專利名稱：環介導等溫擴增檢測剛地弓形蟲的試劑盒及方法
技術領域：
本發明涉及一種用于測定微生物的試劑盒和檢測方法，具體涉及一種環 介導等溫擴增檢測剛地弓形蟲的試劑盒及方法. 背景技術剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii, TOX)是貓科動物的腸il^蟲，由法 國學者Nicolle及Manceaux在剛i^趾鼠的脾臟單核細胞內發現，蟲體呈弓 形，故命名為剛地弓形蟲，該蟲呈世界性分布，人和許多動物都能感染。傳 統的檢測方法有形態學診斷、免疫學檢測等.其中形態學的診斷方法最為可 靠，但費時且易漏檢；免疫學方法并非直接檢測病原體，敏感性較低且特異 性不足。以核酸擴增(Polymerase Chain Reaction, PCR)為基礎的分子生 物學技術的i2AS^艮，為弓形蟲的檢測提供了一種快速、靈敏的方法，但普 通PCR假陽性太高，不適合臨床使用，熒光定量PCR具有靈敏、準確的優 點，但采用TaqMan探針法費用較高，采用熒光染料SYBR Green I可能與 非特異性雙鏈DNA結合容易產生假陽性。環介導等'溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP )不 需PCR經過的變性、復性、5!伸三個階段，可在等溫^Hf下1小時內將目 的序列擴增109倍以上，因此不需特殊i更備，檢測時間更短、敏感性更高； 同時4條特異性引物識別把基因的6個特定區域，特異性更高，因此在M 物檢測上明顯優于PCR (Notomi T， Okayama H， Masubuchi H， et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res, 2000， 28: E63.)。 發明內容本發明目的是提供一種環介導等溫擴增檢測剛地弓形蟲的試劑盒及方 法，解決了普通PCR存在的假陽性高和熒光定量PCR存在的費用高的問題。為達到上述目的，本發明采用的技術方案是 一種環介導等溫擴增檢測 剛地弓形蟲的引物，由一對外引物和一對內引物組成，其序列為外引物1: GGGAATGAAAGAGACGCTAA外引物2: CTGTGTACCTCTTCTCGTATT內引物1: TGCACAGATACTCATGAATTTCACTGTTTGCATAGGTTGCAGTC 內引物2: ACTTTGGTGTATTCGCAGATTGGTTCACGATCTTCTTCTCCTG其中，所述的一對外引物與一對內引物的摩爾數之比為1: 6~9。為達到上述目的，本發明采用的技術方案是 一種環介導等溫擴增檢測 剛地弓形蟲的試劑盒，其特征在于由一套引物、IO倍環介導等溫擴增M 液、DNA聚合酶、陽性對照、陰性對照和顯色劑組成；所述的一套引物是 由一對外引物和一對內引物組成，其序列為外引物1: GGGAATGAAAGAGACGCTAA外引物2: CTGTGTACCTCTTCTCGTATT內引物1: TGCACAGATACTCATGAATTTCACTGTTTGCATAGGTTGCAGTC 內引物2: ACTTTGGTGTATTCGCAGATTGGTTCACGATCTTCTTCTCCTG 其中，所述的一對外引物與一對內引物的摩爾數之比為l: 6~9;所述的 DNA聚合酶為具有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶，活力為8個活性單位/微 升；所述的陽性對照為含有插入剛地弓形蟲一段特異序列的陽性質粒，環介 導等溫擴增反應擴增區位于該特異序列中，其濃度為107拷貝"1;所述的陰 性對照為滅菌雙蒸水；所述的顯色劑為20倍SYBR Green I.1、 上述方案中，所述的10倍環介導等溫擴增反應液(通常用"10 x LAMP 反應液"的形式M示，數字"10"表示的是使用時稀釋的倍數)是由200 mM 三羥曱基^^曱烷鹽酸鹽、100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、40 100mM硫 酸鎂、4 ~ 10M甜菜堿、5 ~ 18mM的dNTPs、和1%質量百分濃度的曲#^1 X-100組成。2、 上述方案中，所述的陽性質粒的制作方法為采用PCR擴增一段剛地 弓形蟲基因特異序列，然后t、PMD18-T栽體，轉化至DH5a感受態細菌， 抽取質粒DNA經序列確M，采用紫外分光光度計測定質粒DNA的濃度并 用滅菌雙蒸水調整拷貝數至107拷貝/ n 1。3、 上述方案中，所述的dNTPs為含有四種dNTP的等量混合物。