專利名稱：一株桉樹內生菌及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株桉樹內生菌及其用途。
背景技術：
土壤缺磷已經成為制約世界農業發展首要因素，在世界13. 19億hm2耕地中缺磷 的占據43%。我國農田的2/3 土壤嚴重缺磷，其中南方土壤是磷含量最低的土壤之一。若 單獨依靠土壤中的磷，只能滿足一季作物需要的 0. 5%。在大部分土壤中，磷元素在 土壤中的擴散能力差，一般集中在土壤表層，隨著深度增加而降低。嚴小龍等研究表明，目 前磷肥的利用率只有0% 25%，這意味著75% 90%的磷被轉化為難吸收的磷酸鹽，土壤 已經形成了一個巨大的磷庫。因此，磷高效利用成為當今解決土壤磷缺乏的一個重要途徑。 內生菌也能通過增強植物吸收氮、磷等營養元素的能力，或產生拮抗物質或與病原菌競爭 空間而達到促進植株生長的作用[1]。植物內生菌的研究始于19世紀末，Vogl從黑麥草Lolium temulentum L.種子中 分離出第一株內生菌[2]。但真正開始大量研究植株中的內生菌起始于上世紀八十年代，主 要是在溫帶地區、亞熱帶地區和熱帶地區的植被中開展研究。前人從大部分植物中都能分離出內生菌，因此可以推測內生菌在植株中是普遍存 在的。在全世界范圍內至少在80多個屬290多種的禾本科農作物中發現了內生菌[3]。目 前從植物中分離的內生菌根據其具有的獨特功能可以分為固氮菌、固鉀菌、固磷菌等植物 促生菌[4_5]、具有抗病蟲害的生防菌[6_9]。在桉樹內生真菌的研究主要集中在外生菌根(ECM)和VA菌根真菌的研究方面_。 桉屬樹種在自然界中既有外生真菌又有內生真菌，這在國內外均被證實，但內生真菌的自 然感染率不高。弓明欽等[11]進行桉樹幼苗菌根接種及生長效應的研究中應用漏斗孢球囊 霉(Glomus Mosseae)和地表球囊霉(G.印igaeum)兩種菌進行高生長和直徑生長比較。陳 應龍[1°]用外生真菌彩色豆馬勃和蘇格蘭球囊霉混合接種對尾葉桉的高生長、直徑生長、干 重的比較研究。前人的研究中應用菌株，多為外生真菌，同時也沒有從促進磷吸收的根本因 素去尋找內生真菌，以提高其科學性和可靠性[12]。桉樹的ECM菌根真菌主要包含擔子菌亞 門(Basidiomycotina)、子囊菌亞門(Ascomycotina)禾口接合菌亞門(Zygomycotina)等，VA 菌根真菌主要包含接合菌亞門球囊霉目(Glomales)。證實能促進磷吸收的內生菌方面尚未 見報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一株桉樹內生菌及其用于提高桉樹抗耐低磷脅迫能力及 促進磷吸收的用途。本發明所述桉樹內生菌為青霉iPenicilliwn sp.)菌株1，保藏號為CGMCC No. 4279。該菌株1的分離、純化步驟包括
3A、材料采集野外鄧恩桉和尾巨桉植株直徑0.5cm以下的根、直徑0. 5cm以下的莖段和 成熟葉；
B、消毒葉片消毒采用70%酒精浸泡40s、0.升汞浸泡90s，莖段消毒采用70%酒精 浸泡30s、0. 升汞浸泡60s，根部消毒采用70%酒精浸泡50s、0. 升汞浸泡120s ；
C、分離將經表面消毒的野外鄧恩桉、尾巨桉植株的根、莖段和成熟葉接入真菌固體培 養基進行內生真菌的繁殖；
真菌固體培養基使用改良馬丁固體培養基，配方為蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉 2. Og/L、葡萄糖20. Og/L、磷酸氫二鉀1. Og/L、硫酸鎂0. 5g/L、瓊脂14. Og/L、其它為無菌水， PH值6. 4士0. 2，培養溫度為28°C，培養方式為平板培養，培養時間為48h ；
D、將分離繁殖出的內生真菌接入平板培養基進行純化，經過2-3次點接純化、轉接后， 從中選擇得到單一菌種，通過桉樹接種試驗，進一步驗證其具有促進桉樹磷吸收活性后，鑒 定并保存菌種；
