β-聚蘋果酸及其鹽的制備方法

專利名稱：β-聚蘋果酸及其鹽的制備方法
技術領域：
本發明的技術方案屬于發酵工程技術領域，具體涉及采用膜技術回流菌 體、截留濃縮P-聚蘋果酸和控制P-聚蘋果酸聚合度，及采用樹脂制備e-聚 蘋果酸鹽、P-聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法。
背景技術：
1969年，研究圓弧青霉菌(尸e"c說/ww c少c/o; /ww)的微生物學家Shimada 和Matsushima等推測該菌中可能存在含蘋果酸結構單元的聚合物，該聚合物 能夠抑制圓弧青霉菌的酸性蛋白酶活性，最終證實該聚合物為聚蘋果酸。1979 年，Vert等首次合成了水溶性脂肪族聚酯——聚蘋果酸，它以聚蘋果酸為唯 一單體。1989年，Fisher等從黏菌(尸/^an/w戶o/;;c印/^/ww)細胞中分離出 聚蘋果酸，并發現它是DNA聚合酶a的抑制劑。迄今為止，以Vert、 Cammas、 Kajiyama等為代表的國外學者已對聚蘋果酸性能和應用做了較深入的研究， 目前國內外有關利用微生物發酵生產聚蘋果酸的專利非常少，已有的發酵生 產或人工合成聚蘋果酸(蘋果酸聚合物)的專利有1995年公開的日本專利 "生產蘋果酸聚合微生物的培養方法(JP7308188A2)"、 1991年公開的日本 專利"酶法生產L-蘋果酸聚合物(JP4341189A2)"和1992年公開的日本專 利"微生物合成L-蘋果酸聚合物(JP4211385A2)",這些專利著重描述了產 聚蘋果酸菌株的培養方法，及醇析獲得聚蘋果酸的方法；美國專利 US4320753，主要是合成聚蘋果酸和相應|3-內酯的衍生物；中國專利 CN101100687，公開了采用不同乙醇濃度醇析，同時獲得普魯蘭和聚蘋果酸 的方法。而關于聚蘋果酸應用的專利較多，如US05811032、 US05324519、 US5702716等多達90余項。
聚蘋果酸是一種特殊的脂肪族聚酯，以蘋果酸為唯一單體、相互通過酯 鍵聯接而成。它是天然多聚物中新近開發的一種生物多聚物。與許多其它天 然多聚物不同，聚蘋果酸分子中有許多自由羧基和非對稱碳原子，這些自由 羧基賦予了它許多特別的性質，它除了具有良好的水溶性、可生物降解性、生物相容性和生物可吸收性之外，還具有兩個顯著的優點(l)易代謝性。由 于L-蘋果酸是生物體內克雷伯氏三羧酸循環的中間體，e-聚蘋果酸容易在 生物體內通過正常的三羧酸循環代謝途徑除去；(2)易修飾性。聚蘋果酸具有 懸掛羧基，容易與其它官能團反應而制得聚蘋果酸衍生物，或引入功能基團 或小分子藥物，從而制得許多具有特殊功能的產物。因此，聚蘋果酸及其衍 生物可作為手術縫合線、組織工程支架材料、藥物載體或原生藥物、藥物控 制釋放體系、食品包裝材料、化妝品等，在生物醫藥、食品、化妝品等領域 獲得重要的應用。
聚蘋果酸可以通過化學的或生物的方法合成，目前兩種方法都在研究中。 通過化學合成可以得到3種聚蘋果酸，即ci、 0、 Y3種類型；而從微生物
細胞中分離的聚蘋果酸僅有e型一種。同化學合成相比，生物合成產品的分
子量較高，可達200 760kDa，而化學合成的聚蘋果酸分子量最多為174kDa。 另外，生物合成所需的原料簡單易得，反應條件溫和，具有較大的開發應用 前景。
出芽短梗霉生產聚蘋果酸過程中的主要副產物是普魯蘭多糖，其易溶于 水，不溶于乙醇。它是一種具有極好的成膜、成纖、阻氣、粘結、無毒性生 物高分子，已廣泛應用于生物醫藥和食品等領域。
到目前為止，發酵法生產e -聚蘋果酸沒有大規模的應用，其主要原因是
發酵周期過長，產率低，生產成本過高，生產的p-聚蘋果酸為多種聚合度的 復合物。

發明內容
