一種增強骨髓間充質干細胞移植后存活率的處理方法

專利名稱：一種增強骨髓間充質干細胞移植后存活率的處理方法
技術領域：
本發明涉及一種增強骨髓間充質干細胞移植后存活率的處理方法，以 提高細胞移植修復組織損傷的效能。。
(二)
背景技術：
熱休克蛋白(heat shock protein, Hsp )是一類在生物進化過程中高度
保守并廣泛存在于原核及真核生物中的蛋白質。熱休克蛋白是一個多基因 家族，其中不同基因的產物在細胞中的表達、功能和定位都有不同。熱休 克蛋白在機體內作為分子伴侶，參與維持蛋白的正常折疊以形成蛋白的正 常結構，并在調節蛋白合成與降解的平衡及蛋白定位中起著重要的作用。 當細胞受到環境的各種刺激時，細胞內熱休克蛋白的表達增加，能快速短 暫地保護細胞對抗內源性應激的進攻，增強細胞的修復功能以及提高細胞 對應激的耐受程度。
熱休克蛋白90 (Hsp90)是細胞內最活躍的分子伴侶蛋白之一，影響 著細胞內許多信號轉導蛋白的正常功能發揮。研究發現，Hsp90對腫瘤發 生發展起著重要作用，已成為治療腫瘤的新靶位。熱休克蛋白通常被認為 是細胞生存因子，在細胞凋亡發生過程中，Hsp90可以通過阻止 procaspase-9與Apaf-l凋亡體的結合而抑制凋亡的發生。這些發現提示分 子伴倡的作用就像是個分界點，它引導感受到外界應激作用的細胞的走向 生存或是死亡。在細胞發生凋亡前，Hsp90允許細胞暫時休整，并動員細 胞本身的能力對應激誘導的損傷進行修復,這個作用有點類似于細胞周期 中的4企測點。細胞移植治療修復組織損傷是目前新興的醫療領域熱點。細胞療法是 對傳統醫學的一種補充手段，為某些難治性疾病的治療提供新的希望。干 細胞是一種能自我復制無限增殖,在特定的誘導條件下向同胚層或其他胚 層細胞分化的祖細胞。大量基礎實驗發現，骨髓千細胞移植能改善心肌梗
死后心功能，延緩心室重構。通過20個臨床研究薈萃分析，顯示骨髓來 源的干細胞移植能提高左室射血分數3.66% (95%CI為1.93%~5.40%, PO.OOl)。有研究發現，細胞移植后4小時存活的細胞僅占20%,但在 24小時后細胞存活不到10%,細胞移植7天后存活的細胞少之又少。通 過優化細胞種類、移植途徑、移植時間等方法能改善干細胞移植的療效， 此外還可以通過提高移植細胞抗凋亡能力和改善移植微環境來獲取最大 限度的細胞移植效能。目前已有的技術包括缺氧預處理，藥物預處理和基 因轉染等。
發明內容
本發明目的是提供一種增強骨髓間充質干細胞移植后存活率的預處 理方法，以提高細胞移植修復組織損傷的效能。 本發明采用的技術方案是
一種增強骨髓間充質干細胞移植后存活率的處理方法，所述方法包 括將經傳代培養穩定的骨髓間充質干細胞置于Hsp90濃度0.1~20ju mol/L的細胞培養基中，缺氧培養24 36小時，獲得處理后的骨髓間充質 干細胞用于細胞移植。所述細胞培養基為常規用于骨髓間充質干細胞體外 培養的培養基，并且不添加血清，如低糖DMEM液體培養基等，培養溫 度為常規適用于骨髓間充質干細胞的培養溫度，只是本發明在培養基中添 加了 Hsp90,其添加濃度為0.1 20jumol/L,優選l~10|amol/L,最優選 為10iamol/L;所述缺氧培養是指在沒有氧氣存在下進行培養，通常可在氮氣、二氧化碳或者氮氣與二氧化碳混合氣的氛圍下進行培養。所述傳代 培養按常規方法在常規氧濃度(即常氧培養)條件下進行，通常的，所述
