專利名稱：：一種角毛殼菌株及其用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及微生物領域，具體地說是一種以罌粟科植物博落回(Macleayacordata)分離得到的一株角毛殼菌株內生真菌，及其在制備3,3',6,6'-tetrahydroxy-4,4'-dimethyl-1,1'-bi(cyclohexa-3,6-diene)-2,2'，5,5'-tetraone中的用途。
背景技術：
：從天然產物中發現新型先導化合物，是新藥創制的重要途徑。微生物是自然界中天然產物的主要來源，植物內生真菌作為其中的一個重要類群，是相對較新的研究領域。植物內生真菌(plantendophyticfongi)是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內部的真菌,被感染的宿主植物不表現或暫不表現出外在病癥，可通過組織學方法從嚴格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內直接擴增出微生物DNA的方法來證明其內生(ZouWX,etal.，2001)。內生真菌所產生的豐富多樣的具多種生物活性的次生代謝產物在現代醫藥和農藥工業中具有重要的應用潛力，它們在抗菌、抗病毒、殺蟲、抗腫瘤、抗心血管疾病以及抗衰老等領域具有廣闊的應用前景。典型例子是產生紫杉醇的內生真菌的發現(Stierleefa/.,1993)。另一方面從植物內生真菌也發現了許多新生物活性物質，如從傳統藥用植物雷公藤分離到的內生真菌Rh/noc/acfe//asp.可產生3種新松胞菌素(cytochalasin)，對多種人腫瘤細胞有很強的抑制作用(Wagenaarefa/,2000);從青蒿莖干中分離的內生真菌Co/tetof/7-c/t/msp.能產生多種對病原真菌和植物病原細菌有良好抑制作用的化合物，其MIC值一般在25~50iJg/L(Luefa/.,2000)。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種角毛殼菌株，該菌株用于制備具有抗腫瘤特性的化合物。為了解決上述技術問題，本發明提供一種角毛殼菌株，該角毛殼菌(Ctoetom/wma^wwm)菌株保藏名稱為角毛殼菌菌株ZJUC-01，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日2009年4月8日，保藏號CGMCC3011。本發明還同時提供了該種角毛殼菌株的用途，用于制備具有抗腫瘤特性的化合物3,3',6,6'-tetrahydroxy-4,4'-dimethyl-1,r-bi(cyclohexa-3,6-diene)-2,2',5,5,畫tetraone,該4t合物的結構式如下HOOHOO本發明的角毛殼菌株是一種從罌粟科植物博落回(Macleayacordata)分離得到的植物菌株；以人工發酵生產的角毛殼菌的發酵液為原料，經單一溶劑萃取和混合溶劑萃取技術相結合，即可分離得到上述化合物。本發明為進一步開發新的抗真菌藥物提供了天然藥物化學研究基礎。下面結合附圖對本發明的具體實施方式作進一步詳細說明。圖1是本發明所得化合物的晶體結構圖。具體實施例方式實施例1、角毛殼菌(C7zaetomZwmcwprewm)菌株的分離培養在實驗室中按下列條件分離培養，即可獲得本發明所述的角毛殼菌株內生真菌。從浙江文成縣采集到的罌粟科植物博落回(Madeayacordata)植物全草地上部分，取一支植株用5X次氯酸鈉表面消毒2min，消毒后的植株用無菌水漂洗三次后置于無菌濾紙上吸干水，用無菌刀片去除外皮層，并將其切成lcm左右大小組織片，將組織片移接在2%含100wml—1氨芐青霉素和鏈霉素的水瓊脂平板上，24"C培養，待菌絲長出后，將菌絲頂端移接到PDA培養基上，連續重復純化3次，獲得純培養的菌株ZJUC-Ol。該菌株形成的菌落為純白色，長時間培養后變為淺褐色。菌株頂端附屬絲較長，稍歪向外彎曲，基部直徑較大，表面粗糙，顏色為純白。該菌株生長緩慢，在28。C的條件下生化培養，每天以輻射狀擴張生長，速率為3醒/d。該菌株在生長過程中無孢子的產生，極易代謝產生大量的紅色物質，即為3，3',6,6'-tetrahydroxy-4,4'-dimethyl-1,1'-bi(cyclohexa-3，6-diene)-2,2',5，5'-tetraone。