本發明所解決的技術問題是發酵過程中利用膜技術回流菌體和截留、 濃縮高分子量P-聚蘋果酸，使低分子量P-聚蘋果酸、蘋果酸及其它成份回 流于發酵過程，降低末端產物0 -聚蘋果酸對P -聚蘋果酸合成過程的抑制作 用，提高發酵過程的菌體密度，控制發酵過程P-聚蘋果酸的聚合度，縮短發 酵周期。采用弱堿性陰離子交換樹脂，吸附P-聚蘋果酸且使普魯蘭多糖溶液 透過，采用堿性溶液洗脫樹脂上吸附的e-聚蘋果酸，得到e-聚蘋果酸鹽。 采用強酸性陽離子交換樹脂吸附P -聚蘋果酸鹽溶液中的鹽離子，經膜濃縮得 游離態的e-聚蘋果酸。
本發明解決該技術問題所采用的技術方案是 1.卩-聚蘋果酸及其鹽的制備方法包括如下步驟 (1 )接種發酵將出芽短梗霉經活化和種子培養后接種于發酵培養基中，pH4.0~4.5，溫 度20-28°C，通氣量0.5-2.5wm，培養72-96h，啟動泵1及2使菌體經膜組 件A (見附圖，膜孔徑0.22-0.8ii m)回流至發酵罐中，壓差0.05-0.hnpa， 滲透液1經膜組件B(見附圖，截留分子量10-100KDa)濃縮，濃縮液回流至 儲罐l，滲透液2返回發酵罐中。控制發酵罐中0-聚蘋果酸含量〈.5g/L，當 發酵罐中e-聚蘋果酸濃度〈0.5g/L時，調節泵1及2的轉速，降低發酵液引 出的速率；當發酵罐中P-聚蘋果酸濃度Hg/L時，調節泵1及2的轉速，提 高發酵液引出的速率；當儲罐A中e-聚蘋果酸含量〉30g/L,將其轉入儲罐2 中。當葡萄糖濃度〈10g/L時，流加300-800g/L葡萄糖、15-40g/LNaNO3的溶 液，維持發酵液中葡萄糖濃度在10g/L左右。當菌體有部分自溶，耗糖速率 下降，停止流加糖液，當糖濃度下降至0.5g/L時，停止發酵，調節泵1與2 的流速，增大膜組件A的壓差，將發酵罐中所有料液泵出，收集滲漏液2， 留待下批實驗配制流加糖及NaN03使用；
(2)日-聚蘋果酸及副產物普魯蘭多糖的制備
① 將第(1)步獲得的e-聚蘋果酸濃縮液經弱堿性陰離子交換樹脂吸附， 收集滲透液，用去離子水沖洗樹脂，洗水與滲透液合并得溶液C。用堿溶液 洗脫吸附在樹脂上的P-聚蘋果酸，洗脫液經脫色得溶液D，將溶液D分別 經濃縮、有機溶劑沉淀、冷凍干燥或噴霧干燥步驟制得白色P-聚蘋果酸鹽產
② 將①所得的溶液D或e-聚蘋果酸鹽產品溶液，經強酸性陽離子交換 樹脂吸附，去除P-聚蘋果酸鹽中的鹽離子，滲透液經膜濃縮去除多余的酸根
離子，經有機溶劑沉淀、冷凍干燥或噴霧干燥步驟制得白色0-聚蘋果酸產品；
③ 將①所得溶液C用膜濃縮，濃縮液中加入氯仿/丁酮混合液(體積比4: 1)，充分振蕩使蛋白析出，離心或過濾除去沉淀。除蛋白的剩余溶液加入2 倍體積無水乙醇，充分攪拌，放置12-24h，使普魯蘭多糖沉淀，分離所得沉 淀經丙酮、乙醚依次洗滌，P205干燥，得普魯蘭多糖粉末狀產品；
說明
(1) 第1步所采用的活化培養基馬鈴薯葡萄糖培養基，121'C滅菌 15min;
(2) 第1步所采用的發酵培養基(w/v): 10% glucose, 0.2% NaN03， 0.01%KH2PO4， 0.02% MgS04 7H20， 0.05% KC1， pH 4.0~ 4.5， 121。C滅 菌15min;
(3) 第l步菌種活化方法
將出芽短梗霉菌株(4weo6aszWMm ; M〃w/a"s ^e-/ )采用活化培養基在
620-28。C進行活化培養48-96小時；
(4)第1步采用的種子培養方法 將斜面上活化的種子培養物接種于發酵培養基中，在20-28'C， 200r/min 條件下振蕩培養48-96h小時。
2. 根據步驟1所述的制備蘋果酸鹽、蘋果酸及普魯蘭多糖的方法，其特 征在于采用膜組件A回流菌體，滲透液1經膜組件B濃縮后，濃縮液回流 至儲罐l，滲透液2返回發酵罐。
3. 根據步驟1所述的制備蘋果酸鹽、蘋果酸及普魯蘭多糖的方法，其特 征在于采用膜組件B截留高分子量P-聚蘋果酸及普魯蘭多糖，低分子量P -聚蘋果酸、普魯蘭多糖及培養基成份回流至發酵過程，降低末端產物反饋抑 制作用并充分消耗培養基成份和讓菌體將低分子量0 -聚蘋果酸、普魯蘭多糖 分別進一步聚合。
