專利名稱：快速簡易篩選多環芳烴降解菌的雙層平板方法及其篩選平板的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種從環境樣品中篩選菌才朱的方法，具體涉及一種從環境樣 品中快速簡易篩選多環芳烴降解菌的雙層平板方法。本發明還涉及該方法所 使用的篩選平板。
背景技術：
多環芳烴是一類在環境中廣泛存在的有機污染物，許多種類都具有致癌、
致畸、致突變的"三致"效應。上世紀80年代初，美國環保署便將其中16種 PAHs列為優先控制污染物。環境中多環芳烴的主要消除方式是通過微生物 降解，所以篩選出高效降解菌是對這種污染物進行生物修復的關鍵步驟。
多環芳烴的水溶性很低(如芘的水溶性僅為0.077mg/L)，無法直接在無 機鹽培養基內引入多環芳烴作為唯一碳源。所以傳統篩選方法是先將污染樣 品中的所有可培養細菌都進行分離純化，再逐個—險證每才朱細菌的降解能力， 這種篩選方法工作強度大、篩選效率低，且易忽略生長較為緩慢的目標菌。 基于此，隨后發展出幾種以多環芳烴為唯一碳源的平板篩選法，其中包括噴 霧法、平板升華法，它們都能直接通過肉眼識別多環芳烴水解圈而篩選出降 解菌。
噴霧法是先將多環芳烴溶解在有機溶劑中，再噴霧方式將其噴灑在無機 鹽固體培養平板上，待有機溶劑揮發之后便形成一層多環芳烴膜。由于多環芳烴膜形成之后再劃線接菌會破壞多環芳烴膜，所以在降解菌分離純化時候 往往是先接菌再制備多環芳烴膜。但是先接菌后再噴霧的操作會由于噴霧時
攜帶的高濃度有機溶劑對已接的菌造成一定的損傷；此外，噴霧平板的制作
過程會對環境空氣造成較大的多環芳烴污染。
平板升華法則是利用升華冷卻的方法設計的，具體步驟為先將菌接種至 無機鹽固體平板，然后再把接種后的平板倒扣底部平鋪有多環芳烴的燒杯 上，并用封口膜將接口處封閉，整體放到沙浴中加熱，并在平板上方放上冰。 多環芳烴在一定溫度下升華，遇到冷平板會冷卻而附著于平板上形成多環芳 烴膜。平板升華法的主要缺點是制作過程相對比較復雜，不利于大量制作。
上述兩種方法都是在無機鹽平板上形成多環芳烴膜，基于劃線接菌會破 壞多環芳烴膜的原因，兩種方法在菌的分離純化時往往是先接菌再制膜，在 制備過程中還應考慮無菌操作，操作相對較為麻煩。此外，兩種方法所形成 多環芳烴膜是無法對多環芳烴污染物的含量進行定量控制的。
發明內容
為了克服現有技術的上述不足，本發明的目的是提供一種從環境樣品中 快速筒易篩選多環芳烴降解菌的雙層平板方法。本方法利用以多環芳烴為唯 一碳源的無機鹽液體培養基對土壤降解菌進行富集培養，采用雙層平板對降 解菌進行初篩，并結合高效液相色譜法所測降解率確定高效降解菌。雙層平
板制作過程比較簡單，適于大量制作；同時能夠對平板中多環芳烴污染物的 含量進行定量控制。
完成上述發明任務的方案是 一種從環境樣品中快速簡易篩選多環芳烴 降解菌的雙層平板方法，其特征在于，步驟如下(1) . 土壤樣品的采集
釆集多環芳烴污染土壤，保存； '
(2) .多環芳烴降解菌的富集
在以多環芳烴為唯一碳源的無機鹽液體培養基中加入污染土壤，避光搖 床培養；每隔數天轉接培養液至新鮮的以多環芳烴為唯一-友源的無機鹽液體 培養基中富集培養；
(3) .多環芳烴降解菌的初篩
