利用米根霉發酵產l-蘋果酸的工藝的制作方法

專利名稱：：利用米根霉發酵產l-蘋果酸的工藝的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物化工
技術領域：
，涉及L-蘋果酸的發酵生產新工藝，具體涉及通過添加金屬離子促進米根霉發酵產L-蘋果酸的方法。
背景技術：
：L-蘋果酸是一種重要的有機酸，它廣泛應用在食品、醫藥、保健品、化工及日化等領域。L-蘋果酸是生物三羧酸循環的中間體，易被人體吸收，因此最主要的用途是作為酸味劑和保鮮劑用于食品工業，是繼檸檬酸、乳酸之后的世界第三大酸味添加劑，并占有該市場份額的10%。因其口感接近天然果汁并具有天然香味，酸味柔和、爽快，與4寧檬酸相比，刺激性緩慢、保留時間長，產生的熱量更低，并且不損傷口腔和牙齒等特點，因此有逐漸替代檸檬酸的勢頭，是目前世界食品工業中用量最大和發展前景較好的有才幾酸之一。L-蘋果酸的生產方法主要有直接提取法、化學合成法、固定化酶或細胞轉化法和發酵法4種。直接提取法由于在原材料中含量相對較少，原料來源有限，生產成本很高，批量生產有困難，因此這一工藝方法應用局限性較大；化學合成法是早期L-蘋果酸的生產方法，生產工藝比較復雜，工藝條件要求高，分離精制技術難度大，加之原料為化工產品，應用受到限制，目前很少采用；由于固定化酶或細胞轉化法需用的原料富馬酸多為石油基產品，限制了L-蘋果酸在食品、醫藥等安全領域的應用，隨著化石資源的枯竭也必將影響L-蘋果酸的可持續性生產。綜上，化學合成法、固定化酶法、固定化細胞轉化法均采用了石油基產品富馬酸為原料，隨著石油價格的持續大幅攀升，以及消費者對化學合成產品持謹慎和懷疑態度，利用可再生生物質資源進行天然L-蘋果酸產品生產的微生物發酵法日益倍受關注。用發酵法來制備L-蘋果酸可以實現人類社會生產由傳統的以不可再生化石資源為原料的石油煉制向以可再生生物質資源為原料的生物煉制轉型，逐漸減少對日益枯竭的石油資源的依賴。發酵法生產L-蘋果酸的研究還未有重大進展，目前正在研究的發酵法生產L-蘋果酸的工藝主要有三類一是糖質原料一步法發酵；二是兩步發酵法；三是以富馬酸為原料的直接發酵法。其中兩步發酵法由于涉及到兩種微生物，培養條件要求嚴格，發酵周期也過長，產酸率相對較低，故其局限性較大，與一步法相比更難工業化；而以富馬酸為底物，雖然其產酸水平高、發酵周期短，但因其所用的原料富馬酸為石油基產品，生產成本較高，同時隨著化石資源的枯竭也必將影響L-蘋果酸的可持續性生產，在這一點上與固定化酶或細胞轉化法局限性是相同的。縱觀以上幾種生產方法，以糖質為原料的一步發酵法生產L-蘋果酸的工藝最經濟、最有發展前途。該方法生產成本低、潛力大、產品安全性高、原料來源豐富。但目前微生物一步發酵法尚未見工業化大量生產的報道，存在的主要問題是產酸尚未達到理i侖值，發酵周期太長，并且目前報道的能直接利用糖質原料進行一步發酵生產L-蘋果酸的微生物多為黃曲霉(j^7erg///1^y/av^)菌林，由于其次生代謝產物黃曲霉毒素對人體及動物有致癌作用，不符合食品工業的要求。米根霉(iWzo;woryzae)是經美國FDA認證的安全菌抹，其發酵產物不存在對人體及動物有害的物質，且其中存在類似黃曲霉的L-蘋果酸代謝途徑(見附圖1)。在黃曲霉發酵過程中L-蘋果酸作為代謝終產物積累，而米根霉將L-蘋果酸進一步代謝為富馬酸。因此，米根霉在廣泛應用于L-乳酸和富馬酸的生產過程中，L-蘋果酸往往作為一種代謝副產物出現，尚未引起人們的重視。由于L-蘋果酸只是傳統米根霉發酵產物中的一種副產物，因此目前國內外尚未有利用米根霉體系發酵生產主產物L-蘋果酸的方法。
