一種直接發酵法生產l-蘋果酸的方法

一種直接發酵法生產l-蘋果酸的方法
【專利摘要】本發明提供了一種直接發酵法生產L-蘋果酸的方法，以霉菌為出發菌株，葡萄糖為主要生產原料，添加一定量的碳酸鈣和有機無機混合氮源，通過搖床培養考察生產L一蘋果酸的發酵條件。通過對發酵菌株、發酵溫度、培養基初始pH、轉速和接種量等參數的優化，其產酸水平最高可達150.3g/L。其具有廣闊的應用前景。
【專利說明】一種直接發酵法生產L-蘋果酸的方法
[0001]【技術領域】本發明屬于微生物發酵【技術領域】，具體涉及一種直接發酵法生產L-蘋果酸的方法。
【背景技術】
[0002]蘋果酸，又名羥基丁二酸、羥基琥珀酸或1-羥基乙烷二羧酸，分子式為C4H6O5，分子量134.09,結構式為H00CCH0HCH2C00H。蘋果酸具有右旋(D-型)和左旋(L-型)兩種旋光異構體及DL-型外消旋體三種型式產品。其中L-蘋果酸，廣泛存在于生物體中，作為三羧酸循環的一員參與細胞代謝；D_蘋果酸人體不易代謝，吸入或吞咽其對人體有害，作為手性合成的手性源，可以合成許多重要的有機化合物；等量L-蘋果酸和D-蘋果酸的混合物為外消旋DL-蘋果酸，在化學工業方面用途廣泛。
[0003]L-蘋果酸是天然果酸的重要組成部分，廣泛存在于自然界蔬菜和其它水果中，其呈味作用明顯，酸味持久柔和、風味別致、解渴爽口、性質穩定，是優良的酸味劑和調酸劑，是國際公認的安全、無毒無害的食用有機酸。此外，它還具有重要的生理功能，可食藥兩用，對加強機體健康有所裨益。例如，我國是肝炎高感染、高發病國家，據統計，人群感染各類肝炎病毒者達10%左右，目前對肝炎的治療尚無特效藥。發揮蘋果酸護肝作用，將其與民間治療肝病的草藥配伍，開發成護肝產品，作為肝病患者及健康人的日常保健食品，可以加強人體新陳代謝，提高免疫力。總之蘋果酸的應用領域十分廣闊。
[0004]近年來，L-蘋果酸市場逐漸啟動，國際市場對蘋果酸的需求量快速增加，已呈現嚴重供不應求的局面，需求量一直以年均10%左右的高速度增長和保持。由于用天然產物提取或者化學合成工藝生產蘋果酸的方法成本過高，，因此用微生物的方法合成L-蘋果酸是今后大規模生產的趨勢。
[0005]利用微生物發酵法生產L-蘋果酸，目前主要有三種方法，一種是直接發酵法，一般采用糖類為原料，用霉菌直接發酵生產L-蘋果酸；一種是兩步發酵法，即先用根霉菌將糖類發酵成富馬酸，在由酵母將底物富馬酸轉化成L-蘋果酸的工藝；另一種是酶轉化法，即用微生物生產的延胡索酸酶將底物富馬酸轉化為L-蘋果酸。以糖質為原料發酵蘋果酸工藝中，一步發酵法和混合發酵法都有較大進展，但有關的研究報道尚少。本發明以霉菌為出發菌株，葡萄糖為主要生產原料，通過搖床培養考察葡萄糖生產L-蘋果酸的發酵條件，通過對發酵溫度、培養基初始pH、轉速和接種量等參數的優化，其產酸水平最高可達150.3g/L。
[0006]

【發明內容】

[0007]本發明提供了一種直接發酵法生產L-蘋果酸的方法，本專利以霉菌為出發菌株，葡萄糖為主要生產原料，通過搖床培養考察糖蜜生產L-蘋果酸的發酵條件，通過對碳酸鈣濃度、氮源的選擇、發酵溫度和轉速的優化，克服了現有技術的不足，進行了多次探索和試驗，獲得一種生產蘋果酸的方法。[0008]本發明的技術方案是通過如下方式來實施的:
一種直接發酵法生產L-蘋果酸的方法，其包括如下步驟:
將霉菌混合菌液(米曲霉(Aspergillus oryzae)和黃曲霉(Aspergillus flavus)兩種菌液體積比為3: 1，兩種菌液中菌體的濃度均約為lX108CFU/mL)按照10% (體積比)的接種量接入種子罐中進行培養，在溫度為34°C，搖床轉速為180r/min，培養16小時得到液體A，其中，種子罐的培養基組分為:蔗糖3g，NaNO3 0.2g，(NH4)2SO4 0.5g，FeSO4 ? 7H20
0.01g,MnSO4-H2O 0.02g ,MgSO4 0.02g，KH2P04 0.lg，pH值 6.0。然后按照液體A:發酵罐培養基為1: 10的體積比例轉入發酵罐中培養，溫度34°C，培養6d，所述發酵罐培養基組分為:葡萄糖 80g/L，加玉米漿 10g/L，碳酸鈣 75g/L，KH2PO4 0.lg/L, K2HPO4 0.lg/L, (NH4)2SO42g/L，MgSO4 2 g/L, NaCl 0.2g/L，pH 值 6.0 ;