點接種純化將消毒后的接種環輕微點擊菌體表面，然后將其點擊接種面，該方法較傳 統的點植培養法更易控制接種量，從而提高對內生真菌的接種效率與檢出率。本發明所述的桉樹內生菌的制種方法即內生菌液的制備方法，是將上述的菌株1 接入液體培養基，搖床振蕩培養，培養溫度為28°C，培養時間48 72h，利用血球計數板計 算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1. 0 9. OX 106CfU/ml備用；
所述液體培養基為改良馬丁培養基，其中蛋白胨5. Og/L、酵母浸出粉2. 0g/L、葡萄 糖20. 0g/L、磷酸氫二鉀1. 0g/L、硫酸鎂0. 5g/L、其它為無菌水、pH值6. 4士0. 2。本發明所述的桉樹內生菌的用途，將所述桉樹內生菌接種桉樹，提高桉樹抗耐低 磷脅迫能力以及用于促進桉樹磷的吸收，具體操作是應用該菌株的菌液，用于林地澆根、組 培進入煉苗期前蘸根或組培過程的切芽階段轉入生根培養基前芽蘸。所述林地澆根是采用5. OX IO6CfuAil菌液，按每株100ml在林地澆于每株桉樹的 根際。所述組培進入煉苗期前蘸根是應用該菌株的菌液3. OX 106CfU/ml在組培進入煉 苗期前蘸根l-5min。所述組培過程的切芽階段轉入生根培養基前芽蘸是應用該菌株的菌液 1. OX IO6CfuAil在組培過程的切芽階段轉入生根培養基前，將芽蘸菌液l-5min后接入生根
培養基繼續培養。本發明的青霉QPenicillium sp.)菌株1的形態特征如下
在平面培養基上按常規方法培養，觀察其形態。培養基的正面其菌落呈灰綠色，背面黃 褐色，點狀圓形；菌絲體有隔，分生孢子梗和孢子無色，末端生小梗，小梗直立，刷狀，單胞， 卵圓形，表面光滑，分生孢子梗自菌絲單個地發生，在頂部附近分枝，形成典型的帚狀特征 結構。參照真菌鑒定手冊將菌株鑒定為青霉屬iPenicillhm)。本發明的青霉(/如iciWi腫sp.)菌株1，已經于2010年10月28日保藏在中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路 1號院3號，保藏編號為CGMCC No. 4279。本發明的顯著優點本發明的桉樹內生菌用于促進桉樹中磷的吸收，通過菌種接種桉樹植株，可提高植株 磷酸酶和土壤磷酸酶的活性，降低土壤根際PH值，較大程度的提高了植株P利用率，從而達 到促進植株在低磷土壤中正常生長的目的，較大程度降低了土壤磷肥的使用率。
圖1為不同處理的植株SOD變化圖； 圖2為不同處理的植株POD變化圖3為不同處理的土壤pH值變化圖； 圖4為不同處理的土壤磷酸酶含量變化圖； 圖5為不同處理的植株全磷含量圖。
具體實施例方式實施例1
1菌液制備
本發明菌株1的分離、純化包括
A、材料采集野外鄧恩桉和尾巨桉植株直徑0.5cm以下的根、直徑0. 5cm以下的莖段和 成熟葉；
B、消毒葉片消毒采用70%酒精浸泡40s、0.升汞浸泡90s，莖段消毒采用70%酒精 浸泡30s、0. 升汞浸泡60s，根部消毒采用70%酒精浸泡50s、0. 升汞浸泡120s ；
C、分離將經表面消毒的野外鄧恩桉、尾巨桉植株的根、莖段和成熟葉接入真菌固體培 養基進行內生真菌的繁殖；
真菌固體培養基使用改良馬丁固體培養基，配方為蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉 2. Og/L、葡萄糖20. Og/L、磷酸氫二鉀1. Og/L、硫酸鎂0. 5g/L、瓊脂14. 0g/L、其它為無菌水， pH值6. 4士0. 2，培養溫度為28°C，培養方式為平板培養，培養時間為48h ；
D、將分離繁殖出的不同種類的內生真菌接入平板培養基進行純化，經過2-3次點接純 化、轉接后得到單一菌種的上述的Penicillium sp.功能菌株；
