一種大量產生β-聚蘋果酸的誘變菌株出芽短梗霉TKPM00006及其培養方法

專利名稱：一種大量產生β-聚蘋果酸的誘變菌株出芽短梗霉TKPM00006及其培養方法
技術領域：
本發明屬于發酵工程技術領域，具體涉及一株大量產生β-聚蘋果酸的誘變菌株 出芽短梗霉ΤΚΡΜ00006及其培養方法。
背景技術：
聚蘋果酸[Poly (malic-acid)或Poly malate，簡稱為PMLA]是以蘋果酸為唯一單 體的均聚高分子聚合物，是一種新型的完全生物降解性高分子材料。該種材料降解的產物 無毒無害，不會對環境產生二次污染，近年來這種高分子材料的開發研究得到了飛速發展。 PMLA主要有三種結構S卩α型、β型、γ型PMLA，唯一存在于人體內的只有β型PMLA。 作為一種脂肪族聚酯，PMLA具有高度的水溶性、生物相容性、生物可降解性、生物可吸收性、 無免疫原性和可化學衍生性，在藥物方面具有很強的用途，可以作為藥物載體用于心血管 及腦腫瘤方面的研究，還可作為微膠囊材料、生物醫學材料如手術縫合線及傷口、燒傷治療 的繃帶等生物醫學材料，直接用于人體，還可用于化妝產品及食品包裝等材料。盡管早在20世紀60年代晚期就已發現聚蘋果酸，但一直到20年后當它從幾種生 物中分離出來時才受到了重視。1969年Shimada等發現一種由蘋果酸組成的高分子化合 物能抑制圓弧青霉(Penicillium cyclopium)的酸性蛋白酶，當時酯鍵中的羧基位置還沒 有確定，沉寂幾年后，聚蘋果酸在黏菌(physarumpolyc印halum)中被重新發現。而后幾年 聚蘋果酸的發展幾乎處于停滯期，1989年Fischer等在黏菌(physarum polycephalum)中 再次發現聚蘋果酸它是DNA聚合酶α的抑制劑。迄今為止，以Shimada，Fischer, Holler et al，Lee等為代表的國外學者對PMLA的性能，合成和應用做了較深入地研究，而我國 在這方面的研究相對較少，直到近幾年才有學者對聚蘋果酸的合成與性能做了基礎性的研 究。因此加強聚蘋果酸的研究，構建可降解生物高分子的一個研究平臺，具有重要的理論價 值和應用價值。聚蘋果酸的合成方法主要有化學法和微生物發酵法兩種。化學合成法又分為直 接聚合和開環聚合兩種。直接聚合法雖然步驟簡單，產物分離提純容易，產率較高，只是聚 蘋果酸分子量低，反應溫度較高，多為Y "PMLA,實際應用價值較低，而且催化劑有毒；開環 聚合法合成產物雖以聚蘋果酸為主，但合成過程步驟較多產率低，中間產物分離提純 繁瑣；生物途徑制備的聚蘋果酸主要是通過微生物發酵合成，生物合成PMLA具有突出的優 點，產物均為β型、分子量高、生產條件溫和、產物純度較高，微生物發酵得到的PMLA分子 量可達200 760kDa，而化學法合成的分子量最多為174kDa，但微生物發酵生產PMLA產量 不高，而且極高的生產成本未能實現大規模的工業生產，以致影響了該物質的應用。本發明利用復合誘變技術篩選獲得一株β -聚蘋果酸高產菌株，并對培養基進行 優化，提高β-聚蘋果酸的產量，有效降低了生產成本，實現了 聚蘋果酸的工業化生產。

發明內容
本發明提供的方法與常規誘變方法相比篩選過程大為簡化，工作效率更高的 β “聚蘋果酸高產菌株的誘變方法，有效提高β “聚蘋果酸產率。本發明解決該技術問題所采用的技術方案為1.采用多組復合誘變技術選育β-聚蘋果酸高產菌株(1)選擇生長良好的β -聚蘋果酸生產菌株ΤΚΡΜ10017斜面菌種，用無菌生理鹽水 洗下孢子，制做IO6個/mL的孢子懸浮液，于30W紫外燈下，30cm處，分別照射1、2、3、4、5、 6、7、8min，將菌懸液梯度稀釋涂平板，避光培養，計算致死率；(2)根據(1)致死率選擇高、中、低三個不同劑量的照射時間分別對菌株TKB016的 孢子懸浮液進行紫外照射處理；(3)然后把(2)三個不同照射時間的菌懸液混合均勻，梯度稀釋涂平板，避光培養；(4)將(3)中的誘變菌株接種到以琥珀酸為唯一碳源的發酵培養基中培養；(5)將(4)中的種子液以10%接種量接種到以檸檬酸為唯一碳源的發酵培養基中
