同步鑒別診斷新城疫病毒和禽流感病毒的核酸檢測試劑盒的制作方法

專利名稱：：同步鑒別診斷新城疫病毒和禽流感病毒的核酸檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明屬于檢驗檢疫
技術領域：
，具體涉及一種同步鑒別診斷新城疫病毒和禽流感病毒的核酸檢測試劑盒。技術背景禽流感(歐洲雞瘟、真雞瘟)與新城疫(亞洲雞瘟、偽雞瘟)同屬國際獸醫局指定的甲類烈性禽類傳染病，都具有傳播快、發病急、死亡率高的特征，在國家動物防疫法上同被列為一類動物疫病。禽流感(記為AIV)與新城疫(記為DNV)的癥狀相似、病理進程難以區分，而社會危害相差懸殊目前對這兩種疫病采取的控制及撲殺的規定不同，禽流感特別是高致病性禽流感如H5N1、H7等可以突破種群傳播的界限，能夠導致易感人群發病，具有極高的致死率；而新城疫屬于嚴格的禽類傳染病，一般對人不致病。所以一旦誤診誤判，后果將不堪想象。同時，并非所有的禽流感均可傳播到人群，只有高致病性禽流感(目前所知主要為H5N1、H7N7、H7N2、H7N3、H9N2等亞型)具備這種能力，其余亞型的禽流感一般對人不致病或低致病(輕微感冒等)，例如常見的H9亞型禽流感。雖然禽流感與新城疫癥狀相似，二者的病原學相差很大，禽流感病毒屬于正粘病毒科甲型流感病毒屬(基因組為分節段的RNA，容易發生重排)，不同亞型的H基因及N基因存在規律性差異；而新城疫病毒是副粘病毒科(基因組為單股不分節的RNA)，因此，可以借助基因診斷等分子生物學手段進行快速準確的鑒別診斷。.新城疫和禽流感對養殖業可造成致命性打擊，高致病性禽流感已造成多人感染與死亡，例如1997年H5N1導致香港18人感染6人死亡，2003年又導致2人感染1人死亡；2004年1-10月則導致越南、泰國33人死亡。1993年美國賓州暴發禽流感，花6000萬美元用于捕殺1700萬只雞；1995年墨西哥暴發禽流感，1800萬只雞被淘汰，3200萬只雞被封鎖，1.3億只雞緊急接種疫苗，直接經濟損失10億美元以上。而在防控禽流感的諸多環節中，最重要的是要快速準確診斷，及時圈定封鎖疫區以免疫情擴散。傳統禽流感、新城疫的診斷方法為雞胚培養試驗、瓊脂擴散試驗、病毒中和實驗、酶聯免疫吸附試驗等，釆用紅細胞血凝抑制試驗及神經氨酸酶抑制試驗來確定亞型。傳統檢測手段耗時長，難度大，操作復雜。因此，研制一種靈敏度高、特異性強、準確性高的"同步鑒別診斷新城疫病毒和禽流感病毒及其H5、H7、H9、Nl亞型的快檢試劑"具有重要的公共衛生意義和現實意義。關于禽流感核酸檢測的專利申請眾多，但這些申請均為單項目檢測，或多項目PCR-電泳法檢測，或H5、H7、H9亞型的多重熒光PCR檢測，費事費力，不能實現新城疫與禽流感通用型、H5、H7、H9、Nl等的同步鑒別檢測。涉及禽流感與新城疫同步檢測的中國專利申請只有一件，申請號為200510042527.1(名稱復合定量聚合酶鏈反應檢測禽流感和新城疫病毒的方法)，但其采用非探針技術而為熒光染料溶解曲線分析法，缺點是特異性差，不能將禽流感分型；究其原因是特異性差的熒光染料溶解曲線分析法不能用作多項目研究，否則過多擴增雜帶干擾導致Tm無法分析。
發明內容本發明的目的在于提供一種能同步鑒別鑒別診斷禽流感病毒和新城疫病毒的核酸檢測試劑盒。其中禽流感病毒還包括其亞型如亞洲主要流行的H5、H7、H9、Nl，通過本試劑盒的檢測，可確定病原體是禽流感病毒還是新城疫病毒，并能確認是高致病型禽流感(H5、Nl、H7)還是其它低致病型禽流感(H9及除H5、H7、H9之外的其它亞型)。本發明提供的核酸檢測試劑盒的工作原理為通過硅膠吸附柱法提取病毒RNA，高濃度胍鹽制成的裂解液在操作開始就加入到待檢標本中，使可能潛在的病毒顆粒裂解變性得以滅活，病毒核酸釋放出來，在有機試劑如乙醇的存在下病毒核酸吸附于硅膠膜上，經過兩次洗滌，除去雜質，低鹽或純水制備的洗脫液將病毒核酸洗脫下來，用作RT-PCRT叫Man熒光探針法檢測的模板。