常氧培養為在0)2體積濃度5%、 02體積濃度95%的混合氣體中培養。 本申請發明人發現，在細胞移植術前，Hsp90預處理能激發細胞內源 性保護機制，通過細胞內多條信號傳導通路，增強細胞抗凋亡能力。研究 發現，Hsp90預處理(培養基中終濃度為0.1~20pmol/L,其中以10)amol/L 時作用最強)能提高骨髓間充質干細胞內Akt和ERK磷酸化水平，降低 SPAK/JNK磷酸化水平，從而降低骨髓間充質干細胞內前凋亡蛋白例如 bax的表達，誘導細胞表達抗凋亡蛋白bcl-2和bcl-xl，降低凋亡執行蛋白 Caspase-3的表達。Hsp90預處理尚能促進細胞合成和分泌一氧化氮(Nitric oxide, NO),減少缺氧無血清誘導的細胞凋亡，Hsp90預處理的細胞移 植到急性心肌梗死局部能提高移植細胞的存活率，改善心功能，增強細胞 移植的效能。
具體的，所述方法如下將繼代第3代的骨髓間充質干細胞于37°C 下在Hsp90濃度10 ju mol/L的低糖DMEM培養基中缺氧培養24小時， 獲得處理后的骨髓間充質干細胞用于細胞移植。
Hsp90包括四個亞單位Hsp90a、 Hsp90p、 GRP94 、 Hsp75/TRAP1。 本發明中，所述Hsp90優選為Hsp90a( GenBank登錄號為CR381646.8 )。
所述缺氧培養是指在缺氧條件下進行培養,具體的，所述缺氧培養為
在C02體積濃度5%、 N2體積濃度95%的混合氣體中培養。
具體的，所述方法如下將繼代第3代的骨髓間充質干細胞于37°C
下、在C02體積濃度5。/。、 N2體積濃度95。/。的混合氣體中，于Hsp90a濃
度10|imol/L的低糖DMEM培養基中培養24小時，獲得處理后的骨髓
間充質干細胞用于細胞移植。本發明的有益效果主要體現在通過Hsp90預處理，可有效提高骨 髓間充質干細胞的抗細胞凋亡能力，能提高骨髓間充質干細胞移植修復組 織損傷的療效。
(四)


圖1為Hsp90預處理能減少缺氧無血清誘導的細胞凋亡示意圖
圖2為Hsp90預處理能減少缺氧無血清誘導的凋亡率示意圖3為Hsp90預處理能促進細胞合成和分泌一氧化氮(NO)示意圖4為Hsp90預處理通過激活細胞內Akt和ERK信號通路，降低SPAK/
JNK磷酸化水平，從而降低細胞內前凋亡蛋白bax表達，誘導細胞表達
抗凋亡蛋白bcl-2和bcl-xl，降低凋亡執行蛋白Caspase-3表達的示意圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍
并不僅限于此
實施例1:
1. 無菌條件下從合適的健康志愿者(排除造血系統疾患)(王某某，25 歲，來自杭州，本人同意將骨髓捐獻供研究使用)的髂后上棘抽取骨 髓液50mL,放置于預先添加4000IU肝素的無菌玻璃瓶中，充分混勻 避免骨髓液凝固，移至層流室生物安全拒進行下一步操作。
2. 將等量低糖DMEM培養基(購自美國GIBCO公司)(添加100U/mL 青霉素和100U/mL鏈霉素)加入放置骨髓液的無菌玻璃瓶中稀釋骨髓 液，用無菌移液器充分吹散骨髓細胞。
3. 按照密度梯度分離法分離骨髓單個核細胞。在50mL無菌離心管中加 6入20mL淋巴細胞分離液(密度是1.077士0.001 g/mL，購自上海恒信化 學試劑有卩艮公司)，將20mL骨髓液輕輕疊加在淋巴細胞分離液表面。 在高速低溫離心機中(Heraeus D-37520,購自德國Thermo Electron 乂> 司)以4。C條件下900g離心25分鐘。離心完畢后，細胞分層，從下 至下，可見培養基、白膜層、淋巴分離液和紅細胞層。用lmL無菌移 液器收集中間白膜層細胞于另一 50mL離心管中，然后加入20mL低 糖DMEM培養基(購自美國GIBCO公司)，漂洗細胞表面殘留淋巴 分離液。于4。C條件下900g離心10分鐘，棄上清，收集骨髓單個核 細胞。以含10%( v/v )胎牛血清(購自美國GIBCO公司)的低糖DMEM 培養基重懸沉淀細胞，按2《105/0112細胞密度接種至75cn^生長面積 的細胞培養瓶(購自美國Corning公司)，放置于37°C,含5%C02 (空 氣體積濃度95% )和飽和濕度的細胞培養箱(Forma3 111,購自美國 Thermo Fisher公司)中，靜置48小時后首次換液，以去除不貼壁細胞。 此后每4~5天換液一次，長滿80% 90%以上傳代。