培養；(6)將(5)中的種子液以10%接種量接種到以醋酸為唯一碳源的發酵培養基中培 養；(7)取(6)中的種子液接種到含CaCO3的固體培養基平板上培養，篩選培養基中 菌落大濕潤、色澤黑亮、透明圈明顯的菌株，即得高產聚蘋果酸誘變菌株TKPM00006(該菌 株于2009年10月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種編號 CGMCC No. 3337 ；分類命名出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)；保藏單位地址北京 市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所)。2.出芽短梗霉TKPM00006的培養方法為(1)菌種活化將出芽短梗霉(Aureobasidium，Pullulan)TKPM00006 轉接至 PDA 斜面培養基，25°C培養3 5d ；(2)種子培養選取生長良好的斜面種子用無菌生理鹽水洗下孢子，制備孢子濃 度約IO6個/mL的孢子懸浮液，按10% (ν/ν)接種量接種裝有IOOmL液體種子培養基的 500mL三角瓶中，25°C，200r/m條件下培養2 3d，制得種子液；(3)發酵培養將(2)中的種子培養液以8 10% (ν/ν)接種量接種于發酵培養 基中，在24 30°C下，200r/m振蕩培養7 12d;3.出芽短梗霉TKPM00006所用到的培養基為(1)菌種活化培養基土豆葡萄糖瓊脂培養基(PDA) 土豆200g/L，葡萄糖20g/L， 瓊脂20g/L, pH 4. 0 4. 5，121 °C高壓蒸汽滅菌15min ；(2)種子培養基葡萄糖 8%，丁二酸銨 0.3%，丁二酸 0.2%,K2CO3 0. 04%,KH2PO4 0. 01%, MgSO4 ·7Η20 0. 01%, ZnSO4 ‘ 7Η20 5X 1(Γ4%，玉米浸出液 0. 05%，CaCO3 2% (單獨 滅菌)，pH 4. 5，121 °C高壓蒸汽滅菌15min ；(3)發酵培養基葡萄糖 12%，丁二酸銨 0.3%，丁二酸 0.2%，K2CO3 0. 04%, KH2PO4 0. 01%, MgSO4 ·7Η20 0. 01%, ZnSO4 · 7Η20 5X 1(Γ4%，玉米浸出液 0· 05%，CaCO3 3% (單獨滅菌)，pH 4. 5，121°C高壓蒸汽滅菌15min ；(4)選擇培養基
①3% 琥珀酸，丁二酸銨 0. 3%，丁二酸 0. 2%，K2CO3 0. 04 %, KH2PO4 0. 01 %, MgSO4 · 7H20 0. 01%, ZnSO4 ‘ 7H20 5 X 1(Γ4%，玉米浸出液 0. 05%，CaC033% (單獨滅菌)， pH 4. 5，121°C高壓蒸汽滅菌15min ；②3% 檸檬酸，丁二酸銨 0. 3 %，丁二酸 0. 2 %，K2CO3 0. 04 %, KH2PO4 0. 01 %, MgSO4 · 7H20 0. 01%, ZnSO4 ‘ 7H20 5 X 1(Γ4%，玉米浸出液 0. 05%，CaC033% (單獨滅菌)， pH 4. 5，121°C高壓蒸汽滅菌15min ；③3% 醋酸，丁二酸銨 0. 