發明內容本發明的技術目的在于能提供一種利用安全菌種米根霉(/Wzo;wOAj加e)作為生產菌種，改變米根審的傳統代謝途徑(見附圖2),使其發酵主要產物為L-蘋果酸的方法，并達到發酵生產L-蘋果酸的目的。為實現本發明的技術目的，本發明采用的技術方案包括米根霉孢子懸浮液的制備、種子培養以及發酵生產L-蘋果酸，其特征在于在發酵過程中向發酵培養基中添加Fe3、Mn2+、Cr3+、Co2+、Al3+、Cr"溶液中的一種或幾種，使其發酵產物主要為L-蘋果酸，并提高L-蘋果酸的產量。具體步驟為1、米根霉孢子懸浮液的制備實施本發明所使用的生產菌種米根審(及/^印wojzae)菌林包括米根霉iWzo;wsw_yzaeATCC20344,購自美國典型菌種保藏中心；米根霉朋&o/ws072fleME-F11,來自本發明人的申請號為200710024503.2、名稱為"一種富馬酸產生菌及其誘變篩選方法和應用"的專利保藏菌抹，其保藏登記號為CCTCCNO:M207066;米根霉朋&o/nwwyzae3.0242,購自中科院微生物研究所。孢子萌發培養基為常規產孢子培養基，例如，麩皮培養基、YMP培養基、PDA培養基、查氏培養基等。孢子懸浮液制備方法為制備孢子懸浮液的常規方法例如用洗脫液重懸孢子萌發培養基瓊脂斜面上培養57天的孢子。這種洗脫液可以是聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯的磷酸鹽緩沖液；或者吐溫80溶液；或者無菌生理鹽水；或者無菌水等均適用于本發明。2、種子培養種子培養基為根霉屬種子培養的常，見種子培養基。本發明所述的種子培養方法為將孢子懸浮液進行稀釋到1.7xl(^個/mL,轉接到無菌的種子培養基中，在3235'C下培養1828h。種子培養結束即可以得到的種子培養液中的米根霉生長形態呈小球狀，直徑500nm左右。3、發酵生產L-蘋果酸1)關于發酵培養基各種適合根霉屬發酵的培養基都適用于本發明。一種合適的碳源由諸如葡萄糖、蔗糖、木糖、果糖、轉化糖、麥芽糖、糖蜜、各種淀粉、谷物制品或者其它包含了前述任一物質的原料的一類有機碳源組成。葡萄糖是一種優先選擇的有機碳源，每100mL培養基大約10g16g。在發酵得到產物階段，一種合適的碳源由諸如上述的有機碳源和一種無機碳酸鹽組成。一種首選的無機碳酸鹽是碳酸鈞。合適的氮源包括諸如尿素、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、硝酸銨、磷酸二氬銨、天冬酰胺以及蛋白質水解物(例如酪蛋白水解物和乳清水解物)這樣的有機和無機氮源。其中尿素和AiL酸銨是首選。為了優化L-蘋果酸的得率，米^f艮霉培養中可利用的氮源濃度應該被限制在1030mmol/L培養基。添加到根霉屬培養基的無機鹽應該包括磷酸鹽、硫酸鹽、鎂離子和鋅離子。合適的磷酸鹽包括KH2P04和K2HP04，NaH2P04和Na2HP04,磷酸二氫銨或者前述的混合物。在首選的發酵基礎培養基中，碳源是葡萄糖和碳酸鈣，氮源是硫酸銨，再加上磷酸二氫鉀、疏酸鎂、硫酸鋅和玉米漿或者生物素。2)發酵方法本發明所述的發酵方法為將培養好的種子培養基按照5%20%的接種量接種于發酵培養基中，在發酵初始階段，即發酵一開始即向發酵培養基中添加金屬離子Fe"、Mn2+、Cr3+、Co2+、Al3+、0"6+中的一種或幾種，整個發酵過程于30。C35。C下培養96120h。通過該發酵方法，L-蘋果酸的產量達10.6719.10g/L,L-蘋果酸的產量提升I9%176%。本發明所述的另一發酵方法為將培養好的種子培養基按照5%20%的接種量接種于發酵培養基中，在產酸階段，即當發酵過程進行到1828h時，向發酵培養基中添加金屬離子Fe"、Mn2+、Cr3+、Co2+、Al3+、Cr"中的一種或幾種，整個發酵過程于30。C35。C下培養96120h。通過該發酵方法，L-蘋果酸的產量達10.0724.12g/L,L-蘋果酸的產量提升39%244%。本發明所述的加入培養基中的Fe^濃度為0.070.26mmol/L,Mi^+濃度為0.120.30mmol/L,&3+濃度為0.020.25mmol/L，0)2+濃度為0.020.15mmol/L,Al"濃度為0.130.3Ommol/L，C濃度為0.050.25mmol/L。