1.一種直接發酵法生產L-蘋果酸的方法，其特征在于發酵時，500mL三角瓶裝一定量的培養液，接入霉菌孢子懸液，在一定的溫度下，以一定轉速，培養6d。
[0009]2.步驟I所述的培養基:葡萄糖80g/L，加玉米漿10g/L，碳酸鈣75g/L，KH2PO4
0.lg/L, K2HPO4 0.lg/L, (NH4)2SO4 2g/L, MgSO4 2 g/L, NaCl 0.2g/L, pH 值 6.0。
[0010]3.步驟I所述的孢子懸液的制備過程為:米曲霉(Aspergillus oryzae),黃曲霉(Aspergillus flavus)兩種菌液的體積比為3: 1，兩種菌液中菌體的濃度均約為lX108CFU/mL,按照10% (體積比)的接種量接入種子罐中進行培養，在溫度為34°C，搖床轉速為180r/min，培養16小時得到。
[0011]4?步驟3所述的種子罐培養基(每升):蔗糖3g，NaNO3 0.2g, (NH4)2SO4 0.5g,FeSO4 ? 7H20 0.01g, MnSO4 ? H2O 0.0`2g, MgSO4 0.02g, KH2PO4 0.lg, pH 值 6.0。
[0012]5.步驟I所述的最佳搖床轉速為180r/min。
[0013]6.步驟I所述的最佳發酵溫度為34°C。
[0014]本發明技術方案通過對現有技術的改進，帶來一系列的有益效果:
1、本發明在現有技術的基礎上，通過大量試驗發現，采用米曲霉(Aspergillusoryzae),黃曲霉(Aspergillus flavus)兩種菌液按照一定比例混合,二者之間具備一定的協同作用，比常規的米曲霉發酵方法，能夠大大提高蘋果酸的產量，采用最優比例3: I混合，其他條件不變的如提下，廣量可提聞30%左右。
[0015]2、培養基篩選:在單因素試驗的基礎上，以L-蘋果酸產量為響應值，選取對L-蘋果酸產量影響顯著的因素以及因素較好的水平區間，根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，采用響應面分析法對發酵培養基參數進行優化，獲得最優培養基組成。每組試驗重復3次，結果取其平均值，由于本申請發酵階段采用添加兩種霉菌，針對兩種霉菌的種子培養及發酵培養，摸索最佳的培養成分配方，種子培養階段主要進行菌體繁殖生長，碳源的消耗量相對要小得多，而且高濃度的碳源底物可阻止細胞生長速度和酶的分泌表達。且蘋果酸的積累是一個復雜的代謝過程，與許多酶的活性有關，而金屬離子作為酶的激活劑或者抑制劑也直接或間接影響蘋果酸的積累，針對黃曲霉與米曲霉兩種霉菌的發酵液對金屬離子的耐性，應用二次通用旋轉組合設計最佳金屬離子濃度，針對不同階段，對培養基進行合理的配伍，能夠獲得最佳的生產效率，最終獲得L-蘋果酸產量為150.3 g/L，且殘糖含量最小為0.7g/L。
[0016]具體實施方法以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0017]實施例1
將霉菌混合菌液(米曲霉(Aspergillus oryzae),黃曲霉(Aspergillus flavus)兩種菌液的體積比為3: 1，兩種菌液中菌體的濃度均約為lX108CFU/mL)按照10% (體積比)的接種量接入種子罐中進行培養，在溫度為34°C，搖床轉速為180r/min，培養16小時得到液體A，其中，種子罐的培養基組分為:蔗糖3g，NaN03 0.2g, (NH4) 2S04 0.5g,FeS04 ? 7H20 0.01g, MnS04 ? H20 0.02g，MgS04 0.02g, KH2P04 0.lg, pH 值 6.0。然后按照液體A:發酵罐培養基為1: 10的體積比例轉入發酵罐中培養，溫度34°C，培養6d得蘋果酸發酵液，所述發酵罐培養基組分為:葡萄糖80g/L，加玉米漿10g/L，碳酸鈣75g/L，KH2P04 0.lg/L, K2HP04 0.lg/L, (NH4)2S04 2g/L, MgS04 2 g/L，NaCl 0.2g/L，pH值
6.0 ;所述米曲霉為米曲霉(Aspergillus oryzae)ACCC30584(例如參見CN2011102578402)，所述黃曲霉為黃曲霉(Aspergillus flavus) ATCC 13697 (參見參考文獻:0rganicacids: old metabolites, new themes Israel Goldberg ET AL, Journal of ChemicalTechnology and Biotechnology);
