專利名稱：11個用于區分原發性肝癌癌組織及癌旁組織的microRNA標志物的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，更具體地，本發明涉及一類可用于區分原發性肝癌癌 組織及癌旁組織的microRNA標志物以及用途。本發明還涉及檢測所述microRNA標志物的 芯片和試劑盒。
背景技術：
原發性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，每年新發病例約占全球50%。肝癌的 惡性程度高，發展迅速，治療困難，病死率高。因此，肝癌的盡早診斷就愈發顯得迫切。任何事物的發生發展都處于內外因共同作用之下，內因為主，外因為輔。基因作為 生命的遺傳介質，在生物體的生、老、病、死中處于基礎內因的地位。絕大部分基因通過轉錄 生成核糖核酸，再翻譯生成蛋白質而發揮生物學功能。microRNA (miR或miRNA，微小RNA)是一類在較高等的真核生物體內廣泛存在的， 長度約18-26個堿基的單鏈RNA分子。它可以通過堿基配對原則特異性地與一些mRNA上 的靶位點相結合，引起靶mRNA降解或翻譯抑制，進而在轉錄后水平對靶基因進行調控。microRNA來源于長度約為IOOObp的長鏈RNA初始轉錄產物(Pri-miRNA)， Pri-miRNA分子在細胞核中經Drosha酶剪切形成長度約60 80nt的具有莖環結構的 miRNA前體(Pre-miRNA)。Pre_miRNA轉運至胞質后，被Dicer酶進一步切割成長約22nt的 雙鏈miRNA。雙鏈miRNA解開后，成熟的miRNA進入RNA誘導基因沉默復合物(RNA_induced silencing complex, RISC)，與互補mRNA完全或不完全配對，降解靶mRNA或阻遏其表達。盡管microRNA在細胞總RNA中所占的比重很小，但由于它可以高效地對所有具有 靶位點的mRNA產生調控作用，microRNA在生物體的發育乃至腫瘤的發生、發展過程所起的 作用仍不可小視。然而，迄今為止，本領域對于與腫瘤(如肝癌)相關的microRNA 了解甚少，因此本 領域迫切需要進一步地分離各種microRNA，尤其是與腫瘤的發生、轉移、復發或檢測有關的 microRNAο
發明內容
本發明的目的就是提供一類新的、可用于區分原發性肝癌癌組織及癌旁組織的 microRNA標志物。本發明的另一目的就是提供所述microRNA標志物的用途。在本發明的第一方面，提供了一種分離的miRNA，所述的miRNA選自⑴序列如SEQ ID NO :n所示的miRNA，其中η為選自1_11的正整數；或(ii)與 SEQ ID NO :n 所示序列互補的 miRNA。在另一優選例中，所述的miRNA分離自人。在本發明的第二方面，提供了一種miRNA集(set)或組合(combination)，所述的集或組合由序列如SEQ ID NO 1-11所示的11種miRNA所構成。在本發明的第三方面，提供了一種分離的或人工構建的前體miRNA，所述的前體 miRNA能在人細胞內剪切并表達成本發明第一方面中所述的miRNA。在本發明的第四方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸能被人細胞 轉錄成前體miRNA，所述的前體miRNA能在人細胞內被剪切且表達成本發明第一方面中所 述的miRNA。在另一優選例中，所述的多核苷酸具有式I所示的結構Seq正向-X-Seq反向 式 I，式I 中，Seq1自為能在人細胞中表達成所述的miRNA的核苷酸序列，Seqfi自為與Seq1自基本上互補或完全互補的核苷酸序列；X為位于Seq1^P Seqg之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq1^P Seq反向 不互補，并且式I所示的結構在轉入人細胞后，形成式II所示的二級結構 Seq jh 向
權利要求
1.一種分離的miRNA，其特征在于，所述的miRNA選自(i)序列如SEQID NO :n所示的miRNA，其中η為選自1_11的正整數；或(ii)與SEQID NO :n所示序列互補的miRNA。
2.—種miRNA集，其特征在于，所述的集由序列如SEQ ID NO :1_11所示的11種miRNA 所構成。
3.一種分離的或人工構建的前體miRNA，其特征在于，所述的前體miRNA能在人細胞內 剪切并表達成權利要求1所述的miRNA。
4.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸能被人細胞轉錄成前體miRNA， 所述的前體miRNA能在人細胞內被剪切且表達成權利要求1所述的miRNA。
5.如權利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸具有式I所示的結構Seq正向 _X_Seq反向 ζ I，式I中，Seq1^1為能在人細胞中表達成所述的miRNA的核苷酸序列， Seqfi^1為與Seq1^1基本上互補或完全互補的核苷酸序列；X為位于Seq1^P Seqg之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq1^P Seqfi自不互補，并且式I所示的結構在轉入人細胞后，形成式II所示的二級結構Seq正向一^n丨丨X式II，Seq反向式II中，Seqra、Seq反向和X的定義如上述， I表示在Seq1^i 之間形成的堿基互補配對關系。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求1所述的miRNA，或權利要求4所述的多核苷酸。
7.權利要求1所述的miRNA的用途，其特征在于，用于制備區分原發性肝癌癌組織及癌 旁組織的芯片或試劑盒。
8.一種miRNA芯片，其特征在于，所述的miRNA芯片包括 固相載體；以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性地對應于 SEQ ID NO :1-11所示的部分或全部序列。
9.如權利要求8所述的miRNA芯片的用途，其特征在于，用于制備區分原發性肝癌癌組 織及癌旁組織的試劑盒。
10.一種試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含有權利要求8所述的miRNA芯片。
全文摘要
本發明涉及11個用于區分原發性肝癌癌組織及癌旁組織的microRNA標志物。具體地，本發明涉及一類可用于區分原發性肝癌癌組織及癌旁組織的microRNA標志物。經檢驗證明，這些特異性的microRNA標志物可非常有效地區分原發性肝癌癌組織及癌旁組織。本發明還涉及檢測所述microRNA標志物的芯片和試劑盒。
文檔編號C12N15/63GK102002491SQ20091019481
公開日2011年4月6日 申請日期2009年8月31日 優先權日2009年8月31日
發明者何祥火, 梁琳慧, 顧健人, 魏霖 申請人:上海市腫瘤研究所