本發明提供的核酸檢測試劑盒，其檢測試劑包括用于硅膠吸附柱法提取病毒RNA的提取試劑和用于提取試劑RT-PCRTaqMan熒光探針法檢測的核酸檢測擴增試劑。此外，還可包括供提取病毒RNA用的固體組織標本的處理液。其中'固體組織標本預處理液的配方如下0.8-2MGTC，0.1-0.8M硫氰酸胺，0.05-0.5MNaOAcPH5.0，2-10%甘油，30-50%苯酚(或使用Trizol/TrizolLS試劑，Invitrogen.CatNo.10296010),用來研磨肉類標本(液氮處理也可)。提取試劑的組成和配方如下裂解液4-5.5MGTC，10-50mMTris-HCIPh6.0-8.0，5-20%非離子表面活性劑即去坭齊U(如TritonX-100、NP-40、Tween20等)、1-10ug/ml多聚腺苷酸或其它載體核酸；去抑制劑l-50mg/ml蛋白酶；洗滌液A:0.5-4MGTC，10-50mMTris-HCIPh6.5-8.0，10-70%乙醇，為體積濃度；洗滌液B:2誦20mMNaCl，0-20mMTris-HCIPh6.5-8.0，30-80%乙醇，為體積濃度；洗脫液含0.01-0.05%重量NaN3的DEPC處理過的純化水；核酸吸附柱硅膠膜(如Millipore公司)性質的層析柱。核酸擴增檢測試劑的組成與配方如下RT國PCR反應液A:40-400MMTrizma—CI或Tricine-CI,Ph8.3-9.2;40-120MMKCI;20-80MM(NH4)2SO4;10-20MMMgCI2;0.01-0.05%Brij-35或TritonX-100或Tween20;0.8-2MMdNTPs,5-40%(mg/ml)甘油等；RT-PCR反應液B:AMV或SuperScriptIII逆轉錄酶，1-100U/反應，RNasin4-40U/反應，抗體封閉或寡核苷酸封閉的HotStartTaqPol，l-5U/反應，適量RT促進劑與糖類穩定劑等；NDVPCR反應液C:0.05-0.8uMNDV正向引物(NDVF)，0.05-0.8uMNDV反向引物(NDVR)，0.01-0.2uMNDVTaqMan探針(NDVP);AIVPCR反應液C:0.05-0.8uMAIV正向引物(AIVF)，0.05-0.8wMAIV反向引物(AIVR)，0.01-0.2liMAIVTaqMan探針(AIVP);H5PCR反應液C:0.05-0.8uMH5正向引物(H5F)，0.05-0.8uMH5反向引物(H5R),0.01-0.2yMH5TaqMan探針(H5P);H7PCR反應液C:0.05-0.8MH7正向引物(H7F)，0.05-0.8uMH7反向引物(H7R)，0.01-0.2uMH7TaqMan探針(H7P);H9PCR反應液C:0.05-0.8uMH9正向引物(H9F)，0.05-0.8uMH9反向引物(H9R)，0.01-0.2PMH9TaqMan探針(H9P);N1PCR反應液C:0.05-0.8uMN1正向引物(NIF)，0.05-0.8uMN1反向引物(NIR)，0.01-0.2uMN1TaqMan探針(NIP)。.上述的引物、探針等寡核苷酸序列的確定是通過分析基因庫中已有新城疫及禽流感的核酸序列，并結合文獻報道的保守區域，通過序列比對獲知特異性后，設計出符合TaqManPCR技術要求的多對引物與探針，并經臨床標本的實踐篩選后確定H5、H7、H9、Nl、通用型禽流感病毒及新城疫病毒特異擴增檢測的引物與探針。選取H和N基因用作分型檢測的靶基因，而選取保守性高的基質蛋白M基因作為檢測禽流感通用型的靶基因。