4、 上述方案中，所述的mM晃學爾濃度的單位，指的是每升溶液中所含 有溶質的摩爾數。5、 上述方案中，所述的SYBR Green I為高靈敏度的DNA熒光染料， SYBR Green I與雙鏈DNA的親和力非常高。對分子生物學中常用的酶沒有 抑制作用。本發明工作原理是環介導等溫擴增反應過程是先由外引物擴增出內引 物擴增所需要的模板即起始反應物模板的合成；緊接著由內引物引導合成把 基因DNA片段，由于內引物擴增的DNA片段含有該引物5，端DNA片段的反向互補序列，因而這些反向互補序列之間通過雜交形成莖環結構，另外一條內引物與其互#^退火雜^引導鏈置換合^^，在擴增的DNA片段 的另外一端產生了新的莖環結構，形成吸鈴狀結構，在一小時內該循環M 可使把DNA累積到109拷貝，電泳后可見擴增終產物由大小不等的DNA片 段組成，呈梯狀條帶，也可通過熒光染料;^察擴增結果。LAMP的整個反 應分三步完成，即起初反應物模板的合成、循環擴增階段、延伸和再循環。 由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點和效果1、 本發明利用BstDNA酶的鏈置換特性，設計4條引物，識別把序列的 6個區域，在等溫條件下生成大量重復的莖環狀結構，在定性檢測時不需任 何特殊設備。2、 本發明的特異性、敏感性均高于普通PCR技術。3、 本發明由于不需經過PCR技術的3個溫度的重復循環，檢測時間比 PCR短。4、 本發明的結果判斷不需經電泳，比PCR簡單，極易推廣。對于定量 檢測，雖然借助了熒光定量PCR儀，但不需合成熒光探針，只需借助熒光 染料SYBR Green I，成本大大減低。5、 本發明的M溫度在601C 65TC左右，且識別乾基因6個特定區域， 引物多聚體及非特異性擴增幾率大大降低，定量準確性大大提高。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步描述實施例一 一種環介導等溫擴增定性檢測剛地弓形蟲的方法，該方法采 用的試劑盒由一套引物、IO倍LAMPJUL液、DNA聚合酶、陽性對照、陰 性對照和顯色劑組成.引物的序列為外引物1: GGGAATGAAAGAGACGCTAA外引物2: CTGTGTACCTCTTCTCGTATT內引物1: TGCACAGATACTCATGAATTTCACTGTTTGCATAGGTTGCAGTC 內引物2: ACTTTGGTGTATTCGCAGATTGGTTCACGATCTTCTTCTCCTG 其中， 一對外引物的摩爾數為5 pmol， 一對內引物的摩爾數為30 pmol (摩爾數之比為1: 6 )。 10 x LAMP反應液由200mM三鞋甲差^氨基甲烷鹽 酸鹽(Tris-HCL )、 100mM氯化鉀(KCL )、 100mM硫酸銨((NH4 ) 2S04 )、 80mM硫酸鎂(MgS04 )、 8M甜菜堿(Betaine )、 14mM的dNTPs、和1% 的曲拉通X-100 (Triton X-100 )組成。所述的DNA聚合酶為Bst DNA聚合醃，8個活性單位/微升。陽性對照為含有插入剛地弓形蟲一段特異序列的陽 性質粒，LAMP反應擴增區位于該特異序列中，濃度為107拷貝/|11。陰性 對照為滅菌雙蒸水。所述的顯色劑為20倍SYBR Green I應用液(20 x SYBR Green I) 定性檢測剛地弓形蟲按照下列步JSMi行(1) 、 HL仿-異戊醇法提取剛地弓形蟲DNA， M于25ylTE中。(2) 、加樣在0.5mlEppendorf管中加入以下試劑10xLAMP反應液(采用實施例一中的試劑盒) 2.5 Jil一對外引物 5pmo1一對內引物 30pmo1提取的剛地弓形蟲DNA 5Ml滅菌雙蒸水 補至24 jii 1(3) 、反應于95t:變性5分鐘，冷卻至室溫后加1 p 1 BstDNA酶，水 谷鍋中60 65"C恒溫反應1小時.(4) 、結果判斷反應結束后加lnl顯色劑，于紫外燈下觀察，反應液 的顏色變為綠色說明檢測結果陽性，并與陽性對照和陰性對照進行比較。本實施例中的一對外引物與一對內引物的摩爾數之比可以選擇l: 7、 1: 8或1:9。 10 x LAMP反應液中的硫酸鎂的摩爾濃度可以選擇40 mM、60 mM 或者是100 mM。甜菜堿的摩爾濃度可以選擇4 M、 7 M或者是10M。 dNTPs 的摩爾濃度可以選擇6mM、 10mM或者是18mM。實施例二 一種環介導等溫擴增定量檢測剛地弓形蟲的方法，由一套引 物、10xLAMP反應液、DNA聚合酶、陽性對照、陰性對照和顯色劑組成。 