4. 以含10。/。胎牛血清低糖DMEM培養基進行原代和繼代細胞培養，放置 于37。C、 一定濕度的含5。/。C02的混合氣體(空氣體積濃度95%)中 常氧培養，根據骨髓間充質干細胞貼壁生長的特性，每4 5天更換細 胞培養基，去除非貼壁細胞，不斷純化人骨髓間充質干細胞。繼代第 3代時細胞可進行形態學、流式細胞學等細胞鑒定。
5. 將正常氧濃度下培養的繼代第3代人骨髓間充質千細胞更換含一定濃 度的人重組Hsp90a (美國assay designs公司，Cat# SPP-776 )的低糖 DMEM培養基(培養基中Hsp90a終濃度為0.1 10 ju mol/L ),繼續于 37°C、 一定濕度的含5% (v/v) C02和950/。 (v/v) N2的混合氣體中進 行缺氧培養培養處理。缺氧處理在一個能精確調控氧濃度的ProOx-C-chamber系統(購自美國Biospherix, Redfield公司)中進行， 設定氧濃度為不大于0.5%,缺氧時間為24小時。缺氧處理結束后進 行免疫染色、流式細胞學檢測、培養上清液比色法和免疫印跡法檢測 細胞凋亡及其相關蛋白。
6. 免疫熒光Hoechst33258染色檢測細胞凋亡情況加入Hoechst33258(美 國Molecular probe公司)染料于細胞培養液中，避光孵育15分鐘。棄 除細胞培養基，以磷酸鹽緩沖液PBS ( 1000mL蒸餾水中含8gNaCl， 0.2gKCl， 1.44gNa2HP04， 0.24gKH2PO4, PH 7.2-7.6)沖洗3遍后， 于熒光倒置顯微鏡(放大400倍，德國Zeiss公司)攝片觀察細胞核 內凋亡小體，實驗結果見圖1,在熒光倒置顯微鏡下觀察Hoechest染 色的細胞(400倍放大)，左圖顯示在缺氧-缺血清培養24小時后，細 胞核染色體斷裂，出現凋亡小體(藍色亮點)。右圖顯示Hsp90共培養 24 d、時的細胞在缺氧-缺血清環境下細胞核凋亡小體不明顯；
7. 流式細胞學檢測細胞表面Annexin-V的表達率反映細胞凋亡率根據 Annexin-V試齊寸盒(美國BD Biosciences/>司)才喿作i兌明書進4亍。以水 PBS緩沖液漂洗細胞兩遍后加入結合緩沖液，將細胞密度調整至lx106 個/ml。取100ul細胞懸液(lx105個細胞)移至5ml離心管，加入5ul Annexin-V和5ul PI。充分混合后常溫避光孵育15分鐘。每個離心管 中加入400ul結合緩沖液， 一小時內在流式細胞儀下讀數。該步驟反 復3遍以上，獲取每組樣本的細胞凋亡率，實驗結果見圖2。
8. 比色法檢測細胞培養上清液NO水平收集細胞培養上清液，應用NO 試劑盒(美國MERCK-Calbiochem公司)；險測細胞分泌NO水平。測 定方法按試劑盒操作說明書進行，繪制標準曲線，根據酶標儀讀取的OD值獲得相應的NO產量，實驗結果見圖3。
9.免疫印跡法檢測細胞內Akt、 ERK、 SAPK/JNK信號通路蛋白及凋亡相 關蛋白bax、 bcl-2、 bcl-xL和caspase-3的表達改變。