符合設計要求并能最佳實施本發明的引物及探針序列如下擴增NDV的引物序列NDW:5'-agtgatgtgetcggRccttc-3'，NDVR:5'-cctgaggagaRgcatttgeta-3'，擴增AIV的引物序列AIVF:5'-atgagtcttctaaccgaggtcg-3'，AIVR:5'-tgcaaaaacatettcaagtctctg-3'，擴增H5的引物序列H5F:5'-,cagagaggaaataagtggagtaa-3'，H5R:5'-gatagaccagetaccatgattgc-3'，擴增H7的引物序列H7F:5'-attggacacgagacgcaatg-3'，H7R:5'-tttctgagtccgcaagatctattg-3'，擴增H9的引物序列H9F:5'-ttattcgactgtcgcetcatetc-3'，H9R:5'-ctgcaagatccattggacatgg-3'，擴增Nl的引物序列N1F:5'-aggtttgagtctgttgcttggtc-3'，NlR:5'隱caaetcttgatagtgtctgttattatgcc-3'，檢測NDV的Taqman探針NDVP:5，FAM-ttctctageagtgggacagectgc-BHQ13，，檢測AIV的Taqman探針AIVP:5，FAM-tcaggccccetcaaagecg-BHQ13，，檢測H5的Taqman探針H5P:5，FAM-tcaacagtggcgagttecctagca-BHQ13，，檢測H7的Taqman探針'H7P:5，FAM-aatgetgagctgttggtggcaatg-BHQ13，，檢測H9的Taqman探針H9P:5，FAM-cccagaacaggaaggcagcaaaccc國BHQ13，，檢測Nl的Taqman探針NIP:5,FAM-caagtgcttgecatgatggcac—BHQl3,。本發明通過優化RT-PCR—步法反應中的關鍵因素，使RT反應與PCR反應偶聯而連續進行不必分開分步操作，既簡化實驗流程又避免污染，并使兩者高效特異進行，本發明者對RT-PCR—步法的緩沖體系、鹽離子極其濃度、逆轉錄酶的選擇及用量、耐熱聚合酶的選擇及用量、附加劑的使用等進行了深入而獨特的研究。建立了以40-4OOMMTriZma-CI，PH8,3-9.2;40-120MMKCI;20-80MM(NHO2S04;10-20MMMgCI2;0,01-0.05%Brij-35或TritonX-100或Tween20、0.8-2MMdNTPs、5-40%甘油等的配方作為高效PCR/RT-PCR的基礎緩沖液鹽體系；選擇AMV或SuperScriptm逆轉錄酶，用量為l-100UAMV/反應、選擇RNasin4-40U/反應，選擇抗體封閉或寡核苷酸封閉的HotStartTaqPol，用量為1-5U/反應，由此為基礎增添RT促進劑與糖類穩定劑后制成可以穩定儲存的RT-PCR混合酶。上述的引物與探針混合后滴配選擇濃度，最終確定優化后的濃度均為0.05-0.8PM引物，50-200nM探針。另外，本發明還采用體外轉錄RNA作為綠色環保試劑盒的陽性對照，既避免了用病毒株直接作為陽性模板可能帶來的潛在風險，又可實施對標本處理與RT-PCR的雙重監測。通過構建涵蓋H5、H7、H9、通用型禽流感及新城疫病毒擴增耙基因的重組質粒，酶切線型化后，RNA聚合酶行體外轉錄，并經DNA酶消化去除DNA模板，純化后制得RNA，紫外分光光度計測得0D260后計算得到RNA的濃度，采用RNA穩定的儲存液稀釋到適當濃度用作陽性對照。其優點是安全可靠，可以實施核酸提取、逆轉錄、熒光PCR擴增檢測等全程的質控。本發明提供的核酸檢測試劑盒，可實現包括標本處理、核酸擴增、熒光探針雜交檢測等流程在內的同步檢測，并提供了優化的操作程序，快速方便，操作者經過簡單的培訓即可勝任該項工作。通過本試劑盒的檢測，可確定病原體是禽流感病毒還是新城疫病毒，并能確認是高致病型禽流感(H5、Nl、H7)還是其它低致病型禽流感(H9及除H5、H7、H9之外的其它亞型)。具體實施方式本發明的核酸檢測試劑盒的具體操作步驟如下1、用硅膠吸附法提取RNA病毒,取一份體積(V)的液體(如尿囊液)樣本中加入等體積的裂解液，混勻后加入適量如1/5—1/4體積的去抑制劑，振蕩混勻后置55-7(TC5-20分鐘，加入適量如1/3—1/2上述總體積的無水乙醇并顛倒混勻后轉移液體至核酸吸附柱，離心或開啟負壓使液體流穿硅膠膜，在依次通過洗滌液A及B，最后洗脫液滴加于膜中央并流穿，將RNA洗脫下來用作PCR檢測的模板。