利用雙層平板(初篩平板)進行多環芳烴降解菌的初篩，雙層平板下層 為無機鹽固體培養基，上層為以多環芳烴為唯一碳源的無機鹽固體培養基； 將步驟(2)得到的富集培養液做梯度稀釋，涂布于雙層平板(初篩平板)培養， 挑取在菌落周圍形成透明水解圈的菌落接種于另 一雙層平板做劃線分離，最 終純化出單菌落；
(4) .多環芳烴降解菌的復篩
(4)-1.將初篩菌抹接種于Luria-Bertani培養基中，培養至OD600約為0.6, 離心去上清，用無機鹽液體培養基洗滌并懸浮菌體；
(4)-2.吸取菌懸液接入裝有以多環芳烴為唯一碳源的無機鹽液體培養基 中，三角瓶中預先加入多環芳烴丙酮溶液，振蕩使丙酮溶液完全揮發，培養 基中多環芳烴終濃度為100 mg/L;
(4)-3.避光搖床培養14天；
(4)-4.瓶內殘留多環芳烴經萃取后，選取降解率高的菌抹作為高效降解
馬—囷。
本發明通過設計一種簡易的篩選多環芳烴降解菌的篩選平板，改進了多平板制作過程比較簡單，適于大量制作；同
時能夠對多環芳烴污染物的含量進行定量控制。
對以上技術方案的進一步優化，得到的具體操作步驟是 一種從環境樣 品中快速簡易篩選多環芳烴降解菌的雙層平板方法，其特征在于，步驟如下
(1) . 土壤樣品的采集
所述的采集多環芳烴污染土壤，是指采集0~20cm深度的多環芳烴污染
土壤；
所述的保存是在4'C保存；
(2) .多環芳烴降解菌的富集
在以多環芳烴為唯一碳源的無機鹽液體培養基中加入污染土壤，避光搖 床培養；每隔數天轉接培養液至新鮮的以多環芳烴為唯一碳源的無機鹽液體
培養基中富集培養；
所述避光搖床培養的操作是；在滅菌三角瓶中加入10mg/mL的多環芳烴 丙酮溶液500iiL, 30。C振蕩使丙酮完全揮發，再加入50mL無機鹽液體培養 基，制成以多環芳烴為唯一碳源的無機鹽液體培養基，多環芳烴終濃度為 100mg/L;在該液體培養基中加入5g污染土壤，30°C 200rpm避光搖床培養；
所述的富集培養是每隔一周按10%接種量轉接培養液至新鮮的以多環 芳烴為唯一碳源的無機鹽液體培養基中富集培養，連續富集4輪；
其中，
無機鹽液體培養基組成如下MgS04.2H20 0.2g; CaCl2'2H20 0.02g; FeSO4'7H2O0.01g; KH2P04 0.4g; Na2HP04 0.6g; MnS04.H20 0.02g; NH4N03 lg;溶于1L蒸餾水中；pH7.0土0.2。 121。C濕熱滅菌20min。以多環芳烴為唯一碳源的無機鹽液體培養基組成如下在滅菌三角瓶中 加入10mg/mL的多環芳烴丙酮溶液500pL, 3(TC振蕩使丙酮揮發完全，再 加入50mL無機鹽液體培養基。
所用的多環芳烴可以為菲、芘、苯并[a]芘等；
(3).多環芳烴降解菌的初篩
所述的將將步驟(2)得到的富集培養液做梯度稀釋，涂布于雙層平板(初 篩平板)培養，是在30。C培養7~14天；
所述的挑取在菌落周圍形成透明水解圈的菌落接種于雙層平板估文劃線分 離，是在30。C培養2周以上，最終純化出單菌落。
多環芳烴水解圈在紫外燈下觀察更為明顯，表現為非曝亮的暗圈。
其中
所述雙層平板制備方法是先在平板中倒入無機鹽固體培養基約15mL, 待其完全凝固；再趁熱吸取4mL以多環芳烴為唯一碳源的無機鹽固體培養 基覆于下層培養基上面，輕搖平板使上層培養基平鋪均勻，靜置凝固。