L-蘋果酸的測定:采用2，7—萘二酚顯色法，取樣品溶液1.0 mL，加入6.0 mL分析純的濃硫酸，再加入0.1 mL 2，7—萘二酚溶液，接著在100°C水浴中加熱15-20 min，取出待冷卻至室溫后，于385 nm下進行比色測定，以蒸餾水作對照校正儀器零點。用標準樣品先作標準曲線，以蘋果酸含量為橫坐標，385 nm處吸收值即0D385為縱坐標，通過未知樣品在385nm處的OD值，則可在標準曲線上查得相應的蘋果酸含量。檢測L-蘋果酸產量為150.3 g/L，且殘糖含量為0.7g/L。
[0018]實施例2
本實施例說明兩種菌協同培養對產酸的影響:將米曲霉菌液(米曲霉菌液中菌體的濃度為I X 108CFU/mL)按照10% (體積比)的接種量接入種子罐中進行培養，在溫度為34°C，搖床轉速為180r/min，培養16小時得到液體A，其中，種子罐的培養基組分為:蔗糖3g，NaN03 0.2g, (NH4)2S04 0.5g, FeS04 ? 7H20 0.01g, MnS04 ? H20 0.02g，MgS04 0.02g,KH2P04 0.lg, pH值6.0。然后按照液體A:發酵罐培養基為1: 10的體積比例轉入發酵罐中培養，溫度34°C，培養6d得蘋果酸發酵液，所述發酵罐培養基組分為:葡萄糖80g/L，加玉米漿 10g/L，碳酸鈣 75g/L, KH2P04 0.lg/L, K2HP04 0.lg/L, (NH4) 2S04 2g/L, MgS04 2g/L, NaCl 0.2g/L, pH 值 6.0 ;所述米曲霉優選為米曲霉(Aspergillus oryzae) ACCC30584(例如參見 CN2011102578402)。
[0019]采用2，7—萘二酚顯色法測定L-蘋果酸產量為105.2 g/L 實施例3
本實施案例說明碳酸鈣濃度對生產L-蘋果酸產量的影響，在使用糖質原料直接發酵L-蘋果酸時，培養基中碳酸鈣的存在是L-蘋果酸有效積累的必要條件。因此，試驗研究了碳酸鈣濃度對兩種霉菌生產L-蘋果酸產量的影響，在發酵培養基中分別添加濃度為0 g/L，60 g/L, 65g/L, 70 g/L, 75 g/L, 80 g/L, 85g/L 的硫酸鈣，發酵溫度為 34°C，轉速為180r/min,發酵 6d。
[0020]由表1可知，從經濟角度分析，當添加碳酸鈣濃度為75g/L時，可獲得較高產量的L-蘋果酸為150.3 g/L，且殘糖含量最小。[0021]表1:不同碳酸鈣濃度對L-蘋果酸產量的影響
【權利要求】
1.一種直接發酵法生產L-蘋果酸的方法，其特征在于將霉菌混合菌液按照10% (體積比)的接種量接入種子罐中進行培養，溫度34°C，轉速為180r/min，培養16小時得到液體A，其中，種子罐的培養基組分為:鹿糖3g，NaNO3 0.2g，(NH4)2SO4 0.5g，FeSO4 ? 7H200.01g，MnSO4 ? H2O 0.02g，MgSO4 0.02g, KH2PO4 0.lg，pH 值 6.0 ;然后按照液體 A:發酵罐培養基為1: 10的體積比例轉入發酵罐中培養，溫度34°C，培養6d，所述發酵罐培養基組分為:葡萄糖 80g/L，加玉米漿 10g/L，碳酸鈣 75g/L，KH2PO4 0.lg/L，K2HPO4 0.lg/L，(NH4)2SO4 2g/L，MgSO4 2 g/L，NaCl 0.2g/L，pH 值 6.0。
2.根據權利要求1所述的直接發酵法生產L-蘋果酸的方法，其特征在于，所述霉菌混合菌液為:米曲霉(Aspergillus oryzae)和黃曲霉(Aspergillus flavus)兩種菌液體積比為3: 1，兩種菌液中菌體的濃度均約為lX108CFU/mL。
3.根據權利要求2所述的直接發酵法生產L-蘋果酸的方法，其特征在于所述米曲霉優選為米曲霉(Aspergillus oryzae)ACCC30584,所述黃曲霉優選為黃曲霉(Aspergillusflavus)ATCC 13697。
【文檔編號】C12R1/69GK103627738SQ201310630635
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月2日 優先權日:2013年12月2日
【發明者】李德衡, 嚴紀文, 李樹標, 劉建陽, 張文麗, 賈召鵬, 魯守斌 申請人:山東阜豐發酵有限公司