收集的細胞用RIPA buffer ( 50 mM HEPES, pH 7.3， 1% sodium deoxycholate, 1% Triton X畫100, 0.1o/oSDS， 150mMNaCl， ImMEDTA, lmMNa3V04， lmMNaF)裂解后，14，000g離心30 min，收集上清 液凍存于-80。C備用。BCA法(Bicinchoninic Acid Assay,購自美國Sigma 公司)測定蛋白濃度。40昭蛋白樣品在6 15% SDS-PAGE梯度膠用 Hoefer Mini-Gel system ( Amersham Biosciences, 購自美國Piscataway 公司)電;永分離，用Hoefer Transfer Tank (Amersham Biosciences,美國 Piscataway公司)將蛋白轉移至PVDF膜(購自美國BioRad公司)上， 膜置于緩沖液[Tris緩沖鹽溶液，含0.1% Tween-20 ( TBS-T )， 7%牛奶， pH7.6]室溫下封閉2h,加入相應一抗(1: 1000,購自美國Cell Signaling 公司)于4。C條件下孵育過夜，小鼠抗p-actin( 1: 1000，購自美國Santa Cruz Biotechnology公司)作為蛋白上樣對照；膜用0.5% TBS-T洗滌 后室溫下與結合堿性磷酸酶的抗兔IgG或抗小鼠IgG抗體(購自美國 Promega公司)孵育2小時，最后TBS-T及TBS洗滌后用BCIP/NBT溶 液顯色(購自美國Sigma公司)，掃描后用Adobe Photoshop CS 8.0 軟件分析信號，實驗結果見圖4。
結論Hsp90預處理能通過激活細胞內Akt和ERK信號通路， 抑制細胞內SAPK/JNK通路，抑制細胞內前凋亡蛋白bax表達降低， 抗凋亡蛋白bcl-2和bcl-xl表達增高，降低凋亡執行蛋白Caspase-3的表達，同時提高細胞合成NO。實驗結果顯示，Hsp90在10umol/L時 預處理抗細胞凋亡的作用最強。Hsp90預處理能提高細胞在缺血缺氧 的心肌微環境中抗凋亡能力
權利要求
1.一種增強骨髓間充質干細胞移植后存活率的處理方法，所述方法包括將經傳代培養穩定的骨髓間充質干細胞置于Hsp90濃度0.1～20μmol/L的細胞培養基中，缺氧培養24～36小時，獲得處理后的骨髓間充質干細胞用于細胞移植。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下將繼代第3代的骨髓間充質干細胞于37°C下在Hsp90濃度10 in mol/L的低糖DMEM培養基中缺氧培養24小時，獲得處理后的骨髓間充質干細胞用于細胞移植。
3. 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述Hsp90為Hsp卯a。
4. 如權利要求1或2所述的方法，所述缺氧培養為在C02體積濃度5%、N2體積濃度95%的混合氣體中培養。
5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下將繼代第3代的骨髓間充質干細胞于37。C下、在C02體積濃度5%、 N2體積濃度95%的混合氣體中，于Hsp90a濃度10 ja mol/L的低糖DMEM培養基中培養24小時，獲得處理后的骨髓間充質干細胞用于細胞移植。
全文摘要
本發明提供了一種增強骨髓間充質干細胞移植后存活率的處理方法，所述方法包括將經傳代培養穩定的骨髓間充質干細胞置于Hsp90濃度0.1～20μmol/L的細胞培養基中，缺氧培養24～36小時，獲得處理后的骨髓間充質干細胞用于細胞移植。本發明的有益效果主要體現在通過Hsp90預處理，可有效提高骨髓間充質干細胞的抗細胞凋亡能力，能提高骨髓間充質干細胞移植修復組織損傷的療效。
文檔編號C12N5/08GK101550409SQ20091009799
公開日2009年10月7日 申請日期2009年4月29日 優先權日2009年4月29日
發明者王建安, 謝小潔, 峰 高 申請人:浙江大學