無機鹽固體培養基組成如下MgS04'2H20 0.2g; CaCl2.2H20 0.02g; FeSO4.7H2O0.01g; KH2P04 0.4g; Na2HP04 0.6g; MnS04-H20 0.02g; NH4N03 lg;瓊脂粉15g;溶于1L蒸餾水中；pH7.0士0.2。 121。C濕熱滅菌20min。
以多環芳烴為唯一碳源的無機鹽固體培養基組成如下MgSO(2H20 0.2g; CaCl2.2H20 0.02g; FeS04.7H20 O.Olg; KH2P〇4 0.4g; Na2HP04 0.6g; MnS04.H20 0.02g; NHtNCb lg;瓊脂粉10g;溶于1L蒸餾水中；pH7.0土0.2。 分裝于10個250mL的三角瓶中，每個三角瓶裝100mL培養基。121。C濕熱 滅菌20min。使用時將固體培養基融化，并置于60。C烘箱中防止凝固，倒平板前在1 OOmL培養基中加入由丙酮配制的多環芳烴(8mg/mL )溶液5mL，
趁熱混勻。
所用的多環芳烴可以為菲、芘、苯并[a]芘等； (4).多環芳烴降解菌的復篩
所述步驟(4)-1.的操作是將初篩菌林接種于50mL Luria-Bertani培養基 中，培養4~5天至OD600約為0.6,離心去上清，用無機鹽液體培養基洗滌 菌體2次，最后用50mL無機鹽液體培養基重新懸浮菌體；
所述步驟(4)-2.的操作是吸取5mL菌懸液接入裝有45mL以多環芳爛為 唯一碳源的無機鹽液體培養基中，三角瓶中預先加入10mg/mL的多環芳烴 丙酮溶液500pL， 3(TC振蕩使丙酮溶液完全揮發，培養基中多環芳烴終濃度 為100mg/L;
其中，
Luria-Bertani培養基組成如下酵母抽提物5.0g;胰蛋白胨10.0g; NaCl 5.0g;溶于1L蒸餾水中；pH7.2 7.4。 121。C濕熱滅菌20min;
無機鹽液體培養基組成如下MgS04.2H20 0.2g; CaCl2'2H20 0.02g; FeS04.7H20 O.Olg; KH2P04 0.4g; Na2HP04 0.6g; MnS04'H20 0.02g; NH4N03 lg;溶于1L蒸餾水中；pH7.0 ±0.2。 121。C濕熱滅菌20min;
以多環芳烴為唯一碳源的無機鹽液體培養基組成如下在滅菌三角瓶中 加入10mg/mL的多環芳烴丙酮溶液50(VL， 30。C振蕩使丙酮溶液揮發完全， 再加入無機鹽液體培養基，使多環芳烴終濃度為100mg/L。
所述步驟(4)-3.的避光搖床培養14天，是在30°C 200rpm避光搖床培養 14天；所述步驟(4)-4.的選取降解率高的菌林作為高效降解菌，是瓶內殘留多環 芳烴經萃取后，采用高效液相色譜HPLC測定，選取降解率高的菌抹作為高 效降解菌。
本發明是依據多環芳烴的溶解特性而設計的高分子量多環芳烴的水溶 性很低，在水相中為非溶解顆粒狀，但多環芳烴易溶于有機溶劑；當將水相、 有機溶劑和多環芳烴以一定比例混合時，多環芳烴能均勻分布于該體系，形 成均一乳濁液。雙層平板技術的原理如下當無機鹽培養基中含有5°/。丙酮 時，多環芳烴在此體系中能形成均勻的的乳濁液；丙酮含量過低，多環芳烴 呈非溶解態顆粒物存在，不能均勻分布于水相的無機鹽培養基；丙酮含量過 高，會對所接種細菌造成一定損傷且提供除多環芳烴以外的額外碳源。當制 備成此乳濁液后，應趁熱將其平鋪一薄層成上層平板，此過程有利于丙酮揮 發而減少丙酮對所篩細菌的影響。本發明所述的要點是利用以多環芳烴為 唯一碳源的無機鹽液體培養基對土壤降解菌進行富集培養，采用雙層平板技 術對降解菌進行初篩，并結合高效液相色語法所測降解率確定高效降解菌。
