagataa14460gcctgtctagcttcaagtatgacgggctgatactgggccggcaggcgctccattgcccag14520tcggcagcgacatccttcggcgcgattttgccggttactgcgctgtaccaaatgcgggac14580aacgtaagcactacatttcgctcatcgccagcccagtcgggcggcgagttccatagcgtt14640aaggtttcatttagcgcctcaaatagatcctgttcaggaaccggatcaaagagttcctcc14700gccgctggacctaccaaggcaacgctatgttctcttgcttttgtcagcaagatagccaga14760tcaatgtcgatcgtggctggctcgaagatacctgcaagaatgtcattgcgctgccattct14820ccaaattgcagttcgcgcttagctggataacgccacggaatgatgtcgtcgtgcacaaca14880atggtgacttctacagcgcggagaatctcgctctctccaggggaagccgaagtttccaaa14940aggtcgttgatcaaagctcgccgcgttgtttcatcaagccttacggtcaccgtaaccagc15000aaatcaatatcactgtgtggcttcaggccgccatccactgcggagccgtacaaatgtacg15060gccagcaacgtcggttcgagatggcgctcgatgacgccaactacctctgatagttgagtc15120gatacttcggcgatcaccgcttcccccatgatgtttaactttgttttagggcgactgccc15180tgctgcgtaacatcgttgctgctccataacatcaaacatcgacccacggcgtaacgcgct15240tgctgcttggatgcccgaggcatagactgtaccccaaaaaaacagtcataacaagccatg15300aaaaccgccactgcgttccatggacatacaaatggacgaacggataaaccttttcacgcc15360cttttaaatatccgattattctaataaacgctcttttctcttaggtttacccgccaatat15420atcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatcagatctagtagg15480aaacagctatgaccatgattacgcca15506<210>52<211>25<212>DNA<213>重組位點attB1*<400>52agcctgcttttttgtacaaacttgc25<210>53<211>25<212>DNA<213>重組位點attB2*<400>53acccagctttcttgtacaaagtggc25<210>54<211>21<212>DNA<213>重組位點attB3*<400>54caactttattatacatagttg21<210>55<211>21<212>DNA<213>重組位點attB4*<400>55caacttttctatacaaagttg21<210>56<211>25<212>DNA<213>重組位點attR1*<400>56gttcaacttttttgtacaaacttgc25<210>57<211>24<212>DNA<213>重組位點attR2*<400>57ttcaactttcttgtacaaagtggg24<210>58<211>25<212>DNA<213>重組位點attR3*<400>58gttcaactttattatacatagttga25<210>59<211>25<212>DNA<213>重組位點attR4*<400>59gttcaacttttctatacaaagttga25<210>60<211>25<212>DNA<213>重組位點attL1*<400>60agcctgcttttttgtacaaagttgg25<210>61<211>25<212>DNA<213>重組位點attL2*<400>61acccagctttcttgtacaaagttgg25<210>62<211>24<212>DNA<213>重組位點attL3*<400>62ggcaactttattatacaaagttgg24<210>63<211>25<212>DNA<213>重組位點attL4*<400>63acccaacttttctatacaaagttgg25<210>64<211>25<2t2>DNA<213>重組位點attP1*<400>64gttcaacttttttgtacaaagttgg25<210>65<211>25<212>DNA<213>重組位點attP2*<400>65gttcagctttcttgtacaaagttgg25<210>66<211>25<212>DNA<213>重組位點attP3*<400>66gttcaactttattatacaaagttgg25<210>67<211>25<212>DNA<213>重組位點attP4*<400>67gttcaacttttctatacaaagttgg2權利要求1.