本發明所述的加入培養基中的Fe"濃度為0.120.21mmol/L，Mn"濃度為0.150.25mmol/L,C一+濃度為0.110.20mmol/L,0)2+濃度為0.050.11mmol/L,A產濃度為0.150.23mmol/L,Cr"濃度為0.110.20mmol/L。本發明所述的加入培養基中的最佳Fe"濃度為0.16mmol/L，Mr^+濃度為0.19mmol/L，Cr3+濃度為0.15mmol/L，0)2+濃度為0.09mmol/L,A產濃度為0.19mmol/L,06+濃度為0.17mmol/L。本發明的有益效果在于通過添加特定金屬離子改變了米根霉的代謝過程，提高L-蘋果酸的積累水平。該方法可以使產物L-蘋果酸從安全菌種米根霉發酵的副產物變成主產物，避免了使用致癌菌種黃曲霉發酵生產L-蘋果酸的不安全性。而且，該工藝較明顯地提高了米根霉發酵生產L-蘋果酸的得率，而且操作簡單，高效經濟，適合于產業化生產。圖1米根霉傳統代謝途徑示意圖6酸代謝原理示意圖具體實施方式實施例1本實施例使用的生產菌林為米根霉朋加/nwoo/zaeATCC20344。一、培養基配制孢子萌發培養基YMP培養基種子培養基(g/L):葡萄糖50,尿素2.0,CaCl21.0,K2HPO40.6,MgSO40.3,ZnSQ0.0176，FeSO40.0005，pH值2.5。發酵培養基(g/L):葡萄糖80,(NH4)2SO42.0,K2HPO40.15，KH2PO40.15,MgS040.1,酒石酸0.0075,生物素1.2X10-6mol/L,CaCO360，初始pH值4。以上各種培養基均在11512(TC下滅菌20min，CaC03裝在燒瓶中干熱滅菌24h或者制成50。/。的漿液在發酵罐中滅菌1小時。氮源和培養基其它組分分開滅菌，然后無菌操作添加到先前的培養基混合物中進行接種。待葡萄糖滅菌完成，溫度降到6070°C時，無菌操作下加入CaC03、(NH4)2SCU和其它鹽溶液。二、孢子懸浮液的制備選擇于產孢子培養基上產孢子良好的米根霉i/z!'zopws0/7zaeYMP瓊脂斜面，配制0.05M的含0.1。/。聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯的磷酸鹽緩沖液(pH6.8)洗脫液，用30mL重懸在YMP瓊脂斜面培養基上培養57天的孢子。三、種子培養將孢子懸浮液稀釋到孢子濃度為1.7x107個/mL,按接種量4%轉接到無菌的裝液量為50mL種子培養基的250mL三角瓶中，在35'C下220rpm搖床培養24h,得到種子液。種子培養結束即可以得到的種子培養液中的米^L霉生長形態呈小球狀，直徑500pm左右。四、發酵生產L-蘋果酸發酵產物定性定量^r測方法為經一定方式處理后的發酵液樣品，釆用DIONEXsummitP680高效液相色譜測定其中的L-蘋果酸及其它諸如富馬酸等雜酸含量。色諳柱為Alltech有機酸色譜柱250mmx4.6mm,柱溫為35°C,紫外檢測波長210nm,流動相為0.025mol/L的pH=2.5的KlHbPO4溶液,流速為1mL/min,進樣量為20pL。將步驟三所得的種子液,按接種量5%接種于裝液量3.5L的5L發酵罐中進行發酵，在34'C下通氣率為0.5v/v,通過攪拌速率維持在800rpm對溶氧濃度進行控制，培養108h。在發酵一開始即發酵初始，或發酵過程進行到24h時即產酸階段加入FeCl3、MnS04'H20、CrCl3-6H20、CoCl2'6H20、A12(S04)3、Na2Cr207'2H20中的一種，其發酵產酸結果如表1所示表l加入一種金屬離子溶液的產酸結果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注A為L-蘋果酸，B為富馬酸。