點接種純化將消毒后的接種環輕微點擊菌體表面，然后將其點擊接種面，該方法較傳 統的點植培養法更易控制接種量，從而提高對內生真菌的接種效率與檢出率。菌液的制備方法，是將上述的菌株1接入液體培養基，搖床振蕩培養，培養溫度為 28°C，培養時間48h，利用血球計數板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成5.0X106cfu/ ml即為成品備用；所述液體培養基為改良馬丁培養基，其中蛋白胨5. 0g/L、酵母浸 出粉2. 0g/L、葡萄糖20. 0g/L、磷酸氫二鉀1. 0g/L、硫酸鎂0. 5g/L、其它為無菌水、pH值 6. 4 士 0. 2。2試驗方法
低磷脅迫試驗設計
所用材料為福建省林業科學院尾巨桉組培苗3229，隨機選擇生長狀態良好，且長勢均 勻一致含有兩對真葉小苗。設計了 3個磷處理水平，每個水平3個重復(表1)。盆栽試驗土壤的基質為黃心 土(酸性貧瘠缺磷黃壤)。經測定其PH值4. 15、土壤有機質含量為0. 315 g kg_\全氮為
50.151 mg *kg人全磷為0. 088 g ·kg入全鉀為1. 998 g ·kg入有效磷為0. 360 mg.kg人盆 子規格為34X 40cm2，盆底有九個排水孔。稱取16kg黃心土裝盆，2009年3月定植桉樹苗， 待其生長一個月后進行3個等級的磷脅迫處理[13_15]。
表1試驗設計
Tab. 1 The experimental design
‘P濃度正常供磷處理P低磷處理LP:低磷處理LP:ClSCmg/l))(6(mg/L))(0(ir,g/D)CKCK-1CK-2CK-3菌種1ΡΕ-1ΡΕ-2ΡΕ-3
磷肥采用KH2PO4,定期施N、K肥和其它微量元素，直至收獲。磷脅迫于2009年4月15 號開始進行，集中施肥一次，同時在植株根際施入菌液，連續3天在樹干基部周圍均勻施入 相同體積相同濃度的IOOml菌液，此做法為保證接種后菌株能實現侵染。將澆施水溶液的 植株作為空白對照。在脅迫15d、30d、45d中進行取樣測定各項指標可溶性蛋白含量的測 定；丙二醛(MDA)含量測定；酸性磷酸酶(APA)活性測定。3個月后收獲植株和土壤樣品進 行生物量測定和植株含P量測定。結果分析
3. 1超氧化物歧化酶含量分析
植株在逆境脅迫下，植株體內產生大量的H2O2、O2_、-oh等活性氧自由基。這些破壞性很 強的活性氧將對膜脂產生過氧化作用，使植物細胞膜收到傷害，從而導致細胞內的電解質 外滲，從而導致電導率增大[16]。sod、POD等是植物自我保護系統中重要的酶，當植株處在逆 境條件下，這些酶可以通過協調作用起到清除上述自由基的作用，使植物免受傷害[17]。同 時，在逆境條件下植株體內會產生大量的脯氨酸，達到降低植物細胞滲透勢，維持壓力勢， 穩定大分子物質，參與葉綠素合成等維持細胞正常功能的作用[17]。隨著低P脅迫的加深，植株超氧化物歧化酶的含量逐漸減少(圖1)。與對照處理相 比較，菌種處理的植株的超氧化物歧化酶含量增加了 27.36%。這表明在低P脅迫下，植株 體內受到了一定程度的傷害，SOD含量一定程度的增加，起到保護植株的作用。過氧化物酶含量分析
隨著低P脅迫的加深，植株超氧化物歧化酶的含量一般呈現逐漸減少的趨勢(圖2)。與 對照處理相比較，菌種處理的植株的過氧化物酶含量增加了 70. 16%。這表明在低P脅迫 下，植株體內受到了一定程度的傷害，POD含量一定程度的增加，起到保護植株的作用。丙二醛含量分析
在正常供P條件下，與對照處理CK相比較，菌種處理的植株的丙二醛含量減少了 0. 46%。可溶性蛋白含量分析
在正常供P條件下，與對照處理CK相比，菌種處理的植株的可溶性蛋白含量增加了 23. 09%。在P脅迫處理LP2條件下，與對照處理CK相比，菌種處理的植株的可溶性蛋白含
6量增加了 27. 60%。這表明菌種處理的植株在低P條件下，植株可溶性糖含量一定程度的增 加，這可能是由于菌株促進了植株在低P條件下的適應性。根系酸性磷酸酶含量分析