產生包含至少兩個不同表達盒的多表達構建體的方法，所述方法包括在體外或體內組合i)一個或更多插入片段供體分子，所述插入片段供體分子一起包含至少兩個插入片段I(n)，每個插入片段包含至少一個表達盒，所述插入片段側翼為兩個不同的重組位點A(2n)和A(2n+1)，其中n是表征每個插入片段的從1到m的整數，且m是不同插入片段的總數，和ii)插入片段受體分子IA，其包含兩個不同的重組位點A1和A(2m+2)，其中m是步驟i)的不同插入片段的總數，其中所有重組位點A(1)到A(2m+2)不同，并且特定i的重組邊A(2i-1)可以與相同i的重組邊A(2i)重組，但基本不與另一重組位點重組，所述i是從1到m+1的整數，和iii)至少一種位點特異性重組蛋白質，其能夠重組所述插入片段供體分子和所述插入片段受體分子中的所述重組位點，且在足以將全部所述插入片段轉移入所述插入片段受體分子的條件下溫育所述組合，由此產生多表達構建體。2.權利要求1所述的方法，其中每個插入片段包含在分開的插入片段供體分子中。3.權利要求1或2所述的方法，其中所述插入片段供體DNA分子和所述插入片段受體分子的至少一個由環狀DNA分子組成。4.權利要求1到3任一項所述的方法，其中所述插入片段供體DNA分子和所述插入片段受體分子的至少一個由線性DNA分子組成。5.權利要求1到4任一項的方法，其中所述插入片段受體分子和/或所述插入片段供體分子和/或所述多表達構建體包含原核和/或真核載體。6.權利要求5的方法，其中所述真核載體包括在酵母細胞、植物細胞、魚細胞、真核細胞、哺乳動物細胞或昆蟲細胞中復制的載體。7.權利要求5的方法，其中所述原核載體包括在革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌中復制的載體。8.權利要求5或7的方法，其中所述原核載體包括在埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、農桿菌屬或假單胞菌屬中復制的載體。9.權利要求5、7或8任一項的方法，其中所述原核載體包括在大腸桿菌和農桿菌中都復制的載體。10.權利要求1到9的任一項所述的方法，其中所述插入片段受體分子和/或所述插入片段供體分子和/或所述多表達構建體是包含至少一種選擇標記的載體。11.權利要求1到10任一項所述的方法，其中所述插入片段受體分子還包含(a)毒性基因和(b)選擇標記，其中所述毒性基因和所述選擇標記在不同的DNA片段上，所述DNA片段由至少兩個重組位點彼此分開。12.權利要求10或11的方法，其中選擇標記包含至少一個DNA片段，其選自由下列組成的組(a)DNA片段，其編碼產物在受體細胞中提供針對毒性化合物的抗性；(b)DNA片段，其編碼產物在受體細胞中缺少；(c)DNA片段，其編碼產物在受體細胞中抑制基因產物的活性；(d)DNA片段，其編碼可以鑒定的產物；(e)DNA片段，其編碼在受體細胞中抑制細胞功能的產物；(f)DNA片段，其抑制以上(a)-(e)的任一DNA片段的活性；(g)DNA片段，其結合修飾底物的產物；(h)DNA片段，其編碼能夠被蛋白質、RNA、DNA或化學品識別的特定核苷酸識別序列；(i)DNA片段，其當缺失時直接或間接賦予對受體細胞內特定化合物引起的細胞殺傷的敏感性；(j)DNA片段，其編碼在受體細胞中有毒性的產物；和(k)DNA片段，其可以用于分離或鑒定所希望的分子。13.權利要求10到12任一項的方法，其中所述選擇標記包括至少一種標記，該標記選自由抗生素抗性基因、除草劑抗性基因、tRNA基因、營養缺陷型標記、毒性基因、表型標記、反義寡核苷酸、限制性內切核酸酶、限制性內切核酸酶切割位點、酶切割位點、蛋白質結合位點和與PCR引物序列互補的序列組成的組。14.根據權利要求1到13任一項的方法，其還包括選擇含有所述插入片段的所有所述表達盒的多表達構建體的步驟。15.權利要求1到14任一項的方法，其中所述重組位點選自由loxP、attB、attP、attL和attR組成的組。16.權利要求15的方法，其中所述重組位點包含選自由下列序列組成的組的DNA序列(a)RKYCWGCTTTYKTRTACNAASTSGB(m-att)(SEQIDNO1)；(b)AGCCWGCTTTYKTRTACNAACTSGB(m-attB)(SEQIDNO2)；(c)GTTCAGCTTTCKTRTACNAACTSGB(m-attR)(SEQIDNO3)；(d)AGCCWGCTTTCKTRTACNAAGTSGB(m-attL)(SEQIDNO4)；(e)GTTCAGCTTTYKTRTACNAAGTSGB(m-attP1)(SEQIDNO5)；和對應或互補的DNA或RNA序列，其中R＝A或G；K＝G或T/U；Y＝C或T/U；W＝A或T/U；N＝A、C或G或T/U；S＝C或G；且B＝C、G或T/U。17.