4. 根據步驟1所述的制備蘋果酸鹽、蘋果酸及普魯蘭多糖的方法，其特 征在于采用的膜組件A為微濾膜，膜孔徑0.22-0.8 Pm有機或無機膜；采 用的膜組件B為超濾膜，截留分子量為10-100kDa的有機或無機膜。
5. 根據4所述，其特征在于采用的膜組件A和膜組件B的型式為平 板式或中空式。
6. 根據4所述，其特征在于采用的膜組件A和膜組件B中的膜材料為 聚砜、聚醚砜、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯腈等有機膜或氧化鋁質、 氧化鈷質、氧化硅質、硅酸鋁質、碳化硅質等陶瓷膜或Ag膜、Ni膜、Ti膜及 不銹鋼膜等金屬膜或金屬與陶瓷復合型無機膜。
7. 根據步驟1所述的制備蘋果酸鹽、蘋果酸及普魯蘭多糖的方法，其特 征在于由膜組件B分離獲得的濃縮液經陰離子交換樹脂吸附，用堿溶液洗 脫吸附在樹脂上的e-聚蘋果酸，洗脫液經膜濃縮去除多余的堿，濃縮液經脫 色、進一步濃縮，有機溶劑沉淀、冷凍干燥或噴霧干燥制得白色e-聚蘋果酸 鹽產品；采用e-聚蘋果酸鹽產品溶液或權利要求l中的溶液D，經強酸性陽
離子交換樹脂吸附，滲透液經膜濃縮去除多余的酸，進一步濃縮，采用有機 溶劑沉淀、冷凍干燥或噴霧干燥制得白色e -聚蘋果酸產品。
8. 根據步驟1所述的制備蘋果酸鹽、蘋果酸及普魯蘭多糖的方法，其特 征在于采用弱堿性的陰離子交換樹脂吸附e -聚蘋果酸而使中性的普魯蘭多
糖穿過，滲透液經濃縮、提純、干燥制得普魯蘭多糖。
9. 根據7所述的制備蘋果酸鹽、蘋果酸及普魯蘭多糖的方法，其特征在 于所用的堿溶液為pH8-9的氨水或銨鹽、0.1mol/LNaOH等。
10. 根據7所述的制備蘋果酸鹽、蘋果酸及普魯蘭多糖的方法，其特征在于所用的有機溶劑為乙醇、丙酮等。
11. 根據7所述的制備蘋果酸鹽、蘋果酸及普魯蘭多糖的方法，其特征 在于，采用的膜為有機膜或無機膜，膜組件型式為平板式或中空式；膜材料 為聚砜、聚醚砜、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯腈等有機膜或氧化鋁質、 氧化鈷質、氧化硅質、硅酸鋁質、碳化硅質等陶瓷膜或Ag膜、Ni膜、Ti膜 及不銹鋼膜等金屬膜或金屬與陶瓷復合型無機膜。
12. 根據步驟1所述的制備蘋果酸鹽、蘋果酸及普魯蘭多糖的方法，其 特征在于所述的陰離子交換樹脂為已處理的碳酸型、氫氧根型和氯型的弱
堿性的陰離子交換樹脂。
13. 根據步驟1所述的制備蘋果酸鹽、蘋果酸及普魯蘭多糖的方法，其 特征在于所述的陽離子交換樹脂為強酸性陽離子交換樹脂。
14. 根據步驟1所述的制備蘋果酸鹽、蘋果酸及普魯蘭多糖的方法，其 特征在于當葡萄糖濃度〈10g/L時，流加300-800g/L葡萄糖、15-40g/LNaNO3 溶液，維持發酵液中葡萄糖濃度在10g/L左右。
本發明與現有技術相比，有益效果是第一，采用膜技術使P-聚蘋果酸 發酵過程的e-聚蘋果酸聚合度得到一定控制，縮短發酵周期；第二，同時獲 得P-聚蘋果酸鹽、P-聚蘋果酸及普魯蘭多糖三種產品，并可根據e-聚蘋果 酸的應用特性進一步切割e-聚蘋果酸產品的聚合度；第三，因發酵過程中的 高分子量P -聚蘋果酸及普魯蘭多糖被截留排出發酵過程，降低了末端產物的 反饋抑制作用，提高了e-聚蘋果酸及普魯蘭多糖的產率。第四，實現了細胞 的循環使用，提高了發酵罐中菌體密度。


圖1. P-蘋果酸鹽與獲得副產物普魯蘭多糖的的工藝流程示意圖 附圖標記
1.發酵罐2.泵1 3.膜組件A 4.滲漏液1 5.泵4 6.泵3 7.儲罐1 8.儲罐2 9.泵2 IO.膜組件B ll.濃縮液12.滲透液2 13.菌體 14.陰離子交換柱15.洗脫液16.儲罐3 17.泵6 18.滲透液 19.儲罐4 20.泵5
圖2. p-蘋果酸的制備方法 附圖標記