本發明的主要優點有
雙層平板的制作過程簡單、污染小，制作平板時只需控制好丙酮、無機 鹽培養基和多環芳烴的比例，將三者混合即可，不會造成環境空氣污染，而 且不需要特殊裝置，易于大批量制作和篩選。
雙層平板的多環芳烴是在上層平板內均勻分布的，不是多環芳烴膜的形 式，所以不需要擔心劃線接種對多環芳烴層的影響。而且采用的是常規的先 做平板再接種的操作，無需擔心先接種再做平板出現的染菌問題。
雙層平板可對上層平板中多環芳烴的含量進行控制，解決了噴霧法和平板升華法無法定量控制的缺點。本發明利用該雙層平4反進行初篩，成功的從
污染土壤樣品中篩選到高效多環芳烴降解菌，降解率最高可達99%。
具體實施例方式
實施例1,從環境樣品中快速簡易篩選多環芳烴降解菌的雙層平板方法。 本發明以多環芳烴污染農田土壤為研究對象，四環結構的芘作為代表性多環
芳烴，具體操作步驟如下 土壤樣品的采集
選取多環芳烴污染嚴重的農田地，采集0 20cm深度的土壤，4。C保存 芘降解菌的富集
在滅菌三角瓶中加入10mg/mL的用丙酮配制的芘溶液500jiL, 30。C振蕩 使丙酮完全揮發，再加入50mL無機鹽液體培養基，制成以芘為唯一碳源的 無機鹽液體培養基，終濃度為100mg/L。在該液體培養基中加入5g污染土 壤，30°C 200rpm避光搖床培養；每隔一周按10%接種量轉接培養液至新鮮 的以芘為唯一碳源的無機鹽液體培養基中富集培養，連續富集4輪。其中，
無機鹽液體培養基組成如下MgS04.2H20 0.2g; CaCl2.2H20 0.02g; FeS04'7H20 0.0lg; KH2P04 0.4g; Na2HP04 0.6g; MnS〇4'H20 0.02g; NH4N03 lg;溶于1L蒸餾水中；pH7.0土0.2。 121。C濕熱滅菌20min。
以芘為唯一碳源的無機鹽液體培養基組成如下在滅菌三角瓶中加入 lOmg/mL的用丙酮配制的芘溶液500(iL, 30。C振蕩使丙酮溶液揮發完全，再 加入50mL無機鹽液體培養基。
芘降解菌的初篩
利用雙層平板進行芘降解菌的初篩，雙層平板下層為無機鹽固體培養基，
14上層為以芘為唯一碳源的無機鹽固體培養基；將富集培養液做梯度稀釋，涂
布于初篩平板，3(TC培養7 14天，挑取在菌落周圍形成透明水解圈的菌落 接種于雙層平板做劃線分離，30。C培養2周以上，最終純化出單菌落。水解 圈在紫外燈下觀察更為明顯，表現為非曝亮的暗圈。其中
無機鹽固體培養基組成如下MgS04'2H20 0.2g; CaCl2.2H20 0.02g; FeS04.7H20 0.0lg; KH2P04 0.4g; Na2HP04 0.6g; MnS04.H20 0.02g; NH4N03 lg;瓊脂粉15g;溶于1L蒸餾水中；pH7.0士0.2。 121。C濕熱滅菌20min。
以芘為唯一石友源的無機鹽固體培養基組成如下MgS04'2H20 0.2g; CaCl2'2H20 0.02g; FeS04'7H20 O.Olg; KH2P04 0.4g; Na2HP04 0.6g; MnS04.H20 0.02g; NH4N03 lg;瓊脂粉10g;溶于1L蒸餾水中；pH7.0土0.2。 分裝于10個250mL的三角瓶中，每個三角瓶裝100mL培養基。121。C濕熱 滅菌20min。使用時將固體培養基融化，并置于60。C烘箱中防止凝固，倒平 板前在100mL培養基中加入由丙酮配制的芘(8mg/mL)溶液5mL，趁熱混 勻。