2、RT-PCRTaqMan熒光探針法檢測，取擴增檢測試劑的反應液A:B:C，按照一定的比例如8:6:l的比例配制成反應液，加入等體積的核酸模板，上機按照50-60°C10-30Min(逆轉錄)、95°C2-5Min(預變性)、95。C0-10S45。C10-30S72°C10-30S預擴增5個循環(低嚴謹度擴增)、95°C0-10S60°C30-60S40-50個循環(高嚴謹度擴增)。根據熒光PCR儀的軟件及試劑盒的質控來判斷標本的陰陽性。下面以實施例對本發明作進一步說明，可以幫助本領域的技術人員更全面的理解本發明，但不以任何方式限制本發明，凡依據本發明的內容所做的任何本領域的等同替換均屬于本發明要求的保護范圍之內。實施例h來自出入境檢驗檢疫局的108份禽流感、新城疫病毒相關標本的檢測。A)標本情況禽流感標本12份(含兩份參考株H5N1與H9，其余禽流感陽標本AIVl-10共10份)；新城疫標本82份(含兩份參考株F48E9與N79株，其余新城疫陽性標本NDV1-80共80份)；各種禽類相關的其它病毒或疫苗14份，來自Intervet;Merialselect,Inc;MaineBiologicalLaboratories,Inc;ISBI;Vinelandlaboratories;AmericanScientificLaboratories,Inc。均為出入境檢驗檢疫局所購或保存。禽流感12份陽性標本中H5陽性標本7份；H9陽性標本5份。兩株禽流感病毒的參考株為禽流感病毒A/chicken/服/1000/97(H5N1)、A/chicken/HK/230.2/01(H9)。其余H5、H9病毒(AIV1-10)由檢驗檢疫局收集、分離、保存。經過HI試驗鑒定為禽流感H5、H9病毒。新城疫標本NDV1-80由檢驗檢疫局收集、分離、保存，經過HI試驗鑒定為新城疫病毒。流感毒階標本兩份。一份為A/chicken/HK/1000/97(H5N1)，毒價為10_65ELD5。/0.1ml,共有11個稀釋度(10倍梯度稀釋)；另一份為A/chicken/服/230.2/01(H9)，毒價為10—72ELD5。/ml，共有9個稀釋度。B)詳細的檢測流程1.標本處理活禽樣品取咽喉拭子和泄殖腔拭子，取咽喉拭子時將拭子深入喉頭口及上顎裂來回刮幾次取咽喉分泌液，取泄殖腔拭子時將拭子深入瀉殖腔轉一圈沾取少量糞便。然后將同一份樣品的咽喉拭子和泄殖腔拭子一并放入盛有lmlPBS的離心管中，充分浸泡，讓拭子在離心管壁上擠壓，使液體擠出，丟棄拭子，充分混勻，10000RPM離心2分鐘，取上清備用。肌肉、臟器樣品取待檢樣品0.5-2g，放在潔凈滅菌研缽中，加適量禽肉組織預處理液或液氮充分研磨，加lmlPBS混勻，取上清備用。其它體液(血清、血漿、尿液、組織滲出液等液體樣品)等直接取樣。2.核酸提取2.1取N個0.5ml離心管(N=標本數量+2個對照品)，作好標記后分別加入IOOu12.2分別用帶濾芯吸嘴加入100iil預處理過的樣品和對照品，用帶濾芯吸嘴反復吹打1-2次。2.3分別用帶濾芯吸嘴加入20iil去抑制劑，蓋上管蓋，振蕩混勻，低速離心數秒，置70'C反應10分鐘。2.4離心數秒，用帶濾芯吸嘴加入110ul無水乙醇，混勻，離心數秒。2.5將作好標記的核酸吸附柱插入連接管后，固定在負壓裝置上，將步驟2.4中的所有液體小心移入核酸提取柱，注意不要將液體濺入其它樣品的核酸提取柱內。2.6開啟負壓，讓核酸提取柱內的液體全部抽干。2.7在每個核酸提取柱內加入500ul洗滌液A，開啟負壓，讓核酸提取柱內的液體全部抽干。2.8在每個核酸提取柱內加入500wl洗滌液B，開啟負壓，讓核酸提取柱內的液體全部抽干。2.9從連接套管上取下核酸提取柱，將其放入2ml離心管中，蓋上管蓋，14000rpm離心2分鐘。