實驗例2、菌株的分子生物學鑒定1)、利用AX丫GEN公司生產的試劑盒AxyprepTmMultisourceGenomicDNAminiprepkit來提取內生真菌ZJUC-01的DNA。2)、然后在50微升的PCR反應體系中，DNA模板含量為3微升，DNTP(25mm)含量為1微升，Taq酶含量為1微升，PCRbufferforTaq(含鎂離子)含量為5微升，雙蒸水含量為38微升，引物LROR和LR5(LROR的堿基序列為5'-acccgctgaacttaagc-3'和LR5的堿基序列為5'-atcctgagggaaacttc-3')含量各為1微升，對ZJUC-01菌核糖體28S進行PCR擴增，反應程序如下表1所示，然后割膠回收測序。表1PCR擴增程序反應循環數反應溫度反應時間第一輪194°C3min94°C30s第二輪3555°C50s72°C50s第三輪172°C10min第四輪14。C30min測得的基因序列如SEQIDNO:l所示。通過基因比對，ZJUC-01菌是一種角毛殼菌將本發明的角毛殼菌(a^to冊'wmcw;7W誦)菌株進行保藏，保藏名稱為角毛殼菌菌株ZJUC-01，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日2009年4月8日，保藏號CGMCC3011。實施例3、化合物3,3',6,6'-tetrahydroxy-4,4'-dimethyl-1,r-bi(cyclohexa-3,6-diene)-2，2'，5,5'-tetraone的分離提取和結構鑒定角毛殼菌菌株ZJUC-01在26"C的溫度，搖床速率為150rpm/min的條件下，發酵培養12天，然后利用濾紙進行抽慮除去發酵液中的菌絲，得到紅色的發酵液。將所得的紅色發酵液，用乙酸乙酯反復萃取，直到水相層變為無色，所得的乙酸乙酯提取液在旋轉真空儀中濃縮蒸干得到浸膏；然后對浸膏先用氯仿進行溶解，然后利用濾紙進行抽慮，利用氯仿除去浸膏中的油性物質；留取的濾渣用水和甲醇的混合溶劑(水甲醇=1:l)進行溶解，過濾后得到紅色混合溶液，然后再用乙酸乙酯萃取上述得到的紅色混合溶液，直到水相層褪為無色，將得到的乙酸乙酯提取液濃縮后靜止放置，經飽和溶液結晶得到紅色單晶3,3'，6,6'-tetrahydroxy-4,4'-dimethyl陽1,1'-bi(cyclohexa-3,6-diene)-2,2',5,5'陽tetraone。該化合物為紅色晶體，熔點為248250'C(分解)，難溶于水，易溶于乙酸乙酯。分子量306。分子式C14HI()08。經x-單晶衍射測定，經SCIFINDER數據庫檢索，該化合物為新化合物，其化合物的結構為，HO0HO0采用x—單晶衍射(CrystalStructure3.7.0)確定新化合物的結構3,3',6,6'-tetrahydroxy-4,4'-dimethyl-1，1'-bi(cyclohexa-3，6-diene)-2,2',5，5'-tetraone的單晶衍射數據如表2和表3所示表2、晶體的部分參數分子式C14H10O8分子量306.23晶系單斜晶系的空間群C12/c1晶體顏色紅色"(A)11.9959(6)6(A)8.3335(5)13.7982(6)a(。)90.0000風°)105.9394(14)y(。)90細06<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>新化合物3,3',6,6'陽tetrahydroxy-4,4'-dimethyl-1,1'-bi(cyclohexa-3，6-diene)-2，2',5，5'-tetraone的晶體結構如圖1所示。實施例4、新化合物3，3',6，6'-tetrahydroxy-4,4'-dimethyl-1,1'-bi(cyclohexa-3,6-diene)-2,2',5，5'-tetraone的抗腫瘤生物測定以對鹵蟲(/Wem/asa//>a)的細胞毒試驗測定新化合物3，3'，6,6,-tetrahydroxy-4,4曙-dimethyl-1,1'-bi(cyclohexa-3,6-diene)-2,2',5,5'-tetraone的抗腫瘤活性。因為本發明的化合物不溶于蒸餾水，因此將化合物溶解于含DMSO10。/。