一種3d細胞培養材料及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于材料化學與生物醫藥技術領域，具體涉及細胞體外三維培養的材料及其應生。
【背景技術】
[0002]三維細胞培養技術(three-dimens1nalcell culture, TDCC )是指將具有三維結構不同材料的載體與各種不同種類的細胞在體外共同培養，使細胞能夠在載體的三維立體空間結構中迀移、生長，構成三維的細胞-載體復合物。
[0003]三維細胞培養技術有著重要的應用。普通的細胞培養由于細胞在體外改變的環境下增生逐漸喪失了原有的性狀，往往和體內情況不相符，而動物實驗完全在體內進行，但由于體內的多種因素制約以及體內和外界環境相互影響而變得復雜化，難以研宄單一過程，且難以研宄中間過程。三維細胞培養技術是介于單層細胞培養與動物實驗之間的一種技術，既能最大程度的模擬體內環境，又能展現細胞培養的直觀性及條件可控性的優勢。
[0004]腫瘤生物學:腫瘤的實驗性治療、腫瘤的侵襲性、轉移和中心壞死的機制、腫瘤的血管形成和營養供給、體內基因表達、測試藥物對腫瘤生長和向鄰近組織轉移的抑制效果的模擬等方面。
[0005]軟骨和骨組織:成熟的軟骨細胞和干細胞被廣泛用于三維細胞培養，以再生損傷的軟骨、骨、韌帶、肌腱和膝關節半月板。
[0006]循環系統和心臟:在成熟的組織中及時產生血管網絡是組織工程的重要課題；在治療領域，所關心的也是如何有目的地改變血管形成，以抑制腫瘤的進展。
[0007]神經系統:培植單一神經元成為多細胞聚集體、海馬體活標本切片后測試神經元電勢、神經干細胞培養治療老年癡呆癥、帕金森病等。
[0008]可見細胞培養對生物醫療領域具有重大的意義。
[0009]目前，三維細胞培養的生物反應器研制進展迅速，而且種類多樣，各有不同特點，都是以不同的方式提供給細胞最適宜的生長環境，目前較有代表性的有攪拌式、中空纖維、旋轉等各種生物反應器。但到目前為止，針對腫瘤細胞，干細胞分化的抑制和培養具有良好的效果。但是針對不同的原代哺乳動物細胞，具體的微環境大小，細胞因子組合，以及微環境PH調節等等，特異性細胞的生長條件需要進一步設計具體產品。仍然沒有一種細胞支架能完全同時滿足多種細胞快速、高活力生長，且能滿足干細胞有增殖過程中有效維持細胞干性的需要。
[0010]有鑒于此，有必要對現有三維細胞培養材料進行了改進，以解決上述問題。
【發明內容】
[0011]本發明的目的在于提供一種三維細胞培養材料。
[0012]本發明的另一目的在于提供上述三維細胞培養材料的應用。
[0013]本發明所采取的技術方案是: 一種三維細胞培養材料，所述三維細胞培養材料包括PEG8000@ Fe3O4和PEG4000Fe3O4; 二者的制備方法如下，
PEG8000i Fe3O4的制備方法:
1)烷基化:取粒徑為15~25nm的Fe3O4納米球，加入有機物的氨水溶液，混勻，于8°C ~10°C條件下反應16?20h，使Fe3O4納米球表面被陽離子烷基化形成保護膜；
2)將烷基化的Fe3O4納米球與磷酸化PEG8000水溶液混合，并通過氬氣排除氧氣，再加入金屬鹽，混勻在55?65°C條件下攪拌催化反應I?2h，即得PEG80000 Fe3O4;
PEG400i Fe3O4的制備方法與上述PEG80000 Fe3O4的制備方法相同，除了將磷酸化PEG8000改用為磷酸化PEG400，其他均不變。
[0014]進一步的，上述三維細胞培養材料還包括納米粒NH2OFe3O4,其制備方法為:
O烷基化:取粒徑為100~200nm的Fe3O4納米球，加入有機物的氨水溶液，混勻，于8°C ~10°C條件下反應16?20h，使Fe3O4納米球表面被陽離子烷基化形成保護膜；
2)氨基化:取上述烷基化后的Fe3O4納米球加入到含氫氧化鈉的氨水溶液中，混勻，使反應完全，即得氨基化的納米粒NH2OFe3O4;
或者將烷基化后的Fe3O4納米球加入純正硅酸乙酯中，于14?18°C磁力攪拌18?22h對納米粒進行包埋，洗脫包埋后的納米顆粒，置于含氫氧化鈉的氨水中反應完全，即得氨基化的納米粒NH2OFe3O40
[0015]進一步的，上述有機物的氨水溶液中有機物的濃度為180?220g/L ;所述有機物為順式十八碳-9-烯酸。
[0016]進一步的，上述步驟2)中烷基化的Fe3O4納米球與磷酸化PEG8000水溶液的質量體積比為10g: (350-450)mL ;所述磷酸化PEG8000水溶液中PEG8000濃度為0.2-0.3g/mL。