引物的序列與實施例一相同， 一對外引物和一對內引物的摩爾IS:之比為1: 8。 10 x LAMP >6^液中的疏酸鎂(MgS04)為85mM 200mM，甜菜堿(Betaine) 為7M、 dNTPs為16mM，其它藥品的摩爾濃度與實施例一相同。DNA聚合 酶、陽性對照、陰性對照和顯色劑也與實施例一相同。 定量檢測剛地弓形蟲按照下列步驟進行(1)、 i^"氯仿-異戊醇法提取剛地弓形蟲DNA，保存于25plTE中。 (2 )、標準曲線制作取陽性對照質粒，按10倍倍比稀釋成107 ~ 103的 濃度梯度，在最佳^Ji條件下用Bio-Rad的iCycleriQTM熒光定量PCR儀 同時擴增，以拷貝數的對數為橫坐標，Ct值為縱坐標繪制標準曲線。 (3)、加樣在0.2 1111薄壁管中加入以下試劑10xLAMP反應液 2.5 ul一對外引物 5 pmol一對內引物 40 pmol 提取的剛地弓形蟲DNA 5 ul顯色劑 0.2 ul滅菌雙蒸水 補至 24 ul(4) 反應于951C變性5分鐘，冷卻至室溫后加1 p 1 BstDNA酶，于 Bio-Rad的iCycler iQTM熒光定量PCR儀上60 ~ 65"C恒溫反應45分鐘。(5) 根據樣品的Ct值，通過與標準曲線比較，確定樣品的起始拷貝數. 上述實施例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人士能夠了解本發明的內容并據以實施，并不能以此限制本發明的保 護范圍.凡#^本發明精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發明 的保護范圍之內。
權利要求
1、一種環介導等溫擴增檢測剛地弓形蟲的引物，其特征在于由一對外引物和一對內引物組成，其序列為外引物1GGGAATGAAAGAGACGCTAA外引物2CTGTGTACCTCTTCTCGTATT內引物1TGCACAGATACTCATGAATTTCACTGTTTGCATAGGTTGCAGTC內引物2ACTTTGGTGTATTCGCAGATTGGTTCACGATCTTCTTCTCCTG其中，所述的一對外引物與一對內引物的摩爾數之比為1∶6～9。
2、 一種環介導等溫擴增檢測剛地弓形蟲的試劑盒，其特征在于由一套引 物、IO倍環介導等溫擴增反應液、DNA聚合酶、陽性對照、陰性對照和顯色 劑組成；所述的一套引物是由一對外引物和一對內引物組成，其序列為外引物l: GGGAATGAAAGAGACGCTAA 外引物2: CTGTGTACCTCTTCTCGTATT內引物1: TGCACAGATACTCATGAATTTCACTGTTTGCATAGGTTGCAGTC 內引物2: ACTTTGGTGTATTCGCAGATTGGTTCACGATCTTCTTCTCCTG 其中，所述的一對外引物與一對內引物的摩爾數之比為1: 6~9;所述的 DNA聚合酶為具有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶,活力為8個活性單位/微升； 所述的陽性對照為含有插入剛地弓形蟲一段特異序列的陽性質粒，環介導等溫 擴增反應擴增區位于該特異序列中，其濃度為107拷貝"1;所述的陰性對照 為滅菌雙蒸7jC;所述的顯色劑為20倍SYBR Green I。
3、 根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的10倍環介導等溫 擴增^Jt^bl由200mM三羥甲差^氨基曱烷鹽酸鹽、100mM氯化鉀、lOOmM 疏酸銨、40 100mM硫酸鎂、4 10M甜菜堿、5 ~ 18mM的dNTPs、和1% 質量百分濃度的曲拉通X-100組成.
全文摘要
一種環介導等溫擴增檢測剛地弓形蟲的試劑盒及方法，用于測定微生物。本發明的試劑盒由一套設計的引物、10×LAMP反應液、DNA聚合酶、陽性對照、陰性對照和顯色劑組成。采用本發明可以定性定量檢測剛地弓形蟲。本發明利用Bst DNA酶的鏈置換特性，設計4條引物，識別靶序列的6個區域，在等溫條件下生成大量重復的莖環狀結構，在定性檢測時不需任何特殊設備。因此具有特異性、敏感性高和檢測時間比普通PCR短的特點。
文檔編號C12Q1/68GK101250577SQ20081001865
公開日2008年8月27日 申請日期2008年3月5日 優先權日2008年3月5日
發明者徐蘭蘭, 斌 朱, 楊志雄, 葛海燕 申請人:蘇州大學