植物酸性磷酸酶主要分布在葉的下表面和植物的根，或由根系分泌在土壤中_。磷酸 酶作為一類水解磷酸單酯鍵的水解酶，與細胞的許多生理生化過程相關，包括細胞防御、細 胞質P043—庫的維持等。它是一種在低磷狀況下表達的誘導酶，其活性受植株供磷狀況的影 響，它是植株在低磷條件下表達最早和最劇烈的反應之一 _。在正常供P條件下，與對照處理CK相比較，菌種處理的植株的根系酸性磷酸酶含 量增加了 53.87%。在P脅迫處理LPi條件下，與對照處理CK相比較，菌種處理的植株的根 系磷酸酶含量增加了 50. 00%。在P脅迫處理LP2條件下，與對照處理CK相比較，菌種處理 的植株的根系磷酸酶含量增加了 25.00%。這表明菌種處理的植株根系磷酸酶含量具有比 較明顯的差異，菌株對植株根系磷酸酶的分泌產生了顯著的影響。根際土壤pH值分析
PH值是影響植物對土壤難溶磷活化的重要因素。在一定范圍內，隨著根際PH值的下 降，磷的吸收顯著增加_。導致根際PH降低的原因有多種，植物根系分泌有機酸，根系吸收 陰陽離子的不平衡。關于有機酸活化土壤中磷的途徑有多種[21]改變吸附劑表面的電荷； 磷酸根與有機酸之間競爭絡合位點，從而降低土壤對磷酸根的吸附；消除土壤的吸附位點； 酸的溶解作用；有機陰離子/有機酸與Ca、Fe等金屬離子間的絡合反應，從而造成含磷化 合物的溶解，活化土壤中的磷。隨著低P脅迫的加重，土壤PH值逐步降低(圖3)。與對照處理相比較，菌種處理的 植株的PH下降了 4. 03%。植株根際PH值受到植株和土壤的酶含量影響，菌種處理的植株 與對照相比土壤PH值差異顯著。土壤磷酸酶含量分析
隨著低P脅迫的加深，土壤磷酸酶的含量逐漸增加(圖4)。與對照處理CK相比較，菌種 處理的植株的土壤磷酸酶的含量增加了 88.88%。這表明菌種處理的植株與對照相比根際 土壤磷酸酶含量差異顯著。葉綠素含量分析
與對照處理CK相比較，菌種處理的植株的總葉綠素含量增加了 30. 51%。這表明在 低P條件下，植株葉綠素的生成受到了一定程度的抑制，但由于內生菌的接種，在一定程度 上減緩了葉綠素含量的降低，菌種處理的植株與對照相比葉綠素含量較大程度的增加。3. 9植株全磷分析
在缺磷條件下植物對磷的利用率明顯提高，主要是由于缺磷誘導了植物根系酸性磷酸 酶活性的顯著提高，從而促進了植株磷的吸收[22]；也可能是植物細胞內的酸性磷酸酶參與 了細胞磷的轉運[23]；也可能是在缺磷條件下，磷酸酶使植株體內僅有的磷重復利用，從而 提高磷的利用率_。隨著低P脅迫的加深，植株全磷的含量逐漸減少(圖5)。與對照處理CK相比較，菌 種處理的植株的植株P含量增加了 35. 14%。表明菌種處理的植株的全P含量與對照相比 出現了顯著的差異性。植株生物量分析
7植株總生物量分析，與對照處理相比較，菌種處理的植株的總生物量增加了 20. 62%。 植株的葉片生物量分析，與對照CK相比較，菌種處理的植株的生物量增加了 27. 91%。這表 明植株在低P條件下生長受到了一定程度的抑制，但由于內生真菌的接種，在一定程度上 提高了體內各項抵御低P傷害的指標，促進了植株的生長，菌種處理的植株的生物量與對 照相比產生了較大的差異性，促進了植株P的吸收，從而達到促進植株生長的目的。結論
本發明通過研究發現，本發明的菌種1接種桉樹提高了植株磷酸酶和土壤磷酸酶的活 性，降低了土壤根際pH值，較大程度的提高了植株P利用率。今后可以考慮在生產實踐中 利用內生真菌或內生真菌與解磷菌混合菌進一步提高植株在低磷土壤中對磷的利用率。參考文獻AdhikariT B, Joseph C M. Evaluation of bacteria isolated from rice for plant growth promotion and biological control of seeding disease of rice [J]. Can. J Microbiol, 2001， 47:916-924.郭良棟.內生真菌研究進展[J].菌物系統，2001，20(1):148 152.于漢壽，紀燕玲，翁忠賀等.禾本科植物內生真菌研究10-內生真菌共生體的 苗期生物學特性[J].