實施例2本實施例使用的生產菌株為米根霉iWzo;^0^;加eME-F11,且本實施例的第一、二、三步與實施例l相同，第四步的發酵產物定性定量檢測方法亦與實施例1相同。將步驟三所得的種子液,按接種量5。/。接種于裝液量3.5L的5L發酵罐中進行發酵，在35'C下通氣率為0.5v/v，通過攪拌速率維持在800rpm對溶氧濃度進行控制，培養120h。在發酵一開始即發酵初始，或發酵過程進行到18h時即產酸階段加入FeCl3、MnS04'H20、CrCl3'6H20、CoCl2.6H20、A12(S04)3、Na2Cr20r2H20中的兩種，其發酵產酸結果如表2所示表2加入兩種金屬離子溶液的產酸結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注A為L-蘋果酸，B為富馬酸。實施例3本實施例使用的生產菌林為米根霉i/n'zo;msoo^e3.0242,且本實施例的第一、二、三步與實施例i相同，第四步的發酵產物定性定量檢測方法亦與實施例1相同。將步驟三所得的種子液，按接種量20%接種于裝液量3.5L的5L發酵罐中進行發酵，在30'C下通氣率為0.5v/v,通過攪拌速率維持在800rpm對溶氧濃度進行控制，培養96h。.在發酵一開始即發酵初始，或發酵過程進行到28h時即產酸階段加入FeCl3、MnS04'H20、CrCl3'6H20、CoCl2'6H20、A12(S04)3、Na2Cr207.2H20中的三種，其發酵產酸結果如表3所示表3加入三種金屬離子溶液的產酸結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注A為L-蘋果酸，B為富馬酸。實施例4本實施例使用的生產菌抹為米根霉W/zizopw07zaeATCC20344，且本實施例的第一、二、三步與實施例1相同，第四步的發酵產物定性定量檢測方法亦與實施例1相同。將步驟三所得的種子液，按接種量15%接種于裝液量3.5L的5L發酵罐中進行發酵，在34'C下通氣率為0.5v/v，通過攪拌速率維持在800rpm對溶氧濃度進行控制，培養120h。在發酵一開始即發酵初始，或發酵過程進行到28h時即產酸階段加入FeCl3、MnS04,H20、CrCl3.6H20、CoCl2'6H20、A12(S04)3、Na2Cr2Or2H20中的四種，其發酵產酸結果如表4所示表4加入四種金屬離子溶液的產酸結果組合方式及加入量A產量A增加比例B產量B減少比例力口入時間mmol/Lg/L%g/L%空白/6.93/23.94/Fe3+0.07+Mn2+0.3+Cr3+0.15+Co2+0.0918.6717010.8153發酵初始Al3+0.19+Co2+0.02+Cr6+0.25+Fe3+0.1619.1017613.1045Mn2+0.9+Co2+0.15+Cr6+0.05+Cr3+0.1520.6619818.4725產酸階段Cr3+0.25+Fe3+0.16+Al3+0.13+Co2+0.0923.2223416.0434注A為L-蘋果酸，B為富馬酸。實施例5本實施例使用的生產菌林為米根霉iWzopiw07zaeME-F11,且本實施例的第一、二、三步與實施例1相同，第四步的發酵產物定性定量檢測方法亦與實施例1相同。將步驟三所得的種子液，按接種量12%接種于裝液量3.5L的5L發酵罐中進行發酵，在33。C下通氣率為0.5v/v,通過攪拌速率維持在800rpm對溶氧濃度進行控制，培養108h。在發酵一開始即發酵初始，或發酵過程進行到24h時即產酸階段將FeCl3、MnS04.H20、CrCl3.6H20、CoCl2.6H20、A12(S04)3、Na2Cr207'2H20中的五種，其發酵產酸結果如表5所示表5加入五種金屬離子溶液的產酸結果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注A為L-蘋果酸，B為富馬酸。實施例6本實施例使用的生產菌抹為米根霉i/i&印^。