的蒸餾水溶液中，然后配制成質量濃度為20ppm、10ppm、6ppm以及2ppm濃度的系列母液，然后將配置的人工海水分別與上述系列母液按照1:1的體積比混合后加入到1mL的試管中，即混合液中本發明的化合物質量濃度分別為10ppm、5ppm、3ppm以及1ppm，分別作為實驗組1-4。每個實驗組(即每個濃度)的DMS0的濃度為5。/。，設置4個重復。同時含有10%DMSO的蒸餾水與配置的人工海水按照1:1的體積比混合后加入1mL的試管中，設置4個重復，作為陰性對照。將鬼臼毒素溶解于含DMSO10y。的蒸餾水中，按照與配置人工海水體積1:1混合，得到質量濃度分別為10ppm、5ppm、3叩m以及1ppm的溶液，每組設置4個重復，作為實驗組的陽性對照。鹵蟲卵在pH8.5的人工海水中28°C培養孵化24h，然后在上述配置的每個試管中加入10只生長正常的鹵蟲，培養24h后觀察及記錄各處理的鹵蟲死亡數，具體結果如表4所示；表4<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>計算校正死亡率，采用劑量對數-死亡率機率值法計算求得半抑制濃度(LCso)。細胞毒試驗測定表明，化合物對鹵蟲的LC5o為1.0|jg/ml。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。序列表SEQIDNO::1cggagaaaaga肌ccaac3gggattgccctagtaacggcgagtgaagcggcaacagctca60aatttgaaatctggcctcggcccgagttgtaatttgcagaggaagctttaggcgcggcac120cttctg喊cccctggaacggggcgccatagagggtgagagccccgtatagttggatgcc180tagcctgtgtaaagctccttcgacgagtcgagtagtttgggaatgctgctcaaaatggga240ggtaaatttcttctaaagctaaataccggccagagaccgatagcgcacaagtagagtgat300cgaaagatgaaaagcactttgaaaagagggttaaatagcacgtgaaattgttgaaaggga360agcgcttgtgaccagacttgcgccgggctgatcatccggtgttctcaccggtgcactctg420cccggctcaggccagcatcggctctcgcggggggataaaggccccgggaacgtagctcct480ccgggagtgttatagcccggggtgtaatgccctcgcggggaccgaggttcgcgcatctgc540aaggatgctggcgtaatggtcaccagcgacccgtcttgaaacacggaccaaggagtcaag600gttttgcgcgagtgtttgggtgtaaaacccgcacgcglaatgaaagtgaacgtaggtgag660agcttcggcgcatcatcgaccgatcctgatgttttcggatggatttgagtaggagcgtta720agccttggacccga犯gatggtgaactatgcttggatagggtgaagccagaggaaactct780ggtggaggctcgcagcggttctgacgtgcaaatcgatcgtcaaatctgagcatgggggcg840aaagactaat85010權利要求1、一種角毛殼菌株，其特征是該角毛殼菌(Chaetomiumcupreum)菌株保藏名稱為角毛殼菌菌株ZJUC-01，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日2009年4月8日，保藏號CGMCC3011。2、如權利要求l所述的角毛殼菌株的用途，其特征在于用于制備具有抗腫瘤特性的化合物，該化合物的結構式如下全文摘要本發明公開了一種角毛殼菌株，該角毛殼菌(Chaetomiumcupreum)菌株保藏名稱為角毛殼菌菌株ZJUC-01，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日2009年4月8日，保藏號CGMCC3011。本發明還同時公開了上述角毛殼菌株的用途用于制備具有抗腫瘤特性的化合物。文檔編號C12N1/14GK101619291SQ20091009847公開日2010年1月6日申請日期2009年5月11日優先權日2009年5月11日發明者林福呈,章初龍,陳紹瑗,超黃申請人:浙江大學