2.10將提取柱放入一新的2ml離心管中，小心將120ul洗脫液加在柱面中央，靜置l分鐘。2.11蓋上管蓋，10000rpm離心2分鐘，取2ml離心管中的收集液做PCR反應模板。3.RT-PCR試劑準備及加樣3.1取[RT-PCR反應液A]、[RT-PCR反應液B]、[NDVPCR反應液C]、[AIVPCR反應液C]、H5PCR反應液C]、[H7PCR反應液C]、[H9PCR反應液C]、[NlPCR反應液C]室溫融化后根據待擴增樣品數按以下比例分別配制PCR反應液，并分裝至PCR反應管中，每管15ul。NDV:RT-PCR反應液A:RT-PCR反應液B:謂PCR反應液C=8:61'AIV:RT-PCR反應液A:RT-PCR反應液B:AIVPCR反應液C=8:6:1H5:RT-PCR反應液A:RT-PCR反應液B:H5PCR反應液C=8:6:1H7:RT-PCR反應液A:RT-PCR反應液B:H7PCR反應液08:6:1H9:RT-PCR反應液A:RT-PCR反應液B:H9PCR反應液C=8:6:1Nl:RT-PCR反應液A:RT-PCR反應液B:N1PCR反應液C=8:6:13.2在裝有PCR反應液的反應管中用帶濾芯吸嘴分別加入15ul提取好的RNA溶液(核酸提取步驟2.ll中的收集液)。蓋上管蓋，轉移到擴增檢測區。4.RT-PCR擴增檢測(在擴增檢測區進行)4.1將反應管放入熒光PCR擴增儀進行擴增檢測。4.2循環參數設定(請參照各類儀器的操作軟件進行設置)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4.3樣品設置在儀器軟件的相應樣品設置窗口內填寫各樣品的名稱、類型。5.結果分析根據各類儀器的軟件進行分析，得到各樣品的RNA檢測結果。閾值設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點，結果顯示陰性為準。或可根據儀器噪音情況進行調整。6.結果判定6.1質控標準陰性對照品的測定結果為陰性(CT》40);陽性對照品的測定結果為陽性(CT〈40);應同時滿足上述2項條件，否則試驗無效。6.2待測標本結果判定測定CT值》40的樣品為陰性樣品；測定CT值《32的樣品為陽性樣品；領使CT值在3240之間的樣品為灰區樣品，建議復測。若復測無數值者為陰性，否則為陽性。'C)檢測結果-表l.AIV、H5、H9、NDV標本、禽類相關的其它病毒或疫苗標本中AIV、H5、H9、NDVRNA的檢出結果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>*注由于暫無H7標本故未作檢測及評價。分析準確性方面，在108份各式各樣的標本中均可檢出相應的RNA陽性標本，陽性檢出率100%;特異性方面，在禽類相關的其它病毒或疫苗14份標本和若干份交叉標本中檢測相應的特異病毒RNA均為陰性，特異性符合率100%。附14份干擾性病毒或疫苗分別為(1)EDS雞產蛋下降綜合征(EDS)(Batch09030)系Intervet產品；(2)鴨肝炎病毒；(3)鴨瘟病毒；(4)新城疫I系活疫苗；(5)豬冠狀病毒；(6)BursalDiseaseVaccineMerialselect,Inc.SerialNo:LZ014;(7)Parvokan(parvovirosisandDerzsy，sdisease)疫苗、ParvovirosisAndDerzsy，DiseasesVaccine(lotL71846)系MerialSelect,Inc產品；(8)雞傳染性支氣管炎疫苗BronchitisVaccine(Mass.