7加e3.0242，且本實施例的第一、二、三步與實施例i相同，第四步的發酵產物定性定量檢測方法亦與實施例1相同。將步驟三所得的種子液，按接種量12%接種于裝液量3.5L的5L發酵罐中進行發酵，在33。C下通氣率為0.5v/v,通過攪拌速率維持在800rpm對溶氧濃度進行控制，培養108h。在發酵一開始即發酵初始，或發酵過程進行到24h時即產酸階段將六種金屬離子FeCl3、MnSCVH20、CrCly6H20、CoCl2'6H20、A12(S04)3、Na2Cr207.2H20均加入發酵體系，其發酵產酸結果如表6所示表6加入六種金屬離子溶液的產酸結果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權利要求1、一種利用米根霉發酵產L-蘋果酸的工藝，包括米根霉孢子懸浮液的制備、種子培養以及發酵生產L-蘋果酸，其特征在于在發酵生產L-蘋果酸過程中向發酵培養基中添加Fe3+、Mn2+、Cr3+、Co2+、Al3+、Cr6+中的一種或幾種，使其發酵產物主要為L-蘋果酸，并提高L-蘋果酸的產量。2、根據權利要求1所述的發酵生產L-蘋果酸的步驟，其特征在于將培養好的種子培養基按照5%20%的接種量接種于發酵培養基中，在發酵初始階段，即發酵一開始即向發酵培養基中添加金屬離子Fe"、Mn2+、Cr3+、Co2+、Al3+、C,+中的一種或幾種，整個發酵過程于30。C35。C下培養96120h。3、根據權利要求1所述的發酵生產L-蘋果酸的步驟，其特征在于將培養好的種子培養基按照5%20%的接種量接種于發酵培養基中，在產酸階段，即當發酵過程進行到1828h時，向發酵培養基中添加金屬離子Fe3+、Mn2+、Cr3+、Co2+、Al3+、C,中的一種或幾種，整個發酵過程于3(TC35。C下培養96120h。4、根據權利要求2和3所述的發酵生產L-蘋果酸的步驟，其特征在于添加的金屬離子的濃度為Fe"濃度為0.070.26mmol/L，Mn2+濃度為0.120.30mmol/L,C一+濃度為0.020.25mmol/L,0>2+濃度為0.020.15mmol/L，Al"濃度為0.130.30mmol/L,Cr"濃度為0.050.25mmol/L。5、根據權利要求2和3所述的發酵生產L-蘋果酸的步驟，其特征在于添加的金屬離子的濃度為Fe3+濃度為0.120.21mmol/L，Mn"濃度為0.150.25mmol/L，0:3+濃度為0.110.20mmol/L,0。2+濃度為0.050.11mmol/L,Al"濃度為0.150.23mmol/L,&6+濃度為0.110.20mmol/L。6、根據權利要求2和3所述的發酵生產L-蘋果酸的步驟，其特征在于添加的金屬離子的濃度為Fe3+濃度為0.16mmol/L，Mn2+濃度為0.19mmol/L,C一+濃度為0.15mmol/L,0)2+濃度為0.09mmol/L，A產濃度為0.19mmol/L,Cr"濃度為0.17mmol/L。全文摘要本發明公開了一種利用米根霉發酵產L-蘋果酸的工藝，包括米根霉孢子懸浮液的制備、種子培養以及發酵生產L-蘋果酸，并在發酵過程中向發酵培養基中添加Fe³⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Al³⁺、Cr⁶⁺中的一種或幾種，以改變米根霉的傳統代謝途徑，使其發酵主要產物為L-蘋果酸。該方法可以使產物L-蘋果酸從安全菌種米根霉發酵的副產物變成主產物，避免了使用致癌菌種黃曲霉發酵生產L-蘋果酸的不安全性。而且，該工藝較明顯地提高了米根霉發酵生產L-蘋果酸的得率，而且操作簡單，高效經濟，適合于產業化生產。文檔編號C12P7/40GK101255450SQ20081001892公開日2008年9月3日申請日期2008年1月31日優先權日2008年1月31日發明者皓何,寧劉,霜李,盛曉燕,和黃申請人:南京工業大學