l.泵l2.儲罐2 3.陽離子交換柱4.滲透液5.儲罐2 6.泵2
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具體實施例方式
下面結合實施例對本發明做進一步說明，本發明所涉及的主題保護范圍 并非僅限于這些實施例。
實施例1
按如下步驟制備P -聚蘋果酸、P -聚蘋果酸鹽和普魯蘭多糖 第一步，培養基配制
① 活化培養基馬鈴薯葡萄糖培養基，12rC滅菌15min;
② 發酵培養基的配制(w/v): 10%glucose， 0.2%NaNO3， 0.01% KH2P04， 0.02% MgS04 7H20， 0.050/oKCl， pH4.0 4.5， 121。C滅菌15min。
第二步，菌種活化
將4。C保存的出芽短梗霉菌株(Ji^eo6aw'c^m /w/Zw/ara z》e-7)，轉接于 活化培養基斜面上，在25。C進行活化培養48小時。 第三步，種子培養
將斜面上活化的種子培養物接種于裝100ml發酵培養基的500ml三角瓶 中，在25""C， 200r/min條件下振蕩培養48小時。 第四步，接種發酵將第三步制得的培養物以5%的接種量接種于裝100ml發酵培養基的 500ml三角瓶中，初始pH4.0 4.5，溫度25。C，轉速200r/min,培養7天。最 后得發酵液中P -聚蘋果酸含量為1.6g/L。
第五步P -聚蘋果酸及副產物普魯蘭多糖的制備
① 將第四步獲得的P -聚蘋果酸發酵液經離心，上清液經弱堿性陰離子交 換樹脂吸附，收集滲透液，用3倍樹脂體積的去離子水沖洗樹脂，洗水與滲 透液合并。用pH8-9的氨水或銨鹽、或0.1mol/LNaOH溶液等堿溶液洗脫吸 附在樹脂上的e-聚蘋果酸，洗脫液經脫色、濃縮，有機溶劑沉淀、冷凍干燥 或噴霧干燥制得白色P -聚蘋果酸產品，此產品為P -聚蘋果酸鹽；
② 將①所得的洗脫液脫色后溶液或產品溶液，經強酸性陽離子交換樹脂 吸附，去除P -聚蘋果酸鹽中的鹽離子，滲透液經膜濃縮去除多余的酸根離子， 有機溶劑沉淀、冷凍干燥或噴霧干燥制得白色P -聚蘋果酸產品；
③ 將①所得滲透液用截留分子量100kDa膜組件濃縮，進一步濃縮，濃 縮液中加入氯仿/丁酮混合液(體積比4: 1)，充分振蕩使蛋白析出，離心或 過濾除去沉淀。除蛋白溶液加入2倍體積無水乙醇，充分攪拌，放置12-24h， 使普魯蘭多糖沉淀，分離所得沉淀經丙酮、乙醚依次洗滌，P205干燥，得普 魯蘭多糖粉末狀產品。實施例2
按如下步驟制備P -聚蘋果酸、3 -聚蘋果酸鹽和普魯蘭多糖
第一步，培養基配制
同實施例1
第二步，菌種活化
同實施例1
第三步，種子培養
同實施例1
第四步，接種發酵
將第三步制得的培養物以10%的接種量接種于裝4L發酵培養基的7L發 酵罐中，初始pH4.0 4.5，溫度25。C,通氣量0.5-2.5vvm，轉速600-700r/min, 培養7天，此時菌體有部分自溶，耗糖速率下降。最后得發酵液中日-聚蘋果 酸含量為8.7g/L，分子量范圍廣5KDa-1000kDa。
第五步P -聚蘋果酸及副產物普魯蘭多糖的制備
① 將第四步獲得的P -聚蘋果酸發酵液經離心，上清液經截留分子量 100kDa的膜組件濃縮，濃縮液經弱堿性陰離子交換樹脂吸附，收集滲透液， 用3倍樹脂體積的去離子水沖洗樹脂，洗水與滲透液合并。用pH8-9的氨水 或銨鹽、或0.1mol/LNaOH溶液等堿溶液洗脫吸附在樹脂上的e -聚蘋果酸， 洗脫液經脫色、濃縮，有機溶劑沉淀、冷凍干燥或噴霧千燥制得白色P-聚蘋 果酸產品，此產品為e-聚蘋果酸鹽；
② 將①所得的洗脫液脫色后溶液或產品溶液，經強酸性陽離子交換樹脂 吸附，去除P -聚蘋果酸鹽中的鹽離子，滲透液經膜濃縮去除多余的酸根離子， 有機溶劑沉淀、冷凍干燥或噴霧干燥制得白色P -聚蘋果酸產品；