3%，丁二酸 0. 2%，K2CO3 0. 04 %, KH2PO4 0. 01 %, MgSO4 · 7H20 0. 01%, ZnSO4 ‘ 7H20 5X 1(Γ4%，玉米浸出液 0. 05%，CaCO3 3% (單獨滅菌)， pH 4. 5，121°C高壓蒸汽滅菌15min ；(5)初篩培養基PDA+0. 5 % CaC03 (分開滅菌)。本發明與現有技術相比，有益效果是采用該誘變方法降低了篩選的盲目性，有效 簡化了篩選過程，同時優化了高產菌株的發酵培養條件，大大提高了誘變育種的工作效率。 并且篩選出的高產菌發酵液為乳黃色，省卻了活性炭除黑色素步驟，有利于后續提取工作， 降低了生產成本。本發明的誘變菌株TKPM00006與常規β -聚蘋果酸生產菌相比，其β -聚蘋果酸 生產能力更為高，并由此能夠有效提高β “聚蘋果酸的產率，降低生產成本。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限 制性的，不能以此限定本發明的保護范圍。實施例1從土壤中篩選出的生產β -聚蘋果酸的菌株出芽短梗霉ΤΚΡΜ100171.菌體形態該菌株有酵母樣和真菌菌絲體兩種形態，分泌聚蘋果酸的為酵母狀 細胞，菌絲體狀細胞缺少高分子，幼齡營養細胞橢圓形至檸檬形，數個菌體可連成桿狀，常 具有節孢子、厚垣孢子、芽分生孢子。無性繁殖方式多樣，主要類似于酵母菌的多邊芽殖形 式到形成明顯的真菌絲。2.菌落形態最初粘稠，臟白色，很快轉變為淡綠色，最終為黑色。菌落質地由粘 稠狀到堅硬和革狀，菌落邊緣呈明顯的根狀，菌落中心凹陷較為濕潤，若長期培養周邊由乳 白色轉為黃褐色。3.培養特征此菌為高耗氧菌，最適溫度為24 30°C，微酸環境利于生長， PH4. 5 5. 0，180 200r/m下振蕩培養7 12d。發酵過程中pH呈現先升高后下降的趨 勢，發酵結束時PH降至最低。發酵液顏色有橙黃色、黃褐色、烏青色和黑色，顏色不穩定。4.可以利用的碳源葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、琥珀酸、檸檬酸、醋酸，檸檬酸 鈉、醋酸鈉和油酸等其中之一。5.可以利用的氮源有機氮蛋白胨、牛肉膏、玉米浸提液等，無機氮丁二酸銨、硝 酸鈉、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等。上述氮源可單獨使用也可復合使用。實施例2以高產菌株TKPM10017為出發菌株采用多組復合誘變技術篩選菌株 TKPM000061.誘變菌株的獲得
6
(1)選擇生長良好的β -聚蘋果酸生產菌株ΤΚΡΜ10017斜面菌種，用無菌生理鹽水 洗下孢子，制做IO6個/mL的孢子懸浮液，于30W紫外燈下，30cm處，分別照射1、2、3、4、5、 6、7、8min，菌懸液梯度稀釋涂平板，于25°C避光培養，計算致死率；(2)選擇lmin、3min、5min三個不同劑量的照射時間分別對菌株TKB016的孢子懸 浮液進行紫外照射處理；(3)然后把三個不同照射時間的菌懸液混合均勻，進行10倍系列稀釋10—1 10_6， 取10-4、10_5、10-6三個稀釋度的孢子懸浮液涂布平板，25°C避光培養4 5d ；(4)將上述(3)中混合均勻的誘變菌株混合液接種到以琥珀酸為惟一碳源的發 酵培養基中，發酵培養基成分為3%琥珀酸，0.3%丁二酸銨，0. 04% K2CO3,0.01% KH2PO4, 0. 01% MgSO4. 7H20，5ppm ZnSO4. 7Η20，0· 05%玉米浸出液，2% CaCO3(單獨滅菌)。