雙層平板制備方法先倒入無機鹽固體培養基約15mL,待其完全凝固； 再趁熱吸取4mL以芘為唯一碳源的無機鹽固體培養基覆蓋于下層培養基， 輕搖平板使上層培養基平鋪均勻，靜置凝固。
多環芳烴降解菌的復篩
將初篩菌抹接種于50mL Luria-Bertani培養基中，培養4 5天至OD600 約為0.6,離心去上清，用無機鹽液體培養基洗滌菌體2次，最后用50mL 無機鹽液體培養基重新懸浮菌體。吸取5mL菌懸液接入裝有45mL以芘為唯 一碳源的無機鹽液體培養基中，三角瓶中預先加入10mg/mL由丙酮配制的芘溶液500(iL, 3(TC振蕩使丙酮溶液完全揮發，培養基中芘終濃度為100 mg/L。 30°C 200rpm避光搖床培養14天。弁瓦內殘留的芘經萃耳又后，采用高效 液相色譜HPLC測定，選取芘降解率高的菌抹作為高效降解菌。最終獲取兩 林高降解芘的菌，降解率最高分別為92%和99%。
Luria-Bertani培養基組成如下酵母抽提物5.0g;胰蛋白胨10.0g; NaCl 5.0g;溶于1L蒸餾水中；pH7.2 7.4。 121。C濕熱滅菌20min。
無機鹽液體培養基組成如下MgS04.2H20 0.2g; CaCl2.2H20 0.02g; FeSO4.7H2O0.01g; KH2P04 0.4g; Na2HP04 0.6g; MnS04.H20 0.02g; NH4N03 lg;溶于1L蒸餾水中；pH7.0士0.2。 121。C濕熱滅菌20min。
以芘為唯一碳源的無機鹽液體培養基組成如下在滅菌三角瓶中加入 10mg/mL由丙酮配制的芘溶液500jiL， 30。C振蕩使丙酮溶液揮發完全，再加 入無機鹽液體培養基，使芘終濃度為100mg/L。
與本實施例相同的其他實施例，所用的多環芳烴可以為菲、芘、苯并[a] 芘等。
權利要求
1、一種從環境樣品中快速簡易篩選多環芳烴降解菌的雙層平板方法，其特征在于，步驟如下(1).土壤樣品的采集采集多環芳烴污染土壤，保存；(2).多環芳烴降解菌的富集在以多環芳烴為唯一碳源的無機鹽液體培養基中加入污染土壤，避光搖床培養；每隔數天轉接培養液至新鮮的以多環芳烴為唯一碳源的無機鹽液體培養基中富集培養；(3).多環芳烴降解菌的初篩利用雙層平板進行多環芳烴降解菌的初篩，雙層平板下層為無機鹽固體培養基，上層為以多環芳烴為唯一碳源的無機鹽固體培養基；將步驟(2)得到的富集培養液做梯度稀釋，涂布于雙層平板培養，挑取在菌落周圍形成透明水解圈的菌落接種于另一雙層平板做劃線分離，最終純化出單菌落；(4).多環芳烴降解菌的復篩(4)-1.將初篩菌株接種于Luria-Bertani培養基中，培養至OD600約為0.6，離心去上清，用無機鹽液體培養基洗滌并懸浮菌體；(4)-2.吸取菌懸液接入裝有以多環芳烴為唯一碳源的無機鹽液體培養基中，三角瓶中預先加入多環芳烴丙酮溶液，振蕩使丙酮溶液完全揮發，培養基中多環芳烴終濃度為100mg/L；(4)-3.避光搖床培養14天；(4)-4.瓶內殘留多環芳烴經萃取后，采用高效液相色譜測定殘留量，選取降解率高的菌株作為高效降解菌。