權利要求15或16的方法，其中所述DNA序列包含選自由下列序列組成的組的序列(a)AGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGT(attB1)(SEQIDNO6)；(b)AGCCTGCTTTCTTGTACAAACTTGT(attB2)(SEQIDNO7)；(c)ACCCAGCTTTCTTGTACAAACTTGT(attB3)(SEQIDNO8)；(d)GTTCAGCTTTTTTGTACAAACTTGT(attR1)(SEQIDNO9)；(e)GTTCAGCTTTCTTGTACAAACTTGT(attR2)(SEQIDNO10)；(f)GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG(attR3)(SEQIDNO11)；(g)AGCCTGCTTTTTTGTACAAAGTTGG(attL1)(SEQIDNO12)；(h)AGCCTGCTTTCTTGTACAAAGTTGG(attL2)(SEQIDNO13)；(i)ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG(attL3)(SEQIDNO14)；(j)GTTCAGCTTTTTTGTACAAAGTTGG(attP1)(SEQIDNO15)；(k)GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG(attP2、P3)(SEQIDNO16)；(l)AGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGC(attB1*)(SEQIDNO52)；(m)ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGC(attB2*)(SEQIDNO53)；(N)CAACTTTATTATACATAGTTG(attB3*)(SEQIDNO54)(O)CAACTTTTCTATACAAAGTTG(attB4*)(SEQIDNO55)(p)GTTCAACTTTTTTGTACAAACTTGC(attR1*)(SEQIDNO56)(q)TTCAACTTTCTTGTACAAAGTGGG(attR2*)(SEQIDNO57)(r)GTTCAACTTTATTATACATAGTTGA(attR3*)(SEQIDNO58)(s)GTTCAACTTTTCTATACAAAGTTGA(attR4*)(SEQIDNO59)(t)AGCCTGCTTTTTTGTACAAAGTTGG(attL1*)(SEQIDNO60)(u)ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG(attL2*)(SEQIDNO61)(v)GGCAACTTTATTATACAAAGTTGG(attL3*)(SEQIDNO62)(w)ACCCAACTTTTCTATACAAAGTTGG(attL4*)(SEQIDNO63)(x)GTTCAACTTTTTTGTACAAAGTTGG(attP1*)(SEQIDNO64)(y)GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG(attP2*)(SEQIDNO65)(z)GTTCAACTTTATTATACAAAGTTGG(attP3*)(SEQIDNO66)(aa)GTTCAACTTTTCTATACAAAGTTGG(attP4*)(SEQIDNO67)和對應或互補的DNA或RNA序列。18.權利要求1到17任一項的方法，其中所述重組蛋白質選自由Int、IHF、Xis、Cre、Flp和Res組成的組。19.權利要求1到18任一項的方法，其中包含在所述插入片段中的所述表達盒包含至少一個啟動子序列和有效連接所述啟動子序列的待表達的目的核酸序列。20.權利要求19的方法，其中所述啟動子選自能夠在真核或原核細胞或生物中起始轉錄的啟動子。21.權利要求19或20的方法，其中所述啟動子是能夠在植物細胞中起始轉錄的啟動子。22.權利要求19到21任一項的方法，其中有效連接所述啟動子的所述目的核酸選自編碼a)正義、反義或雙鏈RNA，b)多肽或蛋白質的序列組。23.權利要求19到21任一項的方法，其中所述表達盒能夠賦予包含所述表達盒的轉基因植物至少一種表型，該表型選自增加的營養價值、增加的油含量、增加的淀粉含量、增加的蛋白質含量、增加的維生素含量、增加的類胡蘿卜素含量、增強的病原體抗性、改變的油組成和增加的脅迫耐受性。24.通過權利要求1到23任一項的方法獲得的多表達構建體。25.權利要求24的多表達構建體，其中所述多表達構建體包含至少兩個插入片段I(n)，每個插入片段包含至少一個表達盒，并且其中每個插入片段側翼是由重組邊A(2i-1)與相同i的重組邊A(2i)重組產生的序列，其中所述插入片段I(n)和所述重組位點如權利要求1到19的任一項所定義。26.權利要求24或25的多表達構建體，其中所述多表達構建體是如權利要求5到13的任一項所定義的載體。27.包含權利要求24到26任一項的多表達構建體的轉基因細胞或非人生物。28.權利要求27的轉基因細胞或非人生物，其中所述細胞或生物選自原核和真核細胞或生物。29.權利要求27或28的轉基因細胞或非人生物，其中所述細胞或生物選自植物細胞或生物。30.生產糧食或飼料產品、藥物或化學品的方法，所述方法包括提供權利要求27到29任一項的轉基因細胞或生物，生長所述細胞或生物，和任選地，分離所述糧食或飼料產物、藥物或化學品。全文摘要本發明涉及通過定向重組克隆用多基因表達盒組裝構建體的方法。提供具有改造的重組位點的DNA和載體用于重組克隆方法，其使得能夠在一個重組克隆步驟中將多個表達盒有效和特異地組裝成一個多表達構建體。文檔編號C12N5/10GK1981039SQ200580022772公開日2007年6月13日申請日期2005年4月28日優先權日2004年5月10日發明者L·P·洛亞爾申請人:巴斯福植物科學有限公司