③ 將①所得滲透液用截留分子量100kDa膜組件濃縮，濃縮液中加入氯 仿/丁酮混合液(體積比4: 1)，充分振蕩使蛋白析出，離心或過濾除去沉淀。 除蛋白溶液加入2倍體積無水乙醇，充分攪拌，放置12-24h，使普魯蘭多糖 沉淀，分離所得沉淀經丙酮、乙醚依次洗滌，P20s干燥，得普魯蘭多糖粉末 狀產品。
實施例3
按如下步驟制備3 -聚蘋果酸、P -聚蘋果酸鹽和普魯蘭多糖 第一步，培養基配制 同實施例1 第二步，菌種活化同實施例1 第三步，種子培養 同實施例1 第四步，接種發酵
將第三步制得的培養物接種于發酵培養基中，pH4.0~4.5,溫度25°C， 通氣量0.5-2.5vvm，轉速600-700r/min，培養72h，啟動泵1使菌體經膜組件 A (見附圖，膜孔徑0.8um)回流至發酵罐中，壓差0.05-0.lmpa，滲透液1 經膜組件B(見附圖，截留分子量lOOKDa)濃縮，濃縮液回流至儲罐l，滲透 液2返回發酵罐中。控制發酵罐中P-聚蘋果酸含量^.5g/L，當發酵罐中P-聚蘋果酸濃度〈0.5g/L時，調節泵1及2的轉速，降低發酵液引出的速率；當 發酵罐中P -聚蘋果酸濃度〉lg/L時，調節泵1及2的轉速，提高發酵液引出 的速率；當儲罐1中P-聚蘋果酸含量〉30g/L，將其轉入儲罐2中。發酵6.5 天，產酸10.9g/L，菌體耗糖速率較高，顯微鏡下觀察菌體形態良好。
第五步0 -聚蘋果酸及副產物普魯蘭多糖的制備
① 將第四步獲得的0 -聚蘋果酸發酵液經離心，上清液經截留分子量 100kDa的膜組件濃縮，濃縮液經弱堿性陰離子交換樹脂吸附，收集滲透液， 用3倍樹脂體積的去離子水沖洗樹脂，洗水與滲透液合并。用pH8-9的氨水 或銨鹽、或0.1mol/LNaOH溶液等堿溶液洗脫吸附在樹脂上的P -聚蘋果酸， 洗脫液經脫色、濃縮，有機溶劑沉淀、冷凍干燥或噴霧干燥制得白色P-聚蘋 果酸產品，此產品為P-聚蘋果酸鹽；
② 將①所得的洗脫液脫色后溶液或產品溶液，經強酸性陽離子交換樹脂 吸附，去除P -聚蘋果酸鹽中的鹽離子，滲透液經膜濃縮去除多余的酸根離子， 有機溶劑沉淀、冷凍干燥或噴霧干燥制得白色P -聚蘋果酸產品；
(D將①所得滲透液用截留分子量100kDa膜組件濃縮，進一步濃縮，濃 縮液中加入氯仿/丁酮混合液(體積比4: 1)，充分振蕩使蛋白析出，離心或 過濾除去沉淀。除蛋白溶液加入2倍體積無水乙醇，充分攪拌，放置12-24h， 使普魯蘭多糖沉淀，分離所得沉淀經丙酮、乙醚依次洗漆，P205干燥，得普 魯蘭多糖粉末狀產品。
實施例4
按如下步驟制備P -聚蘋果酸、P -聚蘋果酸鹽和普魯蘭多糖 第一步，培養基配制 同實施例1 第二步，菌種活化同實施例1 第三步，種子培養 同實施例1 第四步，接種發酵
將第三步制得的培養物接種于發酵培養基中，pH4.0 4.5，溫度25°C， 通氣量0.5-2.5vvm，轉速600-700r/min，培養72h，啟動泵1使菌體經膜組件 A (見附圖，膜孔徑0.2211 m)回流至發酵罐中，壓差0.05-0.lmpa，滲透液 1經膜組件B(見附圖，截留分子量lOKDa)濃縮，濃縮液回流至儲罐l，滲透 液2返回發酵罐中。控制發酵罐中P-聚蘋果酸含量〈.5g/L，當發酵罐中P-聚蘋果酸濃度0.5g/L時，調節泵1及2的轉速，降低發酵液引出的速率；當 發酵罐中P-聚蘋果酸濃度〉lg/L時，調節泵1及2的轉速，提高發酵液引出 的速率；當儲罐1中P-聚蘋果酸含量aOgZL，將其轉入儲罐2中。發酵6.5 天，產酸12.1g/L,菌體耗糖速率較高，顯微鏡下觀察菌體形態良好。
第五步e -聚蘋果酸及副產物普魯蘭多糖的制備
① 將第四步獲得的3 -聚蘋果酸發酵液經離心，上清液經截留分子量 10kDa的膜組件濃縮，濃縮液經弱堿性陰離子交換樹脂吸附，收集滲透液， 用3倍樹脂體積的去離子水沖洗樹脂，洗水與滲透液合并。用pH8-9的氨水 或銨鹽、或0.1mol/LNaOH溶液等堿溶液洗脫吸附在樹脂上的P -聚蘋果酸， 洗脫液經脫色、濃縮，有機溶劑沉淀、冷凍干燥或噴霧干燥制得白色P-聚蘋 果酸產品，此產品為P-聚蘋果酸鹽；