2、根據權利要求1所述的從環境樣品中快速簡易篩選多環芳烴降解菌的 雙層平板方法，其特征在于，各步驟具體操作如下(1). 土壤樣品的采集所述的采集多環芳烴污染土壤，是指采集0~20cm深度的多環芳烴污染土壤；所述的保存是在4"C保存；(2) .多環芳烴降解菌的富集在以多環芳烴為唯一碳源的無機鹽液體培養基中加入污染土壤，避光搖 床培養；每隔數天轉接培養液至新鮮的以多環芳烴為唯一碳源的無機鹽液體培養基中富集培養；所述避光搖床培養的操作是；在滅菌三角瓶中加入10mg/mL的多環芳烴 丙酮溶液500jiL, 30。C振蕩使丙酮完全揮發，再加入50mL無機鹽液體培養 基，制成以多環芳烴為唯一碳源的無機鹽液體培養基，多環芳烴終濃度為 100mg/L;在該液體培養基中加入5g污染土壤，30°C 200rpm避光搖床培養；所述的富集培養是每隔一周按10%接種量轉接培養液至新鮮的以多環 芳烴為唯一碳源的無機鹽液體培養基中富集培養，連續富集4輪；(3) .多環芳烴降解菌的初篩所述的將將步驟(2)得到的富集培養液做梯度稀釋，涂布于雙層平板培養， 是指在30。C培養7 14天；所述的挑取在菌落周圍形成透明水解圈的菌落接種于雙層平板做劃線分離，是指在30。C培養2周以上，最終純化出單菌落； (4).多環芳烴降解菌的復篩所述步驟(4)-1.的操作是將初篩菌抹接種于50mL Luria-Bertani培養基 中，培養4~5天至OD600約為0.6,離心去上清，用無機鹽液體培養基洗滌 菌體2次，最后用50mL無機鹽液體培養基重新懸浮菌體；所述步驟(4)-2.的操作是吸取5mL菌懸液接入裝有45mL以多環芳烴為 唯一碳源的無機鹽液體培養基中，三角瓶中預先加入10mg/mL的多環芳烴 丙酮溶液500pL， 30。C振蕩使丙酮溶液完全揮發，培養基中多環芳烴終濃度 為100mg/L;所述步驟(4)-3.的避光搖床培養14天，是指在30°C 200rpm避光搖床培 養14天；所述步驟(4)-4.的選取降解率高的菌林作為高效降解菌，是指瓶內殘留 多環芳烴經萃取后，采用高效液相色譜HPLC測定，選取降解率高的菌抹作 為高效降解菌。
3、根據權利要求1所述的從環境樣品中快速簡易篩選多環芳烴降解菌 的雙層平板方法，其特征在于，步驟(3)中，所述雙層平板制備方法是先在 平板中倒入無機鹽固體培養基約15mL，待其完全凝固；再趁熱吸取4mL以 多環芳烴為唯一碳源的無機鹽固體培養基覆于下層培養基上面，輕搖平板使 上層培養基平鋪均勻，靜置凝固。
4、根據權利要求1或2或3所述的從環境樣品中快速簡易篩選多環芳烴 降解菌的雙層平板方法，其特征在于，步驟(2)中，所述無機鹽液體培養基組成如下MgS04.2H20 0.2g; CaCl2.2H20 0.02g; FeS04.7H20 0.0lg; KH2P04 0.4g; Na2HP04 0.6g; MnS04.H20 0.02g; NHjNCb lg;溶于1L蒸餾水中；pH 7.0 ±0.2。 121。C濕熱滅菌20min;以多環芳烴為唯一石灰源的無機鹽液體培養基組成如下在滅菌三角瓶中 加入10mg/mL的多環芳烴丙酮溶液500(_iL, 3(TC振蕩使丙酮揮發完全，再 加入50mL無機鹽液體培養基；所用的多環芳烴為菲、芘、苯并[a]芘；步驟(3)中，所述無機鹽固體培養基組成如下MgS04'2H20 0.2g; CaCl2'2H20 0.02g; FeSO4-7H2O0.01g; KH2P04 0.4g; Na2HP04 0.6g; MnS04'H20 0.02g; NH4N03 lg;瓊脂粉15g;溶于1L蒸餾水中；pH7.0士0.2; 121。