&Ark.Types)(SerialNo:31003Z)系MaineBiologicalLaboratories,Inc產品；(9)InfectiousLaryngotracheitisVaccineISBIBatchN:987096;(10)腱鞘炎疫苗(TSV)TenosynovitisVaccine(SerialNo:0160003)系Intervet產品；(11)Marek，sDiseaseVaccine)(SerialNo:G9048)MaineBiologicalLaboratoriesInc口(12)FowlPoxVaccineVinelandlaboratories,SerialNo.51234;(13)脊髓炎疫苗AvianEncephalomyelitis-FowlPoxVaccine(SerialNo:P1016)、系MerialSelect,Inc產品；(14)球蟲CoccidiosisVaccine(serialNo:193/00)AmericanScientificLaboratoriesInc.表2PCR-熒光檢測試劑盒檢測的敏感性與雞胚病毒分離比較<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>分析靈敏度方面，與目前該類病毒檢測的"金標準"----"雞胚病毒分離培養試驗"比較，本發明試劑的靈敏度至少與之相當，達到10-8左右。其中以通用型禽流感試劑的靈敏度為最高，達到10—9，而H5、NDV的靈敏度均可達到10—8，H9為10—'。評價該試劑盒采用體外轉錄RNA作為陽性對照，是一個綠色環保的試劑盒。既避免了用病毒株直接作為陽性模板可能帶來的潛在風險，又可實施對標本處理與RT-PCR的雙重監測。實施例2:來自上海市畜牧獸醫站的500份禽類標本的檢測。標本來自上海及周邊地區的禽類標本，標本類型有咽拭子、禽肉。采用組織標本預處理液處理或直接于生理鹽水中擠壓棉拭子獲取可能帶有病毒的液體，取100ul同案例l操作。檢測結果H5、H7、H9、NDV均為陰性，由于考核標本均來源于健康禽類(常規調研采集)，并且考核前后均無禽流感或新城疫的發生，提示經實踐證明，本發明試劑的檢測特異性良好。權利要求1、一種同步鑒別診斷新城疫病毒和禽流感病毒的核酸檢測試劑盒，其特征在于其檢測試劑包括用硅吸附柱法提取病毒RNA的提取試劑和用作RT-PCRTaqMan熒光探針法檢測的核酸擴增試劑，其中提取試劑的組成和配方如下裂解液4-5.5MGTC，10-50mMTris-HClPh6.0-8.0，5-20％去垢劑、1-10μg/ml多聚腺苷酸或其它載體核酸；去抑制劑1-50mg/ml蛋白酶；洗滌液A0.5-4MGTC，10-50mMTris-HClPh6.5-8.0，10-70％乙醇，為體積濃度；洗滌液B2-20mMNaCl，0-20mMTris-HClPh6.5-8.0，30-80％乙醇，為體積濃度；洗脫液含0.01-0.05％重量NaN3的DEPC處理過的純化水；核酸吸附柱硅膠膜性質的層析柱；核酸擴增檢測試劑的組成與配方如下RT-PCR反應液A40-400MMTrizma-Cl或Tricine-Cl，Ph8.3-9.2；40-120MMKCl；20-80MM(NH4)2SO4；10-20MMMgCl2；0.01-0.05％Brij-35或TritonX-100或Tween20；0.8-2MMdNTPs，5-40％(mg/ml)甘油；RT-PCR反應液BAMV或SuperScriptIII逆轉錄酶，1-100U/反應，RNasin4-40U/反應，抗體封閉或寡核苷酸封閉的HotStartTaqPol，1-5U/反應，適量RT促進劑與糖類穩定劑；NDVPCR反應液C0.05-0.8μMNDV正向引物(NDVF)，0.05-0.8μMNDV反向引物(NDVR)，0.01-0.2μMNDVTaqMan探針(NDVP)；AIVPCR反應液C0.05-0.8μMAIV正向引物(AIVF)，0.05-0.8μMAIV反向引物(AIVR)，0.01-0.2μMAIVTaqMan探針(AIVP)；H5PCR反應液C0.05-0.8μMH5正向引物(H5F)，0.05-0.8μMH5反向引物(H5R)，0.01-0.2μMH5TaqMan探針(H5P)；H7PCR反應液C0.05-0.8μMH7正向引物(H7F)，0.05-0.8μMH7反向引物(H7R)，0.01-0.2μMH7TaqMan探針(H7P)；H9PCR反應液C0.05-0.8μMH9正向引物(H9F)，0.05-0.8μMH9反向引物(H9R)，0.01-0.2μMH9TaqMan探針(H9P)；N1PCR反應液C0.05-0.8μMN1正向引物(N1F)，0.05-0.8μMN1反向引物(N1R)，0.01-0.2μMN1TaqMan探針(N1P)；這里，NDV為新城疫病毒，AIV為禽流感病毒，H5、H7、M9和N1為禽流感病毒亞型。