② 將①所得的洗脫液脫色后溶液或產品溶液，經強酸性陽離子交換樹脂 吸附，去除P -聚蘋果酸鹽中的鹽離子，滲透液經膜濃縮去除多余的酸根離子， 有機溶劑沉淀、冷凍干燥或噴霧干燥制得白色3 -聚蘋果酸產品；
③ 將①所得滲透液用截留分子量100kDa膜組件濃縮，進一步濃縮，濃 縮液中加入氯仿/丁酮混合液(體積比4: 1)，充分振蕩使蛋白析出，離心或 過濾除去沉淀。除蛋白溶液加入2倍體積無水乙醇，充分攪拌，放置12-24h, 使普魯蘭多糖沉淀，分離所得沉淀經丙酮、乙醚依次洗滌，P205干燥，得普 魯蘭多糖粉末狀產品。
實施例5
按如下步驟制備P -聚蘋果酸、e -聚蘋果酸鹽和普魯蘭多糖 第一步，培養基配制 同實施例1 第二步，菌種活化
12同實施例1 第三步，種子培養 同實施例1 第四步，接種發酵
將第三步制得的培養物以10%接種量接種于發酵培養基中，pH4.0~4.5, 溫度25。C，通氣量0.5-2.5wm，培養72h，啟動泵使菌體經膜組件A (見附 圖，膜孔徑0.8iim)回流至發酵罐中，壓差0.05-0.lmpa，滲透液1經膜組 件B(見附圖，截留分子量lOOKDa)濃縮，濃縮液回流至儲罐l，滲透液B返 回發酵罐中。控制發酵罐中P-聚蘋果酸含量^.5g/L，當發酵罐中3-聚蘋果 酸濃度0.5g/L時，調節泵1及2的轉速，降低發酵液引出的速率；當發酵罐 中P-聚蘋果酸濃度〉lg/L時，調節泵1及2的轉速，提高發酵液引出的速率； 當儲罐A中P -聚蘋果酸含量yOgZL，將其轉入儲罐2中。當葡萄糖濃度^0g/L 時，流加每升含500g葡萄糖、25gNaN03的溶液，維持發酵液中葡萄糖濃度 在10g/L左右。當菌體有部分自溶，耗糖速率下降，停止流加糖液，當糖濃 度下降至0.5g/L時，停止發酵，調節泵1與2的流速，增大膜組件A的壓差， 將發酵罐中所有料液泵出，收集滲漏液2，留待下批實驗配置流加糖及NaN03 使用。發酵進行12天，產酸18.2^。
第五步3 -聚蘋果酸及副產物普魯蘭多糖的制備
① 將第四步獲得的P -聚蘋果酸濃縮液經弱堿性陰離子交換樹脂吸附，收 集滲透液，用3倍樹脂體積的去離子水沖洗樹脂，洗水與滲透液合并。用pH8-9 的氨水或銨鹽、或0.1mol/LNaOH溶液等堿溶液洗脫吸附在樹脂上的e -聚蘋 果酸，洗脫液經脫色、濃縮，有機溶劑沉淀、冷凍干燥或噴霧干燥制得白色
e-聚蘋果酸產品，此產品為e-聚蘋果酸鹽；
② 將①所得的洗脫液脫色后溶液或產品溶液，經強酸性陽離子交換樹脂 吸附，去除P -聚蘋果酸鹽中的鹽離子，滲透液經膜濃縮去除多余的酸根離子， 有機溶劑沉淀、冷凍干燥或噴霧干燥制得白色P-聚蘋果酸產品；
③ 將①所得滲透液用截留分子量100kDa膜組件濃縮，進一步濃縮，濃 縮液中加入氯仿/丁酮混合液(體積比4: 1)，充分振蕩使蛋白析出，離心或 過濾除去沉淀。除蛋白溶液加入2倍體積無水乙醇，充分攪拌，放置12-24h， 使普魯蘭多糖沉淀，分離所得沉淀經丙酮、乙醚依次洗滌，P20s干燥，得普 魯蘭多糖粉末狀產品。
實施例6
按如下步驟制備P -聚蘋果酸、P -聚蘋果酸鹽和普魯蘭多糖第一步，培養基配制 同實施例1 第二步，菌種活化 同實施例1 第三步，種子培養 同實施例1 第四步，接種發酵