將種子液 置于25°C恒溫搖床，200r/m,振蕩培養7d ；(5)將上述(4)中的培養液以10%接種量(ν/ν)接種到以3%檸檬酸為唯一碳源 的發酵培養基中培養，培養基其余成分同(3)；(6)將上述(5)中的培養液以10% (ν/ν)接種量接種到以3%醋酸為唯一碳源的 發酵培養基中，培養基其余成分同(3)；(7)取上述(6)中的種子液進行10倍系列稀釋，取10-4、10_5、10-6三個稀釋度的菌 懸浮液涂布固體平板，固體培養基成分為PDA+0.5%CaC03(分開滅菌)；25°C倒置培養4 5d ；(8)從上述平板中挑選菌落大、黑亮濕潤、透明圈明顯的菌落，轉接發酵培養基 培養，檢測聚蘋果酸產量，結果篩選出高產菌株TKPM00006。發酵培養基成分為12%葡 萄糖，0. 3% 丁二酸銨，0. 2% 丁二酸，0. 04% K2C03,0. 01 % KH2PO4,0. 01 % MgSO4. 7H20，5ppm ZnSO4. 7Η20，0· 05% 玉米浸出液，3% CaCO3 (分開滅菌)，500mL 搖瓶裝液量 150mL,25°C, 200r/m，振蕩培養8d。2.誘變菌株TKPM 00006的特性(1)菌體形態主要為酵母樣形態，細胞橢圓形，大小均勻，數個菌體可連成桿狀， 芽分生孢子。(2)菌落形態最初粘稠，乳白色，很快轉變為淡綠色，最終為黑色。菌落質地粘稠 濕潤，圓滑，色澤黑亮，菌落邊緣呈些微的根狀。(3)培養特征25°C，180 200r/m下振蕩培養7 12d，發酵液顏色穩定為乳黃 色，不產黑色素。(4)可以利用的碳源葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、琥珀酸、檸檬酸其中之一。(5)可以利用的氮源丁二酸銨、硝酸鈉、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨及玉米浸提液。上述氮源可單獨使用也可復合使用。(6)可以分別以琥珀酸、檸檬酸、醋酸為唯一碳源進行生長，并生長良好；實施例3出芽短梗霉TKPM00006的培養1.培養基的配制(1)菌種活化培養基土豆葡萄糖瓊脂培養基(PDA) 土豆200g/L，葡萄糖20g/L， 瓊脂20g/L, ρΗ4· 0 4· 5，121 °C高壓蒸汽滅菌15min ；(2)種子培養基葡萄糖 8%，丁二酸銨 0.3%，丁二酸 0.2%,K2CO3 0. 04%,KH2PO40. 01%, MgSO4 ·7Η20 0. 01%, ZnSO4 ‘ 7Η20 5X 1(Γ4%，玉米浸出液 0. 05%，CaCO3 2% (單獨 滅菌)，ρΗ 4. 5，121 °C高壓蒸汽滅菌15min ；(3)發酵培養基葡萄糖 12%，丁二酸銨 0.3%，丁二酸 0.2%，K2CO3 0. 04%, KH2PO4 0. 01%, MgSO4 ‘ 7H20 0. 01%, ZnSO4 ‘ 7H20 5X 1(Γ4%，玉米浸出液 0. 05%，CaC033% (單獨滅菌)，ρΗ 4. 5，121°C高壓蒸汽滅菌15min ；2.菌種活化將出芽短梗霉(Aureobasidium，Pullulan) TKPM00006轉接PDA斜面培養基，于恒 溫培養箱中，25 °C培養3 5d ；3.種子培養選擇生長良好的活化斜面菌種接種于裝有上述1中制得的種子培養基的三角瓶 中，于25°C，200r/m下培養2 3d ；4.發酵培養將3中制得的種子培養液以10% (ν/ν)接種量接種于發酵培養基中，于25°C， 200r/m下培養7 12d ；檢測結果出芽短梗霉(Aureobasidium，Pullulan)TKPM00006在發酵培養基發酵 生產β -聚蘋果酸產量為18. 4士 1. 3g/L.