2、根據權利要求1所述的同步鑒別診斷新城疫病毒和禽流感病毒的核酸檢測試劑盒，其特征在于所述的擴增引物和探針序列如下-擴增NDV的引物序列NDVF:5'-agtgatgtgetcggRccttc-3'，NDVR:5'-cctgaggagaRgcatttgeta-3'，擴增AIV的引物序列AIVF:5'-atgagtcttetaaccgaggtcg-3'，AIVR:5'-tgcaaaaacatettcaagtctctg-3'，擴增H5的引物序列H5F:5'-aaacagagaggaaataagtggagtaa-3'，H5H:5'-gatagaccagetaccatgattgc-3'，擴增H7的引物序列H7F:5'-attggacacgagacgcaatg-3'，H7R:5'-tttctgagtccgcaagatetattg-3'，擴增H9的引物序列H9F:5'-ttattcgactgtcgcetcatetc-3'，H9R:5'-ctgcaagatccattggacatgg-3'，擴增Nl的引物序列N1F:5'-aggtttgagtctgttgettggtc-3'，'N1R:5'-caaetcttgatagtgtctgttattatgcc-3'，檢測NDV的Taqman探針NDVP:5'FAM-ttctctageagtgggacagectgc陽BHQl3,，檢測AIV的Taqman探針AIVP:5，FAM陽tcaggccccetcaaagecg-BHQ13，，檢測H5的Taqman探針H5P:5，FAM-tcaacagtggcgagttecetagca-BHQ13，，檢測H7的Taqman探針H7P:5，FAM-aatgetgagctgttggtggcaatg—BHQ13，，檢測H9的Taqman探針H9P:5'FAM-cccagaacaggaaggcagcaaaccc-BHQ13，，檢測Nl的Taqman探針NIP:5，FAM-caagtgcttgccatgatggcac—BHQ13，。3、根據權利要求1所述的同步鑒別診斷新城疫病毒和禽流感病毒的核酸檢測試劑盒，其特征在于還包括固體組織標本預處理液，其配方為0.8-2MGTC，0.1-0.8M硫氰酸胺，0.05-0.5MNaOAcPH5.0，2-10%甘油，30-50%苯酚。4、根據權利要求1所述的同步鑒別診斷新城疫病毒和禽流感病毒的核酸檢測試劑盒，其特征在于還采用體外轉錄RNA作為陽性對照。全文摘要本發明屬于檢驗檢疫
技術領域：
，具體為一種同步鑒別診斷新城疫病毒和禽流感病毒的核酸檢測試劑盒。該試劑盒的檢測試劑包括用于硅膠吸附柱法提取病毒RNA的提取試劑、用于RT-PCRTaqMan熒光探針法檢測核酸的檢測擴增試劑和供提取病毒RNA的固體組織標本的預處理液，此外，還采用體外轉RNA作為試劑盒的陽性對照。該試劑盒可以同步快速鑒別診斷禽類疫病中傳染性極高而癥狀相似的新城疫與禽流感，并可確定出H5、H7、H9等當前主要流行亞型，同時可區分出傳染源是否為對人高致病性的禽流感或無致病性或低致病性禽流感等。本試劑盒適于畜牧獸醫站或出入境檢驗檢疫局等實驗室的使用，并可用作大規模的流調及疫情監測等。文檔編號C12Q1/70GK101240352SQ20081003477公開日2008年8月13日申請日期2008年3月13日優先權日2008年3月13日發明者華錦彪,周科隆,縵王申請人:上海科華生物工程股份有限公司