將第三步制得的培養物以10%接種量接種于發酵培養基中，pH4.0~4.5， 溫度25'C，通氣量0.5-2.5wm，培養72h，啟動泵使菌體經膜組件A (見附 圖，膜孔徑0.22um)回流至發酵罐中，壓差0.05-0.lmpa，滲透液1經膜組 件B(見附圖，截留分子量lOKDa)濃縮，濃縮液回流至儲罐l，滲透液2返回 發酵罐中。控制發酵罐中P-聚蘋果酸含量〈1.5g/L，當發酵罐中e-聚蘋果酸 濃度0.5gi時，調節泵1及2的轉速，降低發酵液引出的速率；當發酵罐中 P-聚蘋果酸濃度〉lg/L時，調節泵1及2的轉速，提高發酵液引出的速率； 當儲罐A中P -聚蘋果酸含量〉30g/L，將其轉入儲罐2中。當葡萄糖濃度〈10g/L 時，流加每升含500g葡萄糖、25gNaN03的溶液，維持發酵液中葡萄糖濃度 在10g/L左右。當菌體有部分自溶，耗糖速率下降，停止流加糖液，當糖濃 度下降至0.5g/L時，停止發酵，調節泵1與2的流速，增大膜組件A的壓差， 將發酵罐中所有料液泵出，收集滲漏液2，留待下批實驗配置流加糖及NaN03 使用。發酵進行13天，產酸22.5g/L。
第五步P -聚蘋果酸及副產物普魯蘭多糖的制備
① 將第四步獲得的e -聚蘋果酸濃縮液經弱堿性陰離子交換樹脂吸附，收 集滲透液，用3倍樹脂體積的去離子水沖洗樹脂，洗水與滲透液合并。用pH8-9 的氨水或銨鹽、或0.1mol/LNaOH溶液等堿溶液洗脫吸附在樹脂上的P -聚蘋 果酸，洗脫液經脫色、濃縮，有機溶劑沉淀、冷凍干燥或噴霧干燥制得白色 P-聚蘋果酸產品，此產品為e-聚蘋果酸鹽；
② 將①所得的洗脫液脫色后溶液或產品溶液，經強酸性陽離子交換樹脂 吸附，去除P -聚蘋果酸鹽中的鹽離子，滲透液經膜濃縮去除多余的酸根離子， 有機溶劑沉淀、冷凍干燥或噴霧干燥制得白色P -聚蘋果酸產品；
③ 將①所得滲透液用截留分子量10kDa膜組件濃縮，進一步濃縮，濃縮 液中加入氯仿/丁酮混合液(體積比4: 1)，充分振蕩使蛋白析出，離心或過 濾除去沉淀。除蛋白溶液加入2倍體積無水乙醇，充分攪拌，放置12-24h， 使普魯蘭多糖沉淀，分離所得沉淀經丙酮、乙醚依次洗滌，P20s干燥，得普 魯蘭多糖粉末狀產品。
權利要求
1. β-聚蘋果酸及其鹽和普魯蘭多糖的制備方法包括如下步驟1)接種發酵將出芽短梗霉經活化和種子培養后接種于發酵培養基中，pH4.0～4.5，溫度20-28℃，通氣量0.5-2.5vvm，培養72-96h，啟動泵循環菌體、膜濃縮高分量的β-聚蘋果酸及普魯蘭多糖；2)β-聚蘋果酸及其鹽和普魯蘭多糖的制備(1)將第1)步獲得的β-聚蘋果酸濃縮液經弱堿性陰離子交換樹脂吸附，收集滲透液，用去離子水沖洗樹脂，洗水與滲透液合并得溶液C，用堿溶液洗脫吸附在樹脂上的β-聚蘋果酸，洗脫液經脫色得溶液D，將溶液D濃縮，經有機溶劑沉淀、冷凍干燥或噴霧干燥步驟制得白色β-聚蘋果酸鹽產品；(2)將(1)所得的溶液D或β-聚蘋果酸鹽產品溶液，經強酸性陽離子交換樹脂吸附，去除β-聚蘋果酸鹽中的鹽離子，滲透液經膜濃縮去除多余的酸根離子，經有機溶劑沉淀、冷凍干燥或噴霧干燥制得白色β-聚蘋果酸產品；(3)將(1)所得溶液C用膜濃縮，濃縮液中加入氯仿/丁酮混合液(體積比4∶1)，充分振蕩使蛋白析出，離心或過濾除去沉淀。除蛋白的剩余溶液加入2倍體積無水乙醇，充分攪拌，放置12-24h，使普魯蘭多糖沉淀，分離所得沉淀經丙酮、乙醚依次洗滌，P2O5干燥，得普魯蘭多糖粉末狀產品。
2. 根據權利要求1所述的制備聚蘋果酸鹽、聚蘋果酸及普魯蘭多糖的方 法，其特征在于采用膜組件A回流菌體，滲透液1經膜組件B濃縮后，濃 縮液回流至儲罐l，滲透液2返回發酵罐。
3. 根據權利要求l所述的制備e-聚蘋果酸鹽、e-聚蘋果酸及普魯蘭多 糖的方法，其特征在于采用膜組件B截留高分子量P-聚蘋果酸及普魯蘭多 糖，低分子量P-聚蘋果酸、普魯蘭多糖及培養基成份回流至發酵過程，降低 末端產物反饋抑制作用并充分消耗培養基成份和讓菌體將低分子量6 -聚蘋 果酸、普魯蘭多糖分別進一步聚合。
4. 根據權利要求l所述的制備P-聚蘋果酸鹽、P-聚蘋果酸及普魯蘭多 糖的方法，其特征在于采用的膜組件A為微濾膜，膜孔徑0.22-0.8 n m有 機或無機膜；采用的膜組件B為超濾膜，截留分子量為10-100kDa的有機或 無機膜。