[0017]進一步的，上述步驟2)中所述金屬鹽為CoCl2，金屬鹽加入量為使其終濃度為0.18—0.22mol/Lo
[0018]進一步的，上述所制得的PEG80000 Fe3O4、PEG400@ Fe3O4分別經紅外線滅菌后，再用稀鹽酸清洗，洗后分別保存在PBS緩沖液中，備用。
[0019]進一步的，上述步驟2)中所述含氫氧化鈉的氨水溶液中的氫氧化鈉濃度為1.8?2.2%w/v0
[0020]三維細胞培養材料的應用，應用過程中的具體操作包括以下步驟:
1)取權利要求1中所述的PEG8000@Fe304、PEG400@Fe3O4溶解到細胞培養基中，
2)將步驟I)中的培養基經超聲波處理3~5min制備細胞培養空腔；
3 )將需要培養的細胞加入到上述經超聲波處理后的培養基中，混勻，在常規培養條下進行培養即可。
[0021]進一步的，上述步驟I)中所述PEG8000@Fe304、PEG4000 Fe3O4、細胞培養基的用量比為(22?27) mg:(8?12) mg:(15?30) mL。
[0022]進一步的，在上述步驟I)的操作過程中，根據所培養的細胞的需求，可以將培養過程中需加入的細胞因子先與權利要求2所述的納米粒NH2OFe3O4進行反應，制得納米粒狀的細胞因子OFe3O4,再將細胞因子OFe3O4與PEG8000@Fe 304、PEG4000 Fe3O4—起加入到細胞培養基中；
上述細胞因子OFe3O4的具體制備過程為:將權利要求2所述納米粒NH2OFe3O4和細胞因子加入甲醛溶液或者戊二醛溶液中，混勻，反應完全即可。
[0023]本發明的有益效果是:
I)控制細胞微環境的變化是模擬細胞活體離體培養、抑制細胞分化、保持細胞活性大規模培養的關鍵技術。本發明三維細胞培養材料對腫瘤細胞、干細胞分化的抑制和培養具有良好的效果；且可滿足對不同的原代哺乳動物細胞的培養。
[0024]2)本發明三維細胞培養材料可長時間保持微環境pH和細胞因子活性和濃度，更有利于細胞的快速生長、增殖以及細胞活的維持。在本發明中，三維細胞培養材料中納米粒NH2OFe3O4方便、容易的固定細胞因子，束膠的外殘基能以氫鍵在低濃度戊二醛的條件下結合細胞因子蛋白。防止了蛋白在水基中游離產生培養效率的低下。
[0025]3)在本發明中，PEG束膠的羥基端結合納米Fe磁珠，在培養好的細胞進行下一步的細胞治療或者其他分子生物學實驗，傳統的分離膠原和細胞的方法，無比復雜并且極端傷害細胞。本專利通過磁珠聯合束膠，在磁場的作用下，沒有磁性的細胞會游離到水基中。
[0026]4)本發明的3D細胞培養束膠構造的羥基端帶上納米磁珠。便于細胞脫膠，將培養好的細胞完好地的釋放到水基中。
[0027]5)腫瘤細胞可以通過自分泌和旁分泌，改變和維持自身生存和發展的條件，促進腫瘤的生長和發展。干細胞龕(the stem cell niche)是干細胞的集中存儲部位，通過特定的細胞外基質和龕細胞提供特殊的微環境，對維持干細胞的高增殖力和誘導定向分化起關鍵作用。原代細胞在活體特定部位也有其特定的培養條件。本發明3D培養材料采用PEG為基本結構，惰性強，pH值穩定，在形成的三維微環境中可以保持腫瘤所需要的生長因子作用活性；保持三維微環境中保持干細胞干性的細胞因子。也能長時間地維持模擬原代細胞生長的微環境。
[0028]6)細胞三維培養時，需要把三維材料的微環境打開，讓細胞釋放到水基中，這是傳統三維培養比較困難的部分，而本發明3D培養材料在束膠上帶上Fe性磁珠，結合磁力架的使用，該材料的構象會發生改變，細胞很容易融解到水基中。
【附圖說明】
[0029]圖1為含有本發明材料的細胞培養基的穩定性檢測；
圖2為本發明3D細胞培養材料形成微環境的電鏡圖。
【具體實施方式】
[0030]一種三維細胞培養材料，所述三維細胞培養材料包括PEG8000@ Fe3O4和PEG4000Fe3O4; 二者的制備方法如下，
PEG8000i Fe3O4的制備方法:
1)烷基化:取粒徑為15~25nm的Fe3O4納米球，加入有機物的氨水溶液，混勻，于8°C ~10°C條件下反應16?20h，使Fe3O4納米球表面被陽離子烷基化形成保護膜；
2)將烷基化的Fe3O4納米球與磷酸化PEG8000水溶液混合，并通過氬氣排除氧氣，再加入金屬鹽，混勻在55?65°C條件下攪拌催化反應I?2h，即得PEG80000 Fe3O4;
PEG400i Fe3O4的制備方法與