C濕熱滅菌20mki;以多環芳烴為唯一碳源的無機鹽固體培養基組成如下MgS04'2H20 0.2g; CaCl2.2H20 0.02g; FeS04.7H20 O.Olg; KH2P04 0.4g; Na2HP04 0.6g; MnS04'H20 0.02g; NH4N03 lg;瓊脂粉10g;溶于1L蒸餾水中；pH7.0士0.2; 分裝于10個250mL的三角瓶中，每個三角瓶裝100mL培養基；121。C濕熱 滅菌20min;使用時將固體培養基融化，并置于60。C烘箱中防止凝固，倒平 板前在100mL培養基中加入由丙酮配制的多環芳烴8mg/mL溶液5mL,趁 熱混勻；所用的多環芳烴為菲、芘、苯并[a]芘； 步驟(4)中，所述的Luria-Bertani培養基組成如下酵母抽才是物5.0g;胰蛋白胨，10.0g; NaC15.0g;溶于1L蒸餾水中；pH7.2 7.4; 121。C濕熱滅菌20min;無機鹽液體培養基組成如下MgS04.2H20 0.2g; CaCl2.2H20 0.02g; FeS04.7H20 0.0lg; KH2P04 0.4g; Na2HP04 0.6g; MnS04.H20 0.02g; NH4N03 lg;溶于1L蒸餾水中；pH7.0士0.2; 121。C濕熱滅菌20min;以多環芳烴為唯一碳源的無機鹽液體培養基組成如下在滅菌三角瓶中 加入10mg/mL的多環芳烴丙酮溶液50(VL， 3(TC振蕩使丙酮溶液揮發完全， 再加入無機鹽液體培養基，使多環芳烴終濃度為100mg/L。
5、 一種權利要求1所述的從環境樣品中快速簡易篩選多環芳烴降解菌的 雙層平板方法所^使用的篩選平板，其特征在于，所述的篩選平板為雙層結構， 該雙層結構的下層為無^f幾鹽固體培養基，上層為以多環芳烴為唯一碳源的無 機鹽固體培養基。
6、 根據權利要求5所述的從環境樣品中快速簡易篩選多環芳烴降解菌的 雙層平板方法所使用的篩選平板，其特征在于，所述篩選平板的雙層結構是 指，按照以下制備方法得到的雙層結構先在平板中倒入無機鹽固體培養基 約15mL，待其完全凝固；再趁熱吸取4mL以多環芳烴為唯一碳源的無機鹽 固體培養基覆于下層培養基上面，輕搖平板使上層培養基平鋪均勻，靜置凝固。
全文摘要
從環境樣品中快速簡易篩選多環芳烴降解菌的雙層平板方法及其篩選平板(1)采集多環芳烴污染土壤保存；(2)多環芳烴降解菌的富集在以多環芳烴為唯一碳源的無機鹽液體培養基中加入污染土壤避光搖床培養；(3)用雙層平板進行初篩下層為無機鹽固體培養基，上層為以多環芳烴為唯一碳源的無機鹽固體培養基；富集培養液涂布于雙層平板培養，挑取在菌落周圍形成透明水解圈的菌落接種于另一雙層平板做劃線分離，純化出單菌落；(4)多環芳烴降解菌的復篩選取降解率高的菌株作為高效降解菌。本發明能方便的通過篩選平板上的降解圈識別出多環芳烴降解菌。制作過程簡單，且對環境污染小。本發明篩選到高效多環芳烴降解菌，降解率最高可達99％。
文檔編號C12Q1/04GK101597590SQ20091018163
公開日2009年12月9日 申請日期2009年7月24日 優先權日2009年7月24日
發明者晶 張, 軍 曾, 林先貴 申請人:中國科學院南京土壤研究所