5. 根據權利要求4所述，其特征在于采用的膜組件A和膜組件B的 型式為平板式或中空式。
6. 根據權利要求4所述，其特征在于采用的膜組件A和膜組件B中的膜材料為聚砜、聚醚砜、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯腈等有機膜或氧化鋁質、氧化鈷質、氧化硅質、硅酸鋁質、碳化硅質等陶瓷膜或Ag膜、Ni膜、 Ti膜及不銹鋼膜等金屬膜或金屬與陶瓷復合型無機膜。
7. 根據權利要求1所述的制備e-聚蘋果酸鹽、P-聚蘋果酸及普魯蘭多 糖的方法，其特征在于由膜組件B分離獲得的濃縮液經陰離子交換樹脂吸 附，用堿溶液洗脫吸附在樹脂上的P-聚蘋果酸，洗脫液經膜濃縮去除多余的 堿，濃縮液經脫色、進一步濃縮，有機溶劑沉淀、冷凍干燥或噴霧干燥制得 白色0-聚蘋果酸鹽產品；采用P-聚蘋果酸鹽產品溶液或權利要求1中的溶 液D，經強酸性陽離子交換樹脂吸附，滲透液經膜濃縮去除多余的酸，進一 步濃縮，采用有機溶劑沉淀、冷凍干燥或噴霧干燥制得白色P -聚蘋果酸產品。
8. 根據權利要求1所述的制備e -聚蘋果酸鹽、P -聚蘋果酸及普魯蘭多 糖的方法，其特征在于采用弱堿性的陰離子交換樹脂吸附e-聚蘋果酸而使 中性的普魯蘭多糖穿過，滲透液經濃縮、提純、干燥制得普魯蘭多糖。
9. 根據權利要求7所述的制備P -聚蘋果酸鹽、P -聚蘋果酸及普魯蘭多 糖的方法，其特征在于:所用的堿溶液為pH8-9的氨水或銨鹽、0.1mol/LNaOH 等。
10. 根據權利要求7所述的制備P -聚蘋果酸鹽、P -聚蘋果酸及普魯蘭多 糖的方法，其特征在于所用的有機溶劑為乙醇、丙酮等。
11. 根據權利要求7所述的制備P-聚蘋果酸鹽、e-聚蘋果酸及普魯蘭多 糖的方法，其特征在于采用的膜為有機膜或無機膜，膜組件型式為平板式 或中空式；膜材料為聚砜、聚醚砜、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯腈等 有機膜或氧化鋁質、氧化鈷質、氧化硅質、硅酸鋁質、碳化硅質等陶瓷膜或 Ag膜、Ni膜、Ti膜及不銹鋼膜等金屬膜或金屬與陶瓷復合型無機膜。
12. 根據權利要求1所述的制備P-聚蘋果酸鹽、e-聚蘋果酸及普魯蘭多 糖的方法，其特征在于所述的陰離子交換樹脂為已處理的碳酸型、氫氧根 型和氯型的弱堿性的陰離子交換樹脂。
13. 根據權利要求1所述的制備0 -聚蘋果酸鹽、3 -聚蘋果酸及普魯蘭多 糖的方法，其特征在于所述的陽離子交換樹脂為強酸性陽離子交換樹脂。
14. 根據權利要求1所述的制備0 -聚蘋果酸鹽、e -聚蘋果酸及普魯蘭多 糖的方法，其特征在于當葡萄糖濃度〈10g/L時，流加300-800g/L葡萄糖、 15-40g/LNaNO3溶液，維持發酵液中葡萄糖濃度在10g/L左右。
全文摘要
本發明公開了一種制備β-聚蘋果酸及其鹽與同時獲得副產物普魯蘭多糖的方法。通過下述方案予以實現發酵過程中利用膜技術回流菌體和截留、濃縮高分子量β-聚蘋果酸，使低分子量β-聚蘋果酸、普魯蘭多糖及其它成份循環回發酵體系；采用弱堿性陰離子交換樹脂，吸附β-聚蘋果酸且使普魯蘭多糖溶液透過，采用堿性溶液洗脫樹脂上吸附的β-聚蘋果酸，洗脫液經提純、干燥得β-聚蘋果酸鹽產品；所得滲透液經濃縮，采用氯仿/丁酮混合液去除蛋白，乙醇醇析使普魯蘭多糖沉淀，丙酮、乙醚依次洗滌，P₂O₅干燥得普魯蘭多糖粉末狀產品；采用強酸性陽離子交換樹脂吸附β-聚蘋果酸鹽溶液中的鹽離子，脫鹽溶液經膜脫除多余的酸，濃縮、干燥得β-聚蘋果酸產品。
文檔編號C12P19/04GK101487034SQ20091007822
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月23日 優先權日2009年2月23日
發明者萬印華, 曹偉鋒, 飛 沈, 儀 蘇, 方 趙, 陳向榮 申請人:中國科學院過程工程研究所