8
權利要求
一種大量產生β 聚蘋果酸的誘變菌株出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)TKPM00006。
2.根據權利要求1所述的一種大量產生聚蘋果酸的誘變菌株出芽短梗霉 ΤΚΡΜ10017，其特征在于所述誘變菌株ΤΚΡΜ00006是以從我國寧夏回族自治區銀川市王太 堡果園土壤中篩選出的β _聚蘋果酸生產菌ΤΚΡΜ10017的基礎上采用多組復合誘變技術選 育獲得的。
3.根據權利要求1所述的一種大量產生聚蘋果酸的誘變菌株出芽短梗霉 ΤΚΡΜ00006，其特征在于所述的誘變處理方法為(1)選擇生長良好的β-聚蘋果酸生產菌株ΤΚΡΜ10017斜面菌種，用無菌生理鹽水洗下 孢子，制做IO6個/mL的孢子懸浮液，于30W紫外燈下，30cm處，分別照射1、2、3、4、5、6、7、 8min，將菌懸液梯度稀釋涂平板，避光培養，計算致死率；(2)根據(1)致死率選擇高、中、低三個不同劑量的照射時間分別對菌株TKPM00006的 孢子懸浮液進行紫外照射處理；(3)然后把(2)三個不同照射時間的菌懸液混合均勻，梯度稀釋涂平板，避光培養；(4)將(3)中的混合均勻的誘變菌株混合液10%接種量接種到以琥珀酸為唯一碳源的 發酵培養基中培養；(5)將(4)中的種子液以10%接種量接種到以檸檬酸為唯一碳源的發酵培養基中培養；(6)將(5)中的種子液以10%接種量接種到以醋酸為唯一碳源的發酵培養基中培養；(7)取(6)中的種子液接種到含CaCO3的固體培養基平板上培養，篩選培養基中菌落 大濕潤、色澤黑亮、透明圈明顯的菌株，即得高產聚蘋果酸誘變菌株
4.根據權利要求1所述一種大量產生β-聚蘋果酸的誘變菌株出芽短梗霉ΤΚΡΜ00006 及其培養方法，其特征在于菌株的特征為(1)菌體形態主要為酵母樣形態，細胞橢圓形，大小均勻，數個菌體可連成鏈狀，芽分 生孢子。(2)菌落形態最初粘稠，乳白色，很快轉變為淡綠色，最終為黑色。菌落質地粘稠濕 潤，色澤黑亮，菌落邊緣呈些微的根狀。(3)培養特征25°C，180 200r/m下振蕩培養7 12d，發酵液顏色穩定為乳黃色，不產黑色素。(4)可以利用的碳源葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、琥珀酸、檸檬酸其中之一。(5)可以利用的氮源丁二酸銨、硝酸鈉、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨及玉米浸提液。 上述氮源可單獨使用也可復合使用。(6)可以分別以琥珀酸、檸檬酸、醋酸為唯一碳源進行生長，并生長良好；
5.根據權利要求1所述一種大量產生β_聚蘋果酸的誘變菌株出芽短梗霉ΤΚΡΜ00006 及其培養方法，其特征在于其培養方法為(1)菌種活化將出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans) TKPM00006轉接至PDA斜面 培養基，于25 °C恒溫培養3 5d ；(2)種子培養選取生長良好的斜面種子用無菌生理鹽水洗下孢子，制備孢子濃度約 IO6個/mL的孢子懸浮液，按10% (ν/ν)接種量接種到種子培養基中，于25°C，200r/m下培養2 3d，制得種子液；(3)發酵培養將(2)中的種子培養液以8 10% (ν/ν)接種量接種到發酵培養基 中，于25°C，200r/m下振蕩培養7 12d。
全文摘要
本發明提供了一種大量產生β-聚蘋果酸的誘變菌株出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)TKPM00006及利用該誘變菌株發酵生產聚蘋果酸的方法，該菌株是以從我國寧夏回族自治區銀川市王太堡果園土壤中篩選出的β-聚蘋果酸生產菌TKPM10017的基礎上采用多組復合誘變技術選育出的高產β-聚蘋果酸的誘變菌株。在優化條件下β-聚蘋果酸產量達到18.4±1.3g/L。
文檔編號C12P7/62GK101979499SQ200910071018
公開日2011年2月23日 申請日期2009年10月29日 優先權日2009年10月29日
發明者喬長晟, 徐勇虎, 王鳳榮, 蔣磊, 賈士儒, 鐘堃 申請人:天津科技大學