草業科學，2009，26 (10): 150-154.LuH, Zou ff X，Meng J C, Hu J, Tan R X.New bioactive metabolites produced by Colletotrichum sp. , an endophytic fungus in Artemisia annua [J]. Plant Sci, 2000，151:67-73.ReisV M, Baldani V L D, Dobereiner J. Biological dinitrogen fixation in Cramineae and palm trees[J]. Critical Rev Plant Sci, 2000，19:227-247.StoneJ K, Bacon C E, White J F Jr. An overview of endophytic microbes: endophytism defined Microbial Endophytes[J] . New York:Marcel Dekker, 2000;3-29.馮永君，宋未.植物內生細菌[J].自然雜志，2001，23(5)249 252.劉云霞.植物內生細菌的研究與應用[J].植物保護，1994，20(5) 30^32.楊海蓮，孫曉璐，宋未.植物內生細菌的研究[J].微生物學通報， 1998，25(4) 224 227.陳應龍，弓明欽，王鳳珍等.ECM和VAM菌混合接種對尾葉桉生長效應的研究[J]. 林業科學研究，1998，11 (5):481 487.弓明欽等.桉樹幼苗菌根接種及其生長效應的研究[J].林業科學研 究，1992，5(6) 639-645.譙天明等.四川桉樹內生菌根真菌的研究[J].四川林業科技，2001，22(3):6-9.楊曾獎，周文龍.桉樹苗期缺素癥狀的研究[J].林業科學研 究，1992，5(6)646-650.徐大平.不同磷水平對不同種源尾葉桉的生長和養分吸收的影響[J].熱帶亞熱 帶土壤科學，1997,6(2) 76-81.黃勇.不同桉樹品種適應磷脅迫的生理學機制研究[D]，2007.KochianL V.Cellular mechanisms of aluminum toxicity and resistance in
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9
權利要求
一株桉樹內生菌，其特征在于所述桉樹內生菌為青霉(Penicillium sp.)菌株1，保藏號為CGMCC No.4279。
2.如權利要求1所述的桉樹內生菌的制種方法，其步驟包括，將菌株1接入液體培養 基，搖床振蕩培養，培養溫度為28°C，培養時間48 72h，利用血球計數板計算菌液濃度，將 菌液用超純水稀釋成1. 0 9. OX 106cfu/ml。
3.根據權利要求2所述的桉樹內生菌的制種方法，其特征在于所述液體培養基為 改良馬丁培養基，其中蛋白胨5. Og/L、酵母浸出粉2. Og/L、葡萄糖20. Og/L、磷酸氫二鉀 1. Og/L、硫酸鎂0. 5g/L、其它為無菌水、pH值6. 4士0. 2。
4.如權利要求1所述的桉樹內生菌的用途，其特征在于將所述桉樹內生菌接種桉樹， 能提高桉樹抗耐低磷脅迫能力。
5.如權利要求1所述的桉樹內生菌的用途，其特征在于將所述桉樹內生菌接種桉樹， 用于促進桉樹磷的吸收。
全文摘要
本發明提供了一株青霉菌株及其用途，所述桉樹內生菌是青霉(Penicilliumsp.)菌株1，保藏號為CGMCC No.4279。將所述桉樹內生菌接種桉樹，能提高桉樹抗耐低磷脅迫能力，以及用于促進桉樹磷的吸收。本發明的桉樹內生菌用于促進桉樹中磷的吸收，通過菌種接種桉樹植株，可提高植株磷酸酶和土壤磷酸酶的活性，降低土壤根際pH值，較大程度的提高了植株P利用率，從而達到促進植株在低磷土壤中正常生長的目的，較大程度降低了土壤磷肥的使用率。
文檔編號C12N1/14GK101974438SQ20101054896
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月18日 優先權日2010年11月18日
發明